Respiración Celular

Metabolismo energético

1789: Lavoisier escribió que la respiración no es nada más que una combusitón lenta del carbono y el hidrógeno. El había demostrado que los seres vivos cosumen oxígeno y generan CO2.

A finales del siglo XIX se sabía que Glucosa + O2

CO2 + H2O

A principios del siglo XX se vió que esto era por transferencia de electrones y protones de la glucosa al oxígeno para formar agua según las ecuaciones Glucosa + 6H2O 6O2 + 24 H+ + 24 e-

6CO2 + 24H+ + 24e- Se oxida 12H2O.

Se reduce

Siglo XIX término oxidasa

Breve Historia

1910-12 oxidación de compuestos por O2 en presencia de tejidos y la sensibilidad a algunos inhibidores: concepto de proceso enzimático. ’20s término deshidrogenasa y citocromos.

Si gl o X X

’30s compuesto con Fe o las deshidrogenasas. Solución: conexión por hemoproteínas (citocromos)

1939 deshidrogenasa, citocromo b, c a y a2, O2 y H2O 1946 respiración en mitocondrias 1948 fosforilación oxidativa desde el NADH hasta el O 2 1950 ubiquinona o coenzima Q. 1952 membranas por microscopía electrónica. 1953, teoría química. 1960 Fe, S, Cu y Mg como cofactores metálicos y proteínas Fe-S 1961 teoría quimioosmótica: transporte de electrones con el pasaje de H+ contragradiente como fuerza para síntesis de ATP por la ATPasa 1966 Complejos I, II, III (citocromo bc), IV (citocromos a) y V (ATPase), tamaños en precipitaciones con sulfato de amonio y columnas de exclusión molecular que contenían actividad: ’70s controversias En 1975 el ciclo Q.1978 Nobel Prize para Mitchell.1981

Mitocondrias

La respiración celular tiene lugar en la membrana interna de las mitocondrias

Cuatro compartimientos

Contienen su propio ADN con diferente cantidad de genes (desde 37 en humanos a 57-70 en plantas u hongos) Teoría del endosimbionte: α o γ proteobacteria (Rickettsia sp.)

Localización submitocondrial TOM y SAM

Enzimas del ciclo TCA, ADNmt, ribosomas

Factores de apoptosis o PCD

Cadena respiratoria y TIM

Teoría del endosimbionte

La oxidación del NADH es una reacción exergónica El NADH es el intermediario más importante de la célula por su capacidad de óxido-reducción. El NADH es oxidado por el O2 NAD + H+ + 2e-

NADH

E0'= -0,315

½ O2 + 2H+ + 2e-

H2O

E0'= 0,815

La afinidad por electrones aumenta con el potencial de reducción

½ O2 + NADH + H+

H2O + NAD+

∆Eo'= 0,815- (-0,315) = 1,130 V o como ∆Go'= -nF∆Eo' 1,130 V= -218 kJ. mol-1

Cadena de Transporte de Electrones: consideraciones termodinámicas La afinidad por electrones aumenta con el potencial de reducción

∆G:-218,2kJ.mol-1 dividido en tres reacciones

Los electrones provenientes de la oxidación del NADH y FADH 2 pasan por cuatro complejos, desde los potenciales de reducción más bajos a los más altos

Concentración de oxígeno

Inhibidores

100

Sin adiciones

Concentración de oxígeno

% consumo de oxígeno/min

tiempo

Rotenona

-

rot

Células alimentadas con glucosa

KCN

Concentración de oxígeno

tiempo

KCN

tiempo

Cómo daría alimentado con hidroxibutirato que produce NADH?

Cadena de Transporte de Electrones

Cadena Respiratoria

Complex I : NADH dehydrogenase:Ubiquinone oxido reductase

2006

En 2010 se logró cristalizar de una bacteria

Complex III: Cytochrome bc1 complex ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase

Cytochrome c

Complex IV: Cytochrome c Oxidase

La subunidad γ de la ATPase es capaz de girar

Complex V: ATP synthase

Electron Transport Chain

Enfoque proteómico para identificar nuevas funciones en mitocondrias

mitocondrias

Funciones generales de la mitocondria               

decarboxylación de piruvato ciclo de ácidos tricarboxílicos (TCA) fosforilación oxidativa degradación y biosíntesis de aminoácidos ciclo de la urea * β-oxidación de ácidos grasos * biosíntesis de fosfolípidos (ej. cardiolipin) biosíntesis de biotina y ácido lipoico biosíntesis de hemo biosíntesis de ácido fólico y ascórbico (vitamina C) Ensamblaje de complejos Fe-S síntesis de proteínas, transcripción y replicación de ADN importe de proteínas, clivaje y degradación apoptosis / muerte celular programada rol en cancer, Parkinson, ataxia * Ausente en mitocondrias de plantas homeostasis de Ca ++ y Fe ++

Enfoque Proteómico de organelas: •Aislamiento de las organelas a la mayor pureza posible •Aislamiento de todas las proteínas •Separación de las proteínas por diferentes métodos •Aislamiento e identificación sistemática de las proteínas

Muchas de las proteínas son conocidas, forforilación oxidativa el ciclo de TCA, 30-60% (dependiendo del organismos) no han sido todavía identificadas. ˜

˜

25% se desconoce su función experimentalmente

Se supone que las mitocondrias cumplen muchas funciones pero sólo algunas han sido estudiadas en gran detalle . En la mayoría de los casos las proteínas implicadas en estos procesos no han sido identificadas aún. Para poder comprender a fondo estos procesos es necesario establecer un catálogo completo de estas proteínas. Esto es la proteómica.

Purificación de mitocondrias por ultracentrifugación en gradientes de Percoll etiolated seedlings

green seedlings

flower buds

Sistemas de electroforesis en gel en dos dimensiones 2D IEF / SDS-PAGE

2D BN / SDS-PAGE

2D BN / BN-PAGE

Two-dimensional isoelectroenfoque IEF/ SDS PAGE First gel dimension: • proteins • non-ionic detergent • pH gradient Second gel dimension: • gel strip of the first gel dimension • SDS

Two-dimensional Blue-native / SDS PAGE First gel dimension: • proteins • non-ionic detergent • Coomassie-blue Second gel dimension: • gel strip of the first gel dimension • SDS Jänsch et al. (1996), Plant J. 9, 357-368

Two-dimensional Blue-native / Blue-native PAGE First gel dimension: • proteins • non-ionic detergent I • Coomassie-blue Second gel dimension: • gel strip of the first gel dimension • non-ionic detergent II Eubel et al. (2004), Plant Physiol. 134, 1450-59

2D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE) Mix labelled samples

2D gel electrophoresis protein sample I Cy3 label (∆)

protein sample II Cy5 label (wt) Image analysis

excitation wavelength I

excitation wavelength II overlay image

Purificación de los complejos por ultracentrifugación en gradientes de sacarosa actividad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 I+III2 I H V III2 FDH

1D Blue native PAGE

MALDI-TOF MS/MS

Cadena Respiratoria de Plantas CI

NDex

42 subunits 9 plantspecific 51 genes

1 subunit 4 genes H+

Cyt c 1 subunit 2 genes

C

NDex

Q

CII

NDin NADH

NDin 1 subunit 2 genes

NADH

succ

CII 8 subunits 4 plantspecific 12 genes

14 subunits 1 plantspecific 20 genes

H+

H+

NADH

CI

CV

CIII

CIV

CV

135 genes 25% plant specific

AOX O2

AOX 1 subunit 5 genes

O2

CIII 10 subunits 2 plantspecific 17 genes

ATP

H+

CIV 14 subunits 6 plantspecific 23 genes

Cadena ramificada en plantas

Møller, Rasmusson, Brown (2002) In: Plant Physiology, Taiz, Zeiger (Ed), Sinauer Associates

El Complejo I está implicado en la síntesis de ácido ascórbico (vitamina C) La enzima L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase (GLDH) cataliza la reacción final en la síntesis de ácido ascórbico

El Complejo I de plantas tiene un dominio extra Arabidopsis

Neurospora

Guénebaut et al. (1997) J Mol Biol 265: 409-418

Dudkina et al., 2005

Las γCAs están en el brazo de membrana

C

A

S

I

complex I Proteínas de membrana

600 kDa subcomple

400 kDa subcomple

Sunderhaus et al., 2006

Las γCAs están en la membrana hacia la matriz _

+

_

+

_

+

46 30 21

ANT

SOD

CA Sunderhaus et al., 2006

La falta de γCA2 causa reducción del Complejo I Blue-native PAGE

IEF 70

At5g37510

55

55

SDS PAGE

30 At3g48680

14

30

At3g63510

At5g52840

20 At3g07480

A

B I+III2

I

V III2

4.6

5.3

6.0

6.7

8.7

Perales et al., 2005

NADH oxidazing domain

Carbonic anhydrases

Membrane arm

Supercomplejos Respiratorios

tallo I2+III4 I+III2+IVa I+III2+IVb I+III2 I

III2+IVa III2+IVb V III2

? IVa ? IVb Eubel et al. 2004, Plant Physiol. 134, 1450-1459.

tubérculo I+III2+IVa4 I+III2+IVa2 I+III2+IVa I+III2 III2+IVa2 I III2+IVa V III2 ? IVa ?

Respirasoma H+[IMS] H2O

NADH + H+

III

IV ½O2 + 2 H+

I III

+

NAD

IVIV H2O

H+[M]

Eubel et al. 2004, Plant Physiol. 134, 1450-1459.

I+III2

Rol funcional de supercomplejos? Channeling?

Importación de proteínas

Enzimas de la glicólisis asociadas mitocondrias In vitro Proteínas poco abundantes

LC/MS subproteomas

En varios organismos encontraron las enzimas de la glicólisis en proteomas de la membrana externa mitocondrial. In vivo

Mitotracker

Enolase-GFP Aldolase-GFP

GFP

Del 3 al 12% está asociado a la mitocondria

Están asociadas a la membrana externa Giegé et al, 2003

La ATPasa está involucrada en generar Las crestas mitocondriales? ∆ subunidad γ ATPase de levaduras altera la estructura mitocondrial

Paumard et al. 2002, EMBO J. 21, 221-230

El cross-linking de los dominios F1 de la ATPase altera también la morfología

Gavin et al. 2004, J. Cell Science 117, 2333-2343

Estructura de la ATPase dimérica : La asociación angular de los monómeros induce una fuerte curvatura de la membrana interna

Dudkina N., et al.. (2005)

Las mitocondrias pueden diferir en forma y número de acuerdo al organismo o incluso al tejido

Sin embargo los mecanismos moleculares que gobiernan estos parámetros no son claramente entendidos aún.

Comparación de Proteomas de Mitocondrias Genes codificados en mitocondrias

Proteínas estimadas

%identificadas

% Energía

% mantenimiento

% signalling

% defensa y/o apoptosis

% desconocidas

L 28

1000

70

14

53

5

3

25

M 13

2000

35

22

50

12

10

6

P

2000

25

23

49

8

6

22

57

Mitocondrias de diferentes tejidos suelen contener distintas proteínas acordes con sus funciones