BIORREACTORES

PROCESS MONITORING AND CONTROL

PROCESS MONITORING AND CONTROL

¿Que parámetros controlar? Temperatura pH Presión parcial de O2 Formación de espuma

Temperature Temperature is an important parameter of fermentation, since, a deviation by a couple of degrees can diminish dramatically the growth and biosynthesis g y productivity. y The cultivation temperature is commonly monitored with an accuracy not less than ± 0.5°C. The temperature in laboratory bioreactors is controlled by one of the following ways: •

A heater is located inside the bioreactor vessel, and cooling is ensured by thin-wall pipes located in the upper cover, which are connected with an electromagnetic valve with the cooling water. water

•

Heating and cooling proceed in a thermostat, and this p of a p pump, p, circulates through g thermostatted water,, with the help the bioreactor jacket.

pH • pH control is based on the comparison of the adjusted "set point" and pH real values. • Only sterilisable electrodes ("Mettler-Tolede" electrodes) are used. • The control of pH values is ensured with the help of peristaltic pumps (silicone tubes are commonly used), correspondingly metering out the acid and the alkali. • pH measurements should be accurate (± 0.02 pH units), since the dynamics of pH values' changes provides valuable information on the process kinetics.

pO2 (partial pressure of dissolved oxygen) There are different pO2 control principles: •Varying the mixer mixer's s rotational speed n, n assuming that pO2 ~ n. n •Combining C bi i the th change h off the th mixer's i ' rotation t ti speed d n and d the th amount of the inlet compressed air Q. It is assumed that pO2 ~ n, p pO2 ~ Q. •Feeding up the substrate or its any component. It is assumed that pO2 is proportional to the feeding up intensity. intensity Feeding up is normally realised with controlled peristaltic pumps. This way is sometimes combined with the regulation of th mixer's the i ' rotational t ti l speed d n and d the th oxygen or air i supply l flow fl Q.

Foam The appearance of foam is a very undesirable phenomenon • there is a risk to loose part of the fermentation broth • It is not p possible measurements.

to

perform p

high-quality g q y

analyses y

and

Elimination of foam •Additional metering of an antifoam (overdose can decrease dramatically th mass exchange the h parameters) t )

•Mechanical metering of foam. (Special device installed in the bioreactor's upper cover. If an intensive foaming begins, then the mechanical breaking of foam will not help any more).

An optimal p solution is the combination of both the methods. The application of Variant 1 is more widely used in laboratory bioreactors.

Ej. Producción de alcaloides monoterpenoindólicos con cultivos celulares de Uncaria Tomentosa “uña de gato” en tanque agitado

Biorreactores para el cultivo de raíces Bioreactor de lecho de goteo con malla para inmovilizar a las raíces

Entrada de medio

Salida de aire

Malla de inmovilización Adición de nutrientes

Aire

Reservorio

Aire

Bomba

Biorreactores para el cultivo de raíces Bioreactor de lecho de niebla (nutrient mist reactor)

Bomba peristáltica

Filtro de aire

Bomba de aire

Generador de niebla Intensidad On

Condensador de niebla

Off

Controlador

Cámara de cultivo

Biorreactor de lecho de niebla para cultivode raíces

The nutrient mist bioreactor (NMB) has proven to h have d fi it advantages: definite d t •low shear stress to the cultivated roots • high nutrient transfer rate due to a large mass transfer area • rapid replenishment of nutrients •removal of toxic metabolites

Mist trickling reactor

A nutrient mist reactor is substantially the same as aeroponic growth of plants as proposed by botanists

Growth of hairy roots in the 3 L MTR on the 16th day

The oxygen uptake rate of hairy roots is not very high However, it is important to maintain a sufficient PO2 in the reactor.

Biorreactores para cultivo de otros órganos

Para cultivo de órganos

MTB

Centaurium erythraea shoot culture in mist trickling bioreactor after 21 days.

Modelos para células inmovilizadas

Operación de Biorreactores

1.Batch: Son sistemas cerrados que se caracterizan por cambiar las condiciones fisiológicas y ambientales. No hay entrada ni salida de medio de cultivo.

Operación de Biorreactores

1. Batch alimentado: Estos sistemas operan adicionando medio fresco, fresco pero sin remoción del existente. Son muy útiles cuando se requiere una elevada densidad celular en la etapa de iniciación del proceso que implica un alto consumo de nutrientes, especialmente de fuente hidrocarbonada que suele funcionar como sustrato limitante.

Variante del batch alimentado:

Draw-fill o semicontínuo: Consiste en remover, al final de la operación entre un 80 y un 90 % del cultivo y reemplazarlo p por p medio fresco.

De esta manera puede eliminarse el período lag, satisfacerse sencillamente la necesidad de contar t con inóculos i ó l d gran tamaño de t ñ y a su vez evitar la esterilización del reactor entre dos ciclos.

Operación de Biorreactores 1. Continuo: •

el caudal de entrada de medio fresco es igual al de salida de medio utilizado.

•

Son utilizados tili ados en cultivos c lti os donde la velocidad elocidad de crecimiento celular cel lar es constante por lo que existe un suministro constante de nutrientes o para la remoción permanente de producto sobre todo en sistemas inmovilizados.

•

Este tipo de operación presenta grandes inconvenientes con respecto al mantenimiento de las condiciones de asepsia del proceso, y se dificulta debido a la tendencia a formar agregados de las células vegetales en cultivo, la formación de merengue y el lento crecimiento celular.

•

Para su buena aplicación se requiere del diseño de sistemas que permitan suplementar continuamente el medio de cultivo evitando la remoción de las células y así minimizar lo que se denomina lavado del cultivo.

•

Una variante es la Perfusión que implica la remoción y suministro de medio dejando la biomasa ocluída en una malla.

•

Continuous Culture

Growth Batch Culture

0

5

10

15

20

Time (days)

25

Remoción de producto in situ

• Líquido-líquido: Compuestos inmiscibles en agua, como solventes orgánicos o lípidos (sistemas de dos fases agua-orgánico). Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano.

• Sólido-líquido: La segunda g fase es un material sólido como resinas u otros absorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc.

• Requerimientos: - Autoclavables - No tóxicos - Fácil separación del producto de interés de la segunda g fase - No modificación del medio de cultivo - Permanencia de las células en la fase acuosa

Adaptaciones para la extracción in situ del producto

Diagrama de un tanque de agitación mecánica modificado p para operar p con remoción in situ del producto. 1: tanque; 2: malla de acero inoxidable p para inmovilizar raíces; 3: sensor de oxígeno; 4: malla acero inoxidable; 5: medidor DO; 6: agitador; g 7: lana de vidrio; 8: resina XAD-2; 9: filtro de vidrio; 10: g generador de aire; 11: condensador; 12: marco de la malla

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Adaptaciones para la extracción in situ del producto

Un bioreactor de agitación por líquido con loop externo

Ejemplo integrado

Ejemplo integrado

Producción de shikonina por suspensiones celulares de Lithospermum erythrorhizon

Shikonina Yamasaki Plant Photo Gallery

• Planta entera - La extracción se realiza en plantas de aproximadamente 3 años.

• Suspensiones celulares - 2,4-D estimula el crecimiento pero no la producción. - Las bajas concentraciones de nitrógeno y la elicitación inducen la producción de shikonina shikonina. - Se utilizan fermentadores de agitación mecánica y tambor rotatorio. - La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.

Proceso para la producción de shikonina a partir de células de Lithospermum p erythrorhizon y por Mitsui Petrochemical Ind. p

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Secuencia en la optimización de un proceso para la producción d metabolitos de t b lit secundarios

Selección de la planta por su contenido de metabolitos secundarios para iniciar cultivos in vitro it Establecimiento de cultivos in vitro

Estabilización y selección de cultivos in vitro: velocidad de crecimiento, crecimiento niveles de producto, liberación al medio

Optimización de medio de cultivo para producción por diseño factorial: nutrientes, precursores, elicitación, liberación y remoción in situ

Optimización en bioreactores: escalado Sistema de cultivo: batch, continuo, fed fed-batch, batch, perfusión, en dos etapas. Extracción y purificación del producto

Esquema de un proceso completo para la producción de un metabolito secundario por cultivo in vitro de células y órganos vegetales egeta es