Revista Cubana de Ciencia Agrícola ISSN: 0034-7485 [email protected] Instituto de Ciencia Animal Cuba

Prats, Anais; Boucourt, R.; Ducat, L. Uso de la alanina y leucina tritiadas como marcadores en la determinación de la adherencia in vitro de lactobacilos Revista Cubana de Ciencia Agrícola, vol. 39, núm. 2, 2005, pp. 213-217 Instituto de Ciencia Animal La Habana, Cuba

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Uso de la alanina y leucina tritiadas como marcadores en la determinación de la adherencia in vitro de lactobacilos Anais Prats1, R. Boucourt2 y L. Ducat3 1

Centro de Investigaciones Clínicas, calle 34 #4501 esquina 45. Reparto Kohly, C. Habana. Cuba. Correo electrónico: [email protected] 2 Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas, La Habana Cuba. 3 Centro Radioisótopos (CENTIS). Diagnóstico de Cuba Para establecer las condiciones para el marcaje de lactobacilos con aminoácidos tritiados, se realizó un experimento con un diseño factorial (2 x 3) y seis repeticiones por tratamiento. El factor A fue el medio de cultivo (MRS o Semisintético) y el B, el aminoácido marcado (3H-alanina 3H-leucina o la mezcla de ellos). Se encontró interacción entre los factores estudiados para la actividad específica del pellet de lactobacilos sin lisar. Los mejores resultados se obtuvieron en las variantes de medio semisintético, con la mezcla de aminoácidos marcados y con 3H- alanita, pero económicamente fue mejor utilizar un solo aminoácido marcado. No se obtuvieron diferencias en el crecimiento de los lactobacilos sometidos a los diferentes niveles de actividad radiactiva. Se concluye que con la variante del medio semisintético + 3H- alanina se obtuvo un marcaje estable de los lactobacilos, con niveles adecuados de incorporación del isótopo. En estas condiciones de marcaje fue posible realizar la determinación de la actividad sin lisar el microorganismo. No hubo daños en los lactobacilos, debido a los niveles de actividad utilizados. Palabras clave: alanina y leucina tritiada, adherencia, lactobacilos, epitelio intestinal.

Para la selección de cepas con posibilidades de utilizarse como probióticos, uno de los criterios más importantes es la habilidad de adherirse al intestino (Veterlund et al. 2004). Esta garantiza la persistencia, el restablecimiento de la mucosa dañada y el antagonismo contra los patógenos (Jin et al. 2000, Reid y Burton 2002 y Veterlund et al. 2004), a lo que se adiciona la influencia en la inmuno-modulación (Blum et al. 2002). La determinación de la adherencia a las células intestinales in vitro es un índice adecuado como paso previo a las pruebas in vivo (Fuller 1992), pues implica un ahorro considerable de tiempo y recursos. En el desarrollo de este método radiactivo se ha utilizado como isótopo, fundamentalmente, el tritio (3H) (Merkel et al. 1995, Darmstadt et al. 1998 y Schmidt et al. 1998) y el azufre- 35 (35S) (Ibrahim et al. 1995 y Carlén et al. 1998). El tritio, como isótopo radiactivo, posee un largo período de semidesintegración (T½= 12 años) y tiene propiedades nucleares favorables. En-

tre ellas, puede citarse una energía β− pequeña, de 18 KeV, lo que permite trabajar con este isótopo, sin necesidad de blindajes ni medidas de protección adicionales (Efimov et al. 1983). El tritio, como radioisótopo del hidrógeno, es, posiblemente, el más universal de los radionúclidos. Su incorporación a una molécula orgánica no altera las propiedades químicas de ésta, por lo que, como trazador, su presencia física no varía las características del sistema que se estudia. Su baja radiotoxicidad permite trabajar hasta con 100 mCi de actividad en laboratorios convencionales. Los métodos de marcaje radioisotópico de aminoácidos con la utilización de este radionúclido son ampliamente conocidos. Con ellos es posible obtener altos valores de actividad específica, sin grandes complicaciones desde el punto de vista de la protección radiológica (Ducat et al. 1993). El método de los indicadores radiactivos puede ser una vía experimental, rápida y de

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alta sensibilidad, para determinar la adherencia in vitro de probióticos a las células intestinales (Ibrahim et al. 1995 y Gopal et al. 2001). Sin embargo, la validez del ensayo depende, en gran medida, de lograr un marcaje efectivo de los microorganismos con los aminoácidos. Entre los aminoácidos esenciales para los lactobacilos, la leucina y la alanina están entre los de mayores requerimientos para este tipo de microorganismo (Salton 1964). Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue establecer las condiciones para el marcaje de lactobacilos con aminoácidos tritiados, para que puedan utilizarse posteriormente en la determinación de su adherencia in vitro a las células intestinales. Materiales y Métodos Tipo de microorganismo. En el estudio se utilizó la cepa B/103-1-5 (Lactobacillus acidophillus), procedente de la Universidad OLZTYM, Polonia. Esta se incubó a 37 °C, temperatura óptima para su crecimiento. Se utilizó como inóculo un cultivo con un contenido de lactobacilos de 108 ufc/mL. El volumen del inóculo correspondió a la décima parte del volumen total del medio de cultivo. Marcaje de lactobacilos con la utilización de aminoácidos tritiados. Según el medio de De Man, Rogosa y Shalpe (MRS), recogido en el catálogo de medios de cultivo de Merk (2004), el medio semisintético, informado por Prats y Boucourt (2001), así como los aminoácidos tritiados 3H- Alanina (actividad específica de 4662 MBq/mmol, 98 % de pureza radioquímica) y 3 H- Leucina (actividad específica de 3330 MBq/mmol, 96 % de pureza radioquímica), se conformaron seis combinaciones de medio de cultivo y aminoácidos tritiados: 1. Medio semisintético + 25 µL 3H- Alanina + 25 µL 3H- Leucina 2. Medio semisintético + 50 µL 3H- Leucina 3. Medio semisintético + 50 µL 3H- Alanina 4. Medio MRS + 25 µL 3H- Alanina + 25 µL 3 H- Leucina 5. Medio MRS + 50 µL 3H- Leucina 6. Medio MRS + 50 µL 3H- Alanina

Se inoculó un mililitro de cada medio y se incubaron durante 18 h a 37 °C. Posteriormente, se centrifugaron a 3700 rpm, en centrifuga Jouan A14, durante 10 min. Se separó el sobrenadante y el precipitado se lavó con solución buffer fosfato (Armas y Solano 1996) y se resuspendió en ella. Se midieron las actividades del sobrenadante, del precipitado resuspendido, así como de éste tratado previamente con 300 µL de ácido clorhídrico al 32 %, sometido a 100 °C, durante 30 min. Se midió la actividad de 5 µL de muestra en 5 mL de líquido de centelleo Scintran (BDH) en base dioxano. Todas las mediciones se realizaron en un contador de centelleo líquido Wallack 1209 Rackbeta, con 90 % de eficiencia para tritio durante 60 seg. Se aplicó un diseño factorial (2 x 3) con seis repeticiones por tratamiento. El factor A es el medio de cultivo empleado y el B, el aminoácido marcado. El análisis estadístico se realizó según el programa SPSS versión 5.02. Técnicas microbiológicas. Se preparó medio MRS, según el Manual MercK (2002). El pH del medio fue de 5.4 ± 0.2. Los reactivos microbiológicos utilizados fueron de la firma BioCen (catalogo 2004-2005) y el resto, de la BDH. El número de bacterias viables se determinó por diluciones seriadas, usando el método de tubos de roll, según Hungate (1950) y el medio MRS más 2 % de agar para el crecimiento de lactobacilos. Se incubó a 37 °C durante 48 h. Al cabo de ese tiempo, se contó el número de colonias formadas. Los resultados se dan como unidades formadoras de colonia por mililitro (ufc/mL). El valor de densidad óptica se midió a 540 nm en un espectrofotómetro ultravioletavisible (Pharmacia Biotech Ultrospec 2000). Se empleó como blanco el medio de cultivo sin inocular. Se prepararon diluciones, de forma que los valores de absorbancia fueran menores que 0.6, para que se cumpliera la ley de Lambert- Beer. El número de bacterias viables se determinó por el método descrito anteriormente.

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El ajuste de la curva se realizó por el programa Excel 97 para Windows. Se obtuvo la siguiente ecuación: y = 3.10-9 x + 0.0925 r2 = 0.9789 (1) Los valores de crecimiento correspondiente se obtuvieron interpolando en esta recta el valor de densidad óptica obtenido. Determinación de la liberación de la actividad al medio en el tiempo. El pellet del lactobacilo suspendido en buffer fosfato se centrifugó a 3700 rpm y se midió la actividad del sobrenadante en el tiempo, con intervalos de media hora durante 4 h. Efecto de las radiaciones en el crecimiento de los lactobacilos. Se determinó el valor de densidad óptica, como criterio del crecimiento de los lactobacilos desarrollados en medio de cultivo, con 0.93, 7.70 y 13.88 MBq de actividad total, producida por los aminoácidos tritiados. Se utilizó como control el crecimiento de los lactobacilos en medio, sin radioactividad. Resultados y Discusión Solamente se encontró interacción entre los factores estudiados para la actividad específica del pellet de lactobacilos sin lisar (tabla1).

aminoácidos, pues con menor actividad total incorporada al medio de cultivo, se obtuvieron valores similares de actividad específica, con respecto a cuando se utilizó mayor actividad total, proveniente sólo de la alanina- 3H. Las diferencias de actividad, encontradas con la alanina- 3H o la leucina- 3H solas, se deben, en primer lugar, por los bajos niveles de actividad alcanzados para esta última durante el marcaje. Pueden explicarse además, por las concentraciones de estos aminoácidos presentes en la pared de estos microorganismos. Según Salton (1964), el contenido de leucina presente en la pared de los lactobacilos es menor que el de alanina y se correspondió con los porcentajes de actividad hallados para cada uno. Las características de las partículas ß- del tritio permiten afirmar que los niveles de actividad encontrados en los microorganismos, sin previa ruptura de su estructura, se corresponden con la parte más externa de estos, pues la pared actúa como blindaje de la actividad contenida en su interior. Esto se cumplió para las variantes 4, 5, y 6, pero con diferencias con respecto a la 1, 2 y 3, lo que se debe a que en el medio MRS hubo mayor dilución del isótopo radiactivo, al ser

Tabla 1. Actividad específica en el pellet de lactobacilo sin lisar Indicador

Medio

Aminoácido marcado 3

Indicador, cpm/ufc x 10- 5

H Leucina + 3 H Alanina

3

H Leucina

EE sig 3

H Alanina

Medio b semisintético 2.09 (81.1)

0.48a (16.1)

2.11b (82.6) *** ± 0.01

4.53d (9.31)

2.67c (1.44)

2.29c (9.89)

MRS abcde

Valores con letras diferentes difieren significativamente con P < 0.05 (Duncan 1955) ( ) Valores de datos entre paréntesis corresponden a las medias originales Se realizó transformación de los datos originales según log n *** P < 0.001

No se obtuvieron diferencias significativas entre la variante 1 y 3, debido a los bajos niveles de actividad alcanzados durante el proceso de marcaje de la leucina- 3H, con respecto a la alanina- 3H. Sin embargo, puede afirmarse que hubo una mayor incorporación del isótopo al microorganismo cuando se emplearon los dos

éste más complejo nutricionalmente, además, los niveles de crecimiento fueron mayores. Utilizar alguna de estas variantes, implicaría trabajar con menores niveles de actividad específica en el resto del ensayo, lo que atenta contra los niveles de detección en los próximos pasos.

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El número de conteos obtenidos, al medir el pellet de lactobacilos intactos, permite que la determinación de la actividad se lleve a cabo sin lisar. La utilización del isótopo, como señalización para determinar la adherencia a las células intestinales, constituyó una gran ventaja para el desarrollo de la técnica, ya que no hubo necesidad de lisar para determinar la actividad en el sistema. Esto representó un considerable ahorro de tiempo, recursos y manipulación e hizo más dinámica la determinación de la adherencia in vitro (Ibrahim et al. 1995). La lisis del pellet de lactobacilos permitió conocer el porcentaje de incorporación del isótopo al microorganismo, la cual estuvo entre 53.83 y 59.44 % para todos los medios. Las condiciones drásticas de lisis están dadas por las características de la pared de los lactobacilos. Para este género, Salton (1964) informó un espesor de la pared de 800 Å, lo que, según este autor, hace poco efectivas las variantes de calor y ultrasonido, para obtener la ruptura adecuada de la pared de estos microorganismos. Los mejores resultados en el marcaje de los lactobacilos se obtuvieron con las variantes 1 y 3. Desde el punto de vista económico, resulta menos costoso utilizar un solo aminoácido tritiado, por lo que, en estas condiciones de actividad de los compuestos tritiados, es mejor utilizar la variante del medio semisintético, con 50 µL de alanina- 3H para el marcaje de los lactobacilos. Resulta de extraordinaria importancia garantizar que la marca radiactiva permanezca en el microorganismo que va a hacer la función de sonda, al menos durante el tiempo que dure el ensayo. Con el fin de determinar si el isótopo está realmente incorporado al microorganismo y no está adherido a él, de modo que pueda liberarse al medio y afectar la determinación, se midió durante 4 h el nivel de actividad que se liberaba al buffer fosfato. Esto se correspondió con el tiempo máximo que demoraría en llevarse a cabo el último paso del ensayo de adherencia, teniendo en cuenta el proceso de obtención y traslado de las células intestinales de cerdo.

Las variaciones de la actividad en los diferentes tiempos fueron menos de 2 %, por lo que se puede concluir que no hubo una pérdida considerable de actividad en el pellet de lactobacilos, durante el tiempo probado. Estos resultados coinciden con los alcanzados por Conway et al. (1987) en bacterias ácido lácticas, marcadas con aminoácidos tritiados. Existen informes de utilización de lactobacilos muertos como probióticos, sin que la falta de metabolismo activo afecte la adherencia de estos microorganismos a las células del hospedero (Rosenstein 1995). Havenaar et al. (1992) observaron que cepas muertas de lactobacilos acidophillus, en las que no se afectó la capa de polisacáridos acídicos por la acción que ocasionó la muerte, pudieron adherirse a las células intestinales, de forma tan efectiva como los lactobacilos viables. No obstante, como la adherencia in vitro debe simular lo más posible las condiciones in vivo y, en estas últimas, los microorganismos no estarán sometidos a la acción de las radiaciones producidas por los compuestos marcados, se estudió la supervivencia de estos lactobacilos frente a los niveles de actividad probados en estos experimentos. No se observaron diferencias en el crecimiento de los lactobacilos sometidos a los diferentes niveles de actividad. Este resultado corrobora lo que plantea la literatura acerca de este género, que los muestra como microorganismos muy resistentes a las radiaciones. Jay (1994) informó que con 2690 MBq empiezan a morir algunos lactobacilos a las 24 h. Estos niveles de actividad no se alcanzaron en estos experimentos. Los resultados obtenidos demuestran que con la variante semisintética + alanina tritiada se obtuvo un marcaje estable de los lactobacilos, con niveles adecuados de incorporación del isótopo, lo que permite su utilización posterior en el ensayo de adherencia in vitro, sin ruptura previa del microorganismo, en un período de 4 h. No hubo daños significativos en los lactobacilos, producto de los niveles de actividad utilizados.

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Referencias Armas, R. & Solano, R. 1996. Transferencia de embriones y fertilización in vitro. Manual práctico. Ministerio de Ciencia, Tecnología y Medio Ambiente–Ministerio de la Agricultura. La Habana, Cuba. p. 109 BioCen 2004. Catálogo de medios de cultivo 20042005. Ed. Centro Nacional de Biopreparados. C. Habana, Cuba Blum, S., Haller, D., Pfeifer, A. & Schiffrin, E.J. 2002. Probiotics and immune response, Clin. Rev. Allergy Immunol. 22:287 Carlén, A., Bratt, P., Sutenudd, C., Olsson J. & Strömberg, N. 1998. Aglutinin and acidic prolinerich protein receptor patterns may modulate bacterial adherence and colonization on tooth surfaces. Scientific note. J. Dent. Res. 77:81 Conway, P.L., Gorbach, S.L. & Goldin, B.R. 1987. Survival of lactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells. J. Dairy Sci. 70:12 Darmsladt, G.L., Fleckman, P., Jonas, M., Chi, E. & Rubens, C.E. 1998. Differentiation of cultured keratinocytes promotes the adherence of Streptococcus pyogenes. J. Cli. Invest. 101:128 Ducat, L. & Vega, L. 1993. Obtención de 1octocosanol marcado con tritio. Nucleus. N 14:25 Duncan, D.B. 1955. Multiple range and multiple F test. Biometrics 11:1 Efimov, A.I., Belorukova, L.P., Vasilkova, I.V. & Chechev, V.P. 1983. Svoystva neorganicheskij soedineniy. Ed. Jimiya, San Petersburgo, Rusia. p. 21 Fuller, R. 1992. History and development of probiotics. En: Probiotics: The scientific basis. Ed. R. Fuller. Ed. Chapman and Hall. London. p. 8 Gopal, P.K., Prasad, J., Smart, J. & Gill, H.S. 2001. In vitro adherence properties of Lactobacillus rhamnosus DR20 and Bifidobacterium lactis DR10 strains and their antagonistic activity against an enterotoxigenic Escherichia coli. Ent. J. Food Microbiol. 67:207 Havenaar, R., Brink, B.T. & Huis, J.H.J. 1992. Selection of strains for probiotic use. En: Probiotics: The scientific basis. Ed. R. Fuller. Ed. Chapman and Hall. London. p. 209

217

Hungate, R.E. 1950. The anaerobic mesophillic cellulolytic bacteria. Bacteriol. Rev. 14:1 Ibrahim, A.S., Filler, S.G., Alcouloumre, M.S., Kozel, T.R., Edwards, J.E., Ghannnoum, M.A. 1995. Adherence to and damage of endothelial cells by Cryptococcus neoformans in vitro: Role of the capsule. Infect. Immunity 63:4368 Jay, J.M. 1994. Microbiología moderna de los alimentos. 3ra Edición. Ed. Acribia S.A. Jin, L.Z., Marquardt, R.R. & Zhao. X. 2000. A strain of Enterococcus faecium (18C23) inhibits adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli K88 to porcine small intestine mucus. .Appl. Environ. Microbiol. 66:4200 Merck 2002. MRS Agar. Catálogo de medios de cultivo. Cat. No1.10660.0500. Ed. Merck, S.A, Alemania Merkel, G.J., Scofield, B.A., Rescorla, R., Yang, F.J. & Grosfeld, J.L. 1995. Reduced recovery of a Cryptococcus neoformans adherence mutant from a rat model of cryptococcosis. Can. J. Microbiol. 41:428 Prats, A. & Boucourt, R. 2001. Ajustes biológicos en un medio de cultivo para determinar una característica probiótica en lactobacilos. Rev. ICIDCA. XXXV:8 Reid, G. & Burton, J. 2002. Use of lactobacillus to prevent infection by pathogenic bacteria. Microbes Infect. 4:319 Rosenstein, E. 1995. Diccionario de especialidades farmaceúticas. DEF. Ed. 41:1037. MEX PLM. MR. Salton, M.R.J. 1964. The bacterial cell wall. Elsevier Publishing Company. Amsterdam Schmidt, H.E., Schlöricke, R., Fislage, H.A., Schulze, I. & Guthoff, R. 1998. Effect of surface modifications of intraocular lenses on the adherence of Staphylococcus epidermis. Zent. Bl. Bakteriol. 287:145 Vesterlund, S., Paltta, J., Karp, M. & Ouwehand, A.C. 2004. Adhesion of bacteria to resected human colonic tissue. Quantitative analysis of bacterial adhesion and viability. Res. Microb. 15:38 Recibido: 22 de septiembre de 2003.

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les a i c n rovi io P s r re Talle Aniversa 40

InstitutodeCienciaAnimal Como parte de las celebraciones en saludo a su 40 aniversario, el Instituto de Ciencia Animal desarrollará, durante los meses de junio a septiembre, un sistema de talleres en todas las provincias del país junto a universidades, centros de investigación y productores de cada región. Estos constituirán el marco propicio para hacer extensivos los principales resultados a investigadores, docentes y productores de todo el territorio nacional, y concluirán con la celebración del 3er Encuentro de Extensión y Transferencia de Tecnologías, del 3 al 5 de noviembre, y eI I Congreso Internacional de Producción Animal que abrirá sus puertas al debate científico del 7 al 11 de ese mes, en el Palacio de las Convenciones de Cuba. Para mayor información, puede dirigirse al Comité Organizador del evento: Presidente Dr. Emilio Castillo Corría. [email protected]

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