unidad didáctica 1. el microscopio El microscopio es el material inventariable más utilizado en cualquier laboratorio. Por tanto, será un material u aparato de uso cotidiano para el técnico. Lo anterior justifica su inclusión en los contenidos del presente Ciclo Formativo y por tanto del Módulo que nos ocupa. Nuestro objetivo será que el alumno conozca las distintas partes que constituyen el microscopio, así como la utilidad de todas ellas y precauciones a tener en cuenta en su manejo. 1. introducción. La palabra microscopio deriva de dos vocablos griegos: micros (pequeño) y scopein (ver). En términos generales, un microscopio es todo instrumento que permite amplificar la imagen de un objeto o de un ser pequeño. La invención del microscopio fue realizada, hacia 1610, por Galileo, según los italianos, o por Jansen, según la opinión de los holandeses. El primer científico que empleó el microscopio para observar animales diminutos fue Galileo. A éste le siguieron los componentes de la "Accademia dei Lincei" (Academia de los Linces), que publicaron un tratado sobre las observaciones microscópicas del aspecto exterior de una abeja. Sin embargo, fue el médico italiano Marcello Malpighi el que empezó el estudio sistemático de la constitución íntima de la materia viva. En concreto, en su publicación titulada De pulmonibus (Sobre los pulmones) describió los alvéolos y los capilares; esto último fue fundamental para la confirmación de la teoría de Harvey sobre -la circulación de la sangre. Junto a Malpighi, es destacable la labor del comerciante holandés Antony van Leenwenhoek, quien, además -de construir personalmente los mejores microscopios de la época, descubrió numerosos detalles relativos a la anatomía microscópica del cuerpo humano, como por ejemplo, la forma y el tamaño de los hematíes y la :estructura de la pared de los vasos sanguíneos y del corazón. Durante esa misma época, también un grabador esp-añol llamado Crisóstomo Matínez realizó un gran atlas anatómico en el que describía la estructura microscópica de los huesos, y en concreto, de la médula ósea.

2. FUNDAMENTO DE LA MICROSCOPIA. Cuando se acerca un observador a un objeto, crece el ángulo visual y ese objeto parece ser mayor. Sin embargo, por debajo de una determinada distan-cia (unos 25 cm) entre el ojo y el obje-to, éste no se ve con claridad. Este lími-te se debe a la capacidad máxima de deformación del cristalino. Si se sitúa entre el ojo y el objeto un sistema ópti-co capaz de aumentar el ángulo visual, se podrá ver el objeto con mayor ampli-tud y claridad. El sistema de lentes del microscopio sirve, por lo tanto, para producir una imagen aumentada de una muestra 1

diminuta. En el microscopio óptico compuesto, el objetivo funciona como una pequeña lente de proyección, es decir, aumenta y proyecta la "imagen primaria" del objeto hacia el extremo superior del tubo del microscopio. Esta imagen se forma en el aire y, por consiguiente, se conoce como "imagen aérea". El ocular funciona, prácticamente, como una lupa, aumentando la imagen aérea. La imagen final se forma en la retina del ojo, pero éste la percibe como si estu-viera en un plano situado cerca del pie del diafragma (plano virtual). Esta últi-ma imagen se conoce como "imagen virtual", porque los rayos de luz que la originan no proceden del plano virtual, tan sólo parece que proceden de allí. 3. PARÁMETROS ÓPTICOS. 3.1. AUMENTO. Es la relación existente entre el tamaño de un objeto percibido a simple vista y el apreciado con el micros-copio, es decir, es el número de veces que se ve el tamaño de un objeto por encima de su valor real. En el microscopio óptico compuesto, el aumento total se calcula multiplicando el aumento individual del objetivo por el aumento individual del ocular. Se reseña mediante un número seguido del signo "por" (x). 3.2. PODER DE RESOLUCIÓN. Al incrementar el aumento se puede obtener una imagen de tamaño más grande, pero también más borrosa y en la que no se visualizan los detalles más finos. Por lo tanto, a la hora de la observación microscópica, no es sólo importante el aumento generado por las lentes, sino también la resolución del microscopio. La resolución de un microscopio es la capacidad de éste para mostrar los detalles más finos de un objeto. El poder o capacidad de resolución de un microscopio viene determinado por su límite de resolución (dis-tancia resoluble), es decir, por la distancia mínima entre dos puntos que permite distinguirlos como tales, en lugar de como un único objeto borroso. La distancia resoluble es directamente proporcional a la longitud de onda (A) de la luz empleada e inversa-mente proporcional a la apertura numérica (A.N.) de la lente utilizada (objetivo). La A.N. consiste en la capa-cidad de la lente para juntar los rayos de luz proyectados hacia ella, y se calcula multiplicando el índice de refracción (I.R.) del medio que hay entre la muestra y la lente por el seno de la mitad del ángulo de luz que penetra en la lente (sen ). Hay tres métodos para disminuir la distancia resoluble o, lo que es lo mismo, para aumentar el poder de resolución de un microscopio: • Disminuir la longitud de onda de la luz empleada. • Aumentar el ángulo a en el espacio objeto. • Aumentar el índice de refracción en el espacio objeto. La longitud de onda de la luz puede disminuirse mediante el empleo de filtros selectivos. Como el poder de resolución es directamente proporcional a la A.N., para poder aprovechar un objetivo al máximo, la lente condensadora debe ser capaz de producir un cono luminoso del tamaño máximo que el obje-tivo es capaz de aprovechar. No obstante, cuando la A.N. de iluminación es casi igual a la A.N. máxima del objetivo, disminuye el contraste. Debido a esto, no se suele trabajar con la máxima iluminación que permite la lente del condensador. El diseño del objetivo también influye en el poder de resolución del microscopio, ya que un objetivo capaz de aprovechar un gran cono de luz procedente de la muestra generará una mejor resolución que un objetivo 2

limitado a un cono de luz más pequeño. Si se rellena el espacio existente entre la muestra y el objetivo no con aire, sino con una sustancia de mayor índice de refracción (por ejemplo, aceite) se consigue que la mayor palie de los rayos perdidos por los fenómenos ópticos ocasionados en el condensador y en el por-taobjetos, se refracten y penetren en el objetivo, con lo que se incre-menta la resolución del microscopio. 3.3. NÚMERO DE CAMPO. Es el diámetro de la imagen observada a través del ocular, expresado en milímetros. 3.4. PROFUNDIDAD DE FOCO. Al enfocar un objeto por medio del microscopio, hay un margen finito por encima y por debajo de este o!:−.:('-to, en el cual se visual izan nítidamente otros objetos. La profundidad de foco es el espesor de la muestra que es posible tener enfocado por completo. La profundidad de foco es inversamente proporcional al aumento y a la A.N. de la lente. 3.5. CONTRASTE. Es el grado de diferencia entre el tono, el brillo o el color del objeto estudiado y el del medio que lo rodea. Si una muestra tiene poco contraste, para mejorarlo, se debe disminuir el cono de iluminación procedente del condensador. El cono de iluminación se controla mediante el diafragma de apertura. El contraste puede aumentarse mediante procedimientos de tinción. 4. PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO. 4.1. PARTE MECÁNICA. Dentro de la denominada parte mecánica se distinguen distintos elementos que se clasifican en dos grandes grupos. Todo ello se expone detalladamente a continuación. SISTEMA DE SOPORTE O ESTATIVO. • Pie: es la base del microscopio. • Brazo: une el pie con el cabezal. • Cabezal (tubo de observación en los microscopios antiguos): en sus extremos están alojados los oculares . los objetivos. • Platina: es una placa horizontal que sostiene las preparaciones a observar. Sale del brazo y consta de un orificio central que permite el paso de la luz y una pinza que sujeta el portaobjetos (dedo de carga). SISTEMA DE AJUSTE. • Anillo de ajuste de las dioptrías. • Tornillo de fijación del cabezal. • Tornillos reguladores de la platina (control del eje X y control del eje Y): sirven para deslizar el portaobjetos a lo largo y a lo ancho de la platina. Su movimiento queda registrado en 2 escalas móviles, lo que permite establecer la posición exacta de cualquier zona de la preparación. • Tornillo de elevación del condensador: se utiliza para elevar el condensador y aumentar la 3

iluminación descenderlo y reducir la iluminación. • Tornillos de centrado del condensador: se usan para centrar el condensador con respecto al objeto. • Tornillo de seguridad del condensador: permite el desmontaje y la limpieza de la lente superior del condensador. • Control del diafragma de apertura del condensador. • Anillos de enfoque: mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. Son dos: el macrométrico o el micrométrico o de avance lento. Llevan incorporado un anillo de ajuste de la tensión del macrométrico. • Control de ajuste de la claridad: regula la intensidad de la luz emitida por la lámpara. 4.2. PARTE ÓPTICA. SISTEMA DE ILUMINACIÓN. • Fuente de luz: actualmente es una lámpara halógena de intensidad graduable. Está situada en el pie del microscopio. Se enciende y se apaga con un interruptor. En su superficie externa hay una especie de anillo para colocar filtros que facilitan la visualización de algu-nas preparaciones (soporte del filtro). Los modernos microscopios también incorporan, a este nivel, un anillo para el ajuste del diafragma de campo. Si se reduce el diafragma de campo, se circunscribe el campo de visión y se limita la penetración excesiva de luz en el mismo, con lo que puede obtenerse una imagen con mejor contraste. Este ajuste debe realizarse, siempre que se utilice un objetivo de aumentos diferentes, mirando a través del ocular y giran-do en sentido antihorario el anillo del diafragma de campo. • Condensador: es un dispositivo que contiene una lente que concentra la luz, generada en la lámpara, hacia la preparación. Se encuentra colocado entre la fuente luminosa y la platina. • Diafragma de apertura ( diafragme iris): se localiza en el interior del condensador. Sirve para el control adecuado del cono de iluminación que atraviesa la muestra y entre en el objetivo. Con él se puede ajustar, por lo tanto, la A.N. Cuanto más se cierra, más mejora el contraste y más empeora la resolución del microscopio. La imagen visualizada puede mejorarse, ajustando el diafragma de apertura al 80%, cada vez que se cambia el objetivo. Para ello, se retira el ocular, se mira a través del cabezal y se gira el control del diafragma de apertura del condensador hasta que el polígono visualizado ocupa el 80% del campo total. LENTES. • Objetivos: generan una imagen real, invertida y aumentada del objeto. Están colocados en la parte inferior del cabezal, a nivel de una pieza mecánica que permite cambiarlos fácilmente y recibe el nombre de revólver. Se llaman así porque están muy cercanos al objeto.

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Los de mayor aumento poseen un sistema de amOliiguación que dificulta su rotura al chocar con la preparación. -Tienen dibujado un anillo coloreado que indica su número de aumentos. Los más frecuentes son los de 4, 10, 40 Y 100 aumentos. Este último se dice que es de inmersión porque precisa el uso de aceite sobre la preparación. • Oculares: captan la imagen formada por el objetivo y la amplían. Están colocados en la palie superior del cabezal. Se llaman así porque están muy cercanos alojo. En los actuales microscopios binoculares son dos, uno para cada ojo, y están unidos mediante un mecanis-mo que consta de una escala graduada y permite ajustar la distancia interpupilar. La visión binocular se obtiene por medio de un prisma divisor de rayos y de tres espejos. Este sistema divide la luz en partes igua-les, dirigiendo la mitad alojo derecho y la otra mitad alojo izquierdo. Cada ocular consta de dos lentes. Las lentes inferiores de los oculares están fabricadas con plástico óptico. Los más usados producen un aumento de 10 veces.

5. MATERIAL NECESARIO PARA VISUALIZACIÓN MICROSCÓPICA. 5.1. PORTAOBJETOS. El portaobjetos o "porta" es una lámina de vidrio que sirve de soporte para la muestra. Los más utilizados tienen una anchura y una longitud de 26 x 76 mm, y un grosor recomendado que oscila entre los 0,9 y los 1,2 mm. Los mejores son los esmerilados, que están fabricados con un vidrio mejor y cuyos bordes son menos agu-dos. También los hay biselados y con las esquinas cortadas. 5.2. CUBREOBJETOS. El cubreobjetos o "cubre" es una lámina muy fina de vidrio que sirve para cubrir la muestra. Los más corrientes tienen una anchura y una longitud de 22 x 22 mm, pero también los hay de 18 x 18, 18 x 24, 22 x 32 y 24 x 60 mm. Además, su grosor suele ser de unos 0,17 mm. El cubre suele utilizarse siempre, pero puede no emplearse con el objetivo de inmersión.

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5.3. LIQUIDO DE INMERSIÓN. Tradicionalmente se ha usado el aceite de madera de cedro, cuyo índice de refracción es superior al del aire y muy similar al del vidrio utilizado en óptica. Los aceites sintéticos son mejores porque no se secan tan fácilmente como el de cedro. Como líquido de inmersión también se pueden utilizar otras sustancias como, por ejemplo, el bromuro de naftalina. Su empleo es imprescindible cuando se observa una muestra desecada con el objetivo de inmersión. 6. MANEJO DEL MICROSCOPIO. • Accionando el revólver, seleccionar el objetivo adecuado. Se sabe que el objetivo está correctamente seleccionado cuando se percibe un audible clic. Generalmente se empieza enfocando con un objetivo de poco aumento y luego se pasa a otro de mayor aumento. Si se hace esto, basta con mover ligeramente el micrométrico para enfocar la muestra con este último objetivo. • Bajar completamente la platina y colocar la preparación sobre ella, teniendo cuidado de no ponerla al revés. • Accionando los tornillos reguladores de la platina, desplazar la preparación hasta situar la muestra some-tida a estudio sobre el orificio de paso de luz. • Encender la fuente de luz y regularla a una intensidad media para evitar que se sobrecaliente. • Situar el condensador. Bajo, si se utiliza un objetivo de poco poder de ampliación (10 x). En la mitad de su recorrido, si se emplea un objetivo de gran poder de ampliación (40 x). Alto, si se usa un objetivo de inmersión (100 x). También conviene ascender el condensador si se observa una muestra desecada y teñida, y descenderlo si se estudia una muestra "en fresco". • Mirando por fuera de los oculares, hacer ascender la platina con el tornillo macrométrico hasta que objetivo esté muy cercano a la preparación. Cuando se utiliza un objetivo de poco poder de ampliación, el aparato tiene un tope que impide un acercamiento excesivo de aquél a la preparación. Sin embargo, si se emplea el objetivo de inmersión, previamente hay que depositar una pequeña gota de aceite sobre la preparación y, posteriormente, hacer ascender la platina hasta que aquél toque el aceite pero no la preparación. • Ajustar la distancia interpupilar. • Moviendo el tornillo macrométrico, hacer descender lentamente la platina hasta que se vea, mirando los oculares, la imagen de la muestra. Con el objetivo de inmersión, éste nunca debe separarse tanto de la preparación como para perder el contacto con el aceite. • Afinar el enfoque con el tornillo micrométrico. • Desplazando horizontalmente la platina con movimientos en zig−zag, recorrer con el objetivo toda la preparación, para realizar una correcta observación de la misma. • Durante la observación, mover continuamente el tornillo micrométrico, para enfocar sucesivamente todos los planos de la muestra. • Una vez finalizada la observación, hacer descender totalmente la platina y retirar la preparación. 6

• Apagar la fuente de luz. 6.1. AJUSTE DE LOS OCULARES. Se realiza una vez enfocada la muestra y se lleva a cabo de la siguiente forma: • Cerrar el ojo izquierdo y ajustar el enfoque del ojo derecho con el micrométrico. • Cerrar el ojo derecho y ajustar el enfoque del ojo izquierdo con el anillo de ajuste de las dioptrías. • Terminar el ajuste, mirando con los dos ojos, y dando un pequeño toque de enfoque con el micrométrico. 6.2. CONSERVACIÓN DEL MICROSCOPIO. • Transportar el microscopio sujetándolo firmemente con las dos manos, para evitar el riesgo de que se caiga. Tener también cuidado para no dejar caer los oculares. • Mantenerlo tapado con una funda, cuando no esté siendo usado. • Limpiar las lentes frotándolas suavemente con una gasa. Para limpiar huellas dactilares y manchas de grasa depositadas sobre las lentes se puede usar una gasa humedecida ligeramente en alcohol puro. También se pueden limpiar las lentes con una mezcla de éter y alcohol (70:30) o con xilol. Estos últimos disolventes no deben emplearse para la limpieza de las lentes inferiores de los oculares pues, al ser estas últimas de plástico óptico, se pueden empañar. La mezcla de éter−alcohol y el xilol son especialmente útiles para retirar los restos de aceite del objetivo de inmersión. Un uso excesi-vo del xilol puede acarrear la disolución del adhesivo de las lentes. • Retirar el polvo de las partes delicadas del aparato, arrojándole aire con una pera de goma y mediante el uso de un pincel fino. • Limpiar los otros componentes del aparato, que no son las lentes, con un paño humedecido en agua destilada. También se puede uti-lizar para esto una gasa ligeramente humedecida en una solución de un detergente neutro. • Contratar una revisión profesional del microscopio, al menos, una vez al año.

7. TIPOS DE MICROSCOPIOS. Con esta iluminación, el campo microscópico se ve como un fondo oscuro en el que resalta el elemento que se estudia, debido a su aspecto brillante. 7.1. MICROSCOPIOS ÓPTICOS. MICROSCOPIO SIMPLE. También se llama microscopio estereoscópico o lupa. Consta de una base, en la que se sitúa la platina, y de la que emerge una columna que soporta las lentes y el mando de enfoque. Sólo sirve para exámenes 7

superficiales, como la disec-ción de animales, la observación de colonias o la detec-ción de quistes de Triquina en el músculo del cerdo. Con él se puede conseguir un número limitado de aumen-tos y, en concreto, no más de 200. MICROSCOPIO COMPUESTO. Permite el estudio de las estructuras internas de la muestra, para lo cual ésta debe estar dispuesta en una fina capa que puede ser atravesada por la luz. Con este microscopio, el campo visual está intensamente iluminado y los objetos estudiados se ven más oscuros que él, por lo que se dice que es un microscopio de campo claro. MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO. Consta de un condensador especial, que debe estar muy cercano a la preparación, y que lanza un cono hueco de luz cuyo punto vértice (o focal) es el plano de la muestra. Debido a este tipo especial de iluminación, si la mues-tra es totalmente transparente y homogénea, la luz la atra-viesa y no entra en el objetivo. Sin embargo, si dentro de la muestra hay elementos transparentes, con un índice de refracción diferente al del medio que los circunda, la luz es difractada por ellos e incide sobre el objetivo, por lo que pueden ser visualizados. Permite la observación de seres microscópicos trasparentes y no teñidos que, a causa de su bajo contraste son escasamente percibidos con la iluminación de campo claro.

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES. Es muy difícil ver los elementos transparentes de una muestra con una iluminación de campo claro. S' embargo, no todos estos elementos tienen el mismo índice de refracción. El índice de refracción de los distintos elementos que están presentes en la muestra provoca diferentes alteraciones en la fase de onda de los rayos de iluminación, pero estas alteraciones no son percibidas por el ojo humano. En la microscopía de contraste de fases se sitúa un diafragma anular en el plano focal del condensador. Es un diafragma especial proyecta hacia la muestra un haz de luz anular. Cuando incide este haz de luz sobre la muestra, y como consecuencia de su interacción con los distintos elementos que la componen, se produce la 8

difracción de una parte de los rayos luminosos que constituyen este haz. La luz proyectada hacia la muestra es recogida por el objetivo y proyectada, a su vez, en el plano focal posterior de éste. En el plano focal posterior del objeti-vo se coloca una lámina que contiene un anillo (anillo de fase) construido de tal forma que produce una anticipación de un cuarto de onda a la luz que pasa a través de él (la no difractada) con respecto a la luz que no lo atraviesa (la difracta-da). Tras esto, interfieren ambas porcio-nes del haz luminoso (la no difractada y la difractada). Cuando interfieren ondas luminosas que tienen un determinado desfase, dependiendo de las características de éste, se produce una interferencia cons-tructiva o substractiva. Los elementos transparentes que hay en la muestra alte-ran, con la intervención de la lámina de fases, las relaciones de fase entre los rayos de iluminación y esto se traduce en diferencias de luminosidad, que pue-den ser percibidas por el ojo humano y hacer visibles elementos que de otra forma no lo serían. Este microscopio facilita, por lo tanto, el estudio de objetos transparentes y no coloreados como, por ejemplo, los encontrados en un sedimento de orina. MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA. La fluorescencia es la propiedad que tienen ciertas sustancias (sustancias fluorescentes) de emitir, cuando son iluminadas por una radiación de corta, otra radiación de más larga. Así pues, si la luz incidente es ultravio-leta (invisible), la sustancia fluorescente se excita y emite una radiación visible de color característico. A continuación se expone una imagen de una muestra seminal a microscopio de fluorescencia. MICROSCOPIO DE LUZ POLARIZADA. La energía de la luz se transmite por ondas. Estas ondas oscilan en todos los planos del espacio. Sin embargo, es posible restringir la oscilación de las ondas luminosas a un solo plano mediante unos dispositivos conocidos como "polarizadores". A la luz obtenida de esta forma se le llama luz polarizada. Si se combinan dos polarizadores, de forma que el segundo está girado 90° con respecto al primero, como el primero sólo deja pasar la luz que vibra en un determinado plano y el segundo transmite la luz en un ángulo perpendicular a la dirección de transmisión del primero, la luz se extingue. En el microscopio de luz polarizada se sitúa la muestra entre dos po1arizadores cruzados. Los elementos cris-talinos presentes en la muestra cambian el estado de polarización de la luz y de hecho "descruzan" los polari-zadores. Como consecuencia de ello, los elementos cristalinos se ven como estructuras luminosas que resaltan sobre el fondo oscuro generado por los polarizadores cruzados. Además, con este método se obtienen imágenes de colores muy vivos y es posible percibir característi-cas en la estructura y composición de los elementos cristalinos que no son discernibles con una iluminación convencional. Este microscopio sirve, por ejemplo, para identificar las distintas sustancias cristalinas que pueden estar pre-sentes en un sedimento urinario. A continuación se expone una imagen de fibras de colágeno obtenidas mediante microscopia de luz polarizada.

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7.2. MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS. MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN. Éste es un instrumento en el que, para visualizar la muestra, en vez de utilizar un haz de fotones, se emplea un haz de electrones, cuya longitud de onda es del orden del angstrom (10−7 mm). Consiste en un tubo, en cuyo interior se ha hecho el vacío, y a través del cual se propagan los electrones hacia la muestra. El vacío es necesario para que los electrones puedan desplazarse. Los electrones son generados en una fuente y acelerados mediante una diferencia de potencial de 60.000 a 100.000 voltios. El haz de electrones es enfocado hacia la muestra mediante condensadores electromagnéticos. La muestra tiene que ser preparada en forma de lámina muy fina (de 500 angstrom de espesor o menos) y es atravesada por el haz de electrones, que se dispersan al pasar por ella. El haz de electrones que emerge de la muestra es proyectado, por unas lentes electromagnéticas, hacia una pantalla que brilla al recibir el impacto de los electrones. Debajo de ésta se halla situada una placa fotográfica que recoge la imagen generada en aquélla. Con él se consigue una gran amplificación y permite la observación de elementos que son demasiado peque-ños como para ser vistos en un microscopio óptico. Pero no sirve para observar elementos vivos, a causa del vacío que ha de establecerse dentro del tubo, y es muy costoso, por lo que fundamentalmente se usa en inves-tigación La siguiente imagen muestra el aspecto presentado por un linfocito al ser estudiado mediante el empleo de un microscopio electrónico de transmisión.

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MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO. En esta técnica la muestra se congela de una forma especial, y seguidamente se recubre con una capa de metal que emite fácilmente electrones secundarios (oro o platino). Después se irradia la superficie de la muestra con un haz de electrones muy estrecho. Esto origina un des-prendimiento, por parte de la preparación, de electrones secundarios (de baja energía) que inciden sobre una placa cargada positivamente. En ésta se generan unas señales eléctricas que son registradas en un monitor de televisión. Este microscopio no tiene tanto poder de resolución como el de transmisión, pero sin embargo, proporciona una enorme profundidad de campo y genera unas imágenes que producen una gran sensación de tridimensio-nalidad. La siguiente fotografía muestra el aspecto de un linfocito visualizado al microscopio de barrido. LDC− Hematología U.D. 1 −5−

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