Nuevas Fuentes de Antioxidantes Naturales Queda hecho el depósito de ley Depósito legal: ISBN: 980-12-0656-X Diseño de cubierta: Idanis Pozo Montaje digital: Franklin Carrero Impreso en Venezuela/Printed in Venezuela Caracas, Venezuela/ Agosto 2004 Todos los derechos reservados. Esta publicación no puede ser reproducida o transmitida mediante ningún sistema o método electrónico o mecánico (incluyendo el fotocopiado, la grabación o cualquier sistema de recuperación y almacenamiento de información) sin la autorización previa de los editores.

Indice Página Prologo I ................................................................................................................5 FUENTES NOVELES DE ANTIOXIDANTES ........................................................... 11 Alejandro Fernández Barrero, M. Mar Herrador del Pino, Pilar Arteaga Burón, José Quílez del Moral y Jesús Fernández Arteaga MERCADO Y TECNOLOGÍAS DE EXTRACCIÓN ...................................................29 Ana Tymoschouk LA AUTOXIDACIÓN Y LA RANCIDEZ. TEORÍA....................................................57 Alfredo Rosas Romero AUTOXIDACIÓN Y RANCIDEZ. ANALÍTICA ..........................................................77 Alfredo Rosas Romero EL ESTRÉS OXIDATIVO. TEORÍA..........................................................................91 Olga Sonia León de Fernández ESTRÉS OXIDATIVO. ANALÍTICA ........................................................................ 107 Métodos de estudio in vivo de extractos y productos antiinflamatorios ...109 Ríos JL, Recio MC, Giner RM y Máñez S Determinación de la actividad antioxidante en sistemas biológicos ......... 117 Schinella G.R., Tournier H., Góngora L., Ríos J.L. EL DISEÑO EXPERIMENTAL ..............................................................................131 Alfredo Rosas Romero y Gloria Saavedra DESCRIPCIÓN DE LAS PLANTAS .................................................................. 151 Introducción ................................................................................................153 Alfredo Rosas Romero Plantas bolivianas .......................................................................................156 Gloria Saavedra Frutas colombianas .....................................................................................194 Benjamín Rojano Plantas paraguayas .....................................................................................214 Edelira de Velázquez Plantas mediterráneas ................................................................................225 José Luis Ríos LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE 41 PLANTAS BOLIVIANAS ........................233 Alfredo Rosas Romero, Benjamín Rojano y Gloria Saavedra

CAPACIDAD ATRAPADORA DE RADICALES LIBRES Y CONTENIDO DE FENOLES DE ALGUNAS FRUTAS TROPICALES COLOMBIANAS ..................261 Benjamín Rojano, Francoise Bonavoir, Carlos Andrés Gaviria M, Carlos E Monsalve, Guillermo Arrazola y Alfredo Rosas Romero LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE PLANTAS PARAGUAYAS ...........................273 Alfredo Rosas Romero y Edelira Velázquez ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CAPTADORA DE RADICALES EN NUEVE ASTERACEAE BOLIVIANAS .............................................................281 Irene Parejo, Francesc Viladomat, Jaume Bastida, Alfredo Rosas Romero, Gloria Saavedra, M. Antonia Murcia, Antonia M. Jiménez, Carles Codina COMPUESTOS ANTIOXIDANTES DEL HINOJO AMARGO. Foeniculum vulgare ...303 Carles Codina, Irene Parejo, Jaume Bastida, Jesús Burillo, Francesc Viladomat Helichrysum italicum. COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIINFLAMATORIO ..............319 Ríos JL, Schinella GR, Sala A, Recio MC Phagnalon rupestre. COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIALÉRGICO .........................329 Ríos JL, Schinella GR, Góngora L, Máñez S, Giner RM PODER ANTIOXIDANTE DE LOS ESTILBENOS. RELACIONES, ACTIVIDAD, ESTRUCTURA Y MECANISMOS ..............................337 Alejandro Fernández Arteaga FITOQUÍMICA DE Ophryosporus heptanthus .......................................................355 Alejandro F. Barrero, Pilar Arteaga, M. Mar Herrador, Jesús F. Arteaga y Alfredo Rosas Romero DOMESTICACIÓN Y EXPLOTACIÓN COMERCIAL de la Salvia canariensis..........363 Javier G. Luis, Lucía S. Andrés, Joaquín G. Marrero DOMESTICACIÓN DE PLANTAS AROMÁTICAS Y MEDICINALES COMO FUENTE POTENCIAL DE ANTIOXIDANTES .................381 Jesús Burillo, Irene Parejo, Francesc Viladomat, Jaume Bastida, Alfredo Rosas Romero, Carles Codina

Prologo I Resúltame sumamente grato prologar esta obra, producto de la labor mancomunada de un conjunto de prestigiosos profesionales liderados con eficiencia y capacidad por parte del Dr. Alfredo Rosas Romero. El tema motivo de estos estudios es harto importante, en primer lugar para nuestra región, pero además para el mundo industrializado. Los antioxidantes de uso habitual actualmente son de origen sintético y en ello radica su pecado de origen: se encuentran fuertemente cuestionados, cuando no en algunos casos prohibidos, en sus aplicaciones en alimentos, fármacos o cosméticos. Allí reside, precisamente, la razón de ser y fortaleza del presente estudio. En el mismo, se ha efectuado una exhaustiva búsqueda y selección de especies vegetales de nuestra región posibles de proveer moléculas aptas por su poder antioxidante. Una vez obtenidos los extractos del caso, se realizaron los ensayos de determinación de dicho poder. Todo ello implicó una labor cooperativa llevada a cabo entre los distintos grupos de investigación participantes según fuera su especialización. Con ello, estamos cumpliendo con uno de los requisitos del CYTED: incentivar la labor cooperativa. Va de suyo que también hemos cumplido con el otro requisito básico cual es el de producir resultados de utilidad para las sociedades de nuestra región con posibilidades ciertas de transferencia al sector productivo. En todo ello radica nuestro orgullo y obliga a extender a todos los responsables de esta obra nuestras más efusivas congratulaciones. Roberto E. Cunningham Coordinador Internacional del Subprograma IV del CYTED

Prologo II Tiene usted en sus manos los resultados del trabajo de investigación realizado por los integrantes del Proyecto IV.11 del CYTED, titulado Desarrollo de Antioxidantes de Origen Natural e Interés Comercial. Durante cuatro años nos hemos dedicado a la evaluación de potenciales nuevas fuentes de antioxidantes naturales. Participaron 12 instituciones de 7 países iberoamericanos: Argentina, Bolivia, Colombia, Cuba, España, Paraguay y Venezuela. De los resultados no hablaremos en estas líneas, porque suficientes páginas dedicaremos luego a ello. Preferimos referirnos a frutos del proyecto que por su naturaleza intangible podrían pasar desapercibidos. El primero de ellos es habernos conocido. Haber trabajado coordinadamente, en una relación de pares entre pares, fue una de las características definitorias de la ejecución del proyecto y , para nosotros, unos de los más importantes logros. En suma, pertenecemos a 10 universidades y 2 institutos de investigación. Sobre esa infraestructura nos apoyamos, porque sin ella no sería factible la cooperación entre 7 países. Las exigencias del proyecto nos enfrentaron con las fortalezas y debilidades de nuestras instituciones, con lo que nos quedó reafirmado el sentido de pertenencia a ellas y la inmanente necesidad de compartir y cooperar. José Antonio Cordero ejerció la Secretaría del CYTED durante el lapso de ejecución del proyecto. Su liderazgo gerencial y su calidez humana fueron estímulos determinantes para lograr las metas que teníamos planteadas. Al personal del CYTED en Madrid, nuestras palabra de reconocimiento. Roberto Cunningham, Coordinador de nuestro Subprograma CYTED, el IV: Biomasa como Fuente de Productos Químicos y Energía, con su proverbial habilidad y estilo, pendiente en todo momento del curso, timoneó el proyecto como imperceptiblemente. Sin órdenes, con la opinión. Grata experiencia. Nos hemos esforzado por redactar en lenguaje asequible a industriales y profesionales de campos vecinos; cuidándonos de mantener el rigor que nos exigen los especialista del área. Y, de antemano ofrecemos nuestras excusas por las costuras que se notarán en esta obra tejida a varias manos.

Dedicamos el libro a nuestros estudiantes. Tiene usted en sus manos los resultados del trabajo de investigación realizado por los integrantes del Proyecto IV.11 del CYTED, titulado Desarrollo de Antioxidantes de Origen Natural e Interés Comercial. Alfredo Rosas Romero, editor Coordinador Internacional del Proyecto IV.11. Caracas, 2 de abril de 2004

Programa de Cooperación Iberoamericano Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) www.cyted.org El Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) fue creado en 1984 mediante un Acuerdo Marco Interinstitucional firmado por 19 países de América Latina, España y Portugal. El Programa CYTED se define como un programa internacional de cooperación científica y tecnológica multilateral, con carácter horizontal y de ámbito iberoamericano. El Programa CYTED tiene como objetivo principal contribuir al desarrollo armónico de la Región Iberoamericana mediante el establecimiento de mecanismos de cooperación entre grupos de investigación de las Universidades, Centros de I+D y Empresas innovadoras de los países iberoamericanos, que pretenden la consecución de resultados científicos y tecnológicos transferibles a los sistemas productivos y a las políticas sociales. D. Fernando Aldana Mayor Secretario General Programa Cyted C/ Amaniel, 4 28015. Madrid ESPAÑA Teléfonos: (34) 609 000 189 / (34) 91 531 63 87 Fax: (34) 91 522 78 45 Subprograma IV. BIOMASA COMO FUENTE DE PRODUCTOS QUIMICOS Y ENERGIA Dr. Roberto E. Cunningham, Coordinador Internacional Proyecto IV.11. Desarrollo de Nuevas Fuentes de Antioxidantes de Interés Industrial Dr. Alfredo Rosas Romero, Coordinador

FUENTES NOVELES DE ANTIOXIDANTES Alejandro Fernández Barrero, M. Mar Herrador del Pino, Pilar Arteaga Burón, José Quílez del Moral y Jesús Fernández Arteaga [email protected]

FUENTES NOVELES DE ANTIOXIDANTES Alejandro Fernández Barrero, M. Mar Herrador del Pino, Pilar Arteaga Burón, José Quílez del Moral y Jesús Fernández Arteaga Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias, Instituto de Biotecnología, Universidad de Granada, Campus de Fuentenueva, s/n. 18071 Granada, España.

Introducción Los antioxidantes son compuestos que inhiben o retrasan la oxidación de otras moléculas, inhibiendo la iniciación o propagación de las reacciones oxidativas en cadena. Los antioxidantes naturales constituyen un amplio grupo de compuestos que incluye principalmente compuestos polifenólicos y vitaminas (Velioglu et al., 1998). Hoy día numerosas enfermedades se asocian con la formación de oxígeno reactivo y la inducción de peroxidación lipídica. Las especies de oxígeno reactivo constituyen un mecanismo de injuria tisular y son relevantes en procesos de inflamación y envejecimiento, en trastornos cardiovasculares y neurodegenerativos, etc. (Ramarathman et al., 1996). Esto ha conducido a una intensa investigación del uso de los antioxidantes presentes en los alimentos, así como de los procedentes de otras fuentes, para la prevención de este tipo de enfermedades. Por otra parte, el interés de los antioxidantes no solo reside en su utilidad como fármacos, sino también en su uso como aditivos industriales. Fundamentalmente se utilizan como conservantes de alimentos, plásticos, caucho, cosméticos y aceites y grasas industriales.

Fuentes de compuestos polifenólicos con actividad antioxidante Este tipo de compuestos constituyen el grupo más numeroso de antioxidantes, encontrándose en un amplio número de plantas. Dife13

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rentes fracciones butanólicas obtenidas a partir del extracto etanólico del orujo, subproducto obtenido en la producción de aceite de oliva, han mostrado interesantes propiedades antioxidantes (Amro et al., 2002). En las fracciones más potentes se han identificado los ácidos ferúlico 1, caféico 2, cinámico 3, cumárico 4 y protocatequico 5. La presencia de estos compuestos hacen a estos extractos útiles para su aplicación en cosméticos, principalmente en cremas antiarrugas.

El alpechín, otro subproducto obtenido en la elaboración del aceite de oliva, tiene un alto contenido en hidroxitirosol 6, compuesto que ha mostrado notable actividad antioxidante, además de los ácidos ferúlico 1, caféico 2 y cumárico 4. Algunos polifenoles aislados del alpechín se emplean como antioxidantes de grasas y aceites (Janer del Valle, 1980).

El propio aceite de oliva contiene quercetina 7 y trans-resveratrol 8, antioxidantes muy efectivos en inhibir la activación endotelial, lo que puede explicar su efecto ateroprotector. Los flavonoles quercetina 7, myrcetina 9, kaempferol 10, y las flavonas luteolina 11 y apigenina 12, debido a su actividad antioxidante disminuyen el riesgo de mortalidad por enfermedad coronaria (Gordon, 1996). Estos compuestos se encuentran en cítricos. 14

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Los flavonoides presentes en el vino inhiben la oxidación de LDL in vitro (Gordon, 1996). trans-reverastrol 8, otro compuesto polifenólico existente en el vino, también inhibe la oxidación de LDL. Esta oxidación es uno de los factores que inicia la patología de la ateroesclerosis. Hypericum triquetrifolium Turra (Fam. Hypericaceae) es una planta nativa del este de Europa y del área mediterránea, usada tradicionalmente como sedante, antihelmíntica, antiinflamatoria y antiséptica (Baytop, 1984). Recientemente se ha estudiado la actividad antioxidante de esta planta (Conforti et al., 2002). Dicha actividad se debe a la presencia de los flavonoides 13-16. 15

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La infusión acuosa de la planta del té (Camellia sinensis) es rica en antioxidantes de tipo polifenólico (Graham, 1992). El componente mayoritario del té negro es theaflavin galato 17 y del té verde (-)- epigalocatequin galato 18. Este último presenta actividad anticancerígena junto con las flavonas tangeretin 19 y nobiletin 20 presentes en cítricos (Gordon, 1996).

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El extracto acuoso de hojas de espinacas (Spinacia oleracea) ha mostrado una actividad antioxidante semejante a la de la vitamina E (Bergman et al., 2001), siendo los responsables de la misma los compuestos 21-26.

Los extractos de las hojas de Ginkgo biloba se usan en medicina popular china desde hace unos 5000 años. Actualmente se recomiendan sus extractos para el tratamiento de problemas cardiacos, de la enfermedad arterial periférica y en la insuficiencia cerebral (DeFeudis, 1991; Kleijnen et al., 1992; Kunkel, 1993). Recientemente se ha estudiado la actividad antioxidante de esta planta como posible mecanismo de su utilidad clínica. Los resultados de este estudio han mostrado que la actividad antioxidante del Ginkgo biloba se debe a su contenido en flavonoides (Yuting et al., 1990; Husain 17

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et al., 1987; Bors et al., 1990), entre ellos kaempferol-3-O-glucosido 27, kaempferol-3-O-rutinosido 28, theaflavin galato 17 y epigalocatechin galato 18.

El extracto metanólico de las hojas de Tachigalia paniculata Aubl. (Fam. Leguminosae) muestra actividad antioxidante debido fundamentalmente a la presencia de los glicósidos flavonoides 29 y 30 (Cioffi et al., 2002).

Achyrocline satureioides Lam. (Fam. Compositae) es una planta medicinal ampliamente usada como colerética, antiespasmódica y hepatoprotectora en la región de Chaco y tierras bajas meridionales, (Uruguay, Paraguay, sureste de Bolivia, noreste de Argentina y sur de Brasil). El estudio fitoquímico de las partes aereas de esta planta ha confirmado la presencia de quercetina 7 y de los ácidos polifenólicos caféico 2, clorogénico 31 e isoclorogénico 32 (Broussalis et al., 1989). Debido a su alto contenido en compuestos polifenólicos se ha estudiado la actividad antioxidante de esta planta, resultando efectiva en la disminución de la peroxidación lipídica (Lissi et al., 1992). 18

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Achyrocline flaccida (Weinm) DC, especie relacionada con la anterior, también ha mostrado interesantes propiedades antioxidantes, debidas a la presencia de la flavanona 33 y de la chalcona 34 (Payá et al., 1996).

Los flavonoles metoxilados 35-37 se han aislado de las partes aereas de Plucchea sagittalis (Lam.) Cabrera (Fam. Compositae). Aunque no se ha determinado la actividad de estos compuestos, deben ser los responsables de la actividad antioxidante de esta planta (Fraga et al., 1987).

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Otra planta sudamericana interesante es la yerba mate (Ilex paraguariensis). Sus hojas tienen diferentes usos medicinales, entre ellos analgésico, estimulante cardiaco y del SNC, diurético, lipolítico, etc. La yerba mate tiene además una actividad antioxidante significativa (Filip et al., 2000; Schinella et al., 2000; Actis-Goretta et al., 2002; Kalousova et al., 2002). Una infusión de yerba mate inhibe la peroxidación lipídica, particularmente la oxidación de LDL y la formación de AGEs. La formación de AGEs juega un papel importante en el desarrollo de las complicaciones asociadas a la diabetes mellitus. Entre los metabolitos secundarios de la yerba mate se encuentran los compuestos polifenólicos quercetina 7, kaempferol 10, ácido caféico 2, ácido clorogénico 31, ácido isoclorogénico 32 y ácido 5-cafeoilquínico 38 (Alikaridis, 1987).

Los ruibarbos (rizomas de Rheum palmatum L., R. tanguticum Maxim., R. officinale Baill., R. coreanum Nakai y R. undulatum L.) se usan en medicina oriental como purgantes. Los extractos metanólicos de estos rizomas han mostrado significativa actividad antioxidante, siendo el más activo el extracto de R. tanguticum (Matsuda et al., 2001). Estos autores también han estudiado la actividad antioxidante de los metabolitos de naturaleza polifenólica aislados del extracto metanólico de R. undulatum siendo los más potentes los derivados estilbénicos rhaponticin 39 y piceatannol 40, que presentan una actividad semejante a la vitamina E (Matsuda et al., 2001).

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Hoy día aunque se siguen utilizando como fuentes de antioxidantes naturales organismos terrestres, también se efectúan búsquedas de antioxidantes en organismos marinos. Recientemente se ha estudiado la actividad antioxidante de una serie de metabolitos aislados de esponjas, algas y cianobacterias marinas (Takamatsu et al, 2003). Cymopol 41 (aislado de Cymopolia barbata), 7-hidroxicymopol 42 (aislado de C. barbata), avrainvilleol 43 (aislado de Avrainvillia ssp.), fragilamida 44 (aislado de Martensia fragilis), puupehenona 45 (aislado de Hyrtios spp.), aaptamina 46 (aislado de Aaptos aaptos) e isoaaptamina 47 (aislado de A. aaptos) han mostrado interesantes propiedades antioxidantes.

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Los compuestos 41-45 actúan como potentes antioxidantes no solo en ensayos en disolución, sino también sobre células vivas, mientras que los compuestos 46 y 47 no muestran actividad significativa sobre células vivas. Del alga marrón Cystoseira crinita se han aislado una serie de tetrapreniltoluquinoles, tripreniltoluquinoles y tetrapreniltoluquinonas que han mostrado interesantes propiedades antioxidantes, siendo las tetrapreniltoluquinonas 48 y 49 los compuestos más potentes (Fisch et al., 2003).

Fuentes de vitaminas y análogos con actividad antioxidante La vitamina E (α-tocoferol, 50) se encuentra mayoritariamente asociada a la LDL plasmática, evitando su oxidación y su consumo disminuye el riesgo de sufrir trastornos coronarios (Steinberg, 1997; Gordon, 1996).

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Del aceite de palma (Euterpe spp., Fam. Arecaceae) se aislan una serie de tocotrienoles que son mejores antioxidantes que la vitamina E (Duke et al., 1994). Otras fuentes de tocotrienoles son las especies vegetales Elaeis guineensis Jacq (Fam. Arecaceae) e Iryanthera grandis Duke (Fam. Myristicaceae). De estas plantas se aisla g-tocotrienol 51.

Portulaca oleracea L. (Fam. Portulacaceae) es una excelente fuente de antioxidantes, entre ellos: a-tocoferol 50, ácido ascórbico (vitamina C, 52) y β-caroteno 53 (Simopoulos, 1992).

Otros carotenoides con actividad antioxidante son α-caroteno 54, γ-caroteno 55, licopeno 56 y lutein 57 (Krinsky, 1989).

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La mayoría de los antioxidantes pertenecientes a este grupo se usan también como aditivos en las industrias agro-alimentaria y cosmética.

Antioxidantes sintéticos Los antioxidantes sintéticos se usan industrialmente como aditivos. Estos antioxidantes retrasan o previenen los procesos oxidativos que causan el deterioro de los alimentos, el endurecimiento del caucho, el cambio de color y/o enranciamiento de los aceites y grasas, etc. butil hidroxitolueno (BHT, 58), butil hidroxianisol (BHA, 59), tert-butilhidroquinona (TBHQ, 60) y di-tert-butilhidroquinona (DTBHQ, 61) son antioxidantes utilizados en la industria agro-alimentaria, en la de cosmética y en la de plásticos como conservantes.

Los tetrahidrocurcuminoides 62-64 son derivados de los curcuminoides, metabolitos aislados de la raíz de Curcuma longa. Su actividad antioxidante es mayor que la de BHT, utilizándose como aditivos en 24

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la industria cosmética, principalmente en cremas protectoras de la piel y para prevenir el enranciamiento de algunos componentes usados en la elaboración de cosméticos.

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MERCADO Y TECNOLOGÍAS DE EXTRACCIÓN Ana Tymoschouk [email protected] INSTITUTO DE DESARROLLO Y DISEÑO – INGAR. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Fundación ARCIEN para el Arte, la Educación, la Ciencia y la Tecnología. Dirección postal: Avellaneda 3657, 3000. Santa Fe, Agentina.

Introducción Los antioxidantes son sustancias que disminuyen la extensión de reacciones de oxidación espontáneas del oxígeno atmosférico con sustancias orgánicas provocando cambios en sus atributos de calidad, de los cuales el principal es la disminución de la vida útil de muchos productos de la industria de los alimentos, de cosméticos, y química. Las industrias de los polímeros y los plásticos y de los aceites vegetales y minerales otorgan una gran importancia al uso de aditivos antioxidantes para la preservación de sus productos. En el consumo humano, las sustancias antioxidantes comenzaron a popularizarse mundialmente en las últimas décadas a partir de la difusión de los resultados científicos obtenidos en pruebas de compuestos aislados o en los componentes naturales de alimentos y material vegetal y animal. Estas evidencias impulsaron la consideración de los antioxidantes en aplicaciones farmacológicas para tratamientos de prevención de enfermedades como el cáncer o la osteosporosis y con efectos favorables para la salud humana en general. En el área de los cosméticos los antioxidantes surgieron como protectores de los productos o con efectos específicos contra el envejecimiento de la piel. Y en los alimentos los antioxidantes resultan de interés para incrementar la estabilidad de los productos, reduciendo la velocidad de degradación de compuestos por la oxidación y la pérdida de la calidad nutritiva. Hay una estrecha relación entre el área farmacológica y alimenticia por la ingesta de los antioxidantes sea como nutracéuticos en 31

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el primer caso o como alimentos funcionales en el segundo. La diferencia está en la definición de ambos. Los “alimentos funcionales” son aquellos cuya composición se integra de sustancias como glutatión, vitamina A, y otras, con valores nutritivos y fisiológicos. Pueden ser definidos como alimentos que contienen niveles significativos de componentes biológicamente activos que brindan beneficios a la salud ás de la nutrición básica. Un ejemplo son los yogures con cultivos probióticos. Son preventivos de enfermedades, por ejemplo del cáncer y de la osteoporosis, pero las certezas científicas de que puedan curar esas enfermedades no son suficientes y necesitan continuar la investigación en esa dirección. En cambio los nutracéuticos contienen sustancias o agentes bioactivos de efectos farmacológicos sobre la salud, científicamente comprobados y pueden ser presentados en otra forma distintas a la del alimento, con dosis superiores de los mencionados agentes. Los nutracéuticos pueden definirse como alimentos a ser consumidos bajo supervisión médica y para tratamientos específicos de enfermedades con requerimientos nutricionales particulares. Por ejemplo los productos marinos de cartílago de tiburón se recetan para enfermedades articulares. La antocianina de los berries y los betacarotenos de la zanahoria reducen el riesgo de cáncer y mejoran el sistema inmunológico. Los extractos de ginko biloba ayudan a la circulación sanguínea y reducen el riesgo del mal de Alzheimer. La hierba de San Juan ayuda a la recuperación de los pacientes con depresiones moderadas y los extractos de ginseng y guarana reducen fatiga y estrés. La valeriana promueve el sueño. Las isoflavonas de la soja son fitoestrógenos ideales para la prevención de las osteosporosis. Los ácidos grasos omega 3 reducen el riesgo de enfermedades cardiovasculares. El consumo de nutracéuticos y de alimentos funcionales, de preferencia para los productos naturales y con una marcada disminución de los sintéticos tiene que ver con la tendencia mundial hacia lo “natural”. En USA se incrementó el consumo de los alimentos sanos, naturales, con mínimo procesamiento, en contraposición a los platos preparados listos para cocinar pero con alguna pérdida del valor nutritivo. Si bien esto se compensó en parte con la incorporación de adi32

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tivos nutrientes como la niacina y la riboflavina, se prefieren las fuentes naturales de estos nutrientes contenidas en el mismo alimento. El consumo de este tipo de alimentos ha sido tradicionalmente el de los jugos naturales de verduras y frutas pero en los últimos tiempos ha incorporado las bebidas y alimentos con contenido de hierbas, de soja, enriquecidos con minerales, entre otros ingredientes. Algo similar ocurre con los países europeos, que además privilegian la dieta mediterránea, con hortalizas, vegetales, aceite de oliva, pescados, todos de alto contenido en antioxidantes. Respecto a los japoneses y a los asiáticos, hay una contraposición entre la dieta tradicional, pobre en grasas animales pero de alto valor nutritivo con el arroz, la soja, el pescado y las hortalizas, y los alimentos rápidos hamburguesas, pizzas y otros productos ricos en hidratos de carbono. Dada la preferencia hacia lo natural, sinónimo de sano, la industria incorpora aditivos que fortalecen las deficiencias de los alimentos preparados. Estas alternativas juegan un papel de publicidad para las grandes empresas, que dicen no olvidar lo saludable y proponer alimentos funcionales. Hay un número importante de sustancias en la naturaleza que tienen propiedad antioxidante, es decir, la de cumplir con la función de atrapar moléculas de oxígeno inestables y disminuir la velocidad de oxidación de sustratos in vitro ó in vivo. Los antioxidantes pueden producirse en el mismo cuerpo humano (glutationa, co-enzima Q10, etc.). Los vegetales y las frutas en general son fuentes ricas en estos compuestos (vitaminas E y C, carotenoides, flavonoides, etc.). Los antioxidantes se pueden incorporar al organismo humano mediante la ingesta equilibrada de alimentos ricos en estos compuestos, como fármacos o como suplementos dietéticos. Estos últimos son combinaciones de varios antioxidantes y otras sustancias que en conjunto ejercen un sinergismo favorable para la función de protección de la oxidación. A su vez se incorporan minerales como cinc, cobre y/o selenio para potenciar el efecto de los suplementos. Los antioxidantes más consumidos son las vitaminas C, E, betacaroteno y selenio mineral, pero han surgido con mucha fuerza las proantocianidinas (flavonoides de las semillas de uva, de la corteza de pino y de 33

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los vinos), la N-n-acetilcisteína, la co-enzima Q10, el ginko biloba, el té verde, y fórmulas de carotenoides y polifenoles. Las hierbas culinarias y medicinales han demostrado tener propiedades antioxidantes. Las hierbas secas de orégano, salvia, menta, tomillo, clavo de olor y las hierbas medicinales chinas tienen antioxidantes en concentraciones mayores a 75 milimoles cada 100 gramos. Científicos japoneses y noruegos afirman que una ingesta de este tipo de hierbas en la dieta normal mejora significativamente el total de antioxidantes incorporados a través de alimentos ricos en estos compuestos y presentes en frutas, cereales y vegetales. Una preparación a partir de una hierba medicinal Stronger Neo-Minophagen C, usada como inyección intravenosa para tratamiento de hepatitis crónica, favoreció la ingesta de antioxidantes totales y favoreció el tratamiento curativo. Los científicos concluyen que varios de los efectos de estas hierbas se deben a su actividad antioxidante. Las industrias de antioxidantes se muestran optimistas respecto al incremento de consumo y de ventas. Pero no se logra definir exactamente el mercado por la diversidad de los ingredientes y su capacidad antioxidante. A pesar de esto hay especial atención en el poder antioxidante de hierbas y plantas, como extracto de berries, de semilla de uva, de madera de roble, y de otras variedades más exóticas. Esto destaca un potencial interesante en aquellas especies que se desarrollan en abundancia y naturalmente en algunas regiones del mundo, pero que requieren de investigación en su capacidad antioxidante. Este aspecto es de suma importancia para considerar el desarrollo sustentable de las plantas en su aprovechamiento para la extracción o utilización de sus principios activos. Empresas alemanas de antioxidantes han puesto a los extractos de plantas en un rango de importancia en su función y su precio. Afirman que a nivel mundial se evidenció un cambio respecto a la identificación de grupos antioxidantes en los alimentos y eso permite hacer algún tipo de recomendación en relación a los alimentos funcionales y los suplementos con mayor concentración de fitocompuestos en forma natural o agregada. Los antioxidantes tienen una gran atracción medicinal porque se asocian a la pre34

MERCADO Y TECNOLOGÍAS DE EXTRACCIÓN

vención de las enfermedades y el mantenimiento de la salud en ciertas condiciones. Sin embargo el perfil de los consumidores es muy fragmentado y existe la necesidad de que la ciencia brinde la plataforma de despegue de las estrategias de comercialización para asegurar una confianza sustentable para un producto en un grupo determinado. En ese aspecto, la comunicación y la información son elementos esenciales para posicionar y diferenciar productos. La legislación apropiada completa el conocimiento sobre las aplicaciones y las dosis recomendadas de cualquier aditivo. Pero en el área de los antioxidantes de origen natural hay ausencia en general sobre este aspecto, a tal punto que la falta de reglamentación de la FDA de USA trae como consecuencia una gran diversidad de productos en el mercado cuyas leyendas en las etiquetas anuncian actividades o propiedades que no poseen y que confunden o descreen al consumidor. Aún con la evolución favorable de aceptación de los antioxidantes y la información sobre sus beneficios, los consumidores no aprecian claramente la diferencia entre las distintas sustancias antioxidantes. Una de las causas es la complejidad del mecanismo de reacción de protección contra los radicales libres y la diversidad de los sistemas donde se dan este tipo de reacciones. Los consumidores tienen un conocimiento general de los antioxidantes comunes y de algunas acciones sobre la salud, como las vitaminas C y E, y el selenio, pero no conocen sobre los nuevos ingredientes como la luteína, el licopeno, los tocotrienoles y los flavonoides. Se necesita entonces un trabajo de información sobre bases científicas para que los antioxidantes sean aceptados para el consumo y de la legislación adecuada que regule la calidad y exija la estandarización de los productos. La otra cuestión importante es la preferencia a consumir lo natural en contraposición a lo sintético. Esto se evidencia en el consumo de la vitamina E natural y sintética, donde la primera creció en preferencia. La actitud se refuerza por el comportamiento de regiones donde la medicina tradicional ha alcanzado un alto grado de aceptación, lo que consolida el uso de sustancias provenientes de fuentes naturales. 35

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Los grandes industriales de las industrias farmacéuticas y de alimentos consideran que el crecimiento del mercado de los antioxidantes requiere de la educación apropiada del consumidor y de investigaciones científicas. La orientación es hacia los beneficios que produce en la salud a modo preventivo.

Mercado mundial Las cifras de consumo y comercialización mundiales de antioxidantes a partir de hierbas, plantas o productos comercializados como antioxidantes, sea para su consumo en formas tradicionales o para su elaboración mediante un proceso a escala de laboratorio o industrial, se encuentran dispersas en aplicaciones de tipo fármaco y en alimentos. Se puede considerar una clase de antioxidantes de origen vegetal que provienen de especias, hierbas culinarias, o plantas de las cuales se han obtenido productos comerciales de aplicación industrial como el caso de la salvia, el romero, el orégano, el té verde, entre otros, y cuyos cultivos están difundidos o promocionados como alternativas de recursos económicos. La otra clase de antioxidantes de origen vegetal incluye las plantas silvestres o medicinales o con biodisponibilidad en algunas regiones del mundo y con alguna información o tradición en su uso por sus propiedades. En relación a los aditivos de alimentos, hay datos de estudios de mercado de los antioxidantes por parte de la empresa Business Communications Company (BCC) de Estados Unidos. Los antioxidantes y preservantes muestran marcado aumento de los productos naturales a pesar de no ser competitivos en precio con los aditivos sintéticos. El tamaño de mercado de ambos tipos de productos es semejante al de colorantes de alimentos con un valor de 321 millones en el 2001 y con un crecimiento esperado en un 3 % para llegar a 372 millones de dólares en 2006. El impulso de ese aumento lo brinda la preferencia del consumidor hacia los aditivos naturales en lugar de los aditivos “químicos” o derivados de síntesis químicas. Los analistas de mercado Frost & Sullivan sin embargo han detectado que los antioxidantes naturales no son abrumadores como esperaron los fabricantes. Los productos sintéticos comparten un 40% del 36

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mercado total por tener menor costo que los antioxidantes naturales, pero la presión del consumidor conduce este segmento a menores porcentajes de mercado. Así se estima que en el 2009 el mercado de USA y Europa crecerá desde los 190 millones de dólares actuales a 240 millones. Los precios de los antioxidantes en Europa caen generalmente por el crecimiento competitivo de mercados asiáticos y occidentales . En Estados unidos los precios de los productos naturales fluctúan en comparación con los sintéticos que permanecen estables. Se estima que los antioxidantes sintéticos se desplazarán a aplicaciones de la industria plástica y de lubricantes mientras que los naturales particularmente derivados de hierbas se desarrollarán para la industria de los alimentos, cosmética y fármacos. Otro criterio para ubicar y analizar la importancia comercial de los antioxidantes derivados de las plantas silvestres es buscar la información disponible del mercado de los fitofármacos. Los fitofármacos son medicamentos obtenidos mediante modernas tecnologías de producción industrial y que contienen un extracto estandarizado de una planta que constituye su componente biológicamente activo. Estos medicamentos se producen en variadas formas tales como tabletas, grageas, cápsulas y líquidos. Según el criterio de expertos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) los medicamentos herbarios o fitomedicamentos se definen como “Productos medicinales acabados y etiquetados cuyos ingredientes activos están formados por partes aéreas o subterráneas de plantas u otro material vegetal, o combinaciones de éstos, en estado bruto o en forma de preparaciones vegetales. Por material vegetal se entienden: jugos, resinas, aceites vegetales y cualquier otra sustancia de naturaleza semejante. Los medicamentos herbarios pueden contener excipiente además de las ingredientes activos. Si el material se combina con sustancias activas definidas desde el punto de vista químico, inclusive constituyentes de plantas aislados y químicamente definidos, no se consideran medicamentos herbarios”. Esta definición brinda una ubicación de los antioxidantes de las plantas en la categoría de fitofármacos con la funcionalidad principal 37

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de la protección de sustratos contra la oxidación. La aplicación como tal puede extenderse a los alimentos y cosméticos.

Situación comercial de los fitofármacos El mercado mundial de plantas medicinales o fitofármacos no está totalmente determinado porque una parte sustancial de la producción no se registra y las estadísticas oficiales de comercio no identifican individualmente las plantas o no separan su uso de otros, tales como perfumes, hierbas culinarias y especias, aceites esenciales, funguicidas y otros. Como ejemplo, el regaliz se usa como expectorante y antiinflamatorio, pero también para saborizar cigarrillos, chocolates, cerveza y pastas dentales, y para estabilizar espumas en extinguidores de fuego. La papaína, del extracto de la papaya, usada para tratamientos de dispepsia, desórdenes gastrointestinales y coagulantes de sangre, se usa también como tiernizante en la industria alimenticia. Datos del IMS (Institute of Medical Statistical) y del Herbal Medical Data Base de 1993 indicaron que en Europa se produjeron los mayores volúmenes de ventas minoristas de medicinas herbarias, por una cantidad de aproximadamente 6 billones de dólares estadounidenses; mientras que en Japón las ventas minoristas alcanzaron 2,1 billones de dólares; 2,3 billones de dólares en el resto de Asia, y aproximadamente 1,5 billones en Norte América. Estas cifras demuestran el volumen de mercado en distintas regiones, con una tendencia general creciente. Hay datos de la velocidad de crecimiento anual de las Ventas de Fitomedicamentos por Región (en porcentaje) como se muestra en la siguiente tabla:

38

Región

Crecimiento 1985-1991

Crecimiento 1991-1992

Proyección 1993-1998

Norteamérica

10

12

12

Unión Europea

10

5

8

Resto de Europa

12

8

12

Japón

18

15

15

Sudeste asiático India y Pakistán

15 12

12 15

12 15

Fuente: Actas del III Simposio Internacional Química de Productos Naturales y sus Aplicaciones, Chile 1996.

MERCADO Y TECNOLOGÍAS DE EXTRACCIÓN

El mercado europeo para suplementos de hierbas se estima sobre 2,7 billones de dólares y para remedios, 0,9 billones. Alemania va a la cabeza, con un crecimiento anual del 4 % en remedios de hierbas y mas rápido en suplementos de hierbas. El mercado norteamericano está alcanzando la saturación con un pico de 6 a 8 billones de dólares en pocos años. Su mercado de suplementos dietario de hierbas se estima en 4 billones con un crecimiento de 6 a 8 % por año. El líder del mercado es Alemania con ventas anuales de 3 billones de dólares estadounidenses y con una cobertura del 50 % del mercado europeo. El gasto promedio en fitomedicinas por habitante es de 37 dólares anuales. Francia sigue a Alemania con US$1,6 billones de dólares y el 26,5 % del mercado europeo. A continuación siguen Italia, Gran Bretaña, España, Holanda y Bélgica. El gasto de fitomedicinas por habitante europeo se aprecia en la siguiente tabla: Total en millones

%

Gasto anual per cápita U$S

Alemania

3000

50

37

Francia

1600

26,5

28

Italia

600

10

10,5

País miembro

Reino Unido

300

5

5

España

230

4

6

Holanda

100

1,5

6,5

Bélgica

40

1

4

Resto

130

2

4,5

Total

6000

100

17,4

Este comportamiento en el consumo y en las ventas de las fitomedicinas se detecta en el registro de las fitomedicinas. Alemania designó una comisión especial del Bundesgesundheitsamt (la versión alemana del FDA (Food and Drug Administration)) dedicadas a realizar monografías sobre plantas, con más de 230 publicadas en el Bundesanzeiger, organismo de registros alemán. Francia obtuvo una 39

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lista con 200 plantas y 37 indicaciones de sus usos tradicionales. En ambos casos muchas fitomedicinas están subsidiadas. En general, los organismos gubernamentales del área de la salud de Alemania, Francia e Italia han regulado el consumo de estos productos con compensaciones por los sistemas de seguro de salud. En cambio Gran Bretaña y Holanda han considerado a las fitomedicinas como suplementos dietarios sin ninguna argumentación medicinal. Con el advenimiento de la Unión Europea surgió la necesidad de unificar las reglamentaciones vigentes en sus países miembros sobre el uso de las hierbas medicinales y los fitofármacos en tratamientos de la salud. La European Scientific Cooperative for Phytotherapy (ESCOP) realiza resúmenes de las características de los productos (SPC), que deberían ser usadas como base para los registros europeos de las fitomedicinas. A la par de los registros nacionales de cada país miembro de la Comunidad Europea existe un registro descentralizado desde 1995. Si un estado miembro registra una droga, solicita el reconocimiento a otros miembros, con un tiempo de 90 días de espera. Si no hay acuerdo, la Agencia Central de la UE (Committee for Proprietary Medicinal Products, CPMP) tiene que encontrar una decisión que una a todos los estados miembros. Con esta organización se observa una tendencia importante en el consumo de productos naturales debido a la preocupación ambiental. Las drogas alternativas biológicas “naturales” cobran importancia en los pacientes. Las fitomedicinas pueden ser consideradas como el vínculo entre las drogas convencionales con alta tecnología y las medicinas tradicionales. La aceptación se da mayoritariamente en Europa y en Asia. En Estados Unidos ambas medicinas se ven como contradictorias y los organismos de legislación como la Dietary Supplement Health and Education Act (DSHEA), creada en 1994, trata el consumo de los fitofármacos como suplementos dietarios. Esto revela la limitación principal de uso de las hierbas como drogas o productos terapéuticos porque se deben administrar sólo como suplemento dietario (alimento), aunque en la etiqueta se puede incluir una recomendación y una 40

MERCADO Y TECNOLOGÍAS DE EXTRACCIÓN

explicación de la relación entre el nutriente o alimento y una condición de salud o enfermedad específica. La FDA considera que si las hierbas se usan para sabor, aroma o valor nutritivo deben considerarse alimentos, mientras que si se venden para propósitos de salud, son drogas. Por esta razón las empresas deben comercializar en USA sus fitofármacos como suplementos dietarios bajo los términos de la DSHEA. A pesar que en los últimos años en Estados Unidos aumentó el consumo de los productos derivados de plantas medicinales, convirtiéndose en uno de los segmentos de mayor crecimiento de ventas en comercios minoristas, no es posible controlar los canales de venta y distribución por su diversidad, con lo cual no hay precisión del tamaño del mercado de los productos herbarios medicinales. Algunos datos muestran que en general se ha advertido un incremento en las ventas por un valor de $441,5 millones en 1997, con un incremento del 79,5 % respecto a 1996 (Glovsky, 1998).

Tendencias y futuro de los antioxidantes derivados de plantas Las investigaciones recientes sobre el conocimiento de las propiedades de algunas plantas son un factor de aceleramiento del desarrollo de nuevos suplementos y medicinas. En este aspecto los antioxidantes tienen un potencial importante y una amplia e insatisfecha demanda en el mercado. En relación a la metodología de ingreso al mercado de los fármacos, donde los ensayos tienen costos millonarios en dólares, los antioxidantes de origen natural pueden ser sus alternativas rentables atractivas porque vinculan aspectos de las medicinas tradicionales con la medicina alopática moderna. La falta de conocimiento general dentro del mercado mundial acerca del rango completo de medicinas tradicionales disponibles, entre las que se incluye la de los antioxidantes, hace que el consumo de estos productos aún no esté desarrollado significativamente. En la medida que se avance en la investigación se prevee un aumento de la demanda, siempre teniendo en cuenta la seguridad del consumidor. 41

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Se estima que la demanda de hierbas medicinales aumentará como fuente de agentes terapéuticos y como materia prima básica para la extracción de compuestos químicos empleados en cosméticos, perfumes y alimentos. Como se describió anteriormente, hay muchos avances científicos sobre actividad antioxidante de extractos de hierbas y sustancias aisladas de los mismos que orientan los esfuerzos hacia productos de comercialización masiva para la industria y para el consumo humano. Tal es el caso de hierbas con tradición culinaria como el orégano, la salvia y el romero cuyos principios activos antioxidantes se debe a los ácidos carnósico y rosmarínico y sus derivados. Varias empresas disponen de productos comerciales con diferentes precios y presentaciones (extractos, compuestos aislados, líquidos, en polvo, etc.) y aplicaciones para alimentos y cosméticos. El parcial conocimiento científico sobre el amplio rango de plantas hace necesaria la exploración de la producción sustentable comercialmente. En este aspecto cabe destacar que el interés global en plantas medicinales ha creado un sostenido y amplio mercado no oficial en estos productos, recogidos en forma irregular con cosechas indiscriminadas de variedades silvestres con serios daños a la biodiversidad. En la mayoría de los casos, la fuentes vegetales de sustancias antioxidantes y farmacológicas en general provienen de países en vías de desarrollo, con riqueza en recursos naturales, pero con una posición poco favorable en el área comercial, debido a la baja prioridad en las inversiones nacionales, investigación y desarrollo de exportación por el desconocimiento del valor comercial de los productos. El ingreso a los mercados europeos debe superar algunos obstáculos como la disponibilidad de dinero y facilidades de investigación y desarrollo para la aceptación de los productos. Los países proveedores de materias primas para la obtención de productos naturales, entre ellos los antioxidantes, disponen de tecnologías precarias para la recolección y almacenamiento inadecuado de los productos. La falta de sistemas de medición, de estándares, de inspección y control de calidad requerido por los exportadores hace que los productos se 42

MERCADO Y TECNOLOGÍAS DE EXTRACCIÓN

alejen de los estándares de higiene, especificación y calidad y sus precios sean bajos y poco atractivos. Tampoco se conoce el verdadero destino industrial o de consumo de las plantas no cultivadas y el aseguramiento de la provisión es desconocido. Las perspectivas y proyecciones de cultivos son parciales y en general se carece de recursos y capacidad institucional para recomendar sobre políticas y mecanismos que suministren consistentemente productos de alta calidad. El know-how en tecnologías de procesamiento es deficiente, tanto como la disponibilidad de procesos de producción sustentables. Los países en desarrollo tienen oportunidades de expandir sus exportaciones globales en plantas para la obtención de antioxidantes o de los productos extraídos con procesos tecnológicos adecuados. La atención en la comercialización no debe centrarse únicamente al consumo humano en las formas descriptas en este trabajo. La aplicación en la industria de los plásticos, papeles y polímeros en general es importante y con menos restricciones de uso en relación a las reglamentaciones según sea su destino.

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Tecnología de extracción El desarrollo de un proceso de extracción de antioxidantes consiste en una serie de etapas que comienzan con la idea de elaborar un producto hasta su inserción en el mercado. En el presente proyecto se ha comenzado con la identificación de plantas con contenido en antioxidantes y sus pruebas de efectividad en la antioxidación y toxicidad para el consumo humano. Seleccionadas las plantas de interés con comprobados efectos antioxidantes e investigada su biodisponibilidad y el mercado potencial o concreto de productos, sigue la etapa de investigación y desarrollo de los procesos extractivos y la búsqueda de las condiciones de mayor rendimiento de extracción y/o de selectividad de los antioxidantes. Este tipo de tareas son importantes para completar la información sobre propiedades de las sustancia de interés y su relación con las condiciones operativas del proceso de extracción, y orientar al procedimiento de obtención del producto, con datos confiables porque de lo contrario se correría el riesgo de 44

MERCADO Y TECNOLOGÍAS DE EXTRACCIÓN

continuar con desarrollos largos y costosos que finalmente deberán desecharse o abandonarse. Estas actividades son las que generalmente se llevan a cabo en los proyectos de CYTED siguiendo con el estudio de algunas etapas de desarrollo con un análisis preliminar de factibilidad técnica y económica del proceso que justifiquen continuar hacia la búsqueda de un proyecto rentable. En este capítulo se hace una breve descripción de algunos aspectos importantes en los procesos extractivos y de las tecnologías más comunes y factibles de implementar.

Procesos de extracción Los compuestos antioxidantes se extraen de material vegetal mediante una serie de procesos según la especificación del producto final, dependiendo si se trata de un extracto o si se purifica el compuesto hasta su aislamiento total. En estas especificaciones siempre se debe considerar la seguridad del producto mediante análisis y pruebas de toxicidad porque la procedencia a partir de un material natural no siempre es seguro para el consumo humano en sus distintas formas. El proceso general de extracción de antioxidantes tiene las siguientes etapas, comunes a otros procesos extractivos de oleorresinas y fitofármacos: 1. Recolección, acondicionamiento y almacenamiento del material vegetal. 2. Molienda. 3. Extracción con solvente. 4. Filtración y tratamiento del material residual. 5. Eliminación y recuperación del solvente. 6. Purificación y cristalización (puede o no incluirse según el tipo de producto buscado). 7. Estandarización o acondicionamiento del producto final. La extracción de antioxidantes a partir de material vegetal se hace con hojas, raíces, semillas y diferentes partes de la estructura de las plantas que contengan las sustancias de interés. El rendimiento del 45

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proceso depende también de la madurez, la procedencia, los factores ambientales, el tiempo y el modo de la recolección y el almacenamiento de la materia prima vegetal. En las plantas se han encontrado numerosos compuestos antioxidantes que pertenecen a la familia de los polifenoles. Estos tienen una alta eficiencia en su función de protección contra la oxidación en la mayoría de los casos, potenciada en general por otros compuestos que actúan como agentes sinergísticos y mediante una serie de mecanismos de reacción entre ellos favorecen la acción de antioxidación. La cosecha, recolección y almacenamiento del material vegetal requieren de un manejo cuidadoso y de un acondicionamiento para proteger los principios activos. El corte de las plantas implica una pérdida de agua y cambios en la composición de las mismas. Para reducir el deterioro de la materia prima es necesario secar inmediatamente las partes vegetales a ser procesadas y almacenarlas en ambientes controlados en humedad y temperatura. La trituración o molienda del material vegetal favorece el rendimiento de extracción porque las sustancias quedan expuestas a la acción del solvente. En consecuencia, el tamaño de partícula es uno de los factores de interés en la búsqueda de las condiciones operativas óptimas. El tamaño de partículas obtenidos en la molienda puede clasificarse mediante el tamizado con mallas de tamaños estándares. Las partículas se clasifican en un rango de tamaños entre 50 milímetros y 50 micrones. La obtención de tamaños de partículas uniforme es favorable al rendimiento de extracción, como también el tamaño. En el caso de las partículas más pequeñas se pueden obtener mayores rendimientos pero los finos pueden traer inconvenientes en los procesos posteriores. Para reducir el tamaño de partículas hay distintos métodos: por fricción, por presión, por impacto o por corte. Cuando se aplican enzimas para provocar una mayor ruptura de las paredes celulares del material vegetal se mejora el rendimiento. Esto se debe generalmente a la acción de las enzimas pectinasas y celulasas. En el caso de la obtención de los fitofármacos y de los aceites esenciales suele hacerse la trituración con molinos criogénicos para evitar el deterioro o pérdida de los compuestos con alta volatilidad, 46

MERCADO Y TECNOLOGÍAS DE EXTRACCIÓN

usando sustancias criogénicas como el nitrógeno líquido y el dióxido de carbono líquido. Este tipo de operaciones es aplicable a los antioxidantes según estudios previos de comportamientos. Los antioxidantes se obtienen mediante una extracción sólido - líquido de las partes de las plantas trituradas con solventes. La sustancia de interés contenida el tejido vegetal triturado se disuelve en el solvente y se difunde hacia el volumen líquido desprendiéndose del material vegetal. El proceso se detiene cuando se llega a la concentración de equilibrio, momento en que se alcanza la diferencia mínima en el contenido del antioxidante en la fase solvente y en la fase sólida del material vegetal. El punto de equilibrio está determinado por el tipo de antioxidante, la cantidad, el grado de humedad y de trituración, el tipo de solvente y la cantidad o relación sólido/líquido. Otra de las variables que influyen en la extracción por solventes es el pH. En el caso de los polifenoles se han detectados variaciones en los rendimientos con pH alcalinos como favorables al proceso en algunos casos. La temperatura afecta al rendimiento de extracción de cualquier compuesto antioxidante en las etapas de secado del material vegetal y en la extracción. En el primer caso la temperatura actúa en la degradación enzimática y en la estabilidad química. Esta también se ve comprometida en la extracción y en el almacenamiento del producto final. En los compuestos polifenólicos se han comprobado distintos mecanismos que producen otros compuestos de la familia del principio activo antioxidante, algunos con las mismas propiedades y otros sin actividad antioxidativa. El método convencional de extracción con solventes requiere de una serie de ensayos con distintos solventes para seleccionar aquel que extrae la fracción de principios activos de interés con mayor rendimiento. Estos ensayos se complementan con determinaciones analíticas cromatográficas y espectrométricas para establecer los constituyentes, en este caso, de la fracción antioxidantes. Los principios activos pueden ser sustancias solubles en solventes orgánicos como hidrocarburos alifáticos, aromáticos o clorados, alcoholes, cetonas, ácidos carboxílicos, ésteres, éteres y también pueden 47

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ser solubles en solventes inorgánicos como el agua y el dióxido de carbono. En general los procesos extractivos usan solventes polares volátiles con los que, luego de evaporarlos, se logra una alta concentración final de antioxidantes. Se debe tener precaución en la elección del solvente porque hay una dependencia importante en el rendimiento y la actividad antioxidante del extracto por la polaridad de los componentes. También las legislaciones de los países han restringido la cantidad de solvente residual permitido en los productos finales y en algunos casos directamente han prohibido el uso de algunos de ellos, en especial los clorados. Los solventes usados por su disponibilidad y costo son el agua y el etanol. Juega aquí también el tratamiento posterior en relación al medio ambiente y a la reutilización en la extracción. Los solventes no polares como etil acetato y dietil éter tienen una acción de alta selectividad para la extracción de polifenoles y los productos obtenidos tienen mayor poder antioxidante que si se los extrajera con metanol, etanol, butanol, propanol, isopropanol o sus mezclas. Otros solventes pertenecientes a la familia de los hidrocarburos clorados como el cloroformo, el diclorometano, el tetracloruro de carbono o sus mezclas suelen usarse con diferentes rendimientos para cada tipo de sustancia antioxidante. Otro método de extracción por solventes utiliza aceites neutros que, además de disolver o capturar los antioxidantes del material vegetal, no necesitan separarse en el producto final, esto es son soportes de los principios activos del antioxidante. Algunas oleorresinas comerciales de romero, salvia y orégano utilizan el MCT u otros de los aceites mencionados como solventes y a la vez soportes de los principios activos antioxidantes y sus aplicaciones se orientan a alimentos cárnicos y cereales. Los aceites neutros generalmente son triglicéridos de cadena media (Medium Chain Triglycerides (MCT)), con cadenas de diez a 12 átomos de carbono. También se usan aceites de almendra, de sésamo, de maiz y de maní. En estos casos se debe considerar que este tipo de solventes no confieran fuerte olor y sabor al producto, no se enrancien y no se tornen turbios. 48

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El método de extracción de antioxidantes de plantas con fluidos supercríticos se lleva a cabo en condiciones de temperatura y presión de un solvente superiores al punto crítico del mismo. El solvente más usado en esta extracción es el dióxido de carbono. También se usan el agua, el etano, el eteno, el propano, el xenón y el óxido nitroso. Los fluidos en estado supercrítico tienen gran poder disolvente y penetración en sólidos, con buen y rápido rendimiento de extracción. Los extractos se separan del solvente mediante cambios en las condiciones de presión o temperatura del fluido. El proceso tiene cuatro etapas: extracción a alta presión, expansión mediante una válvula reductora, separación con un separador de baja presión y compresión del solvente a través de una bomba para poder reciclarlo en el proceso. El sólido triturado se carga en el extractor. Luego de cerrado el equipo se ingresa el dióxido de carbono con una presión de 100 a 400 bar y temperaturas entre 30 a 60 grados centígrados obtenidas por el pasaje previo del gas en un intercambiador de calor. La salida del gas con los componentes extraídos del material vegetal se hace a un separador a través de una válvula de reducción donde la presión alcanzada ronda entre los 50 y 150 bar. En esas condiciones el extracto precipita y el gas sigue curso hacia un enfriamiento y compresión y vuelve al proceso. El extracto puede separarse en forma seleccionada controlando las condiciones operativas del proceso y utilizando más de un separador según las solubilidades de las sustancias y la especificación del producto buscado. El dióxido de carbono puede ser mezclado con otro fluido para hacer una extracción más selectiva. El método reviste una alta eficiencia de extracción porque, además de un buen rendimiento obtenido hasta agotar el material vegetal de los principios activos antioxidantes, las condiciones del proceso son favorables para conservar las propiedades de las sustancias extraídas y minimizar su degradación, dadas por las bajas temperaturas, el contacto con un solvente inerte y los mínimos procesos posteriores para obtener el producto final. La versatilidad de este método ayuda a realizar extracciones selectivas de sustancias presentes en el extracto modificando las condiciones operativas. Pero este aspecto demanda 49

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

de ensayos experimentales para la búsqueda de dichas condiciones en sus puntos óptimos. Las temperaturas de extracción moderadas protegen a los componentes de la degradación térmica. El producto queda despojado de solvente y de contaminantes biológicos con lo cual prolonga su vida útil. Este es el aspecto de mayor valor para el consumo humano porque es un producto inocuo sin trazas de solventes ni de otro tipo de contaminantes perjudiciales para la salud. A su vez el proceso permite usar mezclas de solventes de extracción supercríticas, y gobernar las variables del proceso para obtener el mejor rendimiento. También no genera contaminantes peligrosos para el medio ambiente y se trabaja en general con equipos altamente automatizados dadas las condiciones de trabajo. La extracción por solvente en condiciones normales tiene un costo moderado en equipamiento y servicios. Se extraen un número importante de sustancias para lo cual se requiere de separaciones selectivas si se quiere aislar un principio activo o sustancia deseadas. Este sería el principal costo. A su vez, las reglamentaciones exigen mínimos e insignificantes residuos de solventes lo cual incrementa los costos en la recuperación. En el caso de la extracción por fluidos supercríticos los equipos deben soportar el rango de altas presiones de trabajo con lo cual el material, el diseño, los equipos auxiliares y el control de los dispositivos son aspectos claves para la seguridad y el funcionamiento del equipo. A los costos de equipamiento se le suman los de consumo de energía para las etapas del proceso lo cual convierte a este ítem en un elemento clave. La extracción con fluidos supercríticos es apta para plantas de extracción de varios productos, para lo cual se requiere de ensayos previos para buscar las condiciones de operación óptimas y los datos de equilibrio para conocer la distribución del componente en las distintas fases y determinar la composición del producto extraído para cualquier composición de la mezcla inicial. Este tipo de extracción se utiliza para la obtención de aceites esenciales destinados a perfumería, esencias de especias y oleoresinas, fármacos naturales, colorantes, té y café descafeinados, etc. 50

MERCADO Y TECNOLOGÍAS DE EXTRACCIÓN

Optimización del proceso de extracción Cualquiera sea el método de extracción por solvente, para que el proceso sea competitivo a escala industrial, se deben optimizar los costos operativos e inversión en equipamiento. Para ello es importante disponer de un modelo para el proceso de extracción utilizado que relacione las variables de proceso con los componentes del costo. El modelo mencionado se construye a partir de las ecuaciones de balance y equilibrio que describen al sistema, incluyendo los parámetros de cada uno de los procesos tales como volumen de los extractores, velocidad o tiempos de alcance del estado de equilibrio, relación sólido/solvente, tamaño de partículas sólidas, temperatura, etc. Se relacionan luego los costos como costo de solvente por volumen del extractor, gastos de funcionamiento de cada equipo, etc. Tabla: implementación del modelo en planilla de cálculo VARIABLES DE OPTIMIZACION

CAPACIDAD DE PRODUCCION

Tiempo de prensado [minutos]

70

Q [kg/año]

1000

Presión de prensado [kg/cm2]

40

H [hr/año]

3500

Relación MCT/romero [litros/kg]

0.3

VARIABLES DEL PROCESO Lotes de AC B [kg AC] =

COSTOS DE PRODUCCION [$/año] 0.38095238

Prensa

112434.079

Concentración MCTx[grAC/ml] =

0.07669947

Romero

140229.916

MCT retenido a t infinito =

0.02763587

MCT

188805.559

Avance del prensado =

0.85340868

Lotes de romero F [kg] =

21.3683681

Suma parcial

441469.553

Tamaño de la prensa m2 =

1.03636585

A partir de un listado inicial de variables de proceso sospechadas de tener un impacto sobre el diseño del proceso de extracción se debe realizar un primer diseño de experiencias destinado a caracterizar la influencia de cada una. Las variables comunes a todos los procesos se dan por la relación sólido/solvente, grado de 51

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humedad de las muestras, tamaño de las partículas del sólido, solubilidad del sólido en el solvente seleccionado, tiempo de alcance del equilibrio, entre otras. Algunas sustancias extraíbles pueden tener ciertas características particulares que deben considerarse junto con el grupo anterior. Con los resultados obtenidos se pueden determinar cotas operativas para las variables que establecen una relación de compromiso entre componentes del costo del proceso industrial. A modo de ejemplo, un proceso de extracción de antioxidantes de romero (ácido carnósico (AC)) con solventes no volátiles o aceites neutros mencionados anteriormente (MCT) por presión hidráulica se modeló con las ecuaciones de balance y equilibrio del sistema. Las variables de optimización seleccionadas fueron el tiempo de prensado la presión de prensado y la relación MCT/romero. Se consideró un objetivo de producción Q = 1000 kg por año de ácido carnósico con H = 3500 hr de producción por año, que corresponde a 2 turnos diarios. Esta producción correspondería a un volumen de ventas de 1.000.000 $/año considerando que el precio del producto está determinado por su actividad antioxidante, por ejemplo 40 $/kg para un producto con 4% de AC u 80 $/kg para un 8% de AC (el agente extractivo y soporte MCT es un insumo cuyo valor no se recupera en el precio del producto porque no se reutiliza en el proceso de extracción ya que forma parte del producto final). Se determinó el tamaño de los lotes a producir, la concentración del producto X por balance de materia considerando el estado de equilibrio, el volumen de solvente retenido en el sólido, el grado de avance del prensado, el tamaño de la prensa, el costo anual de la operación de prensado y de los insumos romero y MCT. Se obtuvieron nueve ecuaciones representativas del sistema y se implementaron en Microsoft Excel para su optimización, como se muestra en la tabla con los valores óptimos de las variables T, P, R. Considérese que a la suma parcial de los costos considerados deberán adicionarse los de molienda, mezclado, envasado, mano de obra, gastos fijos, etc., y que el valor estimado de ventas es de un millón de 52

MERCADO Y TECNOLOGÍAS DE EXTRACCIÓN

pesos anuales, de manera que optimizar este importante componente del costo (aproximadamente 50 %), es crucial para la viabilidad económica del proceso. Esto vale tanto para la etapa de desarrollo como para un proceso en producción, por cuanto ante una variación en los precios de los insumos, será importante readaptar el valor de las variables (en este caso para cada tipo de capacidad de prensa), para trabajar en las condiciones que optimicen económicamente la producción. El efecto de económico de cada variable del proceso se resume en los siguiente: • incrementando T aumenta el tamaño de los lotes (se deben procesar menos lotes más grandes) con lo que aumenta el tamaño y por tanto el costo de la prensa. Pero a su vez se incrementa el avance del prensado con lo que se consumen menos romero y MCT. Ambos efectos se compensan alrededor de un tiempo de prensado T = 70 minutos. • el tamaño de lotes de AC y avance del prensado se mantienen constantes (dependen del tiempo de prensado), lo mismo ocurre con la concentración de AC en el producto, que depende de R. Al aumentar la presión se reduce el contenido de MCT en el sólido a tiempo infinito y conduce a extraer más producto: se reduce el tamaño de los lotes de romero y por tanto el costo en romero y MCT. El tamaño de la prensa también disminuye monotonónicamente, esto es, la tendencia de la respuesta disminuye o aumenta siempre en los rangos considerados y no hay puntos óptimos intermedios. Sin embargo el incremento de la presión de diseño ocasiona un sostenido incremento en el costo de la prensa. Los efectos se compensan con un óptimo alrededor de una presión de prensado P = 40 kg/cm2 • al incrementar la relación romero/MCT se incrementa el costo directo en MCT, sin embargo la cantidad de AC extraído se incrementa con lo que se requieren lotes cada vez menores de romero. Esto se traduce en una disminución constante de los costos por el consumo de romero y una reducción también monotónica del tamaño y costo de la prensa. Estos efectos se compensan alrededor de una relación óptima R = 0.3. 53

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El trabajo descrito ilustra un estudio orientado a la búsqueda de las alternativas más favorables del proceso aprovechando experiencias a escala de laboratorio y utilizando modelos del proceso y su simulación. Se destaca la importancia de la realización de ensayos preliminares, bajo un diseño organizado para obtener la mayor información con el mínimo costo en dinero y tiempo. Estos resultados resultan de utilidad para las etapas siguientes del desarrollo del proyecto a escala industrial que se describen a continuación: 1. Especificaciones de productos. Métodos analíticos de las propiedades. Especificación y suministro de materias primas. 2. Información del mercado del producto y formas de comercialización, y los precios de las materias primas e insumos para estimar el precio del producto y el volumen de producción. 3. Información general del proyecto con temáticas de localización, infraestructura, disponibilidad de servicios, sistemas de transporte, para la instalación de una empresa. 4. Determinación de la capacidad de producción. Descripción del proceso general y búsqueda de alternativas mediante la realización de balances de materia y energía para seleccionar equipos y servicios auxiliares. 5. Análisis de rentabilidad con el estudio de las inversiones requeridas, costos de producción y estimación de beneficios y rentabilidad. 6. Evaluación técnica y económica para determinar las condiciones de factibilidad del proyecto. La realización de este conjunto de etapas se hace en forma iterativa, ya que puede ser necesario profundizar en detalles del mercado, de los equipamientos y de otros elementos para hacer los ajustes necesarios y buscar el proceso de mayor rentabilidad para la producción a escala comercial de los productos antioxidantes. Estos son los aspectos que necesita abordar el proyecto de antioxidantes de origen natural de CYTED conducentes a la evaluación de los procesos de extracción de los productos finales a nivel de ingeniería de procesos.

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Bibliografía Aeschbach R, Bachler R, Rossi P, Sandoz L and Wille HJ (1993): Nestlé Research Centre, Switzerland. Oils and Fats Internationals, 9(2), 18-22. Hudson B (1994): Food Antioxidants. Elsevier Applied Science. Douglas JM (1988): Conceptual Design of Chemical Process, Mc Graw-Hill, New York. Moure A, Cruz J, Franco D, Domínguez M, Sineiro J, Domínguez H, Núñez M and Parajó C (2001): Natural Antioxidant from Residual Sources. Food Chem 72, 145-171. Tymoschuk AR, Mato RO e Iribarren OA (1998): Modelo para escalar extracciones sólido-líquido por Prensado. Jornadas Argentinas de Química Fina, Santa Fe, julio 1-3. Tymoschuk AR, Mato RO and Luna J (1999): Obtention of Rosemary Antioxidant Oleoresins by Extraction under Pressure. Acta Horticulturae, 503, 45-51. List P and Schmidt P (1989): Phytopharmaceutical Technology, CRC Press.

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LA AUTOXIDACIÓN Y LA RANCIDEZ. Teoría Alfredo Rosas Romero [email protected]

LA AUTOXIDACIÓN Y LA RANCIDEZ OXIDATIVA. Teoría Alfredo Rosas Romero [email protected] Universidad Simón Bolívar. Departamento de Química. Apartado 89000 Caracas 1080A. Venezuela

Introducción Por autoxidación designamos la reacción del oxígeno que conlleva la degradación oxidativa de ciertas substancias orgánicas, en general de las grasas y los aceites, y en particular de los lípidos insaturados. Asimismo, llamamos rancidez oxidativa a las consecuencias de la autoxidación, esto es a la acumulación de productos secundarios causantes de malos olores y sabores que nos inducen a rechazar el producto. Eventualmente estas reacciones disminuyen la calidad nutricional del alimento y finalmente lo pueden tornar tóxico. El mismo criterio lo aplicamos a cualquier otro producto que posea una fracción grasa oxidable, como es el caso de las pinturas, los cosméticos, los lubricantes, entre otros ejemplos, que por autoxidación son propensos a enranciar, con la consiguiente pérdida de calidad.

El mecanismo El mecanismo de la autoxidación es una reacción en cadena propagada por radicales libres:

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Iniciación Es aquí donde, a partir del sustrato oxidable, se producen los primeros radicales libres. Una amplia variedad de factores afectan la velocidad de este paso, de los cuales, uno de los más importantes es la presencia de trazas de metales pesados: RH + M+n

R• + H+ + M+ (n-1)

Otro factor es la reacción con el oxígeno singulete, formado por reacciones fotoquímicas de la molécula de oxígeno en su estado fundamental (triplete) en la presencia de un sensibilizador:

Donde 1 S : 1 * S : 3 * S : 3 O2 : : 1 O2* :

Estado singulete del sensibilizador Estado singulete excitado del sensibilizador Estado triplete excitado del sensibilizador Oxígeno en estado triplete normal Estado singulete excitado

hν :

Fotones UV

En general, podemos hablar de la iniciación como la reacción del sustrato con una especie iniciadora, In, que puede ser generado foto60

LA AUTOXIDACIÓN Y LA RANCIDEZ. TEORÍA

química, radiolítica o térmicamente, o por la acción de otros radicales libres originalmente presentes - o generados - en el medio. RH + In

R. + InH

Como se ve, la reacción de iniciación será acelerada por la acción de la luz y por la de compuestos que generen radicales libres; por lo que será inhibida al proteger los sustratos oxidables de la acción de la luz y por compuestos que reaccionen con los radicales libres para formar productos que sean estables. En las primeras etapas, la velocidad de la autoxidación -normalmente lenta- está determinada por la tasa de iniciación, la cual describimos cinéticamente como: ri = ki [In] Por su representatividad, usaremos el ácido linoleico como ejemplo para ilustrar el mecanismo de la autoxidación. Así los primeros radicales libres son generados durante la iniciación por ataque al alfametileno activado por los dos dobles enlaces vecinos. Este radical libre se presenta bajo las tres posibles estructuras:

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Propagación

El primer paso de la propagación es dependiente de la presión parcial de oxígeno en el medio. Es aquí donde se generan los prime62

LA AUTOXIDACIÓN Y LA RANCIDEZ. TEORÍA

ros radicales peroxilos. La molécula de oxígeno se adiciona al radical y produce una típica isomerización cis-trans. En el segundo paso de la propagación, que ya no depende de la presencia del oxígeno, el radical peroxilo reacciona con otra molécula del linoleico para generar los hidroperóxidos isoméricos, y un nuevo radical libre del ácido graso que entrará en la cadena de propagación. Como es de esperarse, la formación de los hidroperóxidos conjugados está favorecido por lo que constituyen el 90% de los hidroperóxidos que se forman. Los sustratos monosaturados, aun a 50 °C, reaccionan muy lentamente. Y los saturados no reaccionan en esas condiciones sino que se comportan como sustratos inertes.

Fase monomolecular Al comienzo la autoxidación está regulada por la descomposición monomolecular de los hidroperóxidos formados durante la propagación. Esta reacción es lenta porque los hidroperóxidos no se acumulan todavía en concentraciones apreciables, por lo cual aun no se establece la rancidez y el producto es estable. ROOH

RO. + HO.

La duración de esta etapa determina la vida de mercado del producto; relacionada con el período de inducción, el cual es un valor empírico que definimos como el tiempo necesario para alcanzar la oxidación del primer 1% del sustrato. Al sobrepasar este punto, y establecerse la reacción de propagación en cadena, ya la estabilidad del producto se verá seriamente reducida, lo que significa que la estabilización el producto por la acción de los compuestos antioxidantes debe realizarse durante esta fase monomolecular.

Fase bimolecular Cuando la concentración de hidroperóxidos ha alcanzado una concentración suficientemente alta, la descomposición de los hidroperóxidos cambia a un mecanismo mucho más eficiente, el bimolecular. 63

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

2ROOH

RO. + ROO. + H2O

A partir de este punto la acción de los antioxidantes es muy poco efectiva. El drástico incremento en la velocidad de la autoxidación conduce rápidamente a la rancidez y a la pérdida del valor comercial del producto.

Terminación Este paso involucra la interrupción de la reacción en cadena porque a partir de los radicales libres se forman compuestos estables que ni inician la reacción ni la propagan, con lo cual se interrumpe la cadena. La reacción más probable en la terminación dependerá de la abundancia relativa de las diferentes radicales libres en la reacción. Después de la fase monomolecular, el paso más probable será la reacción entre dos radicales peróxidos (RO2.). R. + R. RO2.+ R. RO2. + RO2.

Productos que no inician ni propagan la reacción

Formación de productos secundarios La rancidez es consecuencia de los olores y sabores desagradables que se acumulan debido a la formación de una amplia variedad de productos secundarios volátiles, durante los pasos de propagación y terminación de la autoxidación. La siguiente figura ilustra la formación de productos secundarios durante las reacciones de propagación. En el paso A se genera el altamente reactivo radical peróxido. Las reacciones B y D representan el clivaje de los radicales peróxidos para dar origen a: aldehídos insaturados, alcanos, ácidos grasos de cadenas más cortas y aldehídos saturados. La reacción C explica la interacción entre un radical peróxido y una molécula fresca del sustrato (un ácido graso en este ejemplo) para formar un alcohol secundario insaturado.

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LA AUTOXIDACIÓN Y LA RANCIDEZ. TEORÍA

Nótese que en todas estas reacciones se genera un nuevo radical del ácido graso libre, el cual se encargará de continuar la reacción de propagación de manera autocatalítica.

Mediante las reacciones de terminación se produce una amplia gama de compuestos secundarios volátiles que también contribuyen al enranciamiento. Abajo ilustramos los posibles mecanismos para explicar la generación de cetonas insaturadas, alcoholes, ésteres, peróxidos, polímeros y epóxidos. El siguiente mecanismo explica la formación de aldehídos de cadena corta de tamaño variable, de dialdehídos y polímeros carbonocarbono y oxígeno-oxígeno. Nótese que la consecuencia de las reacciones de terminación es la eliminación de dos radicales libres en cada paso y la formación de compuestos secundarios estables que no participan en la autoxidación, aunque sí en la rancidez.

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Consecuencias de la autoxidación En alimentos lo más importante son los olores y sabores desagradable que llevan al rechazo del producto. En otros casos lo más relevan66

LA AUTOXIDACIÓN Y LA RANCIDEZ. TEORÍA

te podría ser el daño a las proteínas, la destrucción de las membranas celulares, la descomposición de las vitaminas, en particular de las vitaminas C y E; el daño oxidativo al ADN, la perdida de las propiedades físicas de las pinturas, gomas, plásticos, cauchos y lubricantes o de la estabilidad de los cosméticos o de los fármacos. En productos terminados, el estudio de la autoxidación se hace mucho más complicado que lo que hemos expuesto por la participación de diferentes componentes del producto como los carbohidratos, las proteínas, los antioxidantes naturales, los amino ácidos libres, los metales y demás prooxidantes; y de las condiciones físicas del medio tales como la actividad del agua, el pH, el estado de agregación del producto, la temperatura y la disponibilidad del oxígeno. Agregando, finalmente, que los efectos de estos factores generalmente están íntimamente interrelacionados.

Modelo cinético de la autoxidación

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De acuerdo con el mecanismo aceptado para la autoxidación:

Donde In : Iniciador ri : Velocidad de iniciación ki : Constante de velocidad de iniciación ko : Constante de velocidad del paso que depende del oxígeno kp : Constante de velocidad de propagación kt kt’ Constantes de velocidad de terminación kt’’ La reacción procede de acuerdo con la siguiente ley de velocidades:

(1)

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LA AUTOXIDACIÓN Y LA RANCIDEZ. TEORÍA

donde velocidad de absorción de oxígeno

velocidad de formación de hidroperóxido k, k’ : ri : [RH]: [O2] :

Constante de velocidad Velocidad de iniciación Concentración del sustrato Concentración de oxígeno

Aceptemos que la reacción puede ser tratada de acuerdo a la aproximación de Boldstein del Estado Estacionario, o sea, que en el estado estacionario la tasa de cambio de las concentraciones de cada tipo de radical es aproximadamente cero una vez que el mecanismo de la reacción se haya instaurado:

Cuando el oxígeno no es limitante, podemos aceptar que inicialmente todo el oxigeno consumido formará hidroperóxidos. Y supongamos también que la mayoría o todos los radicales formados estarán bajo la forma de radicales hidroperóxidos (ROO.), por lo cual la terminación será debida a la reacción entre dos de estos radicales. Entonces la ecuación (1) se convierte en: (2)

Período monomolecular

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Donde ki : [M] : ri :

Constante de velocidad de iniciación monomolecular Catalizador, metal, concentración Velocidad de iniciación monomolecular

La velocidad de iniciación viene dada por:

Sustituyendo en (2), tenemos: (3)

Al comienzo de la reacción podemos suponer que el consumo del sustrato oxidable es muy poco y que por lo tanto su concentración es constante, por lo que podemos definir una constante global de velocidad monomolecular: (4)

Sustituyendo esa expresión en (3), obtenemos: (5)

Dado que a estos niveles de oxidación la concentración de los hidroperóxidos es aproximadamente igual al oxígeno consumido: (6)

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LA AUTOXIDACIÓN Y LA RANCIDEZ. TEORÍA

Integrando: (7)

De allí que un gráfico de la raiz cuadrada de la cantidad de oxígeno consumida o de la concentración de hidroperóxidos formados, contra el tiempo de reacción, dará una línea recta cuya pendiente será igual a Km/2, tal como mostramos en la siguiente gráfica:

Período bimolecular Cuando la concentración de hidroperóxidos ha crecido por encima de un cierto umbral, al finalizar el período de inducción, el mecanismo de la descomposición de los hidroperóxidos cambia a la fase bimolecular

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La nueva tasa de iniciación será:

Donde kii : Constante de velocidad de iniciación bimolecular rii : velocidad de iniciación bimolecular Sustituyendo en (2) (8)

Supongamos que la descomposición de los hidroperóxidos aun no es significante y que el oxígeno absorbido sigue siendo aproximadamente igual a la cantidad de hidroperóxido formado, entonces:

Pero, en estas circunstancias, el consumo del sustrato si será apreciable por lo que su concentración en cada momento se reducirá a: (10) (11) Donde [RH0] es la concentración inicial del sustrato oxidable y [RH] es su concentración en un tiempo t. Agrupando todas las constantes, obtenemos la expresión para la constante global de velocidad bimolecular, Kb.

(12)

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LA AUTOXIDACIÓN Y LA RANCIDEZ. TEORÍA

Sustituyendo 10 y 11 en 12:

que al integrar produce: (13)

De allí que un grafico del logaritmo de y/(1-y) sea una línea recta con pendiente igual a Kb , como mostramos en la siguiente gráfica:

El cálculo de las constantes globales Km y Kb, arroja excelentes resultados para el estudio de sistemas modelo, donde las concentraciones de los reaccionantes y demás variables de reacción, pueden mantenerse bajo control, y cuando la reacción transcurre en ausen-

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

cia de compuestos antioxidantes (Rosas Romero y Morton, 1975a, 1975b, 1977a,1977b).

Modelo cinético de la autoxidación en presencia de antioxidantes La reacción de autoxidación puede ser inhibida por la acción de compuestos que interfieran con los pasos de iniciación y de propagación de la reacción en cadena. La actuación de estos antioxidantes puede ser mediante el acomplejamiento de metales; por descomposición de los radicales peroxilos y de los hidroperóxidos para dar compuestos no radicales o por entrampamiento de los radicales libres que haya en el medio. La reacción también puede ser inhibida ajustando las condiciones físicas para eliminar el oxígeno o prevenir la acción de la irradiación solar. ROO. + AH

Kinh

ROOH + A.

Si el antioxidante no reacciona con el oxígeno y el radical A. no propaga la reacción, esto es, si: AH + O2 A. + RH

no reacción no reacción

Entonces, la velocidad de propagación sufrirá una disminución y, cuando la constante de la inhibición sea mayor que la de iniciación, Kinh>>Ki, la ley de velocidades podrá escribirse como: -d[O2]/dt = [RH] (ri)1/2 Kp/Kinh [AH] Donde ri es la velocidad de la reacción de iniciación. En general, el antioxidante puede volver a reaccionar según: A. + nROOH

no radicales

por lo que debemos reescribir la ecuación cinética como: 74

LA AUTOXIDACIÓN Y LA RANCIDEZ. TEORÍA

-d[O2]/dt = [RH] (ri)1/2 Kp/nKinh [AH] La estequiometría de la reacción inhibida, esto es, el valor de n, lo podemos determinar midiendo el período de inducción, , cuando la reacción no está totalmente inhibida, y es iniciada a velocidad constante (y conocida) por el uso de un generador de radicales libres, como el ABAP (Burton e Ingold, 1981). Recordando que el período de inducción lo hemos definido como el tiempo de duración de la fase monomolecular de descomposición de los hidroperóxidos, nos queda que:

τ

n = ri

τ /[AH]

Donde ri está determinada por la cantidad de iniciador utilizada. Y, como la extensión del período de inducción, , es proporcional a Kinh y a la concentración del antioxidante, [AH], podemos calcular Kinh experimentalmente graficando el consumo de oxígeno durante el período de inducción en función del logaritmo de (1-t/ ); donde t es el tiempo transcurrido de la reacción. La pendiente será -Kp [RHo]/nKinh (Barclay et al, 1995); donde Kp es la constante del paso de propagación, conocida para el sustrato que se esté empleando, y [RHo] es la concentración inicial del sustrato. De esa manera podremos medir la acción antioxidante, calculando las constantes absolutas de reacción.

τ

τ

Midiendo la autoxidación En el capítulo La Autoxidación y la Rancidez Oxidativa. Analítica discutimos las técnicas apropiadas para este fin.

Bibliografía Barclay LRC, Edwards CD, Mukai K, Egawa Y y Nishi T (1995): Chain breaking naphtolic antioxidants: Antioxidant activities of polyalkylbenzochromanol, and 2,3-Di-

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

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LA AUTOXIDACIÓN Y LA RANCIDEZ. Analítica Alfredo Rosas Romero [email protected]

LA AUTOXIDACIÓN Y LA RANCIDEZ OXIDATIVA. Analítica Alfredo Rosas Romero [email protected] Universidad Simón Bolívar. Departamento de Química. Apartado 89000 Caracas 1080A. Venezuela

Una de las maneras más directas de estudiar la cinética de la autoxidación, es medir la cantidad de oxígeno absorbido en función del tiempo, lo cual puede realizarse mediante una técnica manométrica empleando un respirómetro de Warbourg (Rosas Romero y Morton, 1975). El método del Rancimat es ampliamente empleado en la industria de alimentos, mide el período de inducción a alta temperatura para acelerar la velocidad de la oxidación a valores prácticos para la determinación (Murcia et al., 2001) La actividad antioxidante también puede medirse basándose en la velocidad de aparición de los productos de la autoxidación. Entre estas técnicas las más usadas son: La determinación del Valor Peróxido: la oxidación de los ácidos grasos y sus derivados, produce una mezcla de hidroperóxidos, los cuales se acumulan al transcurrir la reacción. La cantidad total de estos compuestos puede ser determinada iodométricamente (AOCS, 1989) y espectrométricamente (El-Saadani et al., 1989) La prueba del Ácido Tiobarbitúrico. (Botsoglou et al., 1994): Los hidroperóxidos formados por la autoxidación de la fracción grasa se transforman en aldehídos. Esta técnica se basa en la determinación de los productos resultantes de la reacción de esos aldehídos (fundamentalmente el malonaldehído) con el ácido tiobarbitúrico (TBA). La determinación de los hidroperóxidos (LOOH) y de los hidróxidos de los ácidos grasos (LOH). (Teng y Smith LL, 1985). Los hidroperóxidos 79

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e hidróxidos que se acumulan con el transcurso de la autoxidación, pueden determinarse cuantitativamente por cromatografía líquida. Estos valores están relacionados con la cinética de la oxidación. La determinación de los hidroperóxidos por Cromatografía de GasesEspectroscopía de Masas (Terao et al., 1984). Este es un método más sensible que el anterior, pero tiene la desventaja de que requiere la derivación del material lipídico para convertirlo en compuestos suficientemente volátiles para poder usarlos en cromatografía de gases. Esta manipulación generalmente involucra la esterificación de los ácidos grasos libres, la sililación y en algunos casos también es necesario reducir los dobles enlaces. El ensayo de Kreis: el floroglucinol forma compuestos fuertemente coloreados al ser atacado por los peróxidos, lo cual permite la evaluación colorimétrica del progreso de la autooxidación o de la actividad antioxidante (Pool y Pratter,1945). La detección por cromatografía de gases de la formación de alcanos, 1-pentanol, o hexanal (Koelsch et al., 1991 y Park y Goins, 1992). La quimiluminiscencia generada por la hidroperoxidación de los lípidos al reaccionar con compuestos como el luminol (Miyazawa et al., 1987 y Parejo et al., 2000) Y, similarmente, por flourescencia (Ghiselli et al., 1995). Por la absorbancia del radical oxígeno (Cao et al., 1993) y por la formación de dienos conjugados como consecuencia de la formación de los hidroperóxioso a partir de ácidos grasas polinsaturados y sus derivados (Esterbauer et al.,1989). A continuación explicaremos las técnicas que hemos usado en nuestro proyecto: la basada en la decoloración del β-caroteno y la que mide el entrampamiento de los radicales libres producidos por el DPPH. Asimismo hemos desarrollado una técnica, basada en la formación de dienos conjugados, para estudiar la autoxidación cuando las soluciones absorben a frecuencias cercanas a la de la absorción del β-caroteno.

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Decoloración del β-caroteno Fundamento de las técnica En el medio de reacción se desarrolla la propagación de la reacción de autoxidación del ácido linoleico, que podemos representar como: L. + O2 LOO2 + LH

LOO2. LOOH + L.

Donde: LH = una molécula de ácido linoleico LOOH = hidroperóxido del ácido linoleico. L. = radical del ácido linoleico LO2. = radical peróxilo

Estructura del β-caroteno Los radicales libres así formados, reaccionan con el β-caroteno presente en el medio destruyendo la conjugación original de sus dobles enlaces, y en consecuencia disminuyendo la intensidad del color anaranjado que él aporta a la solución. Esta perdida de absorbancia es la que medimos en función del tiempo, como una expresión del transcurso de la autoxidación del ácido linoleico. Esta reacción del ácido linoleico puro la tomamos como el control para nuestras determinaciones. En otras celdas de reacción agregamos, a la solución control, los extractos o fracciones que deseemos evaluar, y la velocidad de disminución de la intensidad del color del β-caroteno estará relacionada con el poder antioxidante de las muestras bajo evaluación. La celda 1 contiene agua y el emulsificador, Tween 20, corresponde al 100% T. 81

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Resultado típico de la técnica de decoloración del β−caroteno. Los números representan la colocación de las celdas. La celda 1 es la referencia fotométrica, 100% T.

Definimos la actividad antioxidante de una muestra, φ, como la inhibición de la reacción de oxidación del ácido linoleico, tomando a la acción de BHA como 100%. Y la calculamos mediante la siguiente expresión: φ = [(Pc – Pm) / (Pc – PBHA)] x δ x 100 Donde Pc = es la pendiente de la reacción control, sin antioxidante agregado Pm = es la pendiente de la muestra bajo evaluación PBHA = es la pendiente de la reacción que contiene el antioxidante de referencia, BHA δ = es la concentración del BHA/concentración de la muestra, en mg/mL; igual a 1 en nuestro diseño. 82

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Las pendientes se calculan mediante la regresión de la absorbancia en función del tiempo, empleando los datos de la zona lineal, en la sección D, de la celda correspondiente. Una discusión detallada de la parte experimental de esta técnica se encuentra en EL DISEÑO EXPERIMENTAL.

Capacidad de captura de radicales libres (DPPH) Fundamento de la técnica

La molécula de DPPH contiene un radical libre estable. Como consecuencia del color púrpura de sus soluciones, esta molécula absorbe a 517 nm. El ensayo se fundamenta en la disminución del color púrpura de sus soluciones como consecuencia de la donación de un electrón por un compuesto con poder antioxidante. Calculamos el porcentaje de actividad de acuerdo con la siguiente expresión: %DPPH = [1-(Amuestra-Ablanco)]x100/ADPPH

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Los resultados de esta técnica los expresamos como la concentración de la muestra que inhibe 50% del efecto promotor de radicales libres del DPPH, a lo que llamaremos EC50, en µg/mL.

Comparación de las dos técnicas Escogimos estas dos técnicas para nuestro trabajo de monitoreo porque son fáciles de ejecutar, demandan pequeñas cantidades de muestra, arrojan resultados reproducibles, y miden la actividad antioxidante de los extractos y fracciones desde dos puntos de vista muy diferentes. La técnica basada en la decoloración del β−caroteno está muy bien relacionada con el fenómeno de rancidez en grasas y aceites, ya que trabaja, cercana a la temperatura ambiente, con una emulsión de ácido linoleico en agua, donde la cantidad de oxígeno no es limitante; mientras que la técnica del DPPH está relacionada específicamente con el entrampamiento de los radicales libres generados por el DPPH en un ambiente altamente polar, a temperatura ambiente, en ausencia de un sustrato lipídico oxidable. De esa manera, para que un extracto o sustrato sea considerado como interesante, no es necesario que produzcan buenos resultados en ambas técnicas; ya que buenos resultados con la técnicas del β−caroteno significa una alta capacidad para inhibir el proceso global de la rancidez de los sustratos lipídicos, mientras que la misma muestra puede dar bajos resultados con el DPPH, lo cual significa meramente que su actividad antioxidante no está basada en la inhibición de la acción de radicales libres tipo DPPH. Situaciones contrarias también son frecuentes (Brand-Williams et al., 1995). Proponemos el uso simultáneo de estas dos técnicas para los trabajos de monitoreo de la actividad antioxidante en fuentes naturales, porque de esa manera se obtiene una mejor información sobre la potencialidad de los extractos o fracciones que se estudien, y sobre su eventual aplicación industrial; ya que la primera nos habla del poder antioxidante frente a los procesos de rancidez oxidativa, y con el DPPH identificamos los extractos o fracciones que tienen una alta capacidad para inhibir la acción de los radicales libres. El uso simultáneo de estas dos técnicas también contribuiría a enfrentar el problema ocasionado por el uso, por los diferentes gru84

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pos involucrados con este tipo de trabajo, de una amplia variedad de técnicas para medir la actividad antioxidante, con la consiguiente dificultad en el momento de comparar los resultados, tal como está claramente documentado en la literatura del área (Arnao et al., 1999; Niki y Noguchi, 2000; Antolovich et al., 2002; Koleva et al., 2002 y Emmons et al., 1999).

Método de los dienos conjugados Esta técnica la diseñamos para evaluar el poder antioxidante de fracciones y extractos de plantas que absorben en la misma frecuencia que se usa en la técnica de la decoloración del β-caroteno. Mientras el ensayo del β-caroteno trabaja a 460 nm, el que presentamos lo hace a 235 nm con lo cual evitamos la interferencia.

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El esquema explica como en los primeros pasos de la autoxidación, como consecuencia de la formación de los hidroperóxidos, el sustrato sufre una isomerización, de cis-cis a cis-trans, que conlleva la aparición de los dienos conjugados en el sustrato. En el espectro UV-Visible, estos dienos aparecen como una nueva absorbancia a 235 nm, la cual usamos para seguir la cinética de la autoxidación.

Parte experimental • Solución de dodecilsulfato de sodio (SDS) 0,12 M Disolvemos, en un frasco ámbar, 6,9220 g de SDS en 200 mL de agua desionizada, agitamos hasta lograr una solución homogénea, a temperatura ambiente. Esta solución tiene un tiempo máximo de estabilidad de 15 días. • Solución tampón de fosfato 0,3 M a pH 7,4 Disolvemos, en 100 mL de agua desionizada, 1,60 g de NaH2PO4.H2O y 4,9 g de Na2HPO4.7H2O. Ajustamos el pH a 7,4 con NaOH al 10%, luego agregamos 1 g de CHELEX-100 (para eliminar cualquier traza de metales) y agitamos por 24 horas. Filtramos y guardamos en frasco ámbar. La solución es estable por 15 días. • Emulsión de ácido linoleico 2,6 mM En un frasco ámbar mezclamos con agitación 8330 µL de SDS 0,12 M, 1660 µL de la solución tampón de fosfato y 8,1 µL de ácido linoleico hasta obtener una solución homogénea. Si se conserva bajo refrigeración, la solución es estable durante el día de trabajo. • Solución del blanco de absorbancia Mezclamos en un frasco ámbar 8330 µL de SDS 0,12 M con 1660 µL de la solución tampón de fosfato. La solución es estable por 10 días. • Solución de iniciador (AIBN) 0,15 M Disolvemos 0,0543 g de 2,2´-azobis(2-metilpropionitril) en 1000 µL de metanol, termotatizamos la solución a 40 ºC y la usamos inmediatamente. • Solución patrón de actividad antioxidante 86

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Se selecciona un antioxidante patrón, por ejemplo BHA recristalizado, y se prepara una solución que esté a un 80% de la inhibición total de la reacción. A esta actividad le asignamos el 100%. • Soluciones de las muestras Para cada muestra a la que se le vaya a medir la actividad antioxidante, preparamos una solución metanólicas a la misma concentración (en peso en el caso de extractos, en molaridades para compuesto puros) que la solución patrón de antioxidante. • Solución control Es idéntica a la solución de las muestras, pero sin muestra.

Procedimiento de la evaluación Disponemos de 8 celdas termostatizadas en el espectrofotómetro, en la primera colocamos el blanco de absorbancia. En la octava el control (todo menos muestra) y nos queda capacidad para evaluar seis muestras simultáneamente, una de ellas será el patrón de BHA. Las celdas contienen un volumen total de 1030 µL: 1000 µL de la emulsión, 20 µL del iniciador AIBN y 10 µL de la muestra (de metanol para el control). Medimos la absorbancia durante seis minutos; cuando se

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ha alcanzado el equilibrio térmico, iniciamos la oxidación añadiendo la alícuota indicada del iniciador, agitamos las celdas, con un vortex, por 2 minutos y medimos la absorbancia durante 10 minutos más. Finalmente, adicionamos la muestra (metanol en el control y el blanco), volvemos a agitar y continuamos la medida de la absorbancia. Trabajamos a 235 nm, tomamos lecturas cada 60 segundos durante 20 minutos adicionales. Repetimos el experimento tres veces. Durante la región A se establece el equilibrio térmico, luego se agrega el iniciador y, durante B se establece el estado estacionario de la reacción de autoxidación no inhibida. En el punto C se agregan las muestras y las medidas de absorbancia durante los siguientes 20 minutos, se utilizan para calcular la pendiente de cada muestra. Mediante una regresión lineal de los valores de la absorbancia contra el tiempo, calculamos la pendiente durante los últimos 20 minutos del experimento, esto es, durante la región D. Calculamos la actividad antioxidante, como porcentaje de la actividad del patrón, mediante la siguiente ecuación: % A = [(Pc – Pm) / (Pc – PBHA)] x δ x 100 donde: Pc = es la pendiente de la reacción control, sin antioxidante agregado Pm = es la pendiente de la muestra bajo evaluación PBHA = es la pendiente de la reacción que contiene el antioxidante de referencia, BHA δ = es la concentración del BHA/concentración de la muestra, igual a 1 en nuestro diseño.

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EL ESTRÉS OXIDATIVO. Teoría Olga Sonia León de Fernández [email protected]

EL ESTRÉS OXIDATIVO. Teoría Olga Sonia León de Fernández [email protected] Centro de Investigaciones y Evaluaciones Biologicas (CEIEB)-IFAL-UH Ave. 23 # 21425 e/214 y 222. La Coronela La Lisa. La Habana. Cuba

Especies reactivas del oxigeno El término «Especies Reactivas de Oxígeno» (ERO) es una denominación que engloba los radicales libres (RL) (átomos, iones o moléculas con uno o más electrones no pareados en el orbital más externo) y a moléculas derivadas del oxígeno que tengan alta capacidad reactiva. A continuación referimos una cronología de los descubrimientos más importantes que han tenido lugar en la investigación sobre esta temática: • 1775 Joseph Pristley, el descubridor del oxígeno, sugirió por primera vez que este gas podría ser tóxico a las células. • 1900 Moses Gomberg, demostró la existencia del radical trifenilmetilo (Ph3C•) • 1952 Conger & Fairchild (Proc Natl Acad Sci USA) demostraron por primera vez que el daño oxidativo mediado por las ERO ocurría en los organismos vivos pues al aumentar la presión parcial de O2 aumentaba la frecuencia de aberraciones cromosómicas en granos de polen. • 1954 Gerschman et al. (Science) propusieron que la toxicidad del oxígeno y el daño inducido por la radiación UV tenían al menos un mecanismo común, posiblemente relacionado con la formación de RL. • 1969 McCord y Fridovich demostraron que la eritrocupreína (una proteína que se encuentra en altas concentraciones en los eritrocitos) cataliza la descomposición del anión radical 93

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superóxido en H2O2 y O2. Esto constituyó uno de los avances más importantes en la biología debido a que sugirió por vez primera que los RL de O2 se producen in vivo en cantidades significativas. El O2 molecular es un biradical, al tener 2 electrones sin parear. Sin embargo, los 2 e- sin parear tienen el mismo spin, lo que impide que el O2 reaccione directamente con otros compuestos. La reducción directa por otros 2 e- (a la vez) del O2 molecular está impedida por el hecho de que 2 e- no pueden ocupar un mismo orbital con el mismo spin. El principio de exclusión de Pauli (1925) establece que un orbital atómico no puede ser ocupado por más de 2 electrones y para que estos 2 electrones lo ocupen deben tener spines contrarios (+½ y -½). La restricción de spin puede evadirse de tres formas (lo que permite que el O2 pueda ser utilizado para la generación de energía): 1. Al excitarse el O2, uno de los electrones sin parear puede pasar a otro orbital de más energía y así invertir su spin. De esta forma se forma el oxígeno singlete (altamente reactivo) conocido como 1O2. 2. La unión del O2 a un metal de transición que contiene electrones sin parear forma complejos que pueden aceptar un par de electrones de otros substratos sin violar el Principio de Exclusión de Pauli. 3. La restricción de spin puede violarse añadiendo electrones al O2 paso a paso. La reducción univalente del O2 involucra la producción de Especies parcialmente reducidas de O2 (Fig.1.1). Fig. 1.1 Reducción del oxígeno molecular mediante la adición sucesiva de electrones.

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El estudio de las ERO ha sido de gran significación para la práctica médica, fundamentalmente aportando nuevos conocimientos acerca de la etiología de diversas enfermedades, en la medida que: • Se descubre cómo Sustancias Antioxidantes son efectivas en el tratamiento de estos desórdenes. • Cómo fármacos, de eficacia comprobada en diferentes enfermedades, poseen propiedades Antioxidantes. La repercusión de las investigaciones sobre esta temática se reflejan en el número de artículos publicados sobre RL en las bases de datos de corte biomédico (Fig. 1.2).

Fig. 1.2 Artículos publicados en la temática de radicales libres en la última década

Principales fuentes o mecanismos generadores de ERO Los mecanismos fundamntales por los que se produce la generación de ERO son: • Cadena de transporte electrónico mitocondrial

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Producción del anión radical superóxido por la cadena de transporte electrónico mitocondrial

• Iones de metales de transición

• Fagocitos activados

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• Reacciones bioquímicas redox dependientes de O2 que tienen lugar en el metabolismo celular Monoamino-oxidasa (MAO)

• Fenómenos de isquemia/reperfusión En condiciones de isquemia (baja pO2, pH bajo), la producción de RL ocurre fundamentalmente por las siguientes vías: 1) Disfunción mitocondrial 2) Avivación de la Xantina oxidasa 3) Incremento del metabolismo del ácido araquidónico 4) Infiltración de polimorfonucleares (PMNs) 5) Avivación de la Oxido Nítrico Sintetasa • Hiperoxia La formación de O2•- por la mitocondria (específicamente la ubisemiquinona) es proporcional a la pO2. Se estima que 97

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aproximadamente 85% de las ERO que se producen en el pulmón expuesto a 100% de O2 provienen de las monooxigenasas de función mixta. La mitocondria contribuye con el otro 15%. • Exceso de ejercicio físico El consumo de O2 por el organismo aumenta 20 veces y en músculo se eleva hasta casi 100 veces, para incrementar la producción de ATP por fosforilación oxidativa mitocondrial. EL aumento en la utilización del O2 trae aparejado un incremento en la generación de O2•-. Y, la Xantina Oxidasa produce la activación del catabolismo de nucleótidos de adenina. • Radiaciones ionizantes La radiación ionizante proveniente de la atmósfera o de la radioterapia es absorbida fundamentalmente por el H2O (por su abundancia), produciéndose un gran número de compuestos en aproximadamente 10-9 segundos luego de la exposición.

• Contaminantes ambientales • Componentes del humo del tabaco

ERO más representativas y sus características Especies radicalarias Dentro de las especies radicalarias de mayor interés desde el punto de vista biológico están el radical anión superóxido (O2•-), hidroxilo (•OH), óxido nítrico (NO•), hidroperoxilo (HO2•), peroxilo (RO2•), alcoxilo (RO•).

Especies no radicalarias Las especies no radicalarias de mayor interés biológico son: ácido hipocloroso (HOCL), peroxinitrito (ONOO)-, peróxido de hidrogeno (H2O2) y oxígeno singlete (1O2).

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Mecanismos de defensa antioxidante Las ERO se generan en condiciones fisiológicas en muchas células. Por su potencial efecto destructivo, los leucocitos las producen contra agentes externos y son beneficiosos en este caso, pero la mayor parte de las veces, el organismo utiliza potentes mecanismos para evitar la acumulación de las ERO. El primer componente de los mecanismos de defensa antioxidante es la barrera fisiológica que limita el paso del oxígeno desde el aire inspirado hasta las células (García et al., 1994). El resto de los componentes se describen a continuación.

Antioxidantes primarios: Los llamados antioxidantes primarios son los que previenen la formación de nuevas ERO. Esto lo consigue convirtiendo las ERO en moléculas menos perjudiciales, antes de que puedan reaccionar, o evitando su producción a partir de otras moléculas. En este grupo se destacan las enzimas SOD, GPx y proteínas de unión a metales como la ferritina y la ceruloplasmina (RANDOX, 1996). • Las Superóxido dismutasas (EC 1.15.1.1) son un grupo de metaloenzimas que pueden dividirse en dos familias filogenéticas diferentes CuZn-SOD y Fe/Mn-SOD. Las SOD catalizan la conversión de O2•- a H2O2 y O2 con una constante de reacción de 2·109 M-1 ⋅s-1 para la CuZn-SOD (Guiseppe, 1972). En los organismos eucariotas existen tres tipos diferentes de SOD atendiendo a su localización que, en su conjunto, contribuyen a regular las concentraciones de O2•- (Marklund, 1992). • Superóxido dismutasa dependiente de cobre y cinc (Cu/ZnSOD) Primera línea de defensa antioxidante. Superóxido dismutasa dependiente de Manganeso (MnSOD) Superóxido dismutasa extracelular (EC-SOD) Tiene control primario sobre la inactivación del NO Superóxido dismutasa dependiente de níquel (NiSOD) Presente en microorganismos • Las Glutatión peroxidasas (E.C. 1.11.1.9), son dos enzimas selenio dependientes que ejercen su acción detoxificante por la reducción del H2O2 o los ROOH. 99

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• La catalasa (EC 1.11.1.6) participa en el metabolismo del H2O2. Aunque su afinidad por el H2O2 es inferior a la que exhibe la GPx, bajo condiciones de sobreproducción puede asumir el papel protagónico en la eliminación del H2O2 (Fulbert y Cals, 1992; García et al., 1994). Este grupo se completa con: las tiorredoxinas, la tiorredoxina reductasa, las transferrinas, la lactoferrina, la ferritina, la ceruloplasmina, las albúminas, las haptoglobinas y hemopexinas y las metalotioneínas.

Antioxidantes secundarios: Los antioxidantes secundarios capturan los radicales y evitan las reacciones en cadena. Ejemplos de ellos son la vitamina E y C, β-caroteno, ácido úrico, bilirrubina, albúmina y ubiquinona.

Sustancias endógenas con capacidad antioxidante • Glutatión El glutatión se descubrió en el 1888 por J. De Rey-Pailhade quien lo nombró primeramente philothion (griego: amor por el azufre). En el 1929 fue identificada su estructura en detalles. Es un tripéptido, γ-glutamil-cisteinil-glicina, que se encuentra en todas las células en concentraciones relativamente altas (0.4-12 mM) y es el compuesto con grupos SH más abundante en los tejidos (SH no proteicos). Funciones del GSH 1) detoxificación de compuestos electrofílicos 2) captura de RL 3) cofactor de GPx 4) mantenimiento del estatus de grupos SH en proteínas al prevenir su oxidación 5) reservorio de Cys 6) modulador de procesos celulares como la síntesis de DNA y funciones inmunes • Urato El urato está presente en el plasma en el rango de 180-420 µM. Es capaz de quelatar Fe libre y cobre, además reacciona con 100

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HClO, atenúa la oxidación de lípidos, lipoproteínas y ácidos grasos poliinsaturados inducida por ozono y elimina directamente los radicales peroxilo, alcoxilo e hidroxilo. • Bilirrubina La bilirrubina está presente en el plasma en concentraciones menores de 20 µM. Es capaz de eliminar el oxígeno singlete y radicales peroxilo. La bilirrubina unida a la albúmina plasmática contribuye significativamente a las defensas antioxidantes no enzimáticas presentes en el plasma. • Ubiquinonas (coenzima Q) Las ubiquinonas son derivados de las quinonas que contienen una cola isopeno. La forma reducida de las ubiquinonas, los ubiquinoles son liposolubles y actúan como antioxidantes eficientes. Los ubiquinoles tienen mayor capacidad antioxidante que las ubiquinonas.

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Antioxidantes terciarios Los antioxidantes terciarios son los encargados de la reparación de las biomoléculas dañadas. En este grupo se incluyen las enzimas reparadoras de ADN y la metionina sulfóxido redutasa. (Fig. 2)

Figura 2: Representación de la integración entre los sistemas antioxidante.

Toxicidad celular de las ERO. Blancos principales Las alteraciones funcionales, mediadas por ERO, son una consecuencia directa de sus interacciones con macromoléculas esenciales. Resulta importante, por tanto, analizar la naturaleza de estas reacciones, que modifican la estructura y alteran la función permitiendo acercarnos a los eventos básicos de la enfermedad y a los 102

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probables mecanismos de acción de agentes protectores con capacidad antioxidante. Las moléculas “blanco” del ataque de las ERO de mayor importancia son:

ADN Los daños fundamentales son la hidroxilación de las bases de ADN, entre-cruzamientos, escisión de hebras e inhibición de la síntesis de proteínas, nucleótidos y ácidos grasos (Southorn, 1988), y son causados por •OH y oxígeno singlete (1O2), este último ataca fundamentalmente a la guanina.

Proteínas Muchas ERO son capaces de oxidar los grupos sulfidrilos (-SH) de las proteínas y, en ocasiones, genera daños puntuales a proteínas que están unidas a metales de transición (Stadtman y Oliver, 1991; Aruoma, 1994). Otro importante daño oxidativo, que tiene lugar en las proteínas, es la oxidación de los grupos amino de los aminoácidos, a grupos carbonilos. Por otro lado, el ONOO- también es responsable del daño a las proteínas (Simonian y Coyle, 1996)

Lípidos Las ERO provocan la oxidación de los ácidos grasos polinsaturados y de los fosfolípidos de membrana. La POL conduce a un aumento considerable de la permeabilidad de las membranas celulares, originando alteraciones irreversibles de las propiedades funcionales de la célula que pueden conducir a su lisis total (Fulbert y Cals 1992). Los procesos de peroxidación conducen a la formación de numerosos derivados tóxicos, los hidroperóxidos, el malonildialdehído (MDA) y otros (Dennis y Shibamoto 1989).

Patogenia de las Especies Reactivas de Oxígeno Estados fisiopatológicos mediados por ERO Se conoce en la actualidad que el estrés oxidativo, desbalance temporal o a largo plazo en las concentraciones de ERO, ya sea por incrementos en su producción o por disminución de los mecanismos de 103

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

defensa antioxidante, está relacionado con decenas de patologías o estados fisiopatológicos (Aruoma, 1994). En la actualidad existen controversias sobre si el estrés oxidativo es la causa o la consecuencia de las enfermedades, o si la terapia con antioxidantes puede prevenir o modular su progresión favorablemente. Es probable que algunas enfermedades sean causadas por perturbaciones en los factores que regulan la producción de ERO. Otras patologías pueden inicialmente ser independientes de estos factores pero la enfermedad, por sí misma, puede conducir a un incremento del estrés oxidativo que puede exacerbar el daño tisular y la progresión de la afección (Delanty y Dichter, 1998).

ERO y daño por isquemia/reperfusión hepática El hígado es considerado un órgano altamente sensible a la anoxia y al daño celular luego de un evento isquémico (Castillo et al., 1990). La protección del hígado frente al daño celular por isquemia/reperfusión (I/R) es uno de los factores más importantes que determina el éxito de la cirugía hepática, porque es necesario con frecuencia interrumpir el flujo sanguíneo en varios procederes quirúrgicos como la resección y el transplante de hígado (Nakano et al., 1995).

Fisiopatología de la Isquemia Cerebral En condiciones normales el cerebro utiliza glucosa y O2 para la producción de ATP. La isquemia rápidamente (en segundos) conduce a un agotamiento de O2 y cesa la fosforilación oxidativa. El fallo energético por sí solo no determina la degeneración neuronal. Otros procesos como la acidosis celular, la liberación de excesivas cantidades de glutamato que conducen a la excitotoxicidad, el influjo de Ca2+, la estimulación de la degradación de los fosfolípidos de membrana y la generación de ERO juegan un papel importante en la neurodegeneración durante el proceso de I/R cerebral (MacDonald y Stoodley, 1998).

Las ERO durante el ejercicio La actividad física vigorosa puede incrementar el consumo de oxígeno en 10 a 15 veces por encima del valor de reposo para satisfacer 104

EL ESTRÉS OXIDATIVO. TEORÍA

las demandas de energía. El elevado consumo de oxígeno resultante produce un estrés oxidativo que conduce a la generación de RL y a la peroxidación de lípidos.

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EL ESTRÉS OXIDATIVO. Analítica Ríos JL, Recio MC, Giner RM y Máñez S

EL ESTRÉS OXIDATIVO. Analítica

MÉTODOS DE ESTUDIO IN VIVO DE EXTRACTOS Y PRODUCTOS ANTIINFLAMATORIOS Ríos JL, Recio MC, Giner RM y Máñez S

[email protected] Departament de Farmacologia, Facultat de Farmàcia, Universitat de València, España

Generalidades En la búsqueda de nuevos agentes antiinflamatorios es importante el empleo de modelos experimentales en animales, ya que dependiendo del protocolo, los resultados se pueden en parte extrapolar al posible comportamiento en humanos. Existen varios tipos de protocolos en función de la forma de aplicación, agente irritante utilizado o duración del proceso inducido. 1. En función de la forma de aplicación se emplean métodos que provocan una irritación tópica, aguda o subcrónica y son válidos para el estudio de sustancias activas en procesos inflamatorios de piel y mucosas. La administración oral o parenteral es útil para estudio de agentes de efecto sistémico, independientemente del agente irritante. 2. El agente irritante varía en función del modelo que se quiera mimetizar, puede ser ácido araquidónico (AA), acetato de tetradecanoilforbol (TPA), serotonina (5-HT), histamina, carragenina, bradicinina (BK), fosfolipasa A2 (PLA2), entre otros. Unos de administración tópica y otros de empleo parenteral. 3. La duración del proceso y del tratamiento va a condicionar la posible utilidad del extracto o agente antiinflamatorio. En algunos procesos agudos se cuantifica el edema inducido, que unas veces dura minutos y otras horas. Otros procesos inducen una auténtica inflamación, por lo que además de edema se pueden valorar otros parámetros, como enzimas inducidas, o mediadores liberados. 109

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La evaluación del efecto farmacológico se puede hacer mediante la medición del espesor de la oreja o pata inflamada (derecha) y su comparación con la oreja o pata no inflamada (izquierda), o bien por la diferencia de peso entre una sección calibrada de las orejas, en este caso se requiere el sacrificio previo del animal. El porcentaje de inhibición del edema se refiere al grupo control (no tratado) al cual se le administra solamente el agente irritante (100 % de inflamación). Es imprescindible comparar el resultado con una sustancia o fármaco de referencia. A continuación recopilaremos los métodos más útiles en la búsqueda de nuevos agentes antiiflamatorios, especialmente citaremos su aplicación al estudio de extractos vegetales y productos naturales.

Edema agudo en oreja de ratón inducido por ácido araquidónico (AA) La administración tópica del AA provoca un edema de corta duración, con un comienzo rápido asociado al incremento de los niveles de prostaglandinas (PG), tromboxano B2 (TXB2) y leucotrieno B4 (LTB4), con un ligero aumento de los niveles de LTC4. Varios minutos después de su aplicación, comienza la vasodilatación, a los 10 min se incrementa la permeabilidad vascular desarrollándose el edema que alcanza su máximo al cabo de 1 h y desapareciendo prácticamente a las 6 h, aunque queda un eritema residual. Desde un punto de vista histológico, a los 30 min se observa estasis sanguíneo y a los 60 min se aprecia claramente en la dermis la infiltración de células polimorfonucleares (PMN) y mononucleares (MN). El número de células infiltradas comienza a disminuir a las 3 h, desapareciendo casi completamente a las 6 h. El AA apenas estimula la actividad mitótica epidérmica y la síntesis de DNA, por lo que no hay hiperplasia epidérmica. El estudio bioquímico demuestra que el AA es rápidamente metabolizado (aproximadamente 15 min), dando lugar a la formación de eicosanoides, principalmente PGE2, LTC4 y LTD4. La reducción del edema por la administración tópica de agentes activos está relaciona110

EL ESTRÉS OXIDATIVO. ANALÍTICA

da con la inhibición de la formación de mediadores producidos por la lipoxigenasa (LOX), siendo poco efectivos los inhibidores de la ciclooxigenasa (COX). En ningún caso se puede extrapolar el resultado de inhibición de edema con un posible mecanismo de acción, debido a la poca selectividad del método. Como fármaco de referencia o control positivo en este test se emplearán ácido nordihidroguayarético (NDGA) o fenidona, dos inhibidores de la LOX.

Edema agudo en oreja de ratón inducido por acetato de tetradecanoil forbol (TPA) El TPA es un potente agente flogógeno y promotor de tumores que se encuentra en el aceite de croton (Croton tiglium L.). La administración tópica de TPA provoca un edema agudo con infiltración leucocitaria. El TPA actúa a través de la activación de la proteincinesa C (PKC), dependiente de Ca2+ y fosfolípidos. La PKC desempeña un papel importante en la transducción de señales de una gran variedad de sustancias que activan funciones celulares y de proliferación. La enzima es activada por diacilglicerol (DAG) liberado a partir de inositol-fosfolípidos de la membrana. El TPA y otros ésteres del forbol cuando se intercalan en la membrana pueden actuar como sustitutos del DAG, activando la PKC de forma más permanente que el mediador endógeno, ya que el TPA es difícilmente degradable. La PKC activada actúa a diferentes niveles, incluyendo la liberación de AA, formación de prostanoides, incremento de radicales libres y síntesis de diversas proteínas proinflamatorias. Tras la aplicación de TPA en oreja de ratón, se produce un eritema y vasodilatación entre 1-2 h, a las 3-4 h aumenta el grosor como consecuencia de la extravasación de líquido, siendo el edema máximo a las 6-8 h. Transcurridas 12-14 h el edema desaparece, aunque la vasodilatación y el eritema persisten hasta las 24-48 h. A nivel histológico se observa agregación plaquetaria a las 2 h, agregación y adherencia de leucocitos PMN a las células endoteliales entre 4-6 h, y migración hacia el tejido y desgranulación de mastocitos a partir de las 6 h. Al cabo de 6-24 h comienza el acúmulo de leucocitos en la dermis que 111

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dan lugar a abscesos subcorneales a las 48-72 h. Por último, tras 4896 h se observa hiperplasia en la membrana basal epidérmica, debida al incremento del número de células en división. El estudio bioquímico demuestra un incremento de AMPc, PGE2 y PGE2α, además de actividad de la enzima ornitín-descarboxilasa (ODC) y de síntesis proteica. Los fármacos de referencia más adecuados son los inhibidores de la síntesis de prostaglandinas, como indometacina, aunque los inhibidores de la COX, LOX y PLA2 dan buenos resultados, además de corticoides y antihistamínicos. La ventaja del método es la rapidez y poca muestra necesaria para desarrollar un estudio e incluso una curva dosis-efecto. El principal inconveniente radica en la falta de selectividad, ya que un elevado número de fármacos y sustancias objeto de análisis suelen dar resultados positivos en este test. Otro problema adicional es que el fármaco se administra conjuntamente con el irritante, lo que permitiría conocer un grado de protección no de curación real.

Inflamación en oreja de ratón inducida por aplicación repetida de TPA. El método, considerado un modelo que mimetiza procesos crónicos o subcrónicos de inflamación cutánea, tiene la gran ventaja de que el compuesto objeto de estudio se aplica cuando el proceso inflamatorio ya está en curso, lo que ocurre en la realidad terapéutica. El modelo es válido para la evaluación de fármacos que actúen como los corticosteroides y también se han descrito buenos resultados con los inhibidores selectivos de la producción de LTs. El TPA se aplica 5 veces durante 10 días. El tercer día se observa un aumento del espesor de la epidermis e infiltración de PMN, hay edema, hiperplasia, infiltración celular y fibrosis. En el cuarto día la hiperplasia ya es uniforme. Es un buen método, muy selectivo y que permite estudiar potenciales fármacos con actividad en diversas patología que cursan produciendo dermatitis. Además siempre actúan cuando el proceso inflamatorio está establecido, es decir actúan como curativos. 112

EL ESTRÉS OXIDATIVO. ANALÍTICA

Reacción de hipersensibilidad retardada en oreja de ratón inducida por oxazolona La oxazolona es un compuesto alergénico que penetra en la piel y se conjuga con las proteínas de las células epidérmicas, que son la causa de la sensibilización. En una segunda exposición al alergeno hay reclutamiento de células que migran al lugar del segundo contacto, liberando mediadores proinflamatorios y radicales libres, los cuales pueden agravar el estado patológico del tejido inflamado. La oxazolona afecta únicamente a determinadas áreas, caracterizadas por una necrosis epidérmica importante en los orificios de los folículos pilosos, seguida de acumulación de PMN en la capa epidérmica donde se ha producido la necrosis. Los PMN se acumulan en las pústulas intraepidérmicas y se extienden hacia la región subepidérmica. Si se trata con un fármaco adecuado, hay regeneración epidérmica y reducción gradual del número de leucocitos en la dermis, pero si el tratamiento no es eficaz puede haber pérdida de porciones de tejido auricular por necrosis. Los corticoides, debido a sus propiedades antiinflamatorias e inmunodepresoras, son los fármacos más efectivos en este protocolo experimental, reduciendo tanto la fase de inducción como la lesión inflamatoria. Este protocolo es muy exigente en cuanto a los resultados, ya que a diferencia de los procesos agudos, solo un número limitado de compuestos son activos.

Otros protocolos de hipersensibilidad retardada Existen otros protocolos experimentales de hipersensibilidad retardada menos agresivos o de menor duración, y por lo que se prefieren en algunos estudios. Ejemplos como el dinitroclorobenceno (DNCB) o dinitrofluorobenceno (DNFB), pueden sustituir a la oxazolona, mientras que la reacción frente a eritrocitos de cordero (SRBC), se emplea para detectar reacciones alérgicas tipo tuberculínicas.

Edema inducido por carragenina en pata de ratón En el método original se utilizaba la rata como animal de experimentación. Sugishita y colaboradores, en 1981 adaptaron el método para 113

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el estudio en ratón, lo que es de máxima utilidad por el ahorro en animales y muestras a ensayar. La adaptación del método requiere la administración oral de los productos en estudio, para evitar un falso resultado debido al efecto contrairritante que se puede producir por la administración intraperitoneal. El método consiste en provocar un edema en la región subplantar por la administración de λ-carragenina. En una primera fase (0-1 h) se inicia el proceso inflamatorio por la liberación de aminas y péptidos vasodilatadores (histamina, serotonina y brandicinina). En una segunda fase (1-6 h) se liberan prostaglandinas y hay infiltración de neutrófilos, cuya activación libera otros mediadores, incluyendo radicales libres que potencian la respuesta inflamatoria. El máximo es aproximadamente a las 3 h, por lo que se aconseja la lectura del edema a 1, 3 y 5 h después de inyectar el agente irritante. En la fase tardía, comprendida en el periodo que va desde la 1ª hora hasta la 5ª h, es cuando los antiinflamatorios no esteroídicos tienen mayor efecto, lo que demuestra que el proceso está mediado básicamente por la COX inducida o COX-2. El método permite estudiar compuestos que se administran vía oral, lo que supone una forma común de administración en la práctica terapéutica. También sirve para el estudio de compuestos cuyo mecanismo de acción pueda estar relacionado con la inhibición de la actividad COX o afecte a la inducción de la enzima. El empleo de ratón en vez de rata ha simplificado el protocolo experimental.

Edema inducido por fosfolipasa A2 (PLA2) en pata de ratón La administración subplantar de PLA2 en el ratón, permite el estudio de agentes antiinflamatorios en cuyo mecanismo de acción esté implicada la inhibición de la enzima, la inhibición de la desgranulación de mastocitos o la actividad antiserotonínica. La fosfolipasa más comúnmente utilizada es la procedente del veneno de Naja naja, si bien actualmente se emplea el de N. mossambica, debido a la escasez del primero. La administración de PLA2 provo114

EL ESTRÉS OXIDATIVO. ANALÍTICA

ca la liberación de AA de lípidos de membranas y paralelamente una ruptura de las membranas de los mastocitos que provoca la salida de aminas vasoactivas que inducen un rápido edema, el cual se mide con un pletismómetro a diferentes tiempos para ver su evolución. Fármacos inhibidores de la actividad PLA2 como los corticoides, los inhibidores de la desgranulación de mastocitos y los antiserotonínicos, son los compuestos activos en este modelo experimental.

Edema inducido por serotonina en pata de ratón La administración subplantar de serotonina provoca un rápido edema, que se mide a los 12 min. El método se emplea con varios fines, uno el detectar agentes que inhiben la respuesta de la serotonina, sin embargo no es lo más frecuente. El método se ha descrito principalmente para el estudio de agentes cuyo mecanismo está relacionado con el de los corticosteroides. La aplicación de fármacos o compuestos que necesitan un largo periodo de latencia, puede alargar en exceso un protocolo experimental. En este caso la administración de serotonina acorta el periodo debido a su rápido efecto. Sugishita y colaboradores desarrollaron el método original para realizar estudios sobre posibles formas de actuación in vivo de corticosteroides, para lo cual se bloquean selectivamente el receptor esteroídico (progesterona), la transcripción (actinomicina D) o la síntesis de proteínas (cicloheximida). Actualmente se prefiere la administración de mifepristona en vez de progesterona, por ser más selectivo como antagonista del receptor esteroídico.

Otros protocolos experimentales En el estudio de agentes antiinflamatorios se pueden seleccionar otros agentes irritantes que permiten un conocimiento más selectivo en la forma de actuar de la sustancia objeto de estudio. Es el caso de los mediadores fisiológicos brandicinina o histamina, o los más selectivos resiniferatoxina, capsaicína y xileno, que provocan una inflamación de origen neurogénico, mientras que el empleo de fenilpropiolato de etilo (EPP) permite estudiar agentes antiinflamatorios con un largo periodo de latencia, como son los corticosteroides. 115

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EL ESTRÉS OXIDATIVO. Analítica

Determinación de la Actividad Antioxidante en sistemas biológicos Schinella G.R.1, Tournier H.1, Góngora L.2, Ríos J.L.2 1

Cátedra de Farmacología, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de la Plata, Argentina 2 Departament de Farmacologia, Facultat de Farmacia, Universitat de València, España

Introducción La actividad antioxidante es ampliamente usada como parámetro para caracterizar diferentes materiales vegetales. Esta actividad se relaciona con compuestos capaces de proteger un sistema biológico del efecto potencialmente dañino de procesos que causan excesiva oxidación involucrando especies reactivas del oxígeno. Existen diversos métodos para la evaluación de la capacidad antioxidante de muestras biológicas. Algunos de ellos utilizan la producción de un radical orgánico o especies reactivas del oxígeno y otros se basan en la oxidación-reducción de iones metálicos. Un ensayo universal de la actividad antioxidante in vitro no existe debido a que la actividad anti-radicalaria depende fundamentalmente de la naturaleza del radical y del método de generación del mismo. La elección de un sistema químico para generar especies reactivas es un punto crítico en el desarrollo de cualquier ensayo antioxidante con el fin de obtener resultados relevantes [Aruoma, 2003].

Inhibición de la peroxidación lipídica en mebranas microsomales La peroxidación lipídica es un proceso de oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) mediado por radicales libres, que causa degradación de los lípidos. Estas reacciones en cadena se inician en AGPI debido a la facilidad con que algunos radicales son capaces de sustraer un hidrógeno del grupo metileno presente entre dos insatu117

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raciones, y la estabilidad de las múltiples estructuras resonantes de los radicales formados (AGPI.). La propagación ocurre debido a que en la mayoría de los casos, la rápida reacción de estas formas resonantes con el oxígeno molecular conduce a la formación de radicales lipoperóxidos (AGPIOO.) reorganizados con dobles enlaces conjugados.

Este radical puede de nuevo sustraer un hidrógeno de un AGPI, para formar un hidroperóxido (AGPIOOH) y un segundo radical AGPI., el cual vuelve a reaccionar con el oxígeno molecular regenerando un nuevo radical lipoperóxido, propagando el proceso. LOO• + LH L• + O2

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LOOH + L• LOO.•

EL ESTRÉS OXIDATIVO. ANALÍTICA

La fase de finalización ocurre cuando dos radicales libres reaccionan entre sí, o cuando el radical reacciona con una sustancia donante de átomos de hidrógeno (llamada antioxidante, reductor o captador de radicales libres), dando lugar a productos inactivos. Como productos finales del proceso están los hidroperóxidos, hidroxiácidos grasos, epoxiácidos grasos, aldehídos poliinsaturados, hidroxialdehídos, dialdehídos, cetonas y otros, que pueden reaccionar con grupos amino de proteínas, fosfolípidos o ácidos nucleicos, comprometiendo el buen funcionamiento y la calidad del sistema biológico o elementos que los contienen. Uno de los productos formados en este proceso es el malonildialdehido (MDA), que tiene la capacidad de formar aductos coloreados (rosa) con el TBA, dando un máximo de absorción a 532 nm. Este es el mecanismo químico más usado para determinar la extensión de la peroxidación [Schinella et al., 2002].

Preparación de microsomas hepáticos de rata Se utilizan ratas Wistar macho (200-250 g) mantenidas en ayunas desde el día anterior. Los animales son sacrificados y los hígados rápidamente extirpados y colocados en disolución amortiguadora fosfato 10 mM, pH 7,4, conteniendo 11,5 g/L de KCl a 0 ºC, sobre hielo. El órgano es pesado, cortado en trozos y lavado tres veces con disolución amortiguadora a 0 ºC. Se homogeneiza en disolución amortiguadora a 0 ºC en proporción 1:3 (p/v). Se centrifuga a 12000 × g durante 30 min a 4 ºC. El sobrenadante obtenido se centrifuga a 100000 × g durante 60 min, recogiendo el precipitado que se homogeneiza con tampón en una proporción tal que se obtengan tantos mL como peso inicial de hígado. Se fracciona en alícuotas de 2-3 mL y se conservan a –70 °C, usándose dentro de los dos meses siguientes.

Peroxidación lipídica no enzimática: Sistema Fe2+ / ascorbato La generación no enzimática de OH. puede ocurrir a partir de la autooxidación del Fe2+ y la posterior dismutación del O2.-, haciendo que la 119

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reacción del H2O2 con el Fe2+ remanente promueva la formación de radical OH., que iniciará la peroxidación lipídica de las membranas microsomales. Fe2+ + O2 2 O2•˜ + 2 H+ Fe2+ + H2O2

Fe3+ + O2•˜ O2 + H2O2 OH• + OH˜ + Fe3+

En este sistema, la mezcla Fe2+/ascorbato se comporta como un catalizador de la peroxidación lipídica, ya que el ion ferroso que pasa a estado férrico durante el proceso, es reducido nuevamente por el ascorbato. La mezcla de reacción contiene 2 mg/mL de proteína microsomal en solución 1:2 v/v de tampón Tris-HCl 0,1 M (pH 7,4) y KCl 1,12%. La peroxidación lipídica es inducida por la adición de ascorbato (5 µM) y FeSO4 (500 µM). La reacción se realiza a 37 ºC durante 20 min, tras lo cual se detiene por el agregado de acido tricloroacetico (TCA) al 10%, manteniéndose en hielo durante 10 min. Tras centrifugar durante 10 min a 3000 × g y 4 ºC se toma 1 mL del sobrenadante y se le añade 1 mL TBA 0,7%. Los tubos son calentados en baño de agua a 90 ºC durante 30 min y finalmente, tras ser enfriados se mide la absorbancia a 532 nm. En cada experiencia tendremos un tubo control, donde la absorbancia será máxima puesto que es donde mayor peroxidación lipídica se produce, un tubo blanco para conocer el grado de peroxidación espontánea del material lipídico en ausencia del inductor, un tubo de la muestra a ensayar y otro con su blanco. En la medida que los productos ensayados sean activos, la generación de material reactivo se verá disminuido. Las muestras ensayadas, al igual que la referencia BHT se disuelven en DMSO. La actividad antioxidante se evalúa mediante el cálculo del porcentaje de inhibición de la peroxidación lipídica, según la fórmula siguiente:

120

EL ESTRÉS OXIDATIVO. ANALÍTICA

Siendo:

Peroxidación lipídica enzimática: Sistema CCl4/NADPH El sistema citocromo P450 presente en la membrana de los microsomas hepáticos es activado por la adición de NADPH, como consecuencia de esto, el CCl4 previamente añadido se trasforma en una especie radicalaria muy reactiva, como es el radical triclorometilperoxilo, que inicia la peroxidación lipídica.

La mezcla de reacción contiene la disolución generadora de NADPH, compuesta por NADPNa2 (0,2 mM), glucosa-6-fosfato Na2 (4 mM) y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (0,6 U/mL) en una disolución formada por 18 mL de KCl (0.15 M), 12 mL de tampón Tris-HCl (0.1 M, pH = 7,4) y 8 mL de H2O, todo ello ajustado a un pH de 7,4. Posteriormente se adiciona la muestra a ensayar o vehículo, CCl4 disuelto en DMSO (0,2 M) y tras la adición de la suspensión microsomal (1,5 mg/mL), se agitan y se incuban los tubos a 37 ºC durante 15 min. La peroxidación se detiene añadiendo TCA (10 %) y manteniendo los tubos en hielo durante 10 min. Tras centrifugar a 3000 × g, durante 10 min a 4 ºC, se opera como en el protocolo anterior. Al igual que en el sistema Fe2+/ascorbato, tendremos un tubo control que presentará el máximo de absorción, un tubo muestra y los respectivos blancos. En estos últimos se medirá el grado de peroxidación inducida exclusivamente por el NADPH presente en el medio de reacción en ausencia de CCl4. Los productos y la referencia (BHT) se disuelven en DMSO. La actividad antioxidante se evalúa mediante el 121

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

cálculo del porcentaje de inhibición, según la fórmula expresada en el apartado anterior.

Actividad captadora de especies reactivas del oxígeno Radical superóxido El radical superóxido es el primer producto de la reducción univalente del oxígeno. Aunque no es muy reactivo es importante, porque a partir de él se generan otras especies oxigenadas de más relevancia. Se puede generar con distintos sistemas químicos y enzimáticos. La detección del anión superóxido generado puede realizarse con medios químicos sencillos, debido al carácter reductor de esta molécula. Puede reducir compuestos tales como el ferricitocromo c y el azul de nitrotetrazolio (NBT) que son los más frecuentemente usados.

Generación del radical superóxido mediante el sistema hipoxantina/xantina oxidasa La xantina oxidasa es capaz de generar O2.- in vivo por la oxidación de los productos que provienen del catabolismo de las bases púricas. Esta enzima cataliza las siguientes reacciones de oxidación: Hipoxantina

Xantina

Ácido úrico + O2•˜ + H2O2

El O2.- generado en esta secuencia de reacciones, debido a su carácter reductor, puede reducir compuestos como el NBT, que al ser reducido por el O2.- da lugar a la formación de un cromóforo (formazán) que presenta un máximo de absorción a 560 nm. Aquellos compuestos captadores de O2.- disminuirán la velocidad de formación de dicho cromóforo. Es necesario descartar una posible interferencia del compuesto con la enzima mediante una modificación del ensayo. Igualmente se ha de determinar si el mismo compuesto puede comportarse como reductor del NTB. Este método es altamente sensible y aunque el NBT no es reducido de modo específico por el O2.-, no es fácilmente reducible por compuestos fenólicos, lo que lo hace un método de elección cuando 122

EL ESTRÉS OXIDATIVO. ANALÍTICA

se evalúan muestras que contienen este tipo de principios, especialmente con sustitución catecol. Conforme al protocolo seguido [Haliwell y Guteridge, 1989] la mezcla de reacción (volumen total de 1 mL, en cubeta de plástico o cristal) contiene tampón KH2PO4-KOH (50 mM, pH 7,4), hipoxantina (100 µM), Na2EDTA·2H2O (1 mM), NBT (100 µM) y 10 µL del producto a ensayar, de la referencia pirogalol o del vehículo. La reacción se inicia con la adición de xantina oxidasa (0,06 UI/mL), determinando cinética de la variación de la absorbancia a 560 nm durante 2 min. El grupo control presenta el máximo de radical superóxido generado durante la reacción según nuestras condiciones experimentales. También ensayamos blancos de la reacción, en los que no se adiciona la enzima para comprobar que no existe reducción espontánea del NBT. Si adicionamos a la mezcla de reacción un producto que se comporte como captador de radicales superóxido, disminuye la velocidad de la reacción de reducción del NBT. Es importante ensayar blancos del producto a fin de descartar una posible interferencia del producto en estudio con el sistema detector, ya que algunos compuestos podrían reducir al NBT. Se realiza la determinación cinética de la variación de la absorbancia durante 2 min y los resultados se expresan como porcentajes de inhibición de la reducción del NBT. El porcentaje de inhibición de la producción de radical superóxido se expresa según la fórmula:

Siendo:

123

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Inhibición de xantina oxidasa Productos que inhiben la actividad de la xantina oxidasa producirán una disminución en la generación de anión superóxido por este sistema, por tanto la reducción de NBT será menor que en los controles. Así pues, es necesario comprobar si los compuestos en estudio actúan a este nivel. Tal como se describió previamente, esta enzima cataliza la oxidación de las bases xánticas a ácido úrico, cuyo máximo de absorción se encuentra a 295 nm, lo cual permite hacer un seguimiento espectrofotométrico de la reacción. Para ello, se introduce en una cubeta de reacción xantina oxidasa (0,06 UI/mL) y la muestra a ensayar, el vehículo (blanco) o la sustancia de referencia (alopurinol). Se incuba a temperatura ambiente durante 15 min, transcurrido dicho tiempo se añaden tampón KH2PO4-KOH (50 mM, pH 7,4), Na2EDTA (1 mM) y xantina (100 µM). Se realiza la determinación cinética de la variación de absorbancia a 295 nm durante 2 min. Los resultados se expresan como porcentajes de inhibición de la producción de ácido úrico.

Generación del radical superóxido mediante el sistema fenazina metasulfato (PMS) / NADH Este sistema generador de radical superóxido puede ser utilizado como alternativo cuando los extractos o compuestos ensayados inhiben a la xantina oxidasa. Es un sistema sencillo en el cual la fenazina metasulfato (PMS) reducida por NADH interactúa con el oxígeno, con lo que se produce radical superóxido que a su vez reduce el NBT a formazán [Betts, 1985]. La mezcla de reacción contiene tampón KH2PO4-KOH (20 mM, pH 7,4), NADH (150 µM), NBT (43 µM) y producto a ensayar (grupo problema), producto de referencia (pirogalol) o vehículo (blanco). Tras agitar se dispone en la celda espectrofotométrica y se inicia la reacción con la adición de PMS (2,7 µM), e inmediatamente se realiza la determinación cinética de la variación de la absorbancia a 560 nm durante 2 min. La actividad antioxidante se evalúa mediante el cálculo del porcentaje de inhibición, según la fórmula expresada en el apartado anterior. 124

EL ESTRÉS OXIDATIVO. ANALÍTICA

Radical hidroxilo Entre las especies reactivas derivadas del oxígeno, el radical hidroxilo es uno de los más inestables y reactivos, posee un gran poder oxidante siendo capaz de reaccionar con otras moléculas tales como ácidos grasos, aminoácidos, azucares, ácidos nucleicos, etc.

Generación de radical hidroxilo (sistema Fe3+–EDTA / H2O2 / ascorbato) La técnica para obtener radical hidroxilo se basa en la reacción del ion ferroso con el H2O2 (reacción de Fenton) Fe2+ + H2O2

HO• + HO˜ + Fe3+

Esta reacción esta favorecida por el agregado de quelantes del hierro (EDTA, citrato) y agentes reductores como ácido ascórbico. Cuando en el medio de agrega desoxirribosa, el radical generado la degrada, generando una mezcla de productos que reaccionan con el ácido tiobarbiturico (TBA) para dar un producto con un cromóforo con un máximo de absorbancia a 532 nm [Halliwell et al., 1987]. La mezcla de reacción contiene solución tampón KH2PO4 – KOH (10 mM; pH 7,4), ascorbato (50 µM), FeCl3 (20 µM), EDTA (100 µM), H2O2 (1,42 mM), desoxirribosa (2,8 mM) y la muestra a ensayar. El ascorbato, peróxido de hidrogeno y desoxirribosa se disuelven en la solución tampón. Se incuba esta mezcla a 37 ºC durante 60 min, tras los cuales se determinan sustancias reactivas al TBA. El ensayo también se realiza en ausencia de ascorbato con el fin de estudiar el posible efecto pro-oxidante de los componentes a ensayar. Como sustancias de referencia se utilizan dimetilsulfóxido (DMSO) o manitol.

Capacidad antioxidante total Se han desarrollado varios métodos espectrofotométricos para la determinación del potencial antioxidante de diferentes sistemas bioquímicos. Estos métodos son de rápida aplicación, escasa manipulación de material biológico y bajas necesidades instrumentales por lo que su aplicación es sencilla. La eficacia antioxidante de las muestras en125

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

sayadas se compara con patrones conocidos como ácido ascórbico o Trolox. Estos ensayos se pueden diferenciar por el procedimiento de las reacciones. Algunos utilizan el retraso en la oxidación como parámetro de la actividad antioxidante, otros analizan la capacidad de captación del radical libre o reducción del ion metálico o catión radical [Arnao et al., 1999]. Los métodos que se mencionan a continuación son ampliamente usados en diferentes estudios de la capacidad antioxidante de sistemas biológicos (como plasma sanguíneo o tejidos), tanto de extractos y compuestos aislados de especies vegetales como productos derivados de procesos industriales.

Reacción con el radical 2,2’-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfonato de amonio (ABTS•+) La base del método consiste es formar un radical catiónico ABTS•+ (cromóforo verde) basado en la acción oxidativa de peroxidasas u oxidasas sobre ABTS. Una solución estable de ABTS•+ también puede ser preparada con agentes oxidantes tales como dióxido de manganeso o persulfato de potasio. El radical ABTS•+ presenta máximos de absorción a 414 nm y en las proximidades del infrarrojo (645, 732 y 815 nm). Esta propiedad da la posibilidad de evitar interferencias generadas por cromógenos de la muestra a estudiar. El fundamento de este método consiste en observar la decoloración del radical ABTS debido a la interacción con especies donantes de hidrógeno ABTS (incoloro) ABTS•+ + R H

- 1 e˜

ABTS•+ (verde) ABTS + R•

El radical ABTS•+ se produce utilizando una mezcla de reacción que contiene ABTS (7 mM) y persulfato de potasio (2,45 mM) en tampón fosfato pH 7,0. La mezcla de reacción se prepara 12 h antes de su uso y se mantiene a temperatura ambiente y en ausencia de luz. Se ajusta la absorbancia de la disolución ABTS •+ a 0,7 unidades a 732 nm con tampón [Pannala et al., 2001]. 126

EL ESTRÉS OXIDATIVO. ANALÍTICA

La actividad antioxidante se evalúa midiendo el cambio de absorbancia a 732 nm de la solución de ABTS •+ cuando se alcanza el estado estacionario (Arnao, 1999). La capacidad captadora de radicales libres se calcula como se indica en el apartado anterior.

Medida de la capacidad reductora: Método FRAP Este método evalúa la capacidad antioxidante de una muestra biológica de acuerdo a su capacidad para reducir un determinado compuesto. Originariamente este método se lo denominó “Ferric reducing ability of plasma” (FRAP) porque fue utilizado para medir la actividad antioxidante del plasma humano. Actualmente se lo denomina “Ferric reducing/antioxidant power” y su utilización se ha extendido al estudio de diferentes compuestos, mezclas o extractos biológicos. La base del método consiste en la reducción de un compuesto o mezcla de compuestos (X) sobre el Fe+3 presente en un complejo con un compuesto orgánico: Tripyridyltriazine (TPTZ). Cuando el hierro del complejo es reducido a la forma ferrosa toma un color azul que presenta un máximo de absorción a 593 nm y cuya intensidad de color es proporcional a la capacidad reductora del compuesto o compuestos ensayados (Benzoe et al., 1996). TPTZ-Fe+3) (Color pardusco)

[X] +1e-

TPTZ-Fe+2 (Color azul intenso)

La determinación de la capacidad reductora se lleva a cabo en tampón acético - acetato de sodio 0,3 M a pH 3,6 conteniendo TPTZ (1 mM) y FeCl3 (2 mM). Las soluciones deben ser preparadas el mismo día del ensayo. Para la medida de la capacidad antioxidante se mezcla un volumen de la muestra con 10-100 volúmenes del reactivo recientemente preparado. Se determina la absorbancia a 593 nm a tiempo 0 (A0) y luego de 8 min (A8). La diferencia (A8) – (A0) se compara con la obtenida en una determinación paralela utilizando una sal de Fe+2 (FeSO4, 100 – 1000 µM) como compuesto de referencia. 127

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Las actividades de las muestras en estudio se expresan como equivalentes de Fe+2. También se puede utilizar ácido ascórbico como compuesto de referencia. Los volúmenes a utilizar dependerán de los instrumentos disponibles ya que la determinación se puede realizar en forma automatizada o manual. El tiempo que se requiere para completar la reacción puede ser muy variable en función de los compuestos o mezclas de ellos a estudiar, variando desde segundos hasta minutos, aunque se considera que tras 8 minutos la reacción se completa, al menos con la mayoría de compuestos ensayados. La relación dosis–respuesta es linear hasta una absorbancia de 2,0 para concentraciones de compuestos de 1 mM o superiores. Se puede realizar también un monitoreo cinético determinando las pendientes de crecimiento de la absorbancia a tiempos variables, si el objetivo del trabajo lo requiere.

Reacción con el radical 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH) El fundamento de esta técnica consiste en la medición a 517 nm de la reducción del radical estable 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH.). La absorbancia característica de este radical que posee un color violeta intenso, disminuye en presencia de un antioxidante (AH) u otro radical (R.). Es posible, por tanto, cuantificar la capacidad captadora de radicales libres que poseen determinados compuestos mediante la determinación del grado de decoloración que provocan a una disolución metanólica de DPPH [Brand-Williams et al., 1995]. DPPH• + AH DPPH• + R•

DPPH-H + A• DPPH-H

Según el protocolo de Cavin et al. (1998) se introduce en un tubo de reacción 7,5 µL de la muestra a ensayar, vehículo o compuestos de referencia (butilhidroxitolueno o BHT, quercetina) a las concentraciones estudiadas, 250 µL de agua destilada y 500 µL de la disolución de DPPH (20 mg/mL). Tras incubación a temperatura ambiente y en oscuridad durante 30 min, se lee la absorbancia a 517 nm. 128

EL ESTRÉS OXIDATIVO. ANALÍTICA

La capacidad captadora de radicales libres (capacidad de decoloración) se determina mediante la siguiente fórmula:

siendo:

Bibliografía Arnao M, Cano A, Acosta M (1999): Methods to measure the antioxidant activity in plant material. A comparative discussion. Free Rad. Res. 31:S89-96. Aruoma O (2003): Methodological considerations for characterizing potential antioxidant actions of bioactive components in plant foods. Mutation Res. 523-524: 9-20. Benzie IFF, Strain JJ (1996) The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: The FRAP assay. Anal. Biochem. 239:70-76. Betts WH (1985): Detecting oxy radicals by chemiluminescence. In: Greenwald, E.A. (ed.) Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. CRC Press, Boca Raton, pp. 197-201 Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C (1995): Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensm.-Wiss u. – Technol. 28:25-30. Cavin A, Hostettmann K, Dyatmyko W, Potterat O (1998): Antioxidant and lipophilic constituents of Tinospora crispa. Planta Med. 64:393-396. Halliwell B, Gutteridge JMC (1989) Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford: Clarendon Press. Halliwell B, Gutteridge, JMC, Aruoma O (1987): The deoxyribose method: a simple “test tube” assay for determination of rate constants for reaction of hydroxyl radicals. Anal. Biochem. 165:215-219. Pannala AS, Chan TS, O’Biren J, Rice-Evans C (2001): Flavonoid B-ring chemistry and antioxidant activity: Fast reaction kinetics. Biochem. Biophys. Res. Comm. 282:1161-1168. Schinella GR, Tournier, HA, Prieto JM, Mordujovich de Buschiazzo P, Ríos JL (2002): Antioxidant activity of anti-inflammatory plant extracts. Life Sci. 70: 1023-1033.

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EL DISEÑO EXPERIMENTAL Alfredo Rosas Romero y Gloria Saavedra [email protected] / [email protected]

EL DISEÑO EXPERIMENTAL 1

Alfredo Rosas Romero y 2Gloria Saavedra

[email protected] / [email protected] 1 Universidad Simón Bolívar. Departamento de Química. Apartado 89000 Caracas 1080A. Venezuela 2 Centro de Tecnología Agroindustrial, Facultad de Ciencias y Tecnología, Universidad Mayor de San Simón, PO Box 992, Cochabamba, Bolivia.

En la búsqueda de nuevas fuentes de antioxidantes naturales, estudiamos una colección de plantas bolivianas, paraguayas, mediterráneas, y frutas colombianas. Nuestro diseño experimental parte de la recolección del material vegetal, al que clasificamos taxonómicamente. Este material lo sometimos luego a un proceso de extracción y fraccionamiento. El siguiente paso del diseño es la evaluación de la actividad antioxidante en los extractos crudos y las fracciones resultantes del proceso anterior. Para obtener información de interés para la industria de grasas y aceites, plásticos y polímero, cosméticos, alimentos, y en general, para investigar sobre las aplicaciones frente al fenómeno de la rancidez oxidativa, Empleamos la técnica de la decoloración del β-caroteno y el ensayo del Rancimat para la estabilidad oxidativa. Por su parte, mediante el uso de la técnica del DPPH obtenemos sobre la actividad antioxidante global de cada una de nuestras muestras. Y, para evaluar la actividad como bioantioxidantes, frente a procesos inflamatorios, alérgicos y como protectores ante la acción de las Especies Radicales de Oxígeno, empleamos ensayos más particulares como las técnicas del Fe2+ - ascorbato, CCl4–NADPH, anión Superóxido y la actividad atrapadora del radical hidroxilo. Con las plantas bolivianas y paraguayas, preparamos un extracto metanólico del material vegetal, y luego lo fraccionamos con solven133

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

tes de polaridad creciente (hexano, cloroformo, acetato de etilo y la fracción acuosa remanente). Empleando las técnicas de la decoloración del β-caroteno y del entrampamiento de los radicales producidos por el DPPH, determinamos el poder antioxidante en el extracto crudo y en cada una de las fracciones. Esto no da una respuesta al potencial uso de esas plantas como fuentes de antioxidantes de aplicabilidad industrial. Con las frutas colombianas, preparamos un extracto acuoso al cual le determinamos el poder antioxidante siguiendo la ténica del DPPH, y también medimos el contenido de fenoles, entre otros análisis. Este trabajo se refiere a la eventualidad de mercadear estas frutas como suplementos dietéticos de antioxidantes. Para las plantas mediterráneas, el poder antioxidante lo medimos de acuerdo a las técnicas del Fe2+ - ascorbato, CCl4–NADPH,.anión Superóxido y el DPPH, junto con pruebas de actividad antialérgica, antiinflamatoria. En esta sección presentamos la descripción de los protocolos experimentales y de las técnicas empleadas. Información detallada la presentaremos en la discusión de los resultados específicos. Realizamos un estudio singular sobre los estilbenos en el ruibarbo (Rheum undulatum L.). Realizamos el estudio fitoquímico del extracto del rizoma y evaluamos la actividad como antioxidante y bioantioxidante de los compuestos resultantes. Finalmente, arribamos a varias conclusiones sobre la relación actividad antioxidanteestructura de estos compuestos y sobre el mecanismo de la actividad antioxidante. Según nuestra propuesta, después de la selección del material vegetal más apropiado de acuerdo a los resultados de la evaluación de la actividad antioxidante, debe realizarse un estudio fitoquímico para identificar los compuestos mayoritarios determinantes de la actividad. Presentamos el estudio fitoquímico del Ophryosporus heptanthus, recolectada a 3-5 Km al sur de Tarata (Bolivia). También realizamos el estudio fitoquímico del HINOJO AMARGO (Foeniculum vulgare) y la evaluación de la actividad antioxidante de los compuestos puros aislados, empleando el método del DPPH, el de los radicales 134

EL DISEÑO EXPERIMENTAL

hidroxilo por el método de quimioluminiscencia (QL), y/o el del anión superóxido (SO). Finalmente, la especie que, de acuerdo a nuestros resultados, sea seleccionada como fuente de antioxidantes, debe ser sometida a un proceso de domesticación para obtener las mejores condiciones para su cultivo a escala industrial. Presentaremos dos casos de domesticación, uno realizado en Tenerife y el otro en Zaragoza. En el primero trabajamos con Salvia canariensis, una xerófila endémica del Archipiélago Canario. Nuestro objetivo final es tratar de rentabilizar como un recurso económico para Canarias la especie endémica Salvia canariensis vía la domesticación y cultivo de la misma para su explotación industrial en su vertiente doble de aceites esenciales, para la industria de la perfumería y de sustancias de alto valor añadido como antioxidantes, para la industria cosmética, farmacéutica ó de nutricientes. En el segundo estudio, en Zaragoza, trabajamos con una serie de plantas importantes comercialmente por su contenido de aceites esenciales. El material vegetal remanente de la destilación de esos aceites lo evaluamos luego como fuente de antioxidantes. En ambos casos realizamos la domesticación de las plantas respectivas, para adaptarlas al cultivo industrial sustentable.

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Sobre el material vegetal Recolección Antes de efectuar la recolección del material vegetal, realizamos una amplia prospección de especies, seleccionando plantas adultas que de ser posible, estuvieran en estadio de floración-fructificación, para poder contar con órganos reproductivos (flor y/o fruto) para verificar la identificación taxonómica. Colectamos muestras de especies con diferentes tallos o hábitos de crecimiento: herbáceos, arbustivos y arbóreos. Tomamos 4 muestras representativas por planta: una para el herbario (clasificación taxonómica), otra para intercambio con otros herbarios, una tercera para enviar a especialista y la cuarta para los trabajos de caracterización. Realizamos el acondicionamiento utilizando la técnica del alcohol, para facilitar el transporte y evitar que las muestras se malograsen durante el traslado por efecto de la humedad. Ya en el Herbario, las prensamos y cada 2 días cambiamos el cartón secante. Una vez secas las muestras las envolvimos en paquetes y las refrigeramos por 48 - 72 hrs, a –8 °C para eliminar cualquier agente contaminante, que pudiera deteriorar la muestra. Las muestras destinadas para las extracciones las acondicionamos en bolsas de plástico trenzado para su transporte.

Identificación Taxonómica La descripción botánica de cada planta, que incluimos en el capítulo DESCRIPCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL, la hemos realizado basándonos en la observación directa de la muestra y en una revisión bibliográfica de la literatura. La prospección se refiere a: lugar de colecta, colector, número del colector y el Herbario donde se encuentra la muestra. La identificación la realizamos siguiendo la metodología convencional, esto es, mediante claves y referencias bibliográficas a familia, género y especie; por comparación en consulta con material botánico de los herbarios: Herbario Forestal Nacional “Martín Cárdenas” de Cochabamba (BOLV) y el Herbario Nacional de La Paz (LP); y, por consulta a especialistas como Nee, M. (1998) especialista en Solanáceas, y S. Beck y R. Michel (especialistas en varias familias). 136

EL DISEÑO EXPERIMENTAL

Después de prensarlas y secarlas, identificamos taxonómicamente todas las muestras; primero hasta familia, utilizando claves generales como la de Cronquist (1981); luego seguimos claves a géneros y de estos a especies. Para las muestras de los Valles Secos, la bibliografía más usada fue la flora de Jujuy y la de Entre Ríos; para las muestras de las zonas húmedas se uso la Guía de árboles de Bolivia, Flora del Perú, Flórulas de las Reservas Biológicas de Iquitos Perú y otras monografías (Burkat, 1969a; Burkat, 1969b; Burkat et al., 1987; Cabrera, 1993; Cabrera, 1983; Cabrera 1978; Killeen et al., 1993; Macbride, 1936, 1937, 1938, 1941, 1943, 1956, 1960, 1991a, 1991b; Vásquez, 1997; Moreno, 1984). Una vez que llegamos al género o especie, verificamos nuestros resultados con la descripción botánica del taxón en la bibliografía y/o por comparación con muestras del Herbario. Aquellas muestras afines o por confirmar o que no pudimos identificar en el Herbario Forestal Nacional Martín Cárdenas, las enviamos al Herbario de La Paz, donde se prosiguió con la identificación. Finalmente, aquellas plantas con identificación dudosa las enviamos a especialistas en el exterior del país. Esa información la agregaremos en el lugar correspondiente a esas plantas, en el capítulo Descripcion del Material Vegetal.

Caracterización botánica Los datos de campo tomados fueron: fecha y lugar de recolección, hábitat de la zona (tipo de suelo, clima y altitud), características de la planta y color y olor de la corteza interna y externa de árboles. En las muestras de herbario, el material para su identificación se suavizo con agua tibia, para poder observar las siguientes características morfológicas: número de estambres, tipo e inserción de anteras, numero de pétalos y sépalos, posición de ovario (ínfero, supero o medio), número de pistilos, estilos y estigmas en el gineceo, tipo de placentación (corte transversal del ovario), número de lóculos en el ovario, número de óvulos, tipo de inserción de los diferentes verticilos, forma del estilo, presencia de pelos, tipo de fruto, tipo de flores o inflorescencias, forma, nerviación y arreglo de las hojas, presencia o ausencia de pelos, glándulas, tricomas. 137

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Extracción y fraccionamiento Preparación de los extractos crudos A partir de la parte aérea de las plantas, previo secado a temperatura ambiente, bajo sombra, preparamos un extracto metanólico. Para ello empleamos 30 g del material vegetal, lo molimos y lo extrajimos, a temperatura ambiente, con 600 mL de metanol. Después de 24 horas de maceración descartamos los sólidos, filtrándolos a través de papel de filtro, y eliminamos el metanol a presión reducida. Al material resultante de esta extracción lo denominamos extracto crudo (EC).

Fraccionamiento de los extractos crudos Con el objeto de obtener fracciones con compuestos de polaridad creciente, disolvimos el extracto crudo (EC1) en la mínima cantidad necesaria de metanol y le agregamos 200 mL de agua destilada. Después de 24 horas de refrigeración, eliminamos los sólidos por filtración con papel de filtro. La solución acuosa resultante la particionamos con pequeños volúmenes de hexano, resultando la fracción de solubles en hexano, que llamaremos FHX, y a la solución acuosa remanente, libre de solubles en hexano, lo llamaremos EC2. Luego fraccionamos con cloroformo, llamaremos FC3 a esta fracción con los solubles en cloroformo, y, finalmente, fraccionamos con acetato de etilo, para obtener la fracción FAC. La solución acuosa remanente la liofilizamos, a esta fracción la llamamos FOH. Los solventes de las fracciones orgánicas los eliminamos a presión reducida. Este procedimiento se lo aplicamos a todas las plantas.

Evaluación de la Actividad Antioxidante Decoloración del β-caroteno Fundamento de las técnica En el medio de reacción se desarrolla la propagación de la reacción de autoxidación del ácido linoleico, que podemos representar como: L• + O2 LOO2 + LH 138

LOO2• LOOH + L•

EL DISEÑO EXPERIMENTAL

Donde: LH = una molécula de ácido linoleico LOOH = hidroperóxido del ácido linoleico. L• = radical del ácido linoleico LO2• = radical peróxilo

Estructura del β-caroteno

Los radicales libres así formados, reaccionan con el β-caroteno presente en el medio destruyendo la conjugación original de sus dobles enlaces, y en consecuencia disminuyendo la intensidad del color anaranjado que él aporta a la solución. Esta perdida de absorbancia es la que medimos en función del tiempo, como una expresión del transcurso de la autoxidación del ácido linoleico. Esta reacción del ácido linoleico puro la tomamos como el control para nuestras determinaciones. En otras celdas de reacción agregamos, a la solución control, los extractos o fracciones que deseemos evaluar, y la velocidad de disminución de la intensidad del color del β-caroteno estará relacionado con el poder antioxidante de las muestras bajo evaluación.

Procedimiento • Preparación de la solución de ABAP. Disolver 54,2 mg de 2,2´azobis(2-amidinopropano) dihidrocloruro (ABAP) en 50 µL de agua purificada, saturada con argón. • Preparación de la solución de BHA. 2-t-butil-4-metoxifenol (BHA) es el antioxidante de referencia empleado para esta técnica. Recristalizarlo de etanol. Disolver 24,6 mg de BHA en 100 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). • Preparación de la solución de β−caroteno. Recristalizar el β−caroteno de etanol y conservarlo a –15 ºC, bajo atmósfera de argon seco. Disolver 20 mg de β−caroteno en 500 µL de cloroformo. Esta solución es estable por varios días. • Preparación de la solución de la emulsión de β−caroteno. Purificar 500 µL de la solución de β−caroteno, pasándola a través de una minicolumna SEP-PAK, que ha sido previamente acti139

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vada con 5 mL de éter de petróleo. Eluir con cuatro porciones de 2 mL de del mismo solvente. Recoger el eluyente en un balón volumétrico de 100 mL, evaporar el solvente con argón seco, hasta 10% de su volumen original, agregar 200 mg de Tween 20 y 13,5 mmoles de ácido linoleico y eliminar el remanente del solvente con argón seco. Enrasar con agua purificada, saturada con argón seco. Llevar el balón a un baño de ultrasonido para eliminar los gases y homogeneizar la emulsión. La emulsión resultante debe ser transparente. Tomar 30 mL de esta emulsión, saturarla con oxígeno durante 60 s, y usarla de inmediato. • Preparación de las soluciones de las muestras a evaluar. Preparar soluciones del material a evaluar a la misma concentración del BHA (24,6 mg/mL). Usar DMSO como solvente. • Otras recomendaciones. Mantener el ácido linoleico, en ampolla de vidrio, bajo una atmósfera de argón seco, a –15 ºC. El agua debe ser desionizada y triple destilada, con una conductividad menor que 4 uS, de lo contrario no se lograrán emulsiones homogeneas afectando la reproducibilidad de los datos. Después de su uso, limpiar los cartuchos SEP PAK con etanol y 10 mL de éter de petróleo. Descartar los cartuchos si le aparecen grietas. Trabajar en un ambiente de luz de baja intensidad. Purificar el argón pasándolo sucesivamente por columnas de carbón activado, tamiz molecular y silica gel. • Procedimiento de la evaluación. La celda 1 (referencia espectroscópica, 100% T) contiene 2100 µL de una solución de 100 g de Tween 20 en 50 mL de agua purificada. Todas las otras celdas contienen 1990 µL de la emulsión de β−caroteno. Colocar las celdas en el soporte termostatado del espectrofotómetro y esperar seis minutos para el equilibrio térmico a 32.0 + 0,1 ºC. Agregar 10 µL de la solución de ABAP a las celdas 2-8, para iniciar la oxidación del ácido linoleico, agitar, en un vortex, cada celda durante 20 s y medir la absorbancia, a 460 nm, cada 2 minutos, durante 10 minutos. Al concluir este lapso, agregar 100 µL de la solución de BHA a la celda 2, y el mismo volumen 140

EL DISEÑO EXPERIMENTAL

de las cinco soluciones a evaluar, a las celdas 3-7, respectivamente. Agregar 100 µL de DMSO a la celda 8 (control, no contiene antioxidante, mide la oxidación del linoleico sin ningún agregado). Agitar las celdas 2-8 en un vortex, durante 20 s. El espectrofotómetro toma las medidas de absorbancia de todas las celdas automáticamente, cada 2 minutos, durante 90 minutos. Realizar todos los experimentos por triplicado. Para asegurar la reproducibilidad de los datos, en todos los experimentos se debe incluir el BHA y el control fotométrico (celdas 2 y 8) (Rosas-Romero et al., 1999). • Cálculos. En la figura que mostramos abajo representamos un experimento típico. El equilibrio térmico se logra durante la sección A. Al final de este tiempo, agregamos el iniciador de la formación de radicales (ABAP).Es conveniente apuntar que este iniciador permite mantener constante la velocidad inicial de la oxidación del linoleico, y que esta velocidad es dependiente de la cantidad de ABAP agregada; con lo cual aseguramos, dentro del error experimental, que el ácido linoleico inicia su oxidación a la misma velocidad en todos nuestros experimentos. Durante la sección B se establece el estado estacionario de la cinética de oxidación del linoleico. En el tiempo C agregamos la solución de BHA a la celda 2, como patrón de referencia de la inhibición de la oxidación; agregamos las soluciones de las muestras que vamos a evaluar, a las celdas 3-7 y le mismo volumen de solvente a la celda 8, como control de la oxidación del linoleico sin antioxidante agregado. Se obtendrán resultados incorrectos si eliminamos esta celda de control, porque ella representa la velocidad máxima de la oxidación del linoleico en nuestras condiciones, o sea, esta celda evidencia el 0% de inhibición. La diferencia aritmética del valor de las pendientes, de las reacciones durante la sección D, es lo que relacionaremos con el poder antioxidante. Definimos la actividad antioxidante de una muestra, φ, como la inhibición de la reacción de oxidación del ácido linoleico, tomando a

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Resultado típico de la técnica de decoloración del β−caroteno. Los números representan la colocación de las celdas. La celda 1 es la referencia fotométrica, 100% T.

la acción de BHA como 100%. Y la calculamos mediante la siguiente expresión: φ = [(Pc – Pm) / (Pc – PBHA)] x δ x 100 Donde, Pc = es la pendiente de la reacción control, sin antioxidante agregado Pm = es la pendiente de la muestra bajo evaluación PBHA = es la pendiente de la reacción que contiene el antioxidante de referencia, BHA δ = es la concentración del BHA/concentración de la muestra, en mg/mL; igual a 1 en nuestro diseño.

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EL DISEÑO EXPERIMENTAL

Las pendientes se calculan mediante la regresión de la absorbancia en función del tiempo, empleando los datos de la zona lineal, en la sección D, de la celda correspondiente.

Capacidad de captura de radicales libres (DPPH) Fundamento de la técnica La molécula de DPPH contiene un radical libre estable. Como consecuencia del color púrpura de sus soluciones, esta molécula absorbe a 517 nm. El ensayo se fundamenta en la disminución del color púrpura de sus soluciones como consecuencia de la donación de un electrón por un compuesto con poder antioxidante.

Procedimiento • Preparación de la solución de DPPH. Disolver 2,0 mg de 2,2di-(4-t-octilfenil)-1-picrilhidrazilo (DPPH) en 100 mL de etanol (20 mg/L). Usar esta solución de inmediato y conservarla en oscuridad. • Preparación de las soluciones a evaluar. Preparar soluciones a la concentración de 300 µg/mL y, a partir de ellas, preparar soluciones con las siguientes concentraciones: 100, 50, 10, 5 y 1 µg/mL. 143

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

• Procedimiento de la evaluación. La celda 1 (referencia, 100% T) debe contener 2250 µL del solvente (metanol:agua 2:1 v/v). La celda 2 (ADPPH) contiene 1500 µL de la solución de DPPH y 750 µL de agua purificada. La celda 3 (Ablanco) contiene 1500 µL de la solución del solvente y 750 µL de la solución de la muestra a evaluar. Las celdas 4-8 (Amuestra) contienen 1500 µL de la solución de DPPH y 750 µL de las soluciones de las muestras. Después de 5 minutos, medir la absorbancia a 531 nm (Brand-Williams et al., 1995). Trabajar a temperatura ambiente. Realizar todos los experimentos por triplicado. Trabajar en el máximo de absorbancia de la solución de DPPH. • Cálculos. Calcular el porcentaje de actividad de acuerdo con la siguiente expresión: %DPPH = [1-(Amuestra-Ablanco)]x100/ADPPH Los resultados de esta técnica los expresamos como la concentración de la muestra que inhibe 50% del efecto promotor de radicales libres del DPPH, a lo que llamaremos EC50, en µg/mL.

Comparación de las dos técnicas Escogimos estas dos técnicas para nuestro trabajo de monitoreo porque son fáciles de ejecutar, demandan pequeñas cantidades de muestra, arrojan resultados reproducibles, y miden la actividad antioxidante de los extractos y fracciones desde dos puntos de vista muy diferentes. La técnica basada en la decoloración del β−caroteno está muy bien relacionada con el fenómeno de rancidez en grasas y aceites, ya que trabaja, cercana a la temperatura ambiente, con una emulsión de ácido linoleico en agua, donde la cantidad de oxígeno no es limitante; mientras que la técnica del DPPH está relacionada específicamente con el entrampamiento de los radicales libres generados por el DPPH en un ambiente altamente polar, a temperatura ambiente, en ausencia de un sustrato lipídico oxidable. De esa manera, para que un extracto o sustrato sea considerado como interesante, no es 144

EL DISEÑO EXPERIMENTAL

necesario que produzcan buenos resultados en ambas técnicas; ya que buenos resultados con la técnicas del β−caroteno significa una alta capacidad para inhibir el proceso global de la rancidez de los sustratos lipídicos, mientras que la misma muestra puede dar bajos resultados con el DPPH, lo cual significa meramente que su actividad antioxidante no está basada en la inhibición de la acción de radicales libres tipo DPPH. Situaciones contrarias también son frecuentes (Brand-Williams et al., 1995). Nosotros proponemos el uso simultáneo de estas dos técnicas para los trabajos de monitoreo de la actividad antioxidante en fuentes naturales, porque de esa manera se obtiene una mejor información sobre la potencialidad de los extractos o fracciones que se estudien, y sobre su eventual aplicación industrial; ya que la primera nos habla del poder antioxidante frente a los procesos de rancidez oxidativa, y con el DPPH identificamos los extractos o fracciones que tienen una alta capacidad para inhibir la acción de los radicales libres. El uso simultáneo de estas dos técnicas también contribuiría a enfrentar el problema ocasionado por el uso, por los diferentes grupos involucrados con este tipo de trabajo, de una amplia variedad de técnicas para medir la actividad antioxidante, con la consiguiente dificultad en el momento de comparar los resultados, tal como está claramente documentado en la literatura del área (Arnao et al., 1999; Niki y Noguchi, 2000; Antolovich et al., 2002; Koleva et al., 2002 y Emmons et al., 1999).

Fenoles totales Para esta determinación empleamos el método de Folin-Ciocalteu (Singleton y Rossi, 1965). La mezcla de reacción está contituida por 0,1 mL del extracto, 7,9 mL de agua destilada, 0,5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu y1,5 mL de una solución de bicarbonato de sodio al 20 %. Mezclamos los frascos de reacción y los dejamos reposar por 2 horas. Medimos la absorbancia a 765 nm en un espectrofotómetro HITACHI U-2000. El contenido total de fenoles lo expresamos como equivalentes de ácido gálico/mg de muestra. 145

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Actividad atrapadora del radical hidroxilo Esta actividad la determinamos empleando el sistema Co(II)/EDTA/. OH/H2O2-luminol, siguiendo el método que hemos publicado previamente (Parejo et al., 2000). La intensidad de la quimioluminescencia (QL) la medimos como unidades relativas de luz (URL), en un luminómetro TD-20/20. La máxima intensidad de luminiscencia (la radiación de control) disminuye por la acción de las substancias atrapadoras del radical hidroxilo (Parejo et al., 2000, Merfort, et al., 1996). El medio de reacción lo preparamos en una solución tampón, pH=9, una solución de Co(II)/EDTA, luminol y la solución metanólica de la muestra a estudiar. Como control, usamos metanol.. Finalmente agregamos H2O2 para comenzar la reacción en ausencia de luz. Medimos la quimioluminiscencia después de 20 minutos de haber comenzado la reacción. Calculamos el porcentaje de inhibición de la siguiente manera: % Inhibición = [1 - (URLSAMPLE/URLCONTROL)] x 100 Mediante una regresión lineal del porcentaje de inhibición, en función de la concentración de la muestra, calculamos la concentración de muestra necesaria para inhibir el 50% de la QL, valor que denominamos IC50.

Actividad atrapadora del radical superóxido Generamos in vitro los radicales superóxido, empleando el sistema hipoxantina/xantina oxidasa y debido al carácter reductor de este anión, medimos su reacción con el azúl de nitrotetrazolio (NBT), a 560 nm. Los compuestos antioxidantes son capaces de inhibir esta reducción (Cos et al., 1998, Chu et al., 2000). La mezcla de reacción la preparamos en solución tampón de fosfato, pH 7,5, agregando EDTA (0,05 mM), hipoxantina (0,2 mM), NBT (1 mM), una solución acuosa o etanólica de la muestra y, de última la xantina oxidasa (1,2 U/µL). Preparamos un blanco para cada muestra. Las soluciones las preparamos diariamente y las mantuvimos protegidas de la luz. Los resultados los expresamos como porcentaje 146

EL DISEÑO EXPERIMENTAL

de inhibición de la reducción del NBT con respecto a la mezcla de reacción sin muestra (blanco de control), para ello empleamos la siguiente expresión: % Inhibición = {[(CABS - BCABS) - (SABS - BSABS)] / (CABS - BCABS)} x 100 Donde CABS, BCABS, SABS y BSABS representan la absorbancia del control, del blanco de control, de la muestra y del blanco de la muestra, respectivamente.

El ensayo del rancimat para la estabilidad oxidativa Para este ensayo maceramos el extracto seco (o el antioxidante de referencia), en aceite de maíz, a10 µg/mL, la cual es la concentración máxima permitida en la industria alimentaría para antioxidantes sintéticos. El método del Rancimat (Metrohm model 743, Herisan, Switzerland) determina el período de inducción mediante la medición de de los subproductos volátiles de la oxidación del aceite a 110ºC en presencia de un flujo de aire de 20 L/h. Luego, por conductimetría, medimos la concentración de los productos de degradación, los cuales son recogidos en agua destilada. A mayores períodos de inducción, mayor será la actividad antioxidante de la muestra en estudio. La actividad relativa la expresamos como el Factor de Protección (FP), el cual lo calculamos dividiendo el período de inducción del aceite en presencia del extracto en estudio, por el valor respectivo al del control, esto es el aceite de maíz sin nada agregado (Schwarz y Ernst, 1996). Decidimos emplear esta técnica, a pesar de sus limitaciones (Frankel, 1993), porque es empleada comúnmente en la industria de alimentos y en laboratorios gubernamentales de varios países (Murcia et al., 2001).

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

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EL DISEÑO EXPERIMENTAL

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DESCRIPCIÓN DE LAS PLANTAS Gloria Saavedra • [email protected] Benjamín Rojano • [email protected] Edelira de Velázquez • [email protected] José Luis Ríos • [email protected] Alfredo Rosas Romero • [email protected]

INTRODUCCIÓN Alfredo Rosas Romero [email protected] Universidad Simón Bolívar. Departamento de Química. Apartado 89000 Caracas 1080A. Venezuela

En esta sección presentamos una descripción detallada de las plantas estudiadas, su taxonomía, ubicación geográfica, usos reportados, entre otros datos. Para cada planta preparamos un extracto metanólico crudo (EC1), el extracto metanólico libre de solubles en hexano (EC2), una fracción hexánica (FHX), una clorofórmica (FC3), una de acetato de etilo (FAC) y una que contiene los compuestos remanente en solución acuosa (FOH). Mediante una escala cualitativa junto con la descripción de cada planta o fruta, incluimos los resultados de la evaluación de la actividad antioxidante de cada extracto o fracción.

Preparación de los extractos crudos A partir de la parte aérea de las plantas, previo secado a temperatura ambiente, bajo sombra, preparamos un extracto metanólico crudo (EC1). Para ello empleamos 30 g del material vegetal, lo molimos y lo extrajimos, a temperatura ambiente, con 600 mL de metanol. Después de 24 horas de maceración descartamos los sólidos, filtrándolos a través de papel de filtro, y eliminamos el metanol a presión reducida. Al material resultante de esta extracción lo denominamos extracto crudo (EC1).

Fraccionamiento de los extractos crudos Con el objeto de obtener fracciones con compuestos de polaridad creciente, disolvimos el extracto crudo (EC1) en la mínima cantidad 153

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

necesaria de metanol y le agregamos 200 mL de agua destilada. Después de 24 horas de refrigeración, eliminamos los sólidos por filtración con papel de filtro. La solución acuosa resultante la particionamos con pequeños volúmenes de hexano, resultando la fracción de solubles en hexano, que llamaremos FHX, y a la solución acuosa remanente, libre de solubles en hexano, lo llamaremos EC2. Luego fraccionamos con cloroformo, llamaremos FC3 a esta fracción con los solubles en cloroformo, y, finalmente, fraccionamos con acetato de etilo, para obtener la fracción FAC. La solución acuosa remanente la liofilizamos, a esta fracción la llamamos FOH. Los solventes de las fracciones orgánicas los eliminamos a presión reducida. Este procedimiento se lo aplicamos a todas las plantas. Medimos la actividad antioxidante de los diferentes extractos y fracciones empleando la técnica de lka decoloración del beta caroteno y por la técnica del entrampamiento de los radicales DPPH. Junto con la descripción de cada planta, incluimos una escala cualitativa que nos permite formarnos una idea de la actividad de sus extractos y fracciones.

Escala cualitativa Técnica de la decoloración del beta caroteno En este ensayo el 100 % de actividad lo adjudicamos a una solución patrón de BHA recristalizado con 10 µg/mL. La actividad de todas las muestras las referiremos porcentualmente a esa solución patrón. Hemos establecido que sólo consideraremos interesantes para los objetivos de este trabajo, aquellas muestras que presenten una actividad mayor o igual a 50 % la actividad de la solución patrón de BHA. +++++ ++++ +++

80-100 % 65-79 % 50-64 %

Queda claro que la escala continúa por debajo de +++, pero esos valores no nos interesan y los señalaremos como n.a. (“no actividad”). 154

DESCRIPCIÓN DE LAS PLANTAS

Técnica del DPPH La concentración de una muestra necesaria para entrampar el 50 % de los radicales DPPH, la denominamos EC50, este valor para el BHA recristalizado fue 11,1 µg/mL. Por ello aceptamos como interesantes aquellas muestran que presentaron un EC50 menor que 20 µg/mL ***** **** ***

100

Bibliografía G.R. Schinella, H.A. Tournier, J.M. Prieto, P. Mordujovich de Buschiazzo and J.L. Ríos. Antioxidant Activity of Anti-Inflammatory Plant Extracts. Life Sci. 70 (9): 10231033, 2002 A. Sala, MC Recio, RM Giner, S Máñez, H Tournier, G Schinella, JL Ríos. Anti-inflammatory and anti-oxidant properties of Helichrysum italicum. J. Pharm. Pharmacol. 54 (3): 365-71, 2002 Sala A, Recio MC, Schinella GR, Máñez S, Giner RM, Ríos JL. A new dual Inhibitor of the Arachidonate Metabolism Isolated from Helichrysum italicum. Eur. J. Pharmacol. 460 (2-3): 219-226, 2003 Sala A, Recio MC, Schinella GR, Máñez S, Giner RM, Cerdá-Nicolás M, Ríos JL. Assessment of the Anti-inflammatory Activity and Free Radical Scavenger Activities of Tiliroside. Eur. J. Pharmacol. 461 (1): 53-61, 2003 G.R. Schinella, H.A. Tournier, J.M. Prieto, P. Mordujovich de Buschiazzo and J.L. Ríos. Antioxidant Activity of Anti-Inflammatory Plant Extracts. Life Sci. 70 (9): 10231033, 2002

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LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE 41 PLANTAS BOLIVIANAS Alfredo Rosas Romero, Benjamín Rojano y Gloria Saavedra

LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE 41 PLANTAS BOLIVIANAS Alfredo Rosas-Romero1, Benjamín Rojano2 y Gloria Saavedra3 [email protected] 1 Universidad Simón Bolívar, Departamento de Química. Apartado 89000. Caracas 1080A. Venezuela. 2 Universidad Nacional de Colombia. Departamento de Química. A.A. 3840, Medellín. Colombia. 3 Centro de Tecnología Agroindustrial, Facultad de Ciencias y Tecnología, Universidad Mayor de San Simón, PO Box 992, Cochabamba, Bolivia.

Introducción La búsqueda de nuevas fuentes de antioxidantes naturales es consecuencia de la demostrada toxicidad de los antioxidantes sintéticos y por la demanda industrial de que posean propiedades funcionales apropiadas para su incorporación a los diversos productos comerciales, como por ejemplo que sean soluble en medios muy disímiles, que tengan una apropiada lipofilicidad o hidrofilicidad, que sean capaces de incorporarse y actuar en medios de muy diversas polaridades, en espumas, emulsiones y en la variada gama de condiciones industriales. Como consecuencia de tan exigentes requisitos no existe un compuesto panacea que satisfaga –ni remotamente- todos los requerimientos industriales. Por esta razón, pensamos que la meta es proveer a la industria de la más amplia posible gama de fuentes de antioxidantes naturales, de forma que dentro de esa variedad pueda seleccionar el antioxidante más apropiado para cada aplicación. En nuestro caso, escogimos trabajar con plantas bolivianas por ser esta una de las áreas menos estudiadas de la amazonia occidental, por su formidable diversidad botánica y su muy importante cultura etnobotánica. Un reciente artículo de revisión sumariza este tema (Desmarchelier et al., 2000). Las plantas las recolectamos en diferentes regiones del altiplano boliviano, las identificamos y depositamos un especimen en el Herbario Nacional de la Flora “Martín Cárdenas”, en Cochabamba, Bolivia. 235

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Información completa sobre las plantas aparece en la sección Descripción del Material Vegetal. Cribamos 41 plantas Bolivianas. De cada una de ellas preparamos un extracto metanólico que particionamos secuencialmente con solventes de polaridad creciente. Así obtuvimos de cada planta un extracto (EC1), el extracto crudo desgrasado (EC2) y 4 fracciones: una hexánica (FHX), otra clorofómica (FC3), una de acetato de etilo (FAC) y finalmente una fracción con los compuestos remanentes solubles en agua (FOH). Todos los extractos y las fracciones, seis muestras para cada una de las 41 plantas, fueron evaluados por dos técnicas distintas. 25 especies aportaron por lo menos una fracción con resultados altamente prometedores frente a la técnica de la decoloración del β-caroteno en una emulsión de ácido linoleico en agua. 33 plantas arrojaron muy buenos valores frente al ensayo del DPPH. Proponemos el uso simultáneo de estas dos técnicas para trabajos de tamizaje en busca de actividad antioxidante. La técnica del β-caroteno está muy bien relacionada con el fenómeno de la rancidez oxidativa bajo condiciones ambientales normales. Mientras que el ensayo del DPPH está mejor relacionado con los mecanismos in vivo, donde no es la absorción de oxígeno el parámetro determinante sino la propagación de los radicales libres. Finalmente, mediante el proceso de fraccionamiento obtuvimos una amplia gama de extractos y fracciones que cubren, entre ellos, el rango completo de polaridades, condición que constituye el requisito industrial más exigente en este campo. Una discusión reciente sobre las técnicas para medir la capacidad antioxidante, su comparación crítica y sus limitaciones, puede conseguirse en las siguientes publicaciones (Vandersluis et al., 2000; Arnao et al., 1999, Niki & Noguchi, 2000; Schwarz at al., 2001; Pannala & Rice, 2001; Antolovich et al., 2002; Koleva et al., 2002). Los demás detalles experimentales están descritos en el capítulo de El Diseño Experimental y en Rosas-Romero et al., 1999 y RosasRomero y Saavedra, 2003.

Resultados

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LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE 41 PLANTAS BOLIVIANAS

Preparamos un extracto metanólico de cada planta, eliminamos el solvente a presión reducida, (produciendo EC1). Disolvimos EC1 en la mínima cantidad de metanol, y lo disolvimos en agua. La solución acuosa de EC1 la extrajimos secuencialmente con hexano para obtener la fracción FHX, luego con cloroformo (FC3), acetato de etilo (FAC) y quedó remanente una solución acuosa (FOH). Al EC1 después de extraerlo con hexano, lo llamamos EC2. Así, para cada planta obtuvimos un extracto crudo y 5 fracciones. A todas estas muestras, 246 en total, les medimos la actividad antioxidante de acuerdo a dos técnicas, la decoloración del β-caroteno y la del DPPH (2,2-di(4-ter-octilfenil)-1-picrilhydrazilo). Hemos seleccionado esas dos técnicas para nuestro trabajo de cribado de la actividad antioxidantes en especies vegetales, porque requieren pequeñas cantidades de muestra, arrojan resultados que son reproducibles y nos brindan información sobre la actividad antioxidante, desde dos puntos de vista distintos. La técnica del β-caroteno está muy bien correlacionada con el fenómeno global de la rancidez en grasas y aceites al trabajar a una temperatura cercana a la ambiente, con ácido linoleico como sustrato, en una emulsión acuosa saturada con oxígeno; el mecanismo que se mide con esta técnica es la formación de hidroperóxidos del ácido graso, por el ataque del oxígeno al metileno situado entre los dos doble enlaces, en presencia de suficiente cantidad de oxígeno para que no sea limitante. El medio de reacción también contiene β-caroteno, el cual perderá su típico color anaranjado mediante una reacción acoplada con la oxidación del linoleico, esta disminución de la absorbancia la medimos espectrofotométricamente a 497 nm y es la variable que relacionamos con el poder antioxidante. Le asignamos 100% de poder antioxidante a la inhibición de la oxidación del ácido linoleico ocasionada por una solución patrón de BHA purificado, que corremos como control en cada caso, y las demás muestras las expresamos como porcentajes de ese 100%. Nótese que esta técnica mide explícitamente la actividad antioxidante como la disminución de la velocidad de oxidación de un sustrato –el ácido linoleico- en condiciones ambientes.

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Por su parte, la técnica del DPPH está relacionada con la capacidad de la muestra para entrampar los radicales libres generados por el DPPH, en un ambiente altamente polar, a temperatura ambiente, en ausencia de un lípido oxidable bajo las condiciones de trabajo, esto es, la técnica del DPPH simula un sistema donde los radicales libres, y no la absorción de oxígeno ni la reacción de un sustrato oxidable, son los responsables de la oxidación, sistema este más bien parecido a las oxidaciones vía radicales libres in vivo. A 550 nm medimos la disminución de la absorbancia provocada por la desaparición de los radicales del DPPH, y los resultados los representamos con el IC50, esto es, la concentración requerida, en µg/mL, para reaccionar con el 50% de los radicales producidos por el DPPH. De allí que para que consideremos un extracto o fracción como promisorio, no será necesario obtener buenos resultados en ambas técnicas. Buenos resultados con el β-caroteno significa una buena capacidad para inhibir el fenómeno global de la rancidez oxidativa en grasas y aceites; pero la misma muestra puede arrojar pobres resultados con el DPPH, y resultados inversos también son comunes en la literatura (Brand-Williams et al, 1995). Nosotros proponemos el uso simultáneo de estas dos técnicas para los trabajos de monitoreo de la actividad antioxidante en fuentes naturales, porque de esa manera se obtiene una mejor información sobre la potencialidad de los extractos o fracciones que se estudien, y sobre su eventual aplicación industrial; ya que la primera nos habla del poder antioxidante frente a los procesos de rancidez oxidativa, y con el DPPH identificamos los extractos o fracciones que tienen una alta capacidad para inhibir la acción de los radicales libres. El uso simultáneo de estas dos técnicas también contribuiría a enfrentar el problema ocasionado por el uso, por los diferentes grupos involucrados con este tipo de trabajo, de una amplia variedad de técnicas para medir la actividad antioxidante, con la consiguiente dificultad en el momento de comparar los resultados, tal como está claramente documentado en la literatura del área (Arnao et al., 1999; Niki y Noguchi, 2000; Antolovich et al., 2002; y Koleva et al., 2002).

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LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE 41 PLANTAS BOLIVIANAS

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

En la TABLA 1 recopilamos todos los resultados de la evaluación de los diversos extractos y fracciones según las dos técnicas. Ciento cuarenta y tres muestras, extractos o fracciones, resultaron activas a una de las dos técnicas (de un total de 246 muestras).

Técnica de la decoloración del beta caroteno Como no estamos trabajando con compuestos puros sino con extractos crudos y sus fracciones, hemos establecido que una muestra arroja buenos resultados cuando su actividad es mayor o muy cercana a 50% de la que presenta una solución de la misma concentración en peso, de BHA puro, al que le asignamos 100% de inhibición. Así, los mejores antioxidantes son aquellos con los mayores porcentajes de inhibición de la oxidación de linoleico, esto es, los que tienen mayores valores del % de actividad. En la TABLA 2 presentamos los resultados obtenidos para cada una de las muestras estudiadas, los valores que consideramos potencialmente interesantes, los hemos resaltado en negrita. 22 de las plantas produjeron al menos una fracción con un alto valor de actividad antioxidante frente a la técnica del caroteno. 45 fracciones o extractos resultaron activos.

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LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE 41 PLANTAS BOLIVIANAS

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Extractos Crudos (EC1) El extracto crudo metanólico (EC1) dio muy buenos resultados en 8 de las plantas, ver TABLA 3. Esto es interesante porque nos indica la posibilidad de obtener buenos antioxidantes de interés industrial, con un mínimo de fraccionamiento, lo cual abarataría los costos de producción, porque para obtener estos productos basta con extraer la parte aérea de la planta con metanol y eliminar el solvente.

Resaltan los valores de Piper pilirameum (92,0%), Piper peltatum (88,1%) y Mimosa lepidota (87,4%) que mostraron una actividad muy cercana al de una solución de BHA puro, en las mismas condiciones experimentales. Es importante mantener presente que el extracto crudo EC1 es una mezcla de diversos compuestos, mientras que la solución de BHA, contiene a este antioxidante comercial en estado puro; de allí que un valor entre 95-80% probablemente indique la presencia de antioxidantes, que de estar ellos en estado puro serían bastantes más potentes que el BHA. Le siguen en importancia, Lantana trifolia (63,3%), Lippia boliviana (62,0%), Mikania butchtienii (58,0%), Lantana magnibracteata (52,7%) y Plazia daphnoides (51,4%).

Extractos Crudos desgrasados (EC2) Este extracto es el resultado de extraer con hexano, la solución acuosa del extracto crudo metanólico desolventizado, por ello la 242

LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE 41 PLANTAS BOLIVIANAS

llamamos extracto crudo desgrasado. Los compuestos solubles en hexano conforman la fracción siguiente, la hexánica (FHX). 5 plantas presentaron actividad mayor que 50% frente a esta técnica, ver TABLA 4. Estas fueron: Piper pilirameum (74,6%), Lantana trifolia (59,2%), Mimosa lepidota (56,3%) y Tagetes maxima (54,3%), Senecio herzogui (51,7%).

Fracción hexánica (FHX) Con esta técnica también tiende a cumplirse la tendencia mencionada en la literatura (Mensor et al, 2001), según lo cual no se conseguirá actividad antioxidante (AA) en la fracción hexánica, TABLA 5. Aunque es cierto que la AA tiende a concentrarse en las fracciones polares, sin embargo, nosotros obtuvimos AA en 4 fracciones hexánicas: las de Lippia boliviana (86,6%), Piper pilirameum (79,6%), Piper peltatum (79,3%) y Mimosa lepidota (49,7%), de hecho el valor de la actividad antioxidante correspondiente a la primera, la Lippia boliviana, está entre los más altos que obtuvimos en todo el estudio.

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Fracción Clorofórmica (FC3) Esta es la fracción que contiene los compuestos de polaridad media. 8 plantas resultaron activas, TABLA 6. Croton andinus (76,1%), Lantana trifolia (68,0%), Plazia daphnoides (63,3%), Lantana magnibracteata (62,2%), Ophryosporus heptanthus (59,1%), Mimosa lepidota (56,8%), Chromolaena tunariensie (56,5%) y Helogyne straminaceae (52,6%).

Fracción de acetato de etilo (FAC) Para las plantas que trabajamos, esta fracción, la de los compuestos polares, es donde conseguimos el mayor número de muestras con actividad antioxidante. 12 plantas dieron actividad en FAC, TABLA 7. El mejor resultado lo arrojó la Piper pilirameum con 88,3% de actividad con respecto al BHA. También se observan buenos resultados en los extractos de Mimosa lepidota (76,0), Lantana trifolia (70,1%), Piper peltatum (68,4%), Lantana camara (64,6%), Tagetes maxima (60,7), Hedyosmun angustifolium (59.5%), Senecio herzogui (58.6%), Baccharis grisebachii (57,0%), Tessaria fastigiata (55,5%), Lantana magnibracteata (52,7%) y Baccharis salicifolia (49,0%).

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LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE 41 PLANTAS BOLIVIANAS

Fracción acuosa (FOH) Los compuestos antioxidantes de alta polaridad están en esta fracción. 9 de las muestras acuosas resultaron activas, TABLA 8. La mayor actividad correspondió a la Mimosa lepidota con 85,1%. Luego dieron alta AA la Lantana magnibracteata (65,0%). Y les siguen: Croton andinus (59,4%), Piper peltatum (52,8%), Peltophorum dubium (52,4%), Lantana magnibracteata (52,2%), Mikania buchtieni (50,3%), Croton emporiorum (49,2%) y Buddleja tucumanensis (48,0%).

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Los resultados hasta aquí presentados son muy interesantes porque para satisfacer la demanda industrial de nuevos antioxidantes, es necesario aportar nuevos compuestos que cubran la gama completa de polaridades, entre otras propiedades. Y vemos, como entre las diferentes plantas se cubre el espectro completo de polaridades.

Actividad captadora de radicales libres. Técnica del DPPH Los resultados para todas las muestras, empleando esta técnica los mostramos en la TABLA 9. Debido a que el valor experimental que obtuvimos para el CI50 del BHA es 11.5 µg/mL, y por las mismas razones que mencionamos al discutir la técnica del caroteno, hemos establecido el límite de 20 µg/mL como el máximo valor de CI50 que puede tener una muestra para considerarla interesante para nuestro trabajo, estos valores los resaltamos en negrita en la TABLA 9. Con esta técnica, los mejores antioxidantes tendrán los más bajos valores del CI50. Como esperábamos, dado que esta técnica mide la propiedad menos específica (con respecto al fenómeno de la rancidez) de capturar los radicales libres generados por el DPPH, conseguimos un mayor número de muestras con valores aceptables de CI50 (98) que con la técnica del caroteno (52). 33 plantas resultaron activas, en comparación con las 25 para el β-caroteno Como suponíamos, no existe una correspondencia biunívoca entre las dos técnicas, debido fundamentalmente a que los ensayos miden diferentes causas, diferentes mecanismos de acción de los antioxidantes. Y ésa es precisamente la ventaja de usar las dos técnicas simultáneamente.

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LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE 41 PLANTAS BOLIVIANAS

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Extractos crudos (EC1) 23 extractos crudos presentaron CI50 menores o muy cercanos a 20, TABLA 10. Agrupamos en un primer conjunto a aquellas plantas que dieron valores de CI50 menores que 10 µg/mL, aquí encontramos a Plazia daphnoides (1,0), Tagetes maxima (3,9), Mikania buchtienii (4,8), Piper cf. heterophyllum (5,4), Tessaria dodoneafolia (6,5), Senecio herzogui (6,7), Erechtites valerianaefolia (6,8), Piper peltatum (7,0), Tessaria fastigiata (9,6) y Buddleja tucumanensis griseb (9,9). En el rango de 11 a 15 µg/mL encotramos a: Mimosa lepidota (10,8), Baccharis grisebachii (12,1), Baccharis salicifolia (12,7), Erechtites hieracifolia (13,1). Y con IC50 entre 16-20 µg/mL conseguimos 8 especies: Lantana camara (16,1), Piper aff. pilirameum (16,5), Croton cf. emporiorum (16,9), Mikania psilostachia (16,9), Baccharis pentlandii (18,3), Tagetes multiflora (18,5), Gynoxys psilophyla (19,3) y Alonsoa acutifolia (20,3). Todas estas plantas son altamente prometedoras, sobre todo si tomamos en cuenta que se trata de extractos sin ningún procesamiento posterior.

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LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE 41 PLANTAS BOLIVIANAS

Extractos crudos desgrasados (EC2) 21 plantas dieron por debajo del umbral establecido, esto es, con CI50 menores o muy cercanos a 20, TABLA 11. En el grupo con CI50 menores que 10 µg/mL encontramos 13 plantas: Tagetes maxima (1,5), Lantana camara (2,0), Mikania buchtienii (2,1), Plazia daphnoides (2,7), Lantana trifolia (3,2), Tessaria fastigiata (4,5), Tessaria dodoneafolia (5,7), Baccharis grisebachii (6,1), Tagetes multiflora (6,5), Buddleja tucumanensis (6,5), Senecio herzogui (6,7), Mikania psilostachia (7,7) y Erechtites hieracifolia (8,1). En el rango de 11 a 15 µg/mL detectamos 3 plantas: Erechtites valerianaefolia (10,5), Aloysia gratissima (14,6) y Gynoxys psilophyla (15,0). A las que se agregan 5 otras plantas con 249

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

IC50 entre 16-20 µg/mL: Croton cf. emporiorum (15,1), Ophryosporus heptanthus (15,4), Baccharis salicifolia (17,0), Lantana magnibracteata (18,4) y Lippia boliviana (18,9).

Fracción hexánica (FHX) Empleando esta técnica, no conseguimos AA en los extractos hexánicos, lo cual confirma lo publicado por Mensor et al, 2001, quien, de paso, utilizó esta técnica –la del DPPH- en su trabajo.

Fracción clorofórmica (FC3) 5 especies arrojaron buenos resultados en la fracción clorofórmica, TABLA 12. Dos con IC50 por debajo de 5 µg/mL: Plazia daphnoides 250

LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE 41 PLANTAS BOLIVIANAS

(2,1) y Piper peltatum (5,0); y los otros 3; Lantana trifolia (13,0), Tessaria dodoneafolia (14,3) y Erechtites valerianaefolia (18,8); estuvieron entre 10 y 20 µg/mL.

Extracto de acetato de etilo (FAC) Todas las especies que mostraron alguna fracción con actividad frente a esta técnica, dieron buenos valores en la fracción de acetato de etilo. Lo que confirma que la actividad se concentra en esta fracción, que es la de los compuesto polares, TABLA 13. Hay que resaltar el valor obtenido con Lantana camara cuyo CI50 está muy por debajo de 1 µg/mL, mientras que por debajo de 5 están 19 especies: Baccharis grisebachii (1,7), Baccharis salicifolia (3,3), Erechtites valerianaefolia (4,1), Erechtites hieracifolia (4,2), Gynoxys psilophyla (3,5), Mikania buchtieni (0,2), Ophryosporus heptanthus (3,9), Pluchea sagittalis (2,5), Senecio herzogui (1,4), Tagetes multiflora (1,9), Tagetes maxima (0,5), Tessaria fastigiata (4,3), Tessaria dodoneafolia (2,4), Euphorbia serpens (2,7), Peltophorum dubium (0,5), Aloysia gratissima (2,6), Lantana magnibracteata (3,6), Buddleja tucumanensis (4,4) y Lantana trifolia (5,0).

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Extracto Acuoso (FOH) Con la técnica del DPPH, se obtuvieron excelentes resultados en la fracción acuosa. 21 especies arrojaron resultados interesantes como fuentes de antioxidantes muy polares, solubles en agua, TABLA 14. Los mejores candidatos, para proveer este tipo de antioxidantes, fueron la Lantana camara (IC5030 %), estas son las primeras ocho frutas en la Tabla 1, donde están ordenadas de acuerdo a su actividad abtioxidante. Resalta el marañon que tiene una actividad antioxidante muy fuerte (85.6 ±1. 2%). Le siguen la papaya (58.7 ±1.0%), la pomarossa, (48.7 ±1.2%), la ciruela (47.9 ±1.5%), la guayaba agria (40.0 ±0.7%), el carambolo (39.9 ±1.2%), el mamoncillo (35.1 ±2.0%) y el hobo (29.3 ±0.9%). Estas 8 frutas cumplen con las condiciones para ser promovidas como alimentos ricos en compuestos antioxidantes naturales, lo cual satisface la meta fundamental del proyecto. El siguiente grupo de ocho frutas, en la Tabla 1, presentan una actividad media (entre 10 y 20%) y deben ser promovidas como tales: la pera de Malaca (19.6 ±0.6%), la guanábana (19,17 ±0.5%), el zapote (16.6 ±1.2%), el madroño (13.49 ±0,8%), el tamarindo (13.1 ±0.6%), la chirimoya (12.9 ±1.3%), el mamey (12.7 ±0.2%) y la badea (12.0 ±1.9%). Finalmente, el higo (9.4 ±0,4%) y el borojó (7.4 ±0.5%) demostraron tener una baja actividad.

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

a

La capacidad atrapadora del DPPH está expresada como % de actividad antioxidante, desviaciones menores del ± 2%. b El contenido de fenoles está reportado como mg de ácido tánico/100g de muestra; errores menores del ±3%. c % de humedad media, los errores son menores al ±1.1 %”.

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CAPACIDAD ATRAPADORA DE RADICALES LIBRESY CONTENIDO DE FENOLES DE ALGUNAS FRUTAS TROPICALES COLOMBIANAS

d T = Toda la fruta. P = La pulpa. P, S = La pulpa y las semillas. P, P = La pulpa y la piel. Todos lo análisis se realizaron por triplicado.

Contenido de fenoles totales Como mostramos en la Figura 1, el marañón, que fue la fruta con la mayor actividad antioxidante, también presenta el más alto contenido de fenoles (1.021,27 ± 21,74 mg/100g), seguido de lejos por el mamoncillo (527.7 ± 1.8% mg/100g), la pomarossa (306.5 ±7.9 mg/100g ), el tamarindo (275.3 ±2.2 mg/100g), el hobo (211.2 ±1.5 mg/100g), la ciruela (210.8 ±0.8 mg/100g), el carambolo (202.2 ±3.8 mg/100g), la guanábana (161.3 ±3.1 mg/100g), el madroño (86.7 ±1.0 mg/100g), la papaya (61.8 ±0.1 mg/100g ), el higo (58.4 ±0.1 mg/100g), el borojó (39.1 ±3.4 mg/100g), el zapote (27.6 ±0.4 ) mg/100g, la pera de Malaca (16.8 ±0.2 mg/100g), el mamey (14.9 ±0.2 mg/100g ), la badea (14.0 ±0.1 mg/100g), la chirimoya (13.6 ±0.3 mg/100g).)

Figura 1. fenoles totales en las frutas.

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

De todas estas frutas, el marañon es la fruta con mayor actividad antioxidante y con un alto contenido de fenoles. Existen cultivos de esta fruta para la exportación, pero solo se valoriza su almendra que, tostada, es consumida como aperitivo. La fruta casi no es consumida, porque tiene dos desventajas: el sabor es muy astringente (eso es debido a su contenido alto de fenoles), y debe cocinarse porque crudo es caústico. Por esto no se ha podido explotar comercialmente y aprovechar su ventaja en cuanto a beneficios para la salud; para lo cual es necesario desarrollar transformaciones tecnologicas que permitan un mayor consumo.

Relación actividad antioxidante / fenoles totales Esta relación fue estudiada primero por una regresión simple actividad antioxidante vs. fenoles totales y daba un coeficiente de regresión r, significativo de 0,747. Pero éste era debido a la fuerte actividad antioxidante del marañon y su alto contenido de fenoles, sin este punto la regresión no es significativa ( r = 0,461). La relación entre los compuestos fenólicos y la actividad antioxidante fue estudiada por Kalt & co (13) para la fresa, la frambuesa y dos especies de moras y encontraron un coeficiente de 0,80. Pero en este caso, las frutas tenían altos contenidos de antocianinas, que son antioxidantes muy buenos de la familia de los flavonoides. Además la regresión entre el contenido de fenoles y las antocianinas fue igual a r = 0,91, y el coeficiente de regresión antocianinas vs. Actividad antioxidante fue r = 0,90. Pero, en nuestro caso, las frutas estudiadas, son muy diferentes entre ellas, mientras que en el caso precedente, todas eran bayas pequeñas y de pocos géneros y familias. La ausencia de una correlación estadísticamente significativa, puede ser explicada por dos razones. El método de determinación de fenoles toma en cuenta todos los tipos de fenoles, y la actividad antioxidante de los compuestos fenólicos varía mucho según los sustituyentes presente en el anillo fenólico, o si el compuesto es mono o polifénolico. Las frutas estudiadas pueden tener un alto contenido de fenoles pero tener una pequeña capacidad antioxidante, o al contrario, un pequeño contenido de fenoles pero una alta capacidad antioxidante. 270

CAPACIDAD ATRAPADORA DE RADICALES LIBRESY CONTENIDO DE FENOLES DE ALGUNAS FRUTAS TROPICALES COLOMBIANAS

Muchos de estos frutos tienen alto contenido de vitamina C, como por ejemplo el corombolo. Sawai et al (14) encontraron que la vitamina C reacciona mucho mas rápido con el DPPH que algunos compuestos fenolicos como la catequina, el metilgalato y el α tocoferol, de tal manera que se pueden hacer nuevos estudios para encontrar una mejor correlación, ya sea determinando el contenido de vitamina C y hacer regresiones multiples o usar una técnica más especifica. Esto no significa necesariamente que la vitamina C tenga una actividad antioxidante más fuerte que los otros compuestos. El mecanismo molecular de la reacción entre el DPPH, la vitamina C, y ciertos compuestos fenólicos como la catequina (flavonoide) y el metilgalato fue estudiado por Sawai et al (14). Encontró que la vitamina C captura los radicales de DPPH más rápido que la catequina, el metil-galato o el α tocoferol pero que tiene una capacidad atrapadora de DPPH, menos fuerte que la catequina o el α tocoferol. En nuestro caso, no sabemos que compuestos fenólicos están presentes en las frutas pero podemos pensar que con otro método u otras condiciones (por ejemplo un tiempo de contacto más largo entre la muestra y el DDPH) la contribución de la vitamina C sería menos relevante. Además, Sawai et al muestran que la vitamina C, por sus propiedades reductivas permite regenerar la catequina y el α- tocoferol oxidado. Así hay que tomar en cuenta también las interacciones entre los diferentes compuestos antioxidantes. De todas estas frutas, el marañon es la fruta con mayor actividad antioxidante y sobre todo con alto contenido de fenoles. Existen cultivos de esta fruta para la exportación, pero sólo se valora la almendra que, tostada, es consumida como aperitivo. La fruta casi no es consumida, porque tiene la desventaja de un sabor muy astringente (eso es debido a su contenido alto de fenoles). Sin embargo, se pueden buscar diferentes formas alimenticias de presentación, por ejemplo suplementos alimenticios liofilizados que garanticen la estabilidad de sus componentes.

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ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN EXTRACTOS DE NUEVE PLANTAS PARAGUAYAS Alfredo Rosas Romero y Edelira Velázquez

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN EXTRACTOS DE NUEVE PLANTAS PARAGUAYAS Alfredo Rosas Romeroa y Edelira Velázquezb a

Universidad Simon Bolivar. Departamento de Química. Apartado 89000. Caracas 1080A. Venezuela. b Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Asunción, Casilla de Correos 1055, Campus Universitario, San Lorenzo, Paraguay

Introducción Está bien documentado el efecto de los radicales libres sobre los sistemas biológicos y del papel que desempeñan las sustancias naturales en la prevención y reparación del daño que aquellos producen (Gordon 1996, Larson 1997). Los efectos nocivos de los radicales libres se hacen particularmente notables sobre los lípidos, produciendo manifestaciones biológicas y pérdida del valor nutricional y comercial de los mismos. Para retardar los efectos de los radicales libres sobre los alimentos elaborados ricos en grasas se vienen empleando ampliamente aditivos sintéticos con capacidad para atrapar radicales, tales como butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT), la terbutil hidroxiquinona(TBHQ) y el galato de propilo. Paralelamente, con la extensión del uso de los mencionados antioxidantes sintéticos, se ha producido información sobre su toxicidad asociada, particularmente con BHA, en la que se vincula a este aditivo con inducción de la apoptosis (Yu et al, 2000) y del daño oxidativo al ADN (Schilderman et al., 1995) sin que quede claro el impacto de estos procesos en la salud humana. La necesidad de obtener sustancias no tóxicas con capacidad antioxidante, disponibles para el uso industrial, ha llevado a explorar recursos naturales que demuestren dicha capacidad, y existen varios casos bien documentados con relación a especies de amplio uso como Rosmarinus officinalis ( Schwarz & Ternes, 1992) y Ginkgo biloba (Joyeux et al., 1995), y se dispone de datos sobre la búsqueda 275

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

de dicha actividad en vegetales empleados como condimentos o en residuos de alimentos del mismo origen (Kim et al., 1994; Yen & Duh, 1993). En la presente publicación se comunican los resultados de un tamizaje de la actividad captadora de radicales libres de extractos vegetales y sus fracciones, obtenidos a partir de material proveniente de Paraguay, en el marco del proyecto IV.11“Desarrollo de Antioxidantes de Origen Natural e Interés Comercial”, del CYTED.

Materiales y metodos Material vegetal Trabajamos ocho especies vegetales y un residuo de destilación de esencia vegetal provenientes todos de Paraguay. El material vegetal fue colectado en su habitat natural, debidamente identificado. Depositamos copias en los herbarios de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Nacional de Asunción

Extractos. Secamos las plantas al aire a temperatura ambiente, a la sombra, las molimos y extrajimos por maceración de 30 g de polvo con 600 mL de metanol, a temperatura ambiente, durante 24 h, con agitación ocasional. Filtramos los extractos y eliminamos el solvente a presión reducida. En el caso del agua residual de la destilación de esencia de Bulnesia sarmentoi, la eliminamos por liofilización. Los extractos crudos los sometimos a partición líquido-líquido, suspendiéndolos en agua y extrayéndolos sucesivamente con hexano, cloroformo y acetato de etilo, según lo descrito anteriormente (Ver Diseño Experimental). De esta manera, para cada planta obtuvimos un extracto crudo (EC), y 4 fracciones, la hexánica (FHX), clorofómica (FC3), la de acetato de etilo (FAC) y una fracción remanente con los solubles en agua (FOH).

Evaluación antioxidantes La evaluación de la actividad antioxidante de los extractos crudos y las fracciones la realizamos mediante el ensayo de la Actividad Cap276

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN EXTRACTOS DE NUEVE PLANTAS PARAGUAYAS

tadora de Radicales DPPH y el de la Decoloración del Beta Caroteno, ambos descritos previamente (Ver DISEÑO EXPERIMENTAL) Para cada técnica evaluamos un total de 45 muestras, correspondientes a nueve plantas.

Resultados y discusion

Definimos como CI50 a la concentración, en µg/mL, necesaria para atrapar al 50 % de los radicales DPPH. n.a. significa no actividad antioxidante

Por su actividad frente a los radicales DPPH, una medida de la actividad antioxidante total, resaltan el extracto crudo de Peltophorum dubium. Este es un resultado muy relevante, porque tratándose del extracto crudo, apunta a la obtención de potentes antioxidantes con un mínimo de procesamiento. Peltophorum dubium junto con la Euphorbia serpens se presentan como buenas fuentes de antioxidantes polares por el buen resultado que obtuvimos con sus respectivas fracciones de acetato de etilo 277

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(FAC). Los mismo podemos decir de ellas como fuentes de antioxidantes altamente polares (FOH). El extracto crudo (EC) de la Cedrela fissilis y su fracción en acetato de etilo, también mostraron resultados prometedores. Frente a esta técnica, el IC50 del β-caroteno recristalizado es 11.1 mg/mL.

La inhibición de la decoloración del β-caroteno la expresamos como el % de actividad de la muestra relacionada con una solución patrón de BHA recristalizado, a la cual le adjudicamos el valor de 100%. n.a. significa no actividad antioxidante

De las nueve plantas estudiadas, 4 arrojaron alguna fracción con actividad superior al 50 %, de acuerdo a la técnica de la decoloración del beta caroteno. Este nivel, 50 %, lo hemos establecido en este trabajo como el valor mínimo para que una fuente sea aceptada como interesante para los objetivos de nuestro trabajo. Como antioxidante frente al fenómeno de la rancidez oxidativa, resalta las fracción de acetato de etilo (FAC) de la Euphorbia serpens, 278

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN EXTRACTOS DE NUEVE PLANTAS PARAGUAYAS

la cual dio tan buenos resultados como la solución patrón de BHA que empleamos para referir todos los resultados de esta técnica. además debemos tener presente que mientras la solución patrón la preparamos con BHA recristalizado, la de Euphorbia serpens es una fracción sin ulteriores procesamientos y por ello integrada por diversos compuestos. La Leucaena leucocephala provee una importante fracción de antioxidantes altamente polares. El extracto crudo de la Tabebuia heptaphylla muestra una interesante actividad, con el agregado de que sus fracciones de cloroformo y de acetato de etilo, también son activas. Y, el Peltophorum dubium aparece como una fuente prometedora de antioxidantes my polares.

Bibliografia Gordon MH (1996): Dietary Antioxidants in Disease Prevention. Nat Prod Reports, 265-273 Kim SY, Kim JH, Kim SK, MJ OH, Jung MY (1994): Antioxidant Activities of Selected Oriental Herb Extracts. J Am Oil Chem Soc 71: 633-640 Larson RA (1997): Naturally Occurring Antioxidants. Lewis Publishers-CRC Press, Boca Raton-New York. Joyeux M, Lobstein A, Anton R, Mortier F (1995): Comparative Antilipoperoxidant, Antinecrotic and Scavenging Properties of terpenes and Biflavones from Ginkgo and Some Flavonoids. Planta Medica 61: 126-129 Schwarz K, Ternes W (1992): Antioxidative Constituents of Rosmarinus officinalis and Salvia officinalis. 2. Isolation of carnosoic acid and formation of other phenolic diterpenes. Zeitschrifst Lebensmittel Untersuch Forschung 195: 99-103 Schilderman PA, Rhijnsburger E, Zwingmann I, Kleinjans JC (1995): Induction of Oxidative DNA Damages and Enhacement of Cell Proliferation in Human Lymphocytes In Vitro by Butilated Hydroxyanisole. Carcinogenesis 16: 507 - 512 Yen G-Ch, Duh P-D (1993): Antioxidative Properties of Methanolic Extracts from Peanut Hulls. J Am Oil Chem Soc 70: 383-386 Yu R, Mandlekar S, Kong AT (2000): Molecular Mechanisms of Butylated Hydroxyanisole-induced Toxicity: induction of apoptosis through direct release of citochrome c. Mol Pharmacol 58: 431-437

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ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CAPTADORA DE RADICALES EN NUEVE ASTERACEAE BOLIVIANAS Irene Parejo, Francesc Viladomat, Jaume Bastida, Alfredo Rosas Romero, Gloria Saavedra, M. Antonia Murcia, Antonia M. Jiménez, Carles Codina

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CAPTADORA DE RADICALES EN NUEVE ASTERACEAE BOLIVIANAS Irene Parejoa, Francesc Viladomata, Jaume Bastidaa, Alfredo Rosas Romerob, Gloria Saavedrac, M. Antonia Murciad, Antonia M. Jiménezd, Carles Codinaa* a

Departament de Productes Naturals, Biologia Vegetal i Edafologia, Facultat de Farmàcia, Universitat de Barcelona, Avda. Joan XXIII s/n, 08028 Barcelona, Spain Departamento de Química, Universidad Simón Bolívar, Apartado 89000, Caracas 1080A, Venezuela c Centro de Tecnología Agroindustrial, Facultad de Ciencias y Tecnología, Universidad Mayor de San Simón, Cochabamba, Bolivia d Area de Nutrición y Bromatología, Facultad de Veterinaria y Ciencia y Tecnología de Alimentos, Campus de Espinardo, 30100 Murcia, Spain b

Introducción El uso de la medicina tradicional está muy extendido, y las plantas todavía representan una fuente importante de nuevos compuestos que pueden servir como “cabezas de serie” para el desarrollo de nuevos fármacos. Recientemente, diversos compuestos antiinflamatorios, digestivos, antinecróticos, neuroprotectores y hepatoprotectores han mostrado tener un mecanismo antioxidante y/o de captura de radicales como parte de su actividad (Perry et al., 1999; Lin y Huang, 2002; Repetto y Llesuy, 2002). En la búsqueda continuada de nuevas fuentes de antioxidantes naturales, varias plantas medicinales se han estudiado ampliamente en los últimos años por su actividad antioxidante y captadora de radicales (De las Heras et al., 1998; Desmarchelier et al., 2000; Schinella et al., 2002; VanderJagt et al., 2002). El presente trabajo consiste en un estudio preliminar de varias especies bolivianas pertenecientes a la familia Asteraceae para determinar su posible actividad antioxidante y/o captadora de radicales: Baccharis pentlandii, Baccharis platypoda, Chromolaena tunariense, Erechtites hieraciifolius, Mikania psilostachya, Pluchea sagittalis, Tagetes maxima, Tessaria fastigiata y Wulffia baccata. Plantas de esta familia botánica se han utilizado en la medicina tradicional en Sudamérica en el tratamiento de diferentes patologías (Yan et al., 1999; Kadarian et al., 2002). Aunque algunas especies de Asteráceas pertenecientes a los géneros Baccharis (Mongelli et al., 1997), Chromolaena (Thang et al., 2001), Mikania (Suyenaga et al., 2002), 283

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Pluchea (Sen et al., 2002), Tagetes (De las Heras et al., 1998), y Tessaria (Desmarchelier et al., 2000) se han citado por sus propiedades antiinflamatorias y/o antioxidantes, no existe información de las especies aqui estudiadas, con la excepción de Pluchea sagittalis, la cual ha mostrado tener una cierta actividad antiinflamatoria (PérezGarcía et al., 1996). Hemos estudiado 54 extractos/fracciones de diferente polaridad de las nueve plantas bolivianas indicadas anteriormente para determinar su actividad antioxidante y captadora de radicales. Los tres ensayos que hemos utilizado para evaluar la actividad captadora de radicales son los del DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil), superóxido-azul de nitrotetrazolio (NBT) hipoxantina/xantina oxidasa, y .OH/luminol quimioluminiscencia. Para la evaluación de la actividad antioxidante y de la estabilidad oxidativa de los extractos y fracciones hemos utilizado los métodos de decoloración del ß-caroteno y del Rancimat, respectivamente. Además, hemos determinado también el contenido de fenoles totales por el método de Folin-Ciocalteu. Los resultados los hemos comparado con los obtenidos por diferentes productos de referencia: quercetina, un antioxidante de origen natural, BHA (butilhidroxianisol), uno de los antioxidantes sintéticos más ampliamente empleado en la industria alimentaria, y tres extractos comerciales de origen natural de reconocida actividad antioxidante: romero, té verde y pepitas de uva.

Material y Métodos Material vegetal El material utilizado estuvo constituido en todos los casos por partes aéreas (tallos, hojas y flores). Sus datos están incluidos en la Descripción de las Plantas.

Reactivos Todos los reactivos utilizados en este trabajo fueron de calidad analítica, y fueron suministrados por la firma comercial Sigma Aldrich (USA), con la excepción del reactivo de Folin-Ciocalteu, que procedió de Panreac (España). 284

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Preparación y procesamiento de las muestras Siguiendo el procedimiento metodológico diseñado para el desarrollo del proyecto (Ver Diseño ExperimentaL), consistente en un proceso de extracción y fraccionamiento secuencial, obtuvimos los siguientes extractos y fracciones: EC1, extracto crudo inicial (metanólico); EC2, extracto crudo desengrasado (resultante del tratamiento del EC1 con hexano); y las fracciones FHX, fracción hexánica; FC3, fracción clorofórmica, y FCA, fracción acetato de etilo, obtenidas por la partición sucesiva del EC1 con dichos solventes. La fracción acuosa residual se codificó como FOH.

Determinaciones analíticas Los métodos analíticos utilizados en el presente trabajo para determinar la actividad antioxidante y captadora de radicales libres, hidroxilo y anión superóxido en cada uno de los extractos y fracciones obtenidos se encuentran detallados en el Diseño ExperimentaL. Asimismo, hemos determinado la estabilidad oxidativa de cada uno de ellos por el test de Rancimat, y hemos cuantificado el contenido de fenoles totales por el método de Folin-Ciocalteu, ambos descritos también en el Diseño Experimental.

Análisis estadístico Todas las extracciones y análisis las hemos realizado por triplicado, y se han repetido en el caso de presentar un coeficiente de variación superior al 10 %. Los datos se sometieron a un análisis de la varianza (ANOVA) de una vía (test Newman-Keul) para comparar los resultados de los extractos y fracciones de las nueve plantas estudiadas. Los cálculos de la capacidad captadora de radicales libres y radicales hidroxilo los hemos efectuado utilizando el valor de la eficiencia antiradicalaria (EA = 1000/ CI50). Las diferencias se consideran significativas a valores de P < 0.05.

Resultados Contenido de fenoles totales Los valores del contenido total de fenoles de los diferentes extractos/fracciones se muestran en las Figuras 1-6. En general, se observa 285

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que las fracciones acetato de etilo son las que presentaron un mayor contenido de fenoles, especialmente las de Tessaria fastigiata, Mikania psilostachya y Tagetes maxima. Los extractos EC2 de cinco de las nueve plantas estudiadas mostraron los segundos valores más altos de fenoles totales. Sorprendentemente, las fracciones clorofórmicas no mostraron buenos resultados en comparación con los de un trabajo similar realizado con plantas aromáticas y medicinales mediterráneas (Parejo et al., 2002). El mayor contenido fenólico en las fracciones acetato de etilo que en los extractos crudos se debe probablemente a la purificación y concentración de fenoles que tiene lugar a lo largo del proceso de fraccionamiento.

Actividad captadora de radicales La actividad captadora de radicales de los diferentes extractos/fracciones se muestra también en las Figuras 1-6. La mejor actividad captadora de radicales libres la presentó el extracto crudo desengrasado (EC2) de Tagetes maxima (CI50 = 5.6, EA = 178.57), seguido de las fracciones acetato de etilo de esta misma especie y de Mikania psilostachya (CI50 = 9.4 y 8.3, EA = 106.38 y 120.48, respectivamente). Con la excepción de Tagetes maxima, todas las otras fracciones acetato de etilo mostraron la mayor actividad en comparación con el resto de extractos y fracciones. Las fracciones acuosas presentaron también unos valores relativamente elevados, especialmente la de Tessaria fastigiata (CI50 = 14.63, EA = 68.49), siendo los segundos valores más altos en cuatro de las nueve plantas estudiadas. En relación a la actividad captadora de radicales hidroxilo, los mejores resultados se observaron en el extracto crudo desengrasado (EC2) de Mikania psilostachya y de Tagetes maxima, con valores de CI50 de 12.1 (EA = 82.64) y 12.6 (EA = 79.37), respectivamente (Figura 2), los cuales son significativamente mayores que los de cualquier otro extracto o fracción. Aparte de estas dos especies, las fracciones más activas fueron en general las clorofórmicas (en cuatro de nueve fracciones) y las de acetato de etilo (en tres de nueve), aunque los valores de CI50 fueron superiores a 20, siendo algunos 286

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ejemplos las fracciones acetato de etilo de Tagetes maxima y Tessaria fastigiata (CI50 = 20.3 y 29.3, EA = 49.26 y 34.13, respectivamente), y la clorofórmica de Chromolaena tunariense (CI50 = 24.8, EA = 40.32). Al igual que en los ensayos de DPPH y quimioluminiscencia, los mayores porcentajes de inhibición del anión superóxido correspondieron, en general, a las fracciones acetato de etilo (en seis de nueve), aunque en Baccharis pentlandii, Erechtites hieraciifolius y Tagetes maxima los valores más elevados se observaron en los extractos crudos (EC1) (Figura 1). Este ensayo ha mostrado que la especie más activa es Tagetes maxima, pues tres de los seis extractos/fracciones mostraron unos porcentajes de inhibición superiores al 95 %. Esta elevada actividad está en coincidencia con una actividad captadora de anión superóxido relativamente elevada mostrada también por otra especie de Tagetes, concretamente T. pusilla (De las Heras et al., 1998). Aparte de Tagetes maxima, sólo el extracto crudo de Baccharis pentlandii dió un valor superior al 90 % de inhibición (93 %).

Actividad antioxidante La actividad antioxidante determinada por el método de decoloración del ß-caroteno también fue mayor en las fracciones acetato de etilo (en cinco de las nueve plantas), coincidiendo así con los resultados de otros ensayos de actividad captadora de radicales (Figura 5). Los valores superiores se observaron en las fracciones acetato de etilo de Tagetes maxima y Tessaria fastigiata (con unos porcentajes de inhibición del 60.6 % y 55.5 %, respectivamente), y en la clorofórmica de Chromolaena tunariense (56.5 % de inhibición). No se obtuvieron otros valores superiores al 50 % de inhibición, salvo en el extracto crudo desengrasado (EC2) de Tagetes maxima (54.3 %).

Resultados del Rancimat El mayor factor de protección lo presentó la fracción acetato de etilo de Tessaria fastigiata (FP = 1.35), el cual es significativamente mayor 287

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que el de cualquier otro extracto o fracción analizada (Figuras 1-6). El segundo valor más elevado se observó en la fracción acetato de etilo de Pluchea sagittalis (FP = 1.26), una planta que mostró una escasa actividad en los otros ensayos, pero que se utiliza como antiinflamatoria en Sudamérica (Pérez-García et al., 1996). Resultados similares se obtuvieron en el extracto crudo de Chromolaena tunariense (FP = 1.24), y en las fracciones acetato de etilo de Baccharis pentlandii (FP = 1.22), Tagetes maxima (FP = 1.22), y Mikania psilostachya (FP = 1.20). En general, la mejor estabilidad oxidativa la mostraron las fracciones acetato de etilo, con excepción de Chromolaena tunariense y Erechtites hieraciifolius, en las que los mayores factores de protección se observaron en los extractos crudos (EC1).

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Figura 1 Actividad antioxidante (BC), actividad captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anión superóxido (SO), estabilidad oxidativa (FP), y contenido de fenoles totales (CFT) en los extractos crudos (EC1). Ver la sección de “Material y Métodos” para la identificación de los extractos, fracciones, y productos de referencia. 1 = Baccharis pentlandii, 2 = Baccharis platipoda, 3 = Chromolaena tunariense, 4 = Erechtites hieraciifolius, 5 = Mikania psilostachya, 6 = Pluchea sagittalis, 7 = Tagetes maxima, 8 = Tessaria fastigiata, 9 = Wulffia baccata

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Figura 2 Actividad antioxidante (BC), actividad captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anión superóxido (SO), estabilidad oxidativa (FP), y contenido de fenoles totales (CFT) en los extractos crudos desengrasados (EC2). Ver la sección de “Material y Métodos” para la identificación de los extractos, fracciones, y productos de referencia. 1 = Baccharis pentlandii, 2 = Baccharis platipoda, 3 = Chromolaena tunariense, 4 = Erechtites hieraciifolius, 5 = Mikania psilostachya, 6 = Pluchea sagittalis, 7 = Tagetes maxima, 8 = Tessaria fastigiata, 9 = Wulffia baccata

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Figura 3 Actividad antioxidante (BC), actividad captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anión superóxido (SO), estabilidad oxidativa (FP), y contenido de fenoles totales (CFT) en las fracciones hexánicas (FHX). Ver la sección de “Material y Métodos” para la identificación de los extractos, fracciones, y productos de referencia. 1 = Baccharis pentlandii, 2 = Baccharis platipoda, 3 = Chromolaena tunariense, 4 = Erechtites hieraciifolius, 5 = Mikania psilostachya, 6 = Pluchea sagittalis, 7 = Tagetes maxima, 8 = Tessaria fastigiata, 9 = Wulffia baccata

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Figura 4. Actividad antioxidante (BC), actividad captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anión superóxido (SO), estabilidad oxidativa (FP), y contenido de fenoles totales (CFT) en las fracciones clorofórmicas (FC3). Ver la sección de “Material y Métodos” para la identificación de los extractos, fracciones, y productos de referencia. 1 = Baccharis pentlandii, 2 = Baccharis platipoda, 3 = Chromolaena tunariense, 4 = Erechtites hieraciifolius, 5 = Mikania psilostachya, 6 = Pluchea sagittalis, 7 = Tagetes maxima, 8 = Tessaria fastigiata, 9 = Wulffia baccata

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Figura 5 Actividad antioxidante (BC), actividad captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anión superóxido (SO), estabilidad oxidativa (FP), y contenido de fenoles totales (CFT) en las fracciones acetato de etilo (FAC). Ver la sección de “Material y Métodos” para la identificación de los extractos, fracciones, y productos de referencia. 1 = Baccharis pentlandii, 2 = Baccharis platipoda, 3 = Chromolaena tunariense, 4 = Erechtites hieraciifolius, 5 = Mikania psilostachya, 6 = Pluchea sagittalis, 7 = Tagetes maxima, 8 = Tessaria fastigiata, 9 = Wulffia baccata

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Figura 6 Actividad antioxidante (BC), actividad captadora de radicales libres (DPPH), hidroxilo (QL) y anión superóxido (SO), estabilidad oxidativa (FP), y contenido de fenoles totales (CFT) en las fracciones acuosas (FOH). Ver la sección de “Material y Métodos” para la identificación de los extractos, fracciones, y productos de referencia. 1 = Baccharis pentlandii, 2 = Baccharis platipoda, 3 = Chromolaena tunariense, 4 = Erechtites hieraciifolius, 5 = Mikania psilostachya, 6 = Pluchea sagittalis, 7 = Tagetes maxima, 8 = Tessaria fastigiata, 9 = Wulffia baccata

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Discusión Entre todos los extractos y fracciones analizadas, las de acetato de etilo mostraron unos valores del contenido total de fenoles y una actividad antioxidante y captadora de radicales bastante notable. En general, los extractos o fracciones con mayor actividad antioxidante y captadora de radicales mostraron también unos mayores niveles de fenoles totales, habiéndose encontrado una cierta correlación entre dichos parámetros (Tabla 1).

aCFT = contenido de fenoles totales. bQL = Quimioluminiscencia. cSO = Anión superóxido. dBC = test del β-caroteno. ep < 0.001. f p < 0.05.

Así, los mejores coeficientes de correlación tuvieron lugar entre los niveles totales de fenoles y la actividad captadora de radicales libres (con cuatro de las nueve plantas mostrando coeficientes de correlación superiores a 0.94), y entre el contenido de fenoles totales y la actividad antioxidante (con cinco de las nueve plantas mostrando coeficientes superiores a 0.90). Considerando simultáneamente los cuatro coeficientes de correlación entre el contenido de fenoles totales y los cuatro métodos empleados para determinar la actividad antioxidante y captadora de radicales, las dos plantas que mos295

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traron los mejores resultados fueron Tagetes maxima y Baccharis platipoda, con unos valores promedio de 0.91 y 0.89, respectivamente. En general, las fracciones acetato de etilo mostraron los mayores valores de fenoles totales y la mayor actividad antioxidante y captadora de radicales libres y del anión superóxido, mientras que las fracciones clorofórmicas mostraron mejores resultados de actividad captadora de radicales hidroxilo, confirmándose así resultados anteriores obtenidos con otras especies (Parejo et al., 2002). De entre las nueve fracciones acetato de etilo, sólo las de Baccharis platipoda y Tessaria fastigiata mostraron los mejores resultados de actividad antioxidante y captadora de radicales y los mayores valores niveles de fenoles totales (Figura 5). Otros resultados destacables son los de Tagetes maxima, cuyo extracto crudo desengrasado (EC2) mostró la mejor actividad captadora de radicales libres e hidroxilo, así como el valor más elevado del contenido total de fenoles, de entre los nueve extractos de este mismo tipo. Asimismo, de entre las nueve fracciones clorofórmicas, solamente la de Chromolaena tunariense mostró la mejor actividad antioxidante y actividad captadora de radicales hidroxilo (Figura 4). Las fracciones acetato de etilo mostraron una mayor actividad antioxidante y captadora de radicales libres y del anión superóxido (Figura 7), en coincidencia con otros trabajos (Mensor et al., 2001; Parejo et al., 2002). Sin embargo, la mejor actividad captadora de radicales hidroxilo la mostraron los extractos crudos desengrasados (EC2), aunque no se observan diferencias significativas entre ellos y las fracciones acetato de etilo o las clorofórmicas. También el análisis de Rancimat ha revelado diferencias significativas entre los niveles estabilidad oxidativa de las fracciones acetato de etilo y el resto de extractos y fracciones analizadas. La actividad captadora de radicales libres y la estabilidad oxidativa de las fracciones acetato de etilo de Mikania psilostachya y Tessaria fastigiata, respectivamente, fueron significativamente mayores que las del resto de este tipo de fracciones. Asimismo, la actividad captadora de radicales hidroxilo de los extractos crudos desengrasados de Mikania psilostachya y de Tagetes maxima fueron significativamente 296

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Figura 7 Distribución de las actividades antioxidante y captadora de radicales entre los diferentes extractos y fracciones, separadamente por métodos (DPPH = radical libre; QL = quimioluminiscencia; SO = anión superóxido, BC = β-caroteno). Los valores se expresan como eficiencia antiradicalaria (EA = 1000/CI50) y porcentajes de inhibición, y representan los valores promedio de todas las plantas estudiadas (ver la sección de metodología para la identificación de los extractos y fracciones).

mayores que la del resto de extractos EC2. Por último, la actividad antioxidante y captadora del anión superóxido de la fracción de acetato de etilo de Tagetes maxima fue significativamente mayor que la del resto de fracciones acetato de etilo. El extracto crudo desengrasado de Tagetes maxima mostró una actividad captadora de radicales libres mayor que la de quercetina y que la del extracto de pepitas de uva, el mejor compuesto y extracto de referencia utilizados, respectivamente (Tabla 2). Todas las fracciones acetato de etilo, con excepción de la de Wulffia baccata, mostraron ser más activas que BHA y que el extracto de romero, pero solamente las de Mikania psilostachya, Tagetes maxima y Tessaria fastigiata mostraron una actividad captadora de radicales libre mayor que el té verde. Ningún extracto o fracción presentó una actividad captadora de radicales hidroxilo mayor que el BHA o la quercetina, pero los extractos crudos desengrasados de Mikania psilostachya y Tagetes maxima mostraron una actividad mayor que la de los tres extractos de referencia. Por su parte, los dos extractos (EC1 y EC2) y la fracción acetato de etilo de Tagetes maxima, y también el extracto crudo (EC1) de Baccharis pentlandii, mostraron una actividad captadora del anión 297

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superóxido mayor que la de las diferentes substancias y extractos de referencia utilizados en este trabajo.

aValores expresados como EAG/mg extracto. bValores expresados como eficiencia antiradicalaria. cValores expresados como porcentaje de inhibición. dValores expresados como factor de protección.

Ninguno de los extractos o fracciones mostró una actividad mayor que las pepitas de uva o la quercetina, con excepción de la fracción acetato de etilo de Mikania psilostachya, que resultó ser más activa que el extracto de pepitas de uva, pero menos que la quercetina. En cuanto a la actividad antioxidante, tampoco ninguno de los extractos o fracciones obtenidos mostró una actividad antioxidante mayor que la de los compuestos o extractos de referencia empleados, con excepción de la fracción acetato de etilo de Tagetes maxima, y la clorofórmica de Chromolaena tunariense, las cuales fueron más activas que el extracto de romero (Tabla 2). Finalmente, ninguno de los extractos o fracciones obtenidos de las nueve especies estudiadas presentó una estabilidad oxidativa mayor que la del extracto de romero o la quercetina. Sin embargo, la fracción acetato de etilo de Tessaria fastigiata, que mostró el mayor contenido de fenols totales, presentó una estabilidad oxidativa comparable a la de quercetina. Del trabajo realizado con estas nueve especies se puede concluir que Tagetes maxima y Mikania psilostachya, por este orden, pueden considerarse las mejores. Tagetes maxima mostró la mejor actividad captadora de radicales libres y anión superóxido, y también actividad antioxidante, mientras que Mikania psilostachya presentó la mejor ac298

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tividad captadora de radicales hidroxilo, seguida de Tagetes maxima. Por otra parte, aunque el contenido total de fenoles de la fracción acetato de etilo de M. psilostachya fue mayor que el de la misma fracción de T. maxima, considerando la suma de los niveles totales de fenoles determinados en todos los extractos y fracciones, el contenido fenólico de Tagetes maxima (1191 EAG/mg) fue mayor que el de Mikania psilostachya (1102 EAG/mg). Además, Tagetes maxima mostró el segundo valor de FP en el test de Rancimat, y fue la especie que mostró el mejor coeficiente de correlación entre los diferentes métodos utilizados (R = 0.91), lo que sugiere que posee buenas propiedades antioxidantes. De los seis extractos/fracciones de Tagetes maxima analizados, el extracto crudo desengrasado (EC2) exhibió muy buenos resultados en todos los ensayos, en la mayoría de los casos incluso mejores que los de la fracción acetato de etilo. Este extracto EC2 también presentó propiedades antioxidantes (actividad captadora de radicales libres y anión superóxido) mejores que las de los compuestos y extractos de referencia utilizados. Además, este extracto se considera especialmente interesante por su posible uso en la industria alimentaria o en cualquier otra aplicación porque no resulta necesario someterlo a un proceso posterior de fraccionamiento o purificación. Los buenos resultados mostrados por Mikania psilostachya están en coincidencia con la actividad antiinflamatoria mostrada por otras especies de este género, como M. laevigata y M. involucrata (Suyenaga et al., 2002). Aparte de Tagetes maxima y Mikania psilostachya, que se consideran las mejores plantas de las aquí estudiadas, Tessaria fastigiata y Baccharis pentlandii también mostraron una buena actividad antioxidante y captadora de radicales, de forma similar a otras especies pertenecientes a estos géneros, en particular, T. integrifolia (Desmarchelier et al., 2000), B. coridifolia (Mongelli et al., 1997) y B. trinervis (De las Heras et al., 1998), que son comúnmente utilizadas en la medicina tradicional en Sudamérica. Contrariamente, ningún extracto o fracción de Pluchea sagittalis mostró una actividad antioxidante significativa, en contraste con la actividad observada por un extracto acuoso de esta planta y por uno metanólico de P. indica, especies ambas que han mostrado poseer actividad 299

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antiinflamatoria (Sen and Nag Chaudhuri, 1991; Pérez-García et al., 1996; Sen et al., 2002). En conclusión, el presente trabajo pone de manifiesto que la flora de Bolivia puede constituir una fuente interesante de nuevos extractos vegetales antioxidantes, tales como los de Tagetes maxima y Mikania psilostachya, con una potencial aplicación en diferentes sectores industriales, como el alimentario, cosmético, farmacéutico, entre otros.

Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado por la Generalitat de Catalunya (2001SGR00124), y el Decanato de Investigaciones y Desarrollo de la Universidad Simón Bolívar, Venezuela. y se ha realizado en el marco del Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED, proyecto IV.11). Agradecemos a los Sres. Ferran Sánchez y Luca Lavelli por su asistencia técnica, y a los Sres. Antonio Mañes (EUROMED, España) y Bernd Weinreich (RAPS, Alemania) por el suministro de extractos de pepitas de uva, y de romero y té verde, respectivamente.

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ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y CAPTADORA DE RADICALES EN NUEVE ASTERACEAE BOLIVIANAS

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COMPUESTOS ANTIOXIDANTES DEL HINOJO AMARGO Foeniculum vulgare Carles Codina, Irene Parejo, Jaume Bastida, Jesús Burillo, Francesc Viladomat

COMPUESTOS ANTIOXIDANTES DEL HINOJO AMARGO. Foeniculum vulgare Carles Codinaa, Irene Parejoa, Jaume Bastidaa, Jesús Burillob, Francesc Viladomata a

Departamento de Productos Naturales, Biología Vegetal y Edafología, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Avda. Joan XXIII s/n, 08028 Barcelona, España b Servicio de Investigación Agroalimentaria, (DGA), Unidad de Recursos Forestales, Área de Aromáticas y Medicinales, Apdo. de Correos 727, 50080 Zaragoza, España

Introducción De las especies mediterráneas estudiadas en una fase previa de monitoreo de plantas con actividad antioxidante (Parejo et al., 2002), se seleccionó el residuo constituído por el material destilado del hinojo amargo, Foeniculum vulgare (Apiaceae), para el estudio de su composición química. Si bien los aceites esenciales de esta planta se han estudiado ampliamente, apenas se tiene conocimiento de la presencia de otros compuestos no volátiles, tales como ácidos fenólicos y flavonoides. Así, tan sólo se ha descrito la presencia de ácido clorogénico, derivados del ácido hidroxibenzoico, glicósidos de flavonoides y algunas cumarinas en el hinojo dulce (Schmidtlein and Herrmann, 1975, Murray et al., 1982, Bilia et al., 2000, Soliman et al., 2002), mientras que en el hinojo amargo se han identificado unos pocos aglicones y glicósidos de flavonoides (Crowden et al., 1969, Harbone & Saleh, 1971, Kunzemann & Herrmann, 1977, Soliman et al. 2002). En relación a la actividad antioxidante del hinojo, aunque se han investigado sus aceites esenciales con esta finalidad (Ruberto et al., 2000), no se han efectuado estudios anteriores en extractos polares de esta planta. En el presente trabajo se han identificado 42 compuestos fenólicos distintos, de los cuales 27 no se han descrito con anterioridad en ninguna de las variedades (dulce y amarga) de hinojo.

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Material y Métodos Material vegetal Las plantas de Foeniculum vulgare Mill. var. vulgare (Apiaceae) procedían de cultivos establecidos bajo condiciones agronómicamente controladas, en una parcela exprimental de Cetina (Zaragoza, España). El material vegetal estaba constituido por hojas, tallos y estructuras florales, y fue previamente destilado por arrastre de vapor para la extracción de los aceites esenciales. La extracción se llevo a cabo en la finca experimental “La Alfranca” (Diputación General de Aragón), a nivel de planta piloto, y siguiendo un protocolo de operación estandarizado por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. Una vez destilado, el material se secó al aire, y se pulverizó en molino.

Extracción y fraccionamiento bioguiado 1kg de material seco del residuo destilado de hinojo se extrajo por decocción con agua durante 15 minutos. Los extractos acuosos combinados, una vez enfriados y filtrados, se cromatografiaron en columnas de Amberlita® empaquetadas con XAD-7 and XAD-16, eluyéndose con metanol:agua (1:1), metanol, y finalmente acetona, hasta decoloración. Después de concentrar, se obtuvieron 54 g de extracto crudo (EC), el cual se redisolvió en agua, y particionó con acetato de etilo, lo que dió lugar a una fracción de acetato de etilo (FAE) y otra acuosa (FA). Una alícuota de esta última se disolvió en metanol:agua (1:1) y se fraccionó por cromatografía de gel filtración (Sephadex® LH-20), obteniéndose 96 fracciones de 10 mL, que fueron monitoreadas por TLC utilizando como revelador una solución metanólica de DPPH•, y agrupadas finalmente en siete fracciones (A - G). Cada una de ellas fue objeto de un nuevo fraccionamiento bioguiado y posterior proceso de purificación mediante Sephadex LH 20, TLC preparativa y/o HPLC semipreparativa. Todo el proceso de extracción, fraccionamiento y separación cromatográfica al que fue sometido el residuo de hinojo está resumido en la Figura 1.

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COMPUESTO ANTIOXIDANTES DEL HINOJO AMARGO. FOENICULUM VULGARE

Figura 1. Esquema del proceso de extracción y fraccionamiento bioguiado del residuo de hinojo.

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Identificación de los compuestos fenólicos Una vez aislados y purificados, la identificación de los distintos compuestos se realizó principalmente por espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) mono- y bidemensional. Los espectros de protón (1H-RMN) y de carbono (13C-RMN) se realizaron en un espectrómetro Varian Gemini-300. También se realizaron experimentos bidimensionales (HMBC, HMQC, COSY y NOESY) para la confirmación de algunas estructuras, los cuales se llevaron a cabo en un espectrómetro Inova 500. Para el análisis de las muestras, éstas se disolvieron en metanol deuterado (CD3OD). Además de la elucidación estructural de los compuestos mayoritarios obtenidos en el proceso de aislamiento bioguiado, las diferentes fracciones obtenidas se analizaron por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC/MS), de acuerdo con la metodología desarrollada al efecto (Parejo et al., remitido), con la finalidad de identificar el mayor número posible de substancias fenólicas presentes en el hinojo.

Determinación de la actividad antioxidante El extracto crudo, así como cada una de las fracciones obtenidas y de los compuestos posteriormente aislados, se sometió al análisis de la capacidad captadora de radicales libres por el método del DPPH, radicales hidroxilo por el método de quimioluminiscencia (QL), o del anión superóxido (SO), los cuales se describen en la METODOLOGÍA. El contenido de fenoles totales se expresa como equivalentes de ácido gálico (EAG) por mg de extracto, la actividad captadora de radicales libres e hidroxilo como concentración inhibitoria 50 % (CI50), y la actividad captadora del anión superóxido como porcentaje de inhibición.

Análisis cuantitativo por HPLC Con la finalidad de poder cuantificar los compuestos fenólicos mayoritarios del hinojo, y ante la ausencia de otros métodos cuantitativos de determinación de fenoles en esta planta, se desarrolló un método analítico de determinación cuantitativa por HPLC de diez compuestos 308

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fenólicos, el cual se validó para distintos parámetros siguiendo la normativa ICH (Parejo et al., remitido). Las substancias de referencia utilizadas para la validación del método fueron ácido 5-O-cafeoilquínico (ácido clorogénico), quercetina-3-O-rutinósido (rutina) y ácido rosmarínico, obtenidos comercialmente, y ácido 1,5-O-dicaffeoilquínico, quercetina-3-O-glucurónido (miquelianina), y eriodictiol-7-O-rutinósido (eriocitrina), aislados previamente en nuestro laboratorio de plantas de hinojo. La detección de los compuestos fenólicos se realizó a 330 nm, a excepción de la eriocitrina, que se determinó a 280 nm.

Estudio comparativo de distintas muestras de hinojo Una vez establecido un método de determinación cuantitativa por HPLC de los compuestos fenólicos presentes en el hinojo, se procedió a determinar el contenido de fenoles en distintas muestras de hinojo: material destilado, material sin destilar, y frutos, puesto que éstos últimos constituyen la droga que figura en las Farmacopeas Europea, Alemana y Española, entre otras. Con los tres tipos de muestras se realizó la comparación de los fenoles cuantificados por HPLC con el contenido total de fenoles determinado por el método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu descrito en la sección Diseño Experimental.

Resultados Fraccionamiento bioguiado Las fracciones obtenidas durante el proceso de separación y fraccionamiento cromatográfico del residuo de hinojo fueron objeto de evaluación de su actividad antirradicalaria. La fracción acuosa (FA) obtenida en el proceso inicial de extracción y fraccionamiento exhibió el mayor contenido de fenoles totales (297 EAG/mg), así como la mejor actividad captadora de radicales libres (CI50 = 9.94) y radicales hidroxilo (CI50 = 15.23), aunque la inhibición del anión superóxido (58.63 %) fue inferior a la del extracto crudo (Tabla 1). El proceso posterior de fraccionamiento bioguiado de la fracción acuosa condujo al aislamiento de seis fracciones activas (la fracción A no puede considerarse activa), siendo las fracciones F y G las que mostraron 309

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

una mayor actividad. La fracción F resultó ser la más activa de todas, con un valor de CI50 de 4.58 y un porcentaje de inhibición del 93.6 % para la actividad captadora de radicales hidroxilo y del anión superóxido, respectivamente, así como unos niveles elevados de fenoles totales (368.9 EAG/mg). Sin embargo, la fracción G mostró la mayor actividad captadora de radicales libres (IC50 = 6.45), mientras que la fracción D presentó el mayor contenido de fenoles totales (443.5 EAG/mg) y la mayor actividad captadora de radicales hidroxilo (CI50 = 3.92). Por último, la fracción E mostró la menor actividad captadora de radicales libres y anión superóxido, así como el menor contenido de fenoles totales.

a Valores expresados como EAG/mg extracto b Valores expresados como CI50 (µg/mL) c Valores expresados como porcentaje de inhibición a 50 µg/mL

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COMPUESTO ANTIOXIDANTES DEL HINOJO AMARGO. FOENICULUM VULGARE

Aislamiento y elucidación estructural La separación cromatográfica de las fracciones obtenidas, y su posterior purificación por TLC y HPLC preparativas, dió como resultado el aislamiento de doce compuestos, cinco de los cuales son derivados del ácido cinámico, entre los que se encuentran tres isómeros del ácido clorogénico, concretamente los ácidos neoclorogénico (ác. 3O-cafeoilquínico), criptoclorogénico (ác. 4-O-cafeoilquínico) y el propio ácido clorogénico (ác. 5-O-cafeoilquínico), el ácido rosmarínico, de reconocido valor antioxidante, y el ácido 1,5-O-dicafeoilquínico. Los otros siete compuestos fenólicos aislados e identificados químicamente por RMN fueron tres flavonoides monoglicosidados: quercetina-3-O-galactósido (hiperósido), quercetina-3-O-glucósido (isoquercitrina) y camferol-3-O-glucósido, tres flavonoides diglosidados: quercetina-3-O-rutinósido (rutina), eriodictiol-7-O-rutinósido (eriocitrina) y camferol-3-O-rutinósido, y finalmente la quercetina-3-O-glucurónido (miquelianina). Las estructuras de dichos compuestos se representan en la Figura 2.

Compuestos fenólicos minoritarios Además de los doce compuestos aislados y caracterizados químicamente a lo largo del proceso de fracionamiento bioguiado, el análisis por LC/MS de cada una de las fracciones inicialmente obtenidas permitió la identificación de un total de 42 compuestos de naturaleza fenólica, los cuales se presentan agrupados por categorías estructurales en la Tabla 2. La distribución de dichos compuestos entre las distintas fracciones no fue homogénea en cuanto a la naturaleza de sus constituyentes. Así, las fracciones A, B y G mostraron contener un sólo tipo de compuestos fenólicos: un total de diez isómeros del ácido quínico esterificado con ácidos cafeico, ferúlico o cumárico, simultáneamente en el caso de las fracciones A y B, y flavonoides monoglicosidados en el caso de la fracción G. Por el contrario, el resto de fracciones (C-F) presentó una composición fenólica más diversa, encontrándose en cada una de ellas compuestos pertenecientes a dos o más grupos estructurales distintos (Tabla 2). De los 42 compuestos identificados, 27 de ellos se describen por primera vez en el hinojo. 311

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Figura 2. Compuestos mayoritarios aislados de Foeniculum vulgare

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* Compuestos identificados por primera vez en el hinojo

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Determinación quantitativa de fenoles La prueba preliminar para determinar las condiciones óptimas de extracción de los compuestos fenólicos del hinojo puso de manifiesto que el mejor rendimiento de la extracción se obtenía utilizando una mezcla de agua:metanol (80:20), y sonicando a temperatura ambiente (25 ºC) durante 20 minutos. Una vez establecidos estos parámetros, se desarrolló un método analítico para determinar cuantitativamente dichos compuestos por HPLC (Parejo et al., remitido). El método ha permitido la separación de diez de los constituyentes mayoritarios del hinojo, con una resolución muy aceptable (Figura 3) y en un tiempo de análisis de 40 minutos, lo que representa un ahorro de tiempo y de solvente con respecto a otros métodos de identificación de fenoles. Además, el método se ha validado para diversos parámetros (linearidad, precisión, etc.).

Figura 3 Cromatograma HPLC del perfil fenólico de una muestra destilada de hinojo. Compuestos: 1, ácido neoclorogénico; 2, ácido clorogénico, 3, ácido criptoclorogénico; 4, ácido 1,3-O- dicafeoilquínico; 5, eriocitrina; 6, rutina; 7, miquelianina; 8, ácido 1,5-O-dicafeoilquínico; 9, ácido 1,4-O-dicafeoilquínico, y 10, ácido rosmarínico.

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Contenido de fenoles en distintas muestras de hinojo Los tres tipos de material de hinojo analizado mostraron un perfil fenólico distinto, tanto a nivel cualitativo como cuantitativo. Así, mientras el principal compuesto fenólico del hinojo sin destilar fue el ácido clorogénico, en el material destilado fue el ácido rosmarínico, y en los frutos la miquelianina y el ácido 1,3-O-dicafeoilquínico (Tabla 3).

1 Fenoles totales cuantificados por HPLC 2 Fenoles totales determinados por el método de Folin-Ciocalteu 3 Proporción (%) del contenido fenólico determinado por HPLC con respecto al contenido total de fenoles

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Además, el material destilado mostró un contenido de eriocitrina relativamente elevado, flavonoide éste que se presentó solamente en trazas en los otros dos tipos de materiales analizados. En general, el contenido de compuestos fenólicos en el material destilado fue superior al del material sin destilar, mientras que los frutos mostraron los menores niveles de fenoles en los tres tipos de muestras. En el caso del hinojo destilado, el contenido de fenoles determinado por HPLC representó el 60.5 % del contenido total de fenoles determinados por el método de Folin-Ciocalteu, acumulando así un mayor contenido de compuestos activos que el material sin destilar y que los frutos de hinojo, materiales en los que dicho porcentaje fue del 37.7 % y 33.7 %, respectivamente.

Conclusiones En este trabajo, el fraccionamiento bioguiado del extracto crudo del material de hinojo previamente destilado condujo a la identificación de siete compuestos con actividad captadora de radicales: los ácidos clorogénico, rosmarínico y 1,5-di-O-caffeoilquínico, y los flavonoides eriocitrina (eriodictiol-7-O-rutinósido), rutina (quercetin-3-O-rutinósido), hiperósido (quercetin-3-O-galactósido) y camferol-3-O-rutinósido. A excepción del ácido clorogénico, identificado en la variedad dulce de Foeniculum vulgare (Bilia et al., 2000), i del camferol-3-Orutinósido, presente en la variedad amarga del hinojo (Kunzemann et al., 1977), el resto de los productos aislados no se han descrito anteriormente en el hinojo. Por el contrario, el aglicón quercetina y el flavonoide camferol-3-O-arabinósido, que se habían descrito en los frutos del hinojo (Kunzemann y Herrmann, 1977), no se han encontrado en este residuo vegetal. La identificación de estos compuestos en el hinojo pone de manifiesto la conexión entre su composición química y su actividad antioxidante. Además, estos resultados pueden contribuir a la interpretación de los efectos farmacológicos de esta planta medicinal, y a dar soporte a la posibilidad de que el hinojo posee efectos protectores para la salud humana. Además, aparte de su uso en la dieta mediterránea como una especia o en la medicina popular, el residuo deri316

COMPUESTO ANTIOXIDANTES DEL HINOJO AMARGO. FOENICULUM VULGARE

vado de su destilación para aceites esenciales constituye una fuente accesible de antioxidantes naturales.

Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado por el Gobierno de Aragón a través de las Ayudas a la Experimentación, del Departamento de Agricultura, y por la Generalitat de Catalunya (referencia 2001SGR - 00124), y se ha realizado en el marco del Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED, Proyecto IV.11). Los autores están especialmente agradecidos a la Dra. Olga Jáuregui, de los Servicios Cientificotécnicos de la Universidad de Barcelona, por su asistencia técnica en la identificación de los compuestos fenólicos por LC/MS.

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Helichrysum italicum COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIINFLAMATORIO Ríos JL Schinella GR, Sala A, Recio MC

Helichrysum italicum COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIINFLAMATORIO Ríos JL1 Schinella GR2, Sala A1, Recio MC1 1

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Departament de Farmacologia, Facultat de Farmàcia, Universitat de València, España Cátedra de Farmacología, Facultad de Ciencias Medicas, Universidad Nacional de La Plata, Argentina.

Introducción Helichrysum italicum (Roth) G. Don fil (Asteraceae) es un arbusto característico de la región mediterránea (Figura 1). Las flores y la sumidad florida se han empleado por sus propiedades antiinflamatorias y antialérgicas tanto en medicina tradicional como en fitoterapia [1]. Se utiliza en forma de infusión o extracto fluido para problemas respiratorios con componentes alérgicos o infecciosos, así como en patologías dermatológicas como psoriasis, eczemas y procesos inflamatorios.

Figura 1. Helichrysum italicum (Roth) G. Don fil (Asteraceae)

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Diversos estudios se han realizado sobre sus propiedades antiinfecciosas [2,3] y antiinflamatorias [4,5]. Recientemente se ha profundizado en su posible mecanismo de acción, incluyendo el estudio de sus propiedades antioxidantes [6-10].

Estudio de especies antioxidantes En un cribado previo estudiamos la posible actividad antioxidante de 20 especies antiinflamatorias seleccionadas [6]. Analizamos el comportamiento de los extractos hidroalcohólicos, metanólicos o acuosos de las diferentes especies frente a diversos modelos experimentales, como peroxidación lipídica inducida por Fe2+/ascorbato, CCl4/NADPH, y aminopirina N-desmetilasa en microsomas hepáticos de rata, generación de radical hidroxilo (Fe3+-EDTA/H2O2/ascorbato) y superóxido (hipoxantina/xantina oxidasa), y peroxidación de membranas de eritrocitos de rata. De todos los extractos estudiados (Tabla 1), fue el extracto metanólico de Helichrysum italicum uno de los que mejores resultados dio en diferentes pruebas, con IC50 de 32.0 µg/ml (Fe2+/ascorbato), 37.2 µg/ml (CCl4/NADPH) y 18.9 µg/ml (hipoxantina/xantina oxidasa). Como conclusión, consideramos que la fracción fenólica, especialmente los flavonoides, podrían ser los responsables de la actividad antioxidante observada [6]. En un estudio posterior [7], fraccionamos el extracto metanólico y estudiamos la actividad antioxidante y antiinflamatoria de los subextractos obtenidos: n-hexano, diclorometano, acetato de etilo y n-butanol. A 100 µg/ml los extractos diclorometano, acetato de etilo y n-butanol inhibieron la peroxidación lipídica inducida por Fe2+/ascorbato alrededor del 95%, y por CCl4/NADPH un 87, 80 y 46%, respectivamente. En una prueba paralela frente al radical 2,2-difenil1-picrilhidrazilo (DPPH), los 3 extractos redujeron el radical en porcentajes comprendidos entre el 89% y el 94%. El extracto hexánico inhibió significativamente la peroxidación inducida por CCl4/NADPH (62%) y redujo un 33% el radical DPPH. El estudio paralelo de la actividad antiinflamatoria demostró que los subextractos poseen en general una actividad similar al extracto metanólico total, variando la respuesta cuantitativa en función del agente irritante. De las pruebas 322

HELICHRYSUM ITALICUM COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIINFLAMATORIO

realizadas destaca el efecto frente a la reacción de hipersensibilidad inducida por glóbulos rojos de cordero (SRBC), lo que en parte puede justificar el efecto antialérgico descrito en el empleo de esta planta en la medicina popular [7].

Aislamiento y estudio de los principios activos A partir de los extractos activos aislamos 6 acetofenonas, 1 derivado del maltol y 3 flavonoides (Figura 2) [8-10]. De ellos, los compuestos con mayor interés farmacológico fueron la 4-hidroxi-3-(3-metil-2-butenil) acetofenona, como principio analgésico y antiinflamatorio, y los flavonoides gnafaliína y tilirósido como antioxidantes [9,10].

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Figura 2. Principales compuestos activos aislados de Helichrysum italicum

De todas las acetofenonas aisladas, el compuesto 4-hidroxi-3(3-metil-2-butenil) acetofenona fue el más relevante por su actividad farmacológica, ya que posee propiedades analgésicas periféricas y actividad antiiflamatoria en procesos agudos. La acetofenona inhibió ligeramente el edema agudo inducido por TPA (acetato de 324

HELICHRYSUM ITALICUM COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIINFLAMATORIO

tetradecanoilforbol) en oreja de ratón (20%), el edema agudo en pata de ratón inducido por carragenina (51%, 61% y 66%, a 1, 3 y 5 h, respectivamente), y el edema en pata de ratón inducido por fosfolipasa A2 (PLA2) un 54% y 33% a 30 y 60 min, respectivamente, pero sólo tiene un débil efecto en los procesos crónicos o subcrónicos. Respecto al mecanismo de acción, hemos demostrado que está relacionado con la inhibición del metabolismo del ácido araquidónico, inhibiendo a 100 µM un 95% la actividad 5-lipoxigenasa (5-LOX) y un 69% la actividad ciclooxigenasa-1 (COX-1) por un mecanismo no redox [9]. A diferencia de las acetofenonas, los flavonoides sí poseen actividad antioxidante y antiinflamatoria en procesos subcrónicos. De los flavonoides aislados, el tilirósido fue el más activo, inhibiendo la peroxidación lipídica enzimática (IC50 = 12.6 µM) y no enzimática (IC50 = 28 µM), además posee propiedades captadoras de radical superóxido (IC50 = 21.3 µM) y del DPPH (IC50 = 6 µM). Este compuesto también posee propiedades antiiflamatorias: inhibe el edema agudo en pata de ratón inducido por PLA2 (DE50 = 35.6 mg/kg), el edema agudo inducido por TPA (DE50 = 0.36 mg/oreja) y la inflamación subcrónica inducida por aplicación repetida de TPA (0.5 mg/oreja produce un 50% de reducción de edema y 88% de reducción de infiltración leucocitaria). El tilirósido sólo tiene un ligero efecto en el edema inducido por serotonina y no afecta la actividad de la enzima 5-LOX. En la Tabla 2 se recopilan los valores más representativos de la actividad antioxidante del tilirósido, en comparación con los fármacos de referencia. La pinocembrina fue el único compuesto que inhibió la reacción de hipersensibilidad retardada inducida por SRBC y es el compuesto más potente frente al edema agudo en oreja de ratón inducido por TPA (DE50 = 0.06 mg/oreja), sin embargo en el resto de pruebas in vivo el efecto es claramente inferior al del tilirósido. La gnafaliína fue el compuesto más activo en el edema en pata de ratón inducido por serotonina. La gnafaliína y la pinocembrina inhiben la producción de leucotrieno B4 (LTB4) en neutrófilos peritoneales de rata, mientras que el tilirósido no afecta la producción.

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Tilirosido y gnafalina inhiben la peroxidación lipídica de lipoproteínas de baja densidad humanas (LDL) inducida por Cu2+ en el mismo orden que la droga utilizada como referencia, probucol [11]

Otros estudios de interés realizados con Helichrysum italicum Maffei Facino y colaboradores [5] han demostrado la actividad de extractos de Helichrysum italicum de diferente polaridad obtenidos a partir de la sumidad florida frente al eritema producido por radiación UVB en humanos y en cobayas, siendo en este caso la fracción enriquecida en flavonoides la responsable de la actividad antiinflamatoria. El flavonoide gnafaliína inhibe la generación de tromboxano B2 (TXB2) y de LTB4, la generación de radical superóxido y la peroxidación lipídica [11]. Diversos flavonoides aislados de Helichrysum italicum por otros investigadores tienen propiedades captadoras de radicales libres [12]. Asimismo, hemos mostrado que el triterpeno tetracíclico ácido ursólico, aislado a partir del extracto clorofórmico de Helichrysum italicum, es activo en diferentes modelos experimentales de inflamación agudos [13] y crónicos [14], e inhibe selectivamente la biosíntesis de prostaglandinas (PGs) mediadas por COX-2 [15]. Diversas acetofenonas estructuralmente relacionadas con las aisladas de Helichrysum italicum inhiben el edema inducido por carragenina, la quimiotaxis e infiltración de neutrófilos y la agregación plaquetaria inducida por ácido araquidónico, mediante la reducción 326

HELICHRYSUM ITALICUM COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIINFLAMATORIO

de la formación de LTB4 y PGB2 [16], y poseen actividad antialérgica y antiinflamatoria específica de vías aéreas [17,18].

Conclusiones Como conclusión se puede justificar el efecto antioxidante y antiinflamatorio de la especie Helichrysum italicum en virtud de los efectos observados tanto en los subextractos como en los principios aislados de la especie. Las acetofenonas, son los compuestos responsables de la actividad analgésica y antiinflamatoria, aunque en este caso conjuntamente con los flavonoides. Respecto al posible mecanismo de acción, la actividad está en parte condicionada por la inhibición del metabolismo del ácido araquidónico (LOX y COX) de algunas acetofenonas y flavonoides, y las propiedades antioxidantes de los flavonoides.

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

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Phagnalon rupestre COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIALÉRGICO Ríos JL, Schinella GR, Góngora L, Máñez S, Giner RM

Phagnalon rupestre COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIALÉRGICO Ríos JL1, Schinella GR2, Góngora L1, Máñez S1, Giner RM1 1

Departament de Farmacologia, Facultat de Farmàcia, Universitat de València, España 2 Cátedra de Farmacología, Facultad de Ciencias Medicas, Universidad Nacional de La Plata, Argentina.

Introducción Phagnalon rupestre (L.) DC. (Asteraceae) es un subarbusto perenne que se localiza en comarcas litorales y sublitorales de la región mediterránea (Figura 1). La sumidad florida y la planta entera se utilizan por sus propiedades antiinflamatorias y antialérgicas en medicina tradicional. Además se ha descrito su empleo como anestésico para aliviar el dolor de muelas, como analgésico en cefaleas y como antiasmático [1-3]. No existen muchos trabajos experimentales realizados sobre los potenciales efectos farmacológicos. Se han estudiado las propiedades antimicrobianas de los extractos acuosos y etanólicos [3], y actividad anestésica del aceite esencial obtenido de la planta [4]. Existen también referencias farmacológicas sobre compuestos aislados en esta especie, como las propiedades antioxidantes y antiinflamatorias de los flavonoides, propiedades antiinflamatorias de triterpenos, esteroles y otros compuestos, detectados Figura 1. Phagnalon rupestre (L.) en esta especie. DC. (Asteraceae)

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Estudio previo del extracto En un primer estudio, estudiamos la actividad del extracto metanólico frente a diversos agentes que producen hipersensibilidad retardada, como 2,4-dinitro-1-fluorobenceno (DNFB) y hematíes de cordero (SRBC). Cuando el extracto metabólico de Phagnalon rupestre se administró tópicamente después de desencadenar la reacción de hipersensibilidad con DNFB, la infamación se redujo un 42% y un 39%, a las 24 h (desencadenamiento de la reacción) y 96 h (proceso inflamatorio debido a la misma), respectivamente. En el caso de la hipersensibilidad retardada inducida por SRBC, la reacción se redujo un 32% a las 18 h. A continuación fraccionamos el extracto metanólico total y estudiamos la inhibidora de la reacción de hipersensibilidad inducida por DNFB de los subextractos obtenidos: n-hexano, diclorometano, acetato de etilo y n-butanol. A 0.5 mg/oreja el extracto acetato de etilo fue el más activo, inhibiendo el edema causado por la reacción de hipersensibilidad un 55% tanto a las 24 como a las 96 h.

Aislamiento y estudio de los principios activos A partir de los extractos activos aislamos 4 derivados de la hidroquinona, 4 esteres cafeoil-quínicos, 1 lignano, 1 acetofenona y 1 flavonoide (Figura 2) [1,5-8]. De ellos, los compuestos con mayor interés farmacológico fueron el flavonoide y los derivados de la hidroquinona, los cuales redujeron la inflamación durante la inducción (2 h) y en la fase tardía (96 h). El flavonoide redujo el edema un 49% y un 79%, respectivamente, mientras que los derivados de la hidroquinona más activos lo hicieron sobre un 40-45% y un 70-75%, respectivamente [7-8].

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PHAGNALON RUPESTRE COMO ANTIOXIDANTE Y ANTIALÉRGICO

Figura 2. Principales compuestos activos aislados de Phagnalon rupestre

Inhibiciones enzimáticas de los principios de Phagnalon rupestre A continuación estudiamos la actividad inhibidora de 3 prenilhidroquinonas y 4 ésteres del ácido cafeico aislados del extracto activo de Phagnalon rupestre. Las enzimas seleccionadas han sido elastasa, mieloperoxidasa (MPO), 5-lipoxigenasa (5-LOX) y xantina oxidasa (XO). De los 7 compuestos estudiados 5 inhibieron la liberación de elastasa, 5 la actividad MPO, ninguno la actividad 5-LOX y 4 la XO. Los compuestos 333

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

más activos han sido los derivados del ácido cafeico, especialmente el metil ester del ácido 3,5-di-O-cafeoilquínico, cuya CI50 fue de 8.9 µM (liberación de elastasa), 60 µM (actividad MPO) [7]. El metil éster del ácido 4,5-di-O-cafeoilquínico fue el mas potente inhibidor de XO con una CI50= 3.6 µM, el estudio cinético demostró que la inhibición es de tipo competitiva (Ki = 0.24 µM) estos valores están en el mismo rango que la droga de referencia, allopurinol [8].

Actividad antioxidante de los principios de Phagnalon rupestre El metil ester del ácido 3,5-di-O-cafeoilquínico también fue el más activo como inhibidor de la producción de radical superóxido en leucocitos humanos, con una CI50 de 31.7 µM. En el resto de las técnicas ensayadas los derivados del ácido cafeico fueron los más activos, mientras que los derivados prenilhidroquinona no actuaron en ninguno de los protocolos estudiados, salvo el 1-O-(4”-O-cafeoil)-β-glucopiranosil-1,4-dihidroxi-2-(3’,3’-dimetilalil)benceno, el cual lleva un grupo cafeoilo, lo que demuestra la actividad de este grupo funcional. En la tabla 1 se recopilan los valores de inhibición de los compuestos más activos en las diferentes técnicas ensayadas.

Actividad antioxidante: CI50 (µM) de los principios aislados de Phagnalon rupestre en diferentes modelos experimentales. Compuesto 1 [1-O-(4”-O-cafeoil)-βglucopiranosil-1,4-dihidroxi-2-(3’,3’-dimetilalil)benceno], compuesto 2 [metil ester del ácido 3,5-di-O-cafeoilquínico, compuesto 3 [metil ester del ácido 4,5-di-Ocafeoilquínico], compuesto 4 [ácido 3,5-di-O-cafeoilquínico], compuesto 5 [ácido 3,5-di-O-cafeoilquínico]

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Conclusiones A la vista de los resultados se puede confirmar que la fracción activa de los compuestos estudiados es el radical cafeoil, presente en las moléculas activas. Los derivados prenilhidroquinónicos sin el radical cafeoil son inactivos en los modelos experimentales ensayados. Los estudios de inhibiciones enzimáticas realizados también confirman estas características estructurales. Sin embargo, estos compuesto si han sido activos en los modelos de hipersensibilidad retardada inducida por DNFB y SRBC. Como conclusiones generales se puede postular que Phagnalon rupestre tiene propiedades antiinflatorias y antialérgicas, cuyos principios responsables son los derivados hidroquinónicos, flavonoides y cafeoil-quinatos. Además, esta especie tiene propiedades antioxidantes, lo cual justifica en parte la actividad sobre determinadas enzimas. Los responsables de la actividad son los derivados del ácido cafeico.

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PODER ANTIOXIDANTE DE LOS ESTILBENOS. Relaciones, Actividad, Estructura y Mecanismos Alejandro Fernández Arteaga

PODER ANTIOXIDANTE DE LOS ESTILBENOS. Relaciones, Actividad, Estructura y Mecanismos Alejandro Fernández Arteaga Departamento de Ingeniería Química, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Avda. Fuentenueva s/n. 18071, Granada. España

Introducción Se presenta una revisión de las propiedades antioxidantes de los compuestos naturales presentes en los extractos del rizoma de una especie vegetal denominada Rheum undulatum L., conocido como ruibarbo o rhubarb, que se encuentra fundamentalmente en Asia Central y que es conocida desde la antigüedad y ha sido empleada en la medicina tradicional de Japón, China y Corea, entre otros paises. Los compuestos más abundantes descritos en ruibarbo1 son del grupo de los estilbenos. Los estilbenos son un grupo de compuestos polifenólicos, que reúne unas 200 estructuras2-9 (dentro de las 8000 estructuras que configuran el grupo de los polifenoles), siendo la forma molecular más extendida en la naturaleza el resveratrol10. Otros compuestos de este grupo son las viniferinas y las fitoalexinas estilbénicas.

Componentes químicos del rizoma de r. Undulatum. Del rizoma seco de R. undulatum sometido a extracción con metanol a temperatura ambiente y mediante separaciones primero en columna cromatográfica en fase reversa y posteriormente en silica gel normal se aislaron distintos compuestos que se identificaron por RMN-1H y 13C. Las estructuras se muestran en la Figura-11. Además para aportar más evidencias acerca de la relación entre estructura y actividad en el atrapamiento de radicales, se prepararon por vía sintética los siguientes compuestos (Fig 1), a partir de los naturales que fueron aislados de los extractos. 339

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Figura-1: estructuras de los compuestos aislados.

La isorrapontigenina (5) se obtuvo por hidrólisis enzimática a partir de 4. Los dihidroxiestilbenos (1a, 2a, 6a, 7a, 9a y 12a) se obtuvieron por hidrogenación catalítica en presencia de paladio-carbono de 1, 2, 6, 7, 9 y trans-estilbeno (12). Los derivados completamente metilados (1b, 2b, 6b y 9b) fueron preparados por metilación con yoduro de metilo en medio básico a partir de los sustratos 1, 2, 6 y 9. Finalmente, se prepararon los derivados parcialmente metilados (1c y 2c) por metilación controlada de 1b y 2b.

Estudio de las actividades antioxidantes Actividad de atrapamiento de ·O2- y de radicales DPPH El radical DPPH, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, que es estable y muestra una absorción a 517 nm, ha sido empleado como adecuada herramienta para el ensayo de atrapamiento de radicales, siendo este ensayo independiente de cualquier actividad enzimática. Cuando este compuesto acepta un electrón o radical de hidrógeno se convierte en un compuesto más estable y, por consiguiente, la absorción desaparece. Por otro lado, se usó el sistema xantina-xantina oxidasa para la generación de ·O2-, que se detecta por la reducción del NBT (nitroazul de tetrazolio). Las actividades de atrapamiento del radical DPPH y del ·O2- se examinaron para los constituyentes químicos del rizoma del R. undulatum y sus derivados y se compa340

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a: Glc: β-D-glucopiranosil.

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raron lo resultados con los de un compuesto de referencia, α-tocoferol, que mostró actividad de atrapamiento para el radical DPPH, pero mostró poca actividad para el ·O2-. De acuerdo con estudios previos, donde el ácido gálico mostró una potente actividad de atrapamiento de radicales11,12, los resultados descritos indican que el sustituyente 6’-galoil es esencial para mostrar la actividad antioxidante. Así dos estilbenos con un sustituyente galoilo [raponticinas 2’’-O-galoato (10) y 6’’-O-galoato (11)] mostraron una actividad similar pero más potente que la raponticina (1). Entre los estilbenos sin sustituyente galoilo, el compuesto 7, con cuatro grupos hidroxilo, mostró la actividad más potente, y la desoxirraponticina (3) mostró la menor actividad. Por otra parte, como se muestra en la Tabla-1, los derivados de dihidroxiestilbeno (1a, 2a, 6a, 7a and 9a) mantuvieron la actividad de atrapamiento para el radical DPPH, pero sus actividades para el ·O2se redujeron. Como el trans-estilbeno (12) y su dihidroderivado (12a) así como los estilbenos metilados (1b, 2b, 2c, 6b y 9b), no presentan actividad, considerando los resultados para 7, parece claro que las funciones hidroxilo fenólicas de los estilbenos son esenciales para la actividad de atrapamiento de radicales. Paralelamente se examinaron las actividades de inhibición de la xantina oxidasa para clarificar si sus efectos se deben al atrapamiento de ·O2- o la inhibición de xantina oxidasa. Como resultado, los compuestos 1c, 6 y 8 mostraron la inhibición más fuerte de xantina oxidasa. Estos hallazgos indicaron que la inhibición de formazan por 1c, 6 y 8 se debió a sus inhibiciones para la xantina oxidasa. De acuerdo a sus requerimientos estructurales para la inhibición enzimática, los grupos 3-hidroxi y 4’-metoxi son importantes para la actividad.

Actividad antioxidante de estilbenos sobre la peroxidación lipídica para el sistema de la membrana de eritrocito Como aparece en la Tabla-2, la mayoría de los constituyentes estilbénicos (1-11), excepto 3, mostraron inhibición de la peroxidación lipídica de la membrana de eritrocito por hidroperóxido de tert-butilo.1 342

PODER ANTIOXIDANTE DE LOS ESTILBENOS. RELACIONES, ACTIVIDAD, ESTRUCTURA Y MECANISMOS

a: Concentración requerida para la reducción al 50% del radical DPPH 40 mM. b: Valores entre paréntesis representan la reducción o la inhibición en % a 30 mM. c: Valores entre paréntesis representan la reducción o la inhibición en % a 40 mM. d: Valores entre paréntesis representan la reducción o la inhibición en % a 100 mM.

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a: Valores entre paréntesis representan la reducción o la inhibición en % a 100 mM.

En otros trabajos está bien documentado que varios estilbenos, incluido 7 y resveratrol (9), mostraron actividad antioxidante de atrapamiento de radicales DPPH, peroxidación lipídica de LDL inducida por Cu2+ y formación inducida por TPA de radicales libres en células HL-6013-14.

Relación estructura-actividad. De los resultados expuestos en las Tablas 1 y 2 se pueden extraer algunas evidencias sobre la relación estructura-actividad: • Los grupos hidroxilo fenólicos de los estilbenos son esenciales para mostrar la actividad. • El sustituyente galoilo aumenta la actividad. • El sustituyente glucósido en estilbenos reduce la actividad. • Los dihidroxiestilbeno derivados mantienen la actividad para el radical DPPH, pero manifiestan actividad débil para el ·O2-. Además, varios estilbenos con los grupos 3-hidroxilo y 4’-metoxilo inhibieron la xantina oxidasa. 344

PODER ANTIOXIDANTE DE LOS ESTILBENOS. RELACIONES, ACTIVIDAD, ESTRUCTURA Y MECANISMOS

Por lo que respecta a los estilbenos, que son polifenoles, su actividad antioxidante es más potente que la de monofenoles15. En este sentido la presencia de grupos hidroxilo fenólicos es responsable del aumento de la actividad antioxidante. Esto se pone de manifiesto al comprobar el aumento de actividad cuando está presente el sustituyente galoilo, lo que concuerda con la actividad observada para el ácido gálico de manera independiente. También se pone de manifiesto la importancia de la presencia de sustituyentes metoxilo, que aumenta la actividad antioxidante, aunque el efecto sea menor que en el caso de grupos hidroxilo16. En general, los estilbenos y todo el conjunto de los polifenoles, de acuerdo a su estructura particular, pueden actuar como antioxidantes donantes de hidrógeno y también como agentes quelantes de iones metálicos, previniendo la formación, catalizada por metales, de especies radicales iniciadoras. La sustitución dihidroxilo en orto en el anillo es importante para estabilizar el radical libre formado así como para la actividad quelante de metales17. Finalmente, otros factores que influyen o pueden influir en el mecanismo de inhibición de procesos de oxidación por parte de los estilbenos son la energía de de disociación del enlace O-H, los efectos de deslocalización por resonancia del radical fenilo y los impedimentos estéricos derivados de sustituyentes hidrogenados muy voluminosos en los anillos aromáticos15.

Mecanismos de la acción antioxidante de los derivados de trans-estilbeno: resveratrol, pinosilvina y 4-hidroxiestilbeno Usando radiolisis de pulso, se han estudiado en profundidad las reacciones elementales de radicales oxidantes tales como OH , N3 y Tl2+ con tres derivados del trans-estilbeno (4-hidroxi, 3,5-dihidroxi y 3,5,4’-trihidroxiestilbeno)18. En función de las condiciones de reacción (pH, radical oxidante), los radicales hidroxiciclohexadienil y fenoxil obtenidos a partir de los tres polifenoles pudieron ser identificados en los espectros de absorción UV-visible.

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La concentración de los radicales hidroxiciclohexadienil se ve disminuida por la eliminación de agua u OH- formándose radicales fenoxilo de un modo retardado. Para el 3,5-dihidroxiestilbeno se encontró que sus radicales fenoxilos eran mesoméricos con las formas radicalarias ceto sobre carbono, las cuales podrían explicar sus sensibilidad hacia el oxígeno. De la comparación del espectro y las propiedades cinéticas de los derivados del trans-resveratrol (trans-3,5,4’-trihidroxiestilbeno) y sus análogos, se podría concluir que en disolución neutra y en disolución ácida el grupo para-hidroxilo del trans-resveratrol es más reactivo que sus grupos meta-hidroxilo, mientras que la reactividad de los grupos meta-hidroxilo aumenta en disolución alcalina. Este hecho posibilita al trans-resveratrol el atrapamiento efectivo de radicales libres en el rango de pH entre 2 y 12.

Reacciones La radiolisis del agua es un método útil para la generación de especies reactivas, entre las que se encuentra el radical hidroxilo, OH . También se generan otros radicales pero se emplea oxido nitroso para eliminar dichas especies y estudiar la reacción únicamente bajo la presencia del OH•.19 Al ser una especie altamente reactiva, oxidante y electrofílica el radical hidroxilo reacciona con los compuestos aromáticos preferen346

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temente via adición al anillo aromático. En el caso del fenol, el OH se adiciona al anillo aromático formando radicales dihidroxiciclohexadienilo los cuales seguidamente eliminan agua para dar lugar a los radicales fenoxilo mediante la reacción: ArOH + OH•
ArOH(OH)•
ArO• + H2O Como el resveratrol y sus análogos pertenecen a los compuestos polifenólicos se puede asumir que se comportan de manera similar a los fenoles cuando reaccionan con el OH•. El radical azida es un fuerte oxidante y puede ser generado por la oxidación con OH• del ion azida, N3-, en disolución saturada en oxido nitroso, N2O, según la reacción20: OH• + N3-
OH- + N3• En contraste con los radicales hidroxilo que reaccionan siguiendo diferentes caminos, el radical azida reacciona mayoritariamente via transferencia electrónica y, de hecho, la reacción entre N3 y el fenol da lugar al radical fenoxilo. En disolución alcalina (los fenoles están presentes como aniones fenoxido), se forman directamente los radicales fenoxilo: ArO- + N3•
ArO• + N3En disoluciones ligeramente ácidas, sin embargo, los radicales fenoxilo se producen vía un radical catiónico intermedio y “no-visible”, ya que los polifenoles están presentes en su forma neutra. Esta reacción es casi dos ordenes de magnitud más lenta que en el caso de la disolución alcalina: ArOH + N3•
[ArOH+•]
ArO• + H+ + N3-

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La reacción del fenol con el ion Tl2+ es un camino eficiente para identificar al radical fenoxilo21. Los iones Tl2+ son obtenidos por la oxidación de Tl+ con OH• en disolución ácida: Tl+ + OH•
Tl2+ + H2O Una vez obtenidos reaccionan rápidamente oxidando al fenol para producir radicales fenoxilo: ArOH + Tl2+
[ArOH+•]
ArO• + H+ + Tl+

Mecanismos de reacción A) Trans-4-hidroxiestilbeno Como el 4-hidroxiestilbeno posee sólo un grupo hidroxilo determinar su mecanismo es relativamente simple. En disolución neutra la reacción entre el OH• y el fenol genera el radical dihidroxiciclohexadienilo, el cual seguidamente elimina agua dando lugar al radical fenoxilo. La velocidad de la eliminación del agua aumenta en disolución ácida o básica. Como el resveratrol y sus análogos pertenecen a los compuestos polifenólicos se puede asumir que se comportan de manera similar a los fenoles cuando reaccionan con el OH•. Como el ataque del OH• sobre el anillo aromático representa sustitución electrofílica aromática, el OH• atacará preferentemente las posiciones del anillo activadas por el grupo hidroxilo fenólico, que es un grupo electrón-donante. Así el OH• entraría en orto o en para en relación con el grupo hidroxilo fenólico. Como la posición para está ocupada en el 4-hidroxiestilbeno, el ataque se producirá en orto y el radical dihidroxilo debería tener la estructura mostrada en el mecanismo de reacción que se mostrará seguidamente. Considerando los hechos anteriores, y a la vista de los espectros UV-visible de la reacción con OH• y la confirmación con los resultantes para la reacción con Tl2+ se ha propuesto el siguiente mecanismo para la reacción del 4-hidroxiestilbeno y el OH• en disolución neutra o ligeramente ácida:

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En disolución alcalina, donde el 4-hidroxiestilbeno se encuentra como anión fenóxido, se forma también el radical fenoxilo a través de un intermedio dihidroxilado, pero la eliminación del agua es mucho más rápida. Se puede aplicar el mismo mecanismo para la reacción con el N3• en medio fuertemente alcalino. Finalmente se tiene en cuenta la velocidad de desaparición del radical fenoxilo, que se desarrolla según la reacción: 2ArO•
productos no radicalarios, y que es 3 veces menor que en el caso del radical derivado del fenol, lo que indica la mayor estabilidad del radical fenoxilo de los 4-hidroxiestilbenos.

B) Trans-3,5-dihidroxiestilbeno Debido a la presencia de un grupo hidroxilo fenólico adicional, el 3,5dihidroxiestilbeno ofrece más posibilidades para el ataque del OH• que el 4-hidroxiestilbeno, así que pueden ocurrir varias reacciones o seguir varios caminos. Por otro lado la estructura básica del 3,5dihidroxiestilbeno recuerda la estructura del resorcinol (1,3-dihidroxibenceno) y se puede asumir que mostrarán similar comportamiento respecto al OH•. Los espectros denotan la presencia de un radical fenoxilo deslocalizado a través de formas mesoméricas, varias con grupo cetónico. Considerando estos datos y que la reacción se lleva a cabo en medio ligeramente ácido se formula el siguiente mecanismo para la reacción: 349

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Para la determinación de la estructura del radical intermedio trihidroxiciclohexadienilo se ha tenido en cuenta el efecto orto y para dirigente del grupo hidroxilo fenólico. Este mecanismo también puede hacerse extensivo a la reacción con el N3•.

C) Trans-resveratrol Debido a que la estructura del resveratrol (3,5,4’-trihidroxiestilbeno) comprende las estructuras del 4-hidroxiestilbeno y del 3,5-dihidroxiestilbeno, se puede considerar que el resveratrol muestra un comportamiento en reacción similar a sus análogos. En la reacción con el OH• se fue haciendo un seguimiento espectroscópico y comparando los espectros con los de la reacción de 4-hidroxiestilbeno y 3,5-dihidroxiestilbeno. Se observa que en una primera zona el espectro del resveratrol se asemeja al del 4-hidroxiestilbeno mientras que en la otra zona a mayores longitudes de onda, de absorción, se asemeja al de ambos derivados. Para clarificar este resultado se recurrió a la reacción con el Tl2+ comprobando que las especies resultantes coinciden con las obtenidas para el 4-hidroxiestilbeno. Se puede concluir que el OH• reacciona con las posiciones activadas por los grupos hidroxilo en para y meta del resveratrol, aun350

PODER ANTIOXIDANTE DE LOS ESTILBENOS. RELACIONES, ACTIVIDAD, ESTRUCTURA Y MECANISMOS

que la contribución de los productos resultantes del ataque en la posición activada por el grupo hidroxilo en meta es menor que los resultantes del ataque en posiciones activadas por el grupo hidroxilo en para. A valores elevados de pH el comportamiento se invierte y aumenta la reactividad de las posiciones activadas por el grupo hidroxilo en meta.

Para el estudio del mecanismo de reacción a diferentes pH´s se estudió la reacción con el radical azida, N3•, observándose una gran actividad para todo el rango de pH desde 2 hasta 12. De los resultados obtenidos surge el siguiente mecanismo:

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

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PODER ANTIOXIDANTE DE LOS ESTILBENOS. RELACIONES, ACTIVIDAD, ESTRUCTURA Y MECANISMOS

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FITOQUÍMICA de Ophryosporus Heptanthus Alejandro F. Barrero, Pilar Arteaga, M. Mar Herrador, Jesús F. Arteaga y Alfredo Rosas-Romero

FITOQUÍMICA de Ophryosporus Heptanthus Alejandro F. Barrero1, Pilar Arteaga1, M. Mar Herrador1, Jesús F. Arteaga1 y Alfredo Rosas-Romero2 1

Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Campus de Fuentenueva s/n, 18071 Granada, España. 2 Universidad Simón Bolívar, Departamento de Química, Apartado 89000, Caracas 1080A, Venezuela.

Introducción El género Ophryosporus (Fam. Compositae) consta de unas cuarenta especies que se desarrollan en Sudamérica. Algunas de ellas se han estudiado fitoquímicamente rindiendo una gran variedad de compuestos, como son acetofenonas, tremetonas, cromenos, sesquiterpenos, diterpenos, flavanonas y flavonas (Bohlmann et al, 1984; Ferracini et al, 1989; Zdero et al, 1990; Sigstad et al, 1992; Sigstad et al, 1993; Sigstad et al, 1996; Favier et al, 1997; De Lampasona et al, 1997; Favier et al, 1998). Nosotros hemos realizado el estudio fitoquímico de Ophryosporus heptanthus (Wedd.) H. Rob. & King, planta recolectada en las proximidades de Cochabamba (Bolivia). En este estudio hemos identificado tres nuevos diterpenos ent-labdanícos 8, 11 y 14, la tremetona 2 se describe por primera vez como producto natural y los metabolitos conocidos 1, 3-7, 9, 10, 12 y 13. En un trabajo previo (Ferracini et al, 1989) se ha efectuado un estudio fitoquímico de Ophryosporus heptanthus recolectada a 3-5 Km al sur de Tarata (Bolivia), aislándose los diterpenos ent-labdánicos 5, 9, 10 y 13, el cromeno precocene II, 1, y la flavona sakuranetin, 7, del extracto diclorometánico de sus hojas. El trabajo de recolección fue realizado por la Lic. Gloria Saavedra, del Centro de Tecnología Agroindustrial. Facultad de Ciencias y Tecnología, Universidad Mayor de San Simón, Cochabamba, Bolivia.

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Metodos y resultados Las partes aéreas secas y pulverizadas de Ophryosporus heptanthus (1989.6 g) se han extraído a temperatura ambiente durante 5 días con t-butilmetil éter, obteniéndose 165.3 g de extracto. Posteriormente, la planta fue nuevamente extraída a temperatura ambiente durante dos meses con MeOH. Este último extracto fue fraccionado con t-butilmetil éter, EtOAc y n-BuOH, obteniéndose 71.7 g de fracción etérea, 10.5 g de fracción de acetato de etilo y 32.3 g de fracción butanólica. 25 g de extracto etéreo se han cromatografiado en columna de silicagel, eluyendo con mezclas de hexano-t-butilmetil éter-acetato de etilo de polaridad creciente, obteniéndose 16 fracciones. Después de sucesivas cromatografías en columna de silicagel, y usando como eluyentes mezclas de hexano-t-butilmetil éter de polaridad creciente, se han identificado los siguientes compuestos, mediante técnicas de RMN: precocene II, 1 (Ferracini et al, 1989), 5-acetoxi-4,6-dimetoxitremetona, 2, 4,5-bis(3-metil-2-butenil)-4-hidroxiacetofenona, 3 (Bohlmann et al, 1973), 5,6-dimetoxitremetona, 4 (Bohlmann et al, 1979), 15-acetoxi-3β-hidroxi-ent-labda-7,13E-dieno, 5 (Ferracini et al, 1989), 4,5-dimetoxisalicilaldéhido, 6, sakuranetin, 7 (Ferracini et al, 1989), 15-acetoxi-2α-hidroxi-ent-labda-8(17),13E-dieno, 8, 15acetoxi-2β-hidroxi-ent-labda-7,13E-dieno, 9 (Ferracini et al, 1989), 15-acetoxi-2β,3β-dihidroxi-ent-labda-7,13E-dieno, 10 (Ferracini et al, 1989), 2α,15-dihidroxi-ent-labda-7,13E-dieno, 11, 2α,15-dihidroxient-labda-8(17),13E-dieno, 12 (Bohlmann et al, 1984), 2β,15-dihidroxi-ent-labda-7,13E-dieno, 13 (Ferracini et al, 1989) y 15-acetoxi2β,3β,7β-trihidroxi-ent-labda-8(17),13E-dieno, 14. La actividad antioxidante se ha determinado mediante la técnica de decoloración de β-caroteno (Rosas-Romero et al, 1999), usando como patrón BHA y la técnica de DPPH (Brand-Williams et al, 1995), mostrándose los resultados en la tabla 1.

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FITOQUÍMICA DE OPHRYOSPORUS HEPTANTHUS

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Técnica DPPH. bTécnica de decoloración de β-caroteno. cExtracto etereo. dExtracto etanólico-Fracción de acetato de etilo. eExtracto etanólico-Fracción butanólica

a

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FITOQUÍMICA DE OPHRYOSPORUS HEPTANTHUS

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DOMESTICACIÓN Y EXPLOTACIÓN de la Salvia Canariensis Javier G. Luis, Lucía S. Andrés, Joaquín G. Marrero

DOMESTICACIÓN Y EXPLOTACIÓN de la Salvia Canariensis Javier G. Luis, Lucía S. Andrés, Joaquín G. Marrero

Antecedentes En los países en vías de desarrollo el uso de las plantas medicinales representa una alternativa importante, en algunos casos única, a la atención primaria de la salud. Además el cultivo y comercialización de dichas plantas representa una fuente importante de ingresos y disminuye la dependencia de medicamentos importados. Salvia canariensis L. es una planta xerófila, endémica del Archipiélago Canario, que vive frecuentemente en la zona inferior, aunque no es raro que suba hasta los 1000 m y aún más en la isla de Gran Canaria (Ceballos y Ortuño, 1951; Pitard y Pronst, 1909). Esta especie, que se encuentra esporádicamente en colonias más o menos extensas y a veces en grandes masas, está ampliamente distribuida por todo el Archipiélago, a excepción de la isla de Lanzarote. Nuestro objetivo final es tratar de rentabilizar como un recurso económico para Canarias la especie endémica Salvia canariensis vía la domesticación y cultivo de la misma para su explotación industrial en su vertiente doble de aceites esenciales, para la industria de la perfumería y de sustancias de alto valor añadido como antioxidantes, para la industria cosmética , farmacéutica ó alimentaria. Para la obtención de estos principios activos nos proponemos dos rutas. Una es la separación optimizada directamente de la parte aérea de la planta. Y, la otra vía es la obtención de estos principios activos por rutas sencillas de síntesis o semisíntesis. Con lo cual apuntamos a contribuir como ejemplo metodológico para la domesticación y apro365

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

vechamiento comercial de las especies vegetales promisorias de las regiones implicadas en el Proyecto CYTED IV.11, como fuentes de nuevos compuestos antioxidantes.

Adaptación La adaptación a cultivo de la especie silvestre se realizó plantando esquejes en hileras con separación de 1 metro y espaciado entre hileras también de 1 metro. El progreso del cultivo, que requirió poco riego, se siguió durante dos años en los que la planta alcanzó unos dos metros de altura.

Fitoquímica El estudio fitoquímico de la parte aérea de S. canariensis, dio como resultado el aislamiento y caracterización de los diterpenos: galdosol (1) (González et al., 1973), salviol (2) y arucatriol (3) (González et al., 1975).

Posteriormente y del extracto etanólico de las flores de la misma especie, recolectadas en el mes de Agosto, se obtuvieron, además del galdosol (1), los diterpenos rosmanol (4) (González et al., 1985) y canariquinona (5) (González et al., 1989a).

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DOMESTICACIÓN Y ESPLOTACIÓN DE LA SALVIA CANARIENSIS

También de las flores de S. canariensis pero recolectadas esta vez en el mes de Marzo, caracterizamos además de galdosol (1), salviol (2), rosmanol (4) y canariquinona (5), los diterpenos aromáticos: ácido carnósico (6), carnosol (7), metiléster del ácido 7-oxo-carnósico (8), metiléster del ácido 6-oxo-7α-hidroxicarnósico (9), metiléster del ácido 6-oxo-7α-hidroxicarnósico (10), carnosato de rosmanoilo (11), dimetiléter metiléster del ácido 6,7-didehidrocarnósico (12) (González et al., 1987), 7-etoxi-rosmanol (13), 7-metoxi-rosmanol (14), rosmaquinona (15) (González et al., 1989b) y ácido 11-acetoxi-carnósico (16) (González et al., 1989b).

Estos estudios, ponen de manifiesto una marcada diferencia en la composición química de las flores de esta especie, según la época del año en la que se hace la recolección de la planta. Así, el componente mayoritario de las flores recolectadas en el mes de Marzo, resultó ser el ácido carnósico (6), cuya presencia no fue detectada en las flores recolectadas en el mes de Agosto. Este hecho señala al ácido carnósico (6) como el precursor de los otros diterpenos aromáticos con un mayor grado de oxidación en el anillo B.

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Actividad antioxidante Se llevaron a cabo pruebas de actividad antioxidante de dos lactonas diterpénicas de la serie del abietatrieno, carnosol (7) y rosmanol (4) que se aislaron de Salvia canariensis.

La viabilidad celular se determinó espectrofotométricamente por reducción de MTT a azul de formaban. La apoptosis celular se midió por microscopía de fluorescencia contando núcleos celulares que presentaban la fragmentación típica de células apoptóticas. 368

DOMESTICACIÓN Y ESPLOTACIÓN DE LA SALVIA CANARIENSIS

Usando células PC12 (Feocromocitoma de rata) se observó que a bajas concentraciones (30µM) ambos compuestos, (7) con mayor potencia que (4), contrarrestan los efectos citotóxicos de dos inductores de la peroxidación de lípidos de membrana: THB (hidroperóxido de tert-butilo) y CUH (hidroperóxido de cumeno) usados a la concentración de 300µM (Figura 5) . Además, en este modelo neuronal, el tratamiento con ambos compuestos contrarresta de forma dosisdependiente la inducción de apoptosis (muerte celular programada) por la proteína β-amiloide (βAP) (Figuras 6 y 7).

Figura 5 Los antioxidantes (4) y (7) revierten de forma similar los efectos deletéreos del hidroperóxido de cumeno (CUH) sobre la viabilidad celular

CUH 30 µM CUH 100µM (7) (4)

− − − −

+ − − −

− + − −

+ − + −

− + + −

+ − − +

− + − +

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Figura 6 Los compuestos (4) y (7) revierten de forma similar la apoptosis inducida por hidroperóxido de tert-butilo (THB) en células PC12 de rata.

THB 100 µM THB 300 µM (7) (4)

− − − −

+ − − −

− + − −

+ − + −

− + + −

+ − − +

− + − +

Puesto que la acumulación de βAP, que induce la generación de RLO en neuronas, se considera responsable del daño del sistema nervioso central que caracteriza la enfermedad de Alzheimer, estos resultados demuestran un potencial terapéutico importante para estos compuestos. Los compuestos (4) y (7) son capaces de contrarrestar de forma mucho más eficaz que otros antioxidantes naturales y sintéticos la apoptosis inducida por peróxidos lipídicos en células neuronales de rata PC12 (Feocromocitoma de rata). Los dos compuestos contrarrestan el efecto deletéreo de la proteína β-amiloide, que induce estrés oxidativo neuronal y que juega un papel importante en la enferme370

DOMESTICACIÓN Y ESPLOTACIÓN DE LA SALVIA CANARIENSIS

Figura 7.- El compuesto (7) (30 µM) previene de forma más efectiva que otros antioxidantes naturales (Vitamina E) y sintéticos (PDTC, SHA y N-acetilcisteina) la apoptosis inducida por la proteína β-amiloide.

β-AP 10 µM (7) 25 µM Vitamina E 100 µM PDTC 100 µM SHA 200 µM N-acetilcisteina 200µM

− − − − − −

+ − − − − −

+ + − − − −

+ − + − − −

+ − − + − −

+ − − − + −

+ − − − − +

dad de Alzheimer, con lo que ambos presentan un potencial terapéutico interesante. Los diterpenos aislados por nuestro grupo de trabajo, de varias especies de Salvia, fueron sometidos a estudios de actividad antimicrobiana frente a bacterias Gram (+) y Gram (-) y frente a levaduras; actividad citotóxica frente a dos líneas celulares (HeLa y Hep-2); actividad antivírica y actividad antioxidante. Por otro lado el rosmanol (4) y el carnosol (7) mostraron ser potentes antioxidantes (Mederos et al., 1997) en estudios de cultivo in 371

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

vitro de algunas especies de interés económico, impidiendo la excreción al medio de cultivo de polifenoles que eran un problema para el crecimiento de los brotes (González A G et al.,1989; Moujir L et al, 1993 y Moujir L et al.,1996).

Metodología de la extracción Búsqueda de un método rápido y eficaz para el aislamiento, a partir de extractos de S. canariensis L., de carnosol y otros diterpenos con alta capacidad antioxidante. De esta manera pusimos a punto una metodología sencilla y económica para la obtención de estos productos a partir de un extracto acetónico a temperatura ambiente de la parte aérea (ramas, hojas y flores) de S. canariensis L. cultivada. Por otro lado provocamos la transformación completa del ácido carnósico (6) en carnosol (7) directamente en el extracto acetónico de la planta, de acuerdo con el Esquema 6. De esta manera logramos establecer una técnica eficaz para aumentar el contenido de carnosol (7) en el extracto antes de ser sometido al proceso de obtención.

Esquema 6

Camino síntetico y de semisíntesis Desde el punto de vista sintético, el ácido carnósico (6) y el carnosol (7) nos parecían los sintones más apropiados para llevar a cabo una aproximación a la síntesis parcial de los diferentes diterpenos abietatriénicos aislados del género Salvia y que junto con 6 y 7, constituyen la fracción con potente capacidad antioxidante de S. canariensis El rosmanol (4) lo obtuvimos con buen rendimiento a partir del compuesto (26) tal y como se muestra en el Esquema 7 372

DOMESTICACIÓN Y ESPLOTACIÓN DE LA SALVIA CANARIENSIS

373

NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Esquema 7

Para la rosmaquinona porponemos el sguiente camino:

Esquema 8

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DOMESTICACIÓN Y ESPLOTACIÓN DE LA SALVIA CANARIENSIS

Para el 16-hidroxirosmanol:

Esquema 9

Los derivados metoxilado y etoxilado en el carbono C-7 del rosmanol (4). Así proponemos le Esquema 10, ara la síntesis del 7-metoxirosmanol (14) y del 7-etoxirosmanol (139) (González AG et al., 1989).

Esquema 10

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

El epirosmanol lo sintetizamos siguiendo el Esquema 11.

Esquema 11

Al emplear el Esquema 12, obtuvimos un compuesto nuevo en la literatura, al que hemos denominado 12,16-epoxicarnosol (30).

Esquema 12

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DOMESTICACIÓN Y ESPLOTACIÓN DE LA SALVIA CANARIENSIS

La formación del rosmanol (4), galdosol (1), isorosmanol (21) e isogaldosol (22), la justificamos mediante el Esquema 13, el cual se basa en la participación del oxígeno en su estado singlete en los procesos biosintéticos hacia la formación de diterpenos abietatriénicos altamente oxidados en los anillos B y C, tal como lo hemos publicado anteriormente (Luis JG et al.., 1994) llevando a la conclusión de la participación de un intermedio perepóxido.

Esquema 13

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NUEVAS FUENTES DE ANTIOXIDANTES NATURALES

Por su parte el rosmanol (4) y el isorosmanol (21) lo podemos obtener a partir del carnosol (7) según el Esquema 14.

Esquema 14

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DOMESTICACIÓN Y ESPLOTACIÓN DE LA SALVIA CANARIENSIS

Agradecimientos El trabajo de investigación se ha desarrollado en el contexto del Proyecto IV.11 del CYTED (Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo), cofinanciado por el FEDER y fondos del Plan Nacional de I+D. La investigación se ejecuta conjuntamente entre nuestro grupo del IUBO “Antonio González” de La Universidad de La Laguna (donde se realizan los aspectos analíticos, de separación, reactividad química y síntesis) y el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Medicina de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria.

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DOMESTICACIÓN Y EXPLOTACIÓN DE PLANTAS AROMÁTICAS Y MEDICINALES COMO FUENTE POTENCIAL DE ANTIOXIDANTES Jesús Burillo, Irene Parejo, Francesc Viladomat, Jaume Bastida, Alfredo Rosas Romero, Carles Codina

DOMESTICACIÓN DE PLANTAS AROMÁTICAS Y MEDICINALES COMO FUENTE POTENCIAL DE ANTIOXIDANTES Jesús Burilloa, Irene Parejob, Francesc Viladomatb, Jaume Bastidab, Alfredo Rosas-Romeroc, Carles Codinab a

Servicio de Investigación Agroalimentaria, (DGA), Unidad de Recursos Forestales, Área de Aromáticas y Medicinales, Apdo. de Correos 727, 50080 Zaragoza, España b Departamento de Productos Naturales, Biología Vegetal y Edafología, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Avda. Joan XXIII s/n, 08028 Barcelona, España c Departamento de Química, Universidad Simón Bolívar, Apartado 89000, Caracas 1080A, Venezuela

Introducción Son muchas las plantas medicinales que se han estudiado intensamente en los últimos años en búsqueda de antioxidantes naturales (Lugasi et al., 1998; Velioglu et al., 1998; Kähkönen et al., 1999; Mensor et al., 2001; Singh et al., 2002). Las especias y plantas aromáticas, ampliamente distribuídas por la región mediterránea, tienen un gran interés comercial debido a sus aceites esenciales (Lis-Balchin & Hart, 1999; Burits et al., 2001). Algunas de ellas, por ejemplo, la soja, romero, timo, orégano y otras especies de Labiadas, ya se han estudiado en relación a su actividad antioxidante (Haraguchi et al., 1996; Lagouri & Boskou, 1996; Hidalgo et al., 1998; Wang et al., 1999; Marinova & Yanishlieva, 1997). Por otra parte, en los últimos años la búsqueda de antioxidantes naturales se está extendiendo también a los residuos agrícolas como una fuente alternativa a los antioxidantes sintéticos utilizados en las industrias alimentaria y farmacéutica. Algunos de dichos residuos incluyen los restos de la industria olivarera (Capasso et al., 1999; Visioli et al., 1999; Lesagemeessen et al., 2001) y vitícola (Torres & Bobet, 2001), y las pieles de patata (Desotillo et al., 1998). Sin embargo, no existen antecedentes del estudio de la actividad antioxidante en residuos procedentes de plantes utilizadas en la extracción de aceites esenciales. En la actualidad el cultivo de plantas aromáticas y medicinales en España se presenta con posibilidades de rentabilidad para zonas donde 383

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los cultivos tradicionales pueden considerarse poco rentables. En Aragón dichas posibilidades se ponen de manifiesto en distintas comarcas en las que existe una abundante flora espontánea en plantas aromáticas y medicinales, siendo necesario mejorar genéticamente dicha flora con especies o variedades seleccionadas, adaptarla a cultivo, y utilizar las técnicas culturales más adecuadas para poder contribuir en la mejora global de la rentabilidad agraria, en la fijación social, y en la conservación del medio natural. Los cultivos experimentales de plantas aromáticas y medicinales que se vienen desarrollando desde el Servicio de Investigación Agroalimentaria (Burillo y García-Vallejo, 2003), determinan la importancia que puede suponer la utilización de materias primas transformadas de estas plantas para la industria en general (Guillén et al., 1996), contando además con el valor añadido que se obtendría si del material de desecho (material destilado en este caso) se consiguiera una fuente potencial de antioxidantes de origen natural. Una vez realizados una serie de estudios previos sobre la flora autóctona de plantas aromáticas y medicinales en Aragón, se inició el cultivo experimental en diferentes comarcas, y se estudiaron las plantas teniendo en cuenta los siguientes objetivos: a) conocer la capacidad de adaptación agronómica de seis especies o ecotipos seleccionados, con vistas a la planificación de un cultivo moderno y rentable, b) desarrollar las técnicas de cultivo más adecuadas en mecanización, marcos de plantación y recolección, c) conocer la potencialidad productiva en rendimiento y calidad de la materia prima obtenida (materia seca y aceite esencial), d) efectuar un estudio económico del cultivo en base a los parámetros de mercado, y e) evaluar la capacidad antioxidante del material objeto de estudio en sus dos formas: material destilado y material sin destilar.

Material y Métodos Plantas objeto de estudio El material vegetal utilizado en el presente estudio estuvo constituido por las especies vegetales que se indican en las páginas 384

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siguientes, las cuales se cultivaron bajo condiciones agronómicas controladas.

Localización geográfica de las parcelas experimentales Los ensayos experimentales se desarrollaron en dos localidades, Cetina y Alacón, ubicadas, respectivamente, en las comarcas de CALATAYUD (provincia de Zaragoza) y del BAJO ARAGÓN (provincia de Teruel), ambas representativas de este tipo de cultivos. La experimentación se llevó a cabo en colaboración con agricultores de las zonas seleccionadas.

Figura 1 Mapa de la localización geográfica de las localidades de Cetina (Calatayud, Zaragoza) y Alacón (Bajo Aragón, Teruel) en la Comunidad Autónoma de Aragón

Comarca de Calatayud (Zaragoza) La Comarca de Calatayud se encuentra situada en el curso alto del río Jalón, entre la provincia de Guadalajara y las comarcas de Cariñena y Daroca, limitando al oeste con la provincia de Soria.

Características de la parcela de Cetina (Zaragoza) • • • • •

Parcela de riego por inundación Altitud de la zona 650 m sobre el nivel del mar Precipitación media anual 434 mm Temperatura media anual 13.7 ºC Tipo de suelo de textura franco-arcillo-limosa 385

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Especies cultivadas • • • •

Estragon Artemisia dracunculus L. Hinojo amargo Foeniculum vulgare Mill. Meliloto Melilotus officinalis Lam. Milenrama Achillea millefolium L.

Comarca del Bajo Aragón (Teruel) La Comarca del Bajo Aragón se localiza en torno a la Sierra de Arcos, en pleno corazón de la provincia turolense.

Características de la parcela de Alacón (Teruel) • • • • •

Parcela de secano Altitud de la zona 702 m sobre el nivel del mar Precipitación media anual 400 mm Temperatura media anual 15 ºC Tipo de suelo de textura franco-arcillosa

Especies cultivadas • Espliego Lavandula latifolia (L. Fil.) Medikus • Lavandín Super Híbrido de Lavandula angustifolia x L. latifolia

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Espliego Familia botánica Lamiaceae

Nombre científico Lavandula latifolia (L. Fil) Medikus

Descripción de la planta El Espliego es una planta perenne, de base leñosa, con una raíz pivotante fuerte, formando una mata de la que surgen numerosas ramas sencillas y erguidas, pudiendo alcanzar más de 50 centímetros de altura. Las hojas de color verde intenso son lanceoladas. Las flores, de color azul violáceo, están agrupadas en glomérulos, dispuestos en pisos que forman espigas terminales. Las brácteas florales son estrechas, verdes y con un solo nervio dorsal. El cáliz es tubuloso. La corola, de 8 a 10 mm de longitud, es tubular. El fruto es un tetraquenio, con cuatro semillas oscuras y brillantes (Muñoz, 1987).

Importancia del cultivo La plantación del cultivo se debe realizar con material vegetal seleccionado procedente de vivero-semillero (planta en cepellón o a raíz desnuda). El Espliego se adapta bien para poder mecanizar tanto las labores de mantenimiento como su recolección en suelos calizos de secano. Inicia la producción al segundo año de su puesta en cultivo, pudiendo tener un ciclo productivo de más de seis años. La floración se desarrolla en el mes de agosto. El mercado lo que demanda mayoritariamente es el aceite esencial obtenido por destilación.

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Estragón Familia botánica Asteraceae

Nombre científico Artemisia dracunculus L.

Descripción de la planta Es una planta perenne leñosa, de tallos erguidos, ramificados, que pueden llegar a medir más de 1 metro de altura. Las hojas son enteras, lineares o lanceadas, ligeramente dentadas de color verde. Las flores son amarillentas y se hallan agrupadas en capítulos, dispuestos en panojas terminales. Las hojas secas tienen sabor picante, algo amargo (Muñoz, 1987).

Importancia del cultivo Su cultivo se debe efectuar en zonas con pluviometría por encima de los 600 mm anuales; de lo contrario será necesario efectuar riegos puntuales al cultivo durante primavera-verano. La plantación se realiza por división vegetativa con pies sanos obtenidos de plantas madre seleccionadas. Tiene una gran plasticidad, tanto en tipos de suelo como en su adaptación a distintas altitudes, y al tratarse de una planta de porte erguido se puede mecanizar fácilmente. La floración tiene lugar en el mes de julio, y entra en producción el primer año de cultivo, pudiendo tener un ciclo productivo de 6-7 años. El mercado demanda materia seca (hoja/flor).

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Hinojo amargo Familia botánica Apiaceae

Nombre científico Foeniculum vulgare Mill

Descripción de la planta Planta perenne, herbácea, de altura variable entre 0.8 y 2 m, lampiña, de color glauco y cepa densa; dispone de tallos robustos, lisos, estriados, con hojas envainadoras. Las flores amarillas están agrupadas en umbelas, de 12 a 30 radios, muy largos y casi iguales. Los frutos son diaquenios, de perímetro circular en su corte transversal, de color gris oscuro. Toda la parte aérea de la planta tiene un olor anisado y un sabor picante y amargo (Muñoz, 1987).

Importancia del cultivo Es una especie que en la actualidad está poco seleccionada, y todavía se recolecta a nivel espontáneo en distintas zonas españolas. Dado que es una planta que su demanda por parte del mercado va en aumento, es necesario planificar su cultivo mecanizado, contando con material vegetal seleccionado. Aunque su cultivo puede darse en secanos frescos, en zonas con pluviometría menor de 400 mm anuales, es conveniente dar riegos puntuales en verano. Al tener floración escalonada es necesario ajustar la recolección cuando tiene el mayor porcentaje de frutos maduros que suele ser en el mes de septiembre. Se demanda por parte del mercado frutos/semilla y aceite esencial.

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Lavandín Super Familia botánica Lamiaceae

Nombre científico Híbrido de Lavandula angustifolia x Lavandula latifolia

Descripción de la planta Forma una mata leñosa, perenne, que todos los años emite brotes o tallos con flores en espiga. Las brotaciones son ramificadas. Las flores son de color azul grisáceo, más parecidas a la Lavanda. El Lavandín Super es una planta híbrida obtenida en laboratorio en Francia. En el Pirineo se puede encontrar en estado natural en las zonas donde conviven el Espliego y la Lavanda.

Importancia del cultivo Al ser una planta híbrida que no produce semilla, su multiplicación se realiza por estaquilla. Para su puesta en cultivo es necesario contar con estaquillas enraizadas procedentes de plantas madre seleccionadas. Es una planta a la que se le han adaptado una serie de máquinas desde su configuración como cultivo. Se puede cultivar en terrenos calizos de secanos frescos. Inicia la producción al segundo año de su plantación, y su ciclo productivo puede durar más de diez años. El mercado de perfumería y cosmética demanda principalmente de esta planta su aceite esencial.

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Meliloto Familia botánica Fabaceae

Nombre científico Melilotus officinalis Lam.

Descripción de la planta Es una planta herbácea, anual o bianual, lampiña, con hojas compuestas, trifoliadas, que recuerdan a la de la alfalfa, ligeramente dentadas, con estípulas lanceoladas. Las flores son pequeñas, amarillas, olorosas y agrupadas en racimos delgados, que arrancan de la axila de las hojas superiores y son más largos que ellas. El fruto es una legumbre pequeña, de unos 3 mm, ovoidea, de color verde-amarillenta, con arrugas transversales, que contiene una o dos semillas redondeadas. Florece en verano. La planta tiene un sabor ligeramente amargo y al secarse desprende un intenso olor a cumarina (Muñoz, 1987).

Importancia del cultivo Dado el poder germinativo de la semilla, que puede llegar al 85% en condiciones óptimas, y teniendo en cuenta que su cultivo puede considerarse anual, lo interesante es efectuar siembra directa con máquina de precisión, manteniendo un marco de plantación que permita realizar labores de bina al cultivo, y poder calcular el número de plantas por ha. Se adapta bien a distintos tipos de suelo y altitudes, aunque requiere terrenos de secano fresco, o en zonas áridas riegos de apoyo en primavera-verano. La demanda por parte del mercado de esta planta es de materia seca hoja y flor.

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Milenrama Familia botánica Asteraceae

Nombre científico Achillea millefolium L.

Descripción de la planta Planta herbácea, perenne, con tallo subterráneo, o rizoma. El tallo aéreo es simple, erecto, algo velloso y de 50 a 80 cm de altura. Las hojas son dentadas, doblemente divididas en foliolos lineales, que a su vez se dividen en otro plano, dando al follaje un aspecto rizado. La inflorescencia es un corimbo de cabezuelas, formada por flores de color blanco o rosado. Los frutos son aquenios. La planta desprende un olor canforáceo (Muñoz, 1987).

Importancia del cultivo La puesta en cultivo de esta planta se puede realizar por semilla, división vegetativa o rizomas. Es conveniente disponer de plántulas obtenidas en vivero-semillero para poder realizar la plantación. Se puede adaptar a distintos tipos de suelo de secanos frescos; si el cultivo se realiza en zonas de menos de 400 mm de pluviometría, será necesario dar riegos puntuales en primavera-verano. Entra en producción el primer año de cultivo. La floración tiene lugar durante el mes de junio, aunque puede seguir dando flores durante todo el verano y principio de otoño. Su ciclo productivo puede llegar a ser de 4 años o más. El mercado demanda materia seca de las sumidades floridas.

Diseño experimental del ensayo agronómico A continuación se describen los ensayos agronómicos realizados en las respectivas parcelas experimentales de Cetina y Alacón.

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Ensayo de Cetina (Zaragoza) • La plantación se realizó en el mes de octubre de 1999 y la densidad de plantación fue de 20.000 plantas/ha. Puntualmente se realizaron riegos de apoyo por inundación, debido a que durante el período de primavera-verano existe una cierta escasez de lluvias en la zona. • El diseño utilizado en la parcela de estudio fue el de bloques al azar con tres repeticiones, y el modelo estadístico aplicado fue el del factorial triple: bloque-especie-año, considerando en todos los casos factores fijos. • El marco de plantación fue de 1m de separación de filas x 0.50 m de planta a planta (0.50 m2/planta).

Ensayo deAlacón (Teruel) • Las muestras estudiadas corresponden al final del ciclo productivo de las especies o ecotipos ensayados en secano. • El diseño utilizado en la parcela de estudio fue el de bloques al azar con tres repeticiones, y el modelo estadístico aplicado fue el del factorial triple: bloque-especie-año, considerando en todos los casos factores fijos. • El marco de plantación fue de 1.50 m x 0.70m (1.05 m2/planta), es decir, una densidad de plantación de 9.600 plantas/ha.

Las variables controladas para cada especie fueron las siguientes: • • • • •

Producción anual de biomasa pesada en campo Estudio fenológico de la planta en el momento de la recolección. Porcentaje de marras (% para cada especie) Producción anual y rendimiento de materia seca Rendimiento y producción de aceite esencial

Recolección y tratamiento del material vegetal Las muestras se recolectaron cuando las plantas se encontraban en el estadio fenológico de floración.

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Una parte del material vegetal recolectado se sometió a un proceso de secado a la sombra, bajo corriente de aire, durante un período de 7 días. El resto del material se destinó a la obtención de aceites esenciales por arrastre de vapor a escala de planta piloto y por hidrodestilación en laboratorio por el método Clavenger acogido a Farmacopea Europea. Todo el proceso se realizó en la Finca Experimental “La Alfranca”, de la Diputación General de Aragón.

Procesamiento de las muestras Siguiendo el procedimiento metodológico diseñado para el desarrollo del proyecto (ver Diseño Experimental), consistente en un proceso de extracción y fraccionamiento secuencial, obtuvimos los siguientes extractos y fracciones: EC1, extracto crudo inicial (metanólico); EC2, extracto crudo desengrasado (resultante del tratamiento del EC1 con hexano); y las fracciones FHX, fracción hexánica; FC3, fracción clorofórmica, y FCA, fracción acetato de etilo, obtenidas por la partición sucesiva del EC1 con dichos solventes. La fracción acuosa residual se codificó como FOH.

Análisis de la capacidad antioxidante En cada muestra se determinó el contenido de fenoles totales (CFT), la capacidad captadora de radicales libres (por el método del DPPH), radicales hidroxilo (por el método de quimioluminiscencia) y del anión superóxido (por el sistema superóxido-azul de nitrotetrazolio hipoxantina/xantina oxidasa), así como la actividad antioxidante (por el método de decoloración del ß-caroteno), según los procedimientos analíticos descritos en la Diseño Experimental. Las actividades antioxidante y captadora de radicales determinadas en cada una de las muestras estudiadas se compararon con las de diferentes productos de referencia, la quercetina (Q), un antioxidante de origen natural, el butilhidroxianisol (BHA), uno de los antioxidantes sintéticos más ampliamente utilizados en la industria alimentaria, y tres extractos comerciales de origen natural con elevada actividad antioxidante: romero (R), té verde (TV) y pepitas de uva (PU). Todos los análisis (extracciones y fraccionamientos) re realizaron por triplicado, y los resultados se sometieron a un análisis multifacto394

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rial de ANOVA para la comparación de los resultados correspondientes al material destilado y sin destilar, a los extractos y fracciones, así como a las seis plantas estudiadas. Las diferencias se consideraron significativas para valores de P