Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas ISSN: 1870-0195 [email protected] Asociación Farmacéutica Mexicana, A.C. México

Amaya-Chávez, Araceli; Dolores-Ledezma, Emilia; Álvarez-Sánchez, Patricia; Ferreira-Rubio, Guillermo; Gómez-Oliván, Leobardo Manuel; Galar- Martínez, Marcela Evaluación de un modelo de diabetes tipo 2 para estudiar la actividad hipoglicemieante de la glibenclamida Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, vol. 38, núm. 3, julio-septiembre, 2007, pp. 5-11 Asociación Farmacéutica Mexicana, A.C. Distrito Federal, México

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Trabajo Científico

Evaluación de un modelo de diabetes tipo 2 para estudiar la actividad hipoglicemieante de la glibenclamida Assessment of diabetes type 2 model to study the hypoglycemic activity of glibenclamide Araceli Amaya-Chávez1, Emilia Dolores-Ledezma1, Patricia Álvarez-Sánchez1†, Guillermo Ferreira-Rubio1, Leobardo Manuel Gómez-Oliván1, Marcela Galar- Martínez2. 1 Departamento de Farmacia de la Facultad de Química, Universidad Autónoma del Estado de México 2 Sección de Graduados e Investigación, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN RESUMEN: en este trabajo se evaluó un modelo de diabetes tipo 2, basado en la administración secuencial de nicotinamidaestreptozotocina (225 y 65 mg/kg, respectivamente) a ratas Wistar macho y posteriormente tratadas con glibenclamida, aguda y subagudamente. Se emplearon diseños paralelos; el primero para establecer la dosis de nicotinamida que protege contra la destrucción total de células β producida por la estreptozotocina y el segundo para determinar la dosis de glibenclamida que produce el efecto hipoglucemiante en el modelo. Para su evaluación se midieron niveles de glucosa sanguínea y se examinaron cortes histológicos del páncreas. Los resultados mostraron que este modelo es adecuado para el estudio agudo, pero es necesario evaluar otras dosis de nicotinamida que protejan eficientemente a las células β del páncreas de la destrucción total provocada por la estreptozotocina y que sea útil para los estudios subagudos o crónicos, a fin de poder utilizarlo para la evaluación de la eficiencia de fármacos hipoglucemiantes. ABSTRACT: a type 2 diabetes model, consisting in the sequential administration of nicotinamide-streptozotocin (225 y 65 mg/kg respectively) to male Wistar rats, was evaluated and subsequently treated with glibenclamide, by acute and subacute tests. Parallel designs were used; the first one to establish the nicotinamide dose which protects against the total destruction of β cells, produced by the streptozotocin and the second one to determine the glibenclamide dose that produces the hypoglycemic effect in the model. The evaluation was done by blood glucose measures and pancreas histological studies. The results showed that this model is adequate for the acute study, but it is necessary to test other nicotinamide doses which may efficiently protect pancreatic β cells from the total destruction produced by the streptozotocin, and that may be useful for subacute or chronic studies, in order to employ it for the efficiency evaluation of other hypoglycemiant drugs. Palabras clave: modelo de diabetes tipo 2, nicotinamida, estreptozotocina, glibenclamida, administración subaguda, histopatología

Key words: type 2 diabetes model, nicotinamide, streptozotocin, glibenclamide, subacute administration, histopathology

Correspondencia: Dra. Araceli Amaya Chávez Universidad Autónoma del Estado de México. Facultad de Química Departamento de Farmacia Paseo Tollocan esq. con Paseo Colón Col. Universidad. CP 50120. Toluca, Estado de México Teléfono 01(722)2175901 Ext. 115 Fax: 01(722) 2173890 e-mail: [email protected]

Introducción

Fecha de recepción: 05 de abril de 2006 Fecha de aceptación: 29 de marzo de 2007

La diabetes es una alteración del metabolismo de los carbohidratos, lípidos y proteínas, caracterizada por niveles elevados de glucosa debido a fallas o defectos en la acción de la insulina, secretada por las células β del páncreas. Esta hormona es necesaria para que las células del organismo puedan utilizar la glucosa como combustible y transformarla en energía. La enfermedad se clasifica en tipos 1 y 2.1-2 En la diabetes tipo 2 el trastorno central es la resistencia de todos los tejidos periféricos a la acción de la insulina, debido a

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Volumen 38 • Número 3 • Julio - Septiembre 2007 defectos en su síntesis por modificaciones del receptor, alteraciones en los mecanismos intracelulares de acción de esta hormona o porque se produce en bajas concentraciones. El resultado es que se genera un exceso de glucosa en la sangre, lo que ocasiona daños a vasos sanguíneos y a ciertos órganos.3-5 Aproximadamente del 85 al 90% de los enfermos diabéticos presentan diabetes tipo 2, siendo por lo general, pacientes mayores de 40 años u obesos, en quienes se desarrolla paulatinamente la enfermedad. Su expresión clínica puede pasar desapercibida por muchos años.4 Los modelos experimentales de diabetes son útiles para conocer aspectos fundamentales de la enfermedad. El más importante históricamente fue la pancreatectomía, que develó la importancia de los islotes de Langerhans para la regulación de la glicemia. Estos modelos permiten simular algunos fenómenos que se observan en la clínica y contribuyen al conocimiento de los factores fisiológicos, bioquímicos y ambientales que predisponen a la enfermedad. 6-10 Otro modelo empleado para inducir la diabetes experimental tipo 2 es la destrucción química de los islotes con aloxana o estreptozotocina. 6-7, 11-12 La estreptozotocina (SZT) produce insulinismo pancreático por la destrucción progresiva de las células β en la rata. En la actualidad, se han propuesto diferentes mecanismos de acción, tales como: 6-7, 11-14 1. Metilación del DNA, dado que la SZT opera como donador de óxido nítrico en los islotes pancreáticos, induciendo la muerte de las células β. 2. Destrucción autoinmune de células β. 3. Inhibición de la enzima N-acetil-beta-D-glucosaminidasa que cataliza la ruptura de N-acetilglucosamina unida a una proteína de 135 kD enlazada por un oxígeno (O-glicosilación). Comparadas con otras células, las β producen más cantidad de esta enzima por lo que pueden ser particularmente sensibles al efecto del compuesto. Estudios realizados en ratas macho Wistar de 6 a 12 semanas de edad han mostrado que dosis únicas de 65 mg/kg de peso de SZT, inducen diabetes en un periodo de 2 a 4 semanas postadministración intravenosa o intraperitoneal, con una duración de 8 a 10 semanas.6-7, 15-16 Algunos datos previos empleando el modelo de SZT se resumen en tres trabajos de investigación realizados en el Departamento de Farmacia de la Facultad de Química de la Universidad Autónoma del Estado de México: Ramírez (2001) encontró que la SZT induce diabetes en el 8.3 % de los animales tratados por administración intraperitoneal de 65 mg/kg.17

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Albiter (2001) obtuvo un 100 % de ratas Wistar diabéticas cuando administró 65 mg/kg de SZT por vía intravenosa.18 Caracheo y Gutiérrez (2001) demostraron que los animales con diabetes inducida por SZT vía intravenosa no presentaron efecto hipoglucemiante después de la administración de sulfonilureas.19 Por otro lado, Masiello y col. (1998) indican que este modelo no presentó resultados satisfactorios en la medición de la actividad de las sulfonilureas, por lo que emplearon nicotinamida (NIC) para proteger parcialmente a las células β del efecto citotóxico de la SZT y lograron el desarrollo de un síndrome similar al de la diabetes tipo 2 en los organismos probados. 6,19 La glibenclamida (GLI), una sulfonilurea, tiene un efecto hipoglucemiante agudo ya que actúa sobre las células β del páncreas estimulando la secreción de insulina. Asimismo, presenta actividad hipoglucemiante crónica debido a la potenciación de la acción de esta hormona, a través de un aumento en el número de sus receptores. 20-23 El objetivo de este trabajo, fue evaluar la eficiencia del modelo de diabetes tipo 2 inducido por SZT y NIC a fin de ser empleado en estudios subagudos, utilizando GLI como fármaco de prueba.

Material y métodos Este trabajo está dividido en dos fases experimentales. En la primera se seleccionaron las dosis de NIC y SZT adecuadas para inducir diabetes tipo 2 en los animales de prueba, caracterizada por hiperglucemia moderada. En la segunda se retó con GLI al modelo establecido para evaluar su eficacia. Diseño del modelo experimental para la inducción de diabetes tipo 2 Se emplearon 18 ratas Wistar macho con peso de 173 a 191 g, alimentadas ad libitum, distribuidas en seis lotes de tres ratas cada uno de acuerdo a la asignación de tratamientos mostrada en la tabla 1. Posteriormente, se seleccionó la dosis de NIC que protegía a las ratas de la hiperglicemia severa producida por la SZT, llegando a un estado moderado, es decir, cuando el nivel de glucosa sanguínea fue significativamente menor al del grupo de hiperglucemia severa, y mayor a la del testigo. El ensayo se repitió incrementando el número de ratas a seis. Dos semanas después de la administración de los tratamientos se determinaron los niveles de glucosa sanguínea y se realizó el estudio histopatológico del páncreas.

Tabla 1. Asignación de tratamientos en el diseño del modelo experimental de inducción de diabetes tipo 2

Lote

Solución salina 0.9 % i.p. (mL/kg)*

Buffer de citratos 0.01 M, pH 4.5 i.v.**

T

1

0.5 mL

T SZT

1

T NIC Tx 1 NIC-SZT Tx 2 NIC-SZT Tx 3 NIC-SZT T = Testigo Tx = Tratamiento i.p. = Administración intraperitoneal

NIC en solución salina 0.9 % i.p. (mg/kg)*

SZT en buffer de citratos 0.01 M, pH 4.5 i.v. (mg/kg)** 65

0.5 mL

350 100 225 350

65 65 65

i.v. = Administración intravenosa * = Primera administración ** = Segunda administración, 15 minutos después

Determinación de los niveles de glucosa en rata Se utilizó el método de la glucosa oxidasa (kit de Randox), que se fundamenta en la oxidación enzimática de la glucosa catalizada por la glucosa oxidasa. Durante esta reacción, mediada por peroxidasa, se produce peróxido de hidrógeno que reacciona con el fenol y la 4–aminofenazona, originando una quinoneimina. El complejo rojo-violeta formado se leyó en un espectrofotómetro UNICAM a una longitud de onda de 546 nm. Estudio histopatológico del páncreas Se seleccionó una rata al azar de cada uno de los lotes para extraer el páncreas. Éste fue perfundido con solución salina, fijado 12 horas con solución de formol al 10 % y deshidratado con alcohol etílico a concentraciones crecientes (70 a 96 %) de 6 a 24 horas. Posteriormente, el tejido se aclaró con xilol, alcohol y parafina durante un periodo de 1 a 6 horas. Se efectuó la impregnación con parafina de 30 minutos a 6 horas, se realizaron cortes con un microtomo y se tiñeron mediante la técnica de hematoxilinaeosina. El análisis se realizó en el Departamento de Patología del Hospital “Dr. Nicolás San Juan”, Toluca, Estado de México.

subagudo de dos semanas, empleando la dosis que en el estudio agudo demostró mayor eficacia. Después del tratamiento, se anestesiaron las ratas con éter, se obtuvieron muestras de sangre por punción cardiaca, utilizando EDTA como anticoagulante y se determinaron los niveles de glucosa. El ensayo fue repetido incrementando a seis el número de animales. Se seleccionó uno al azar de cada lote y se realizó el estudio histopatológico. El análisis estadístico se efectuó utilizando el método de Dunnett y Duncan (previo análisis de varianza) con la ayuda del paquete estadístico Sigma Stat, versión 2.

Resultados y discusión Diseño del modelo experimental para la inducción de diabetes tipo 2

Se formaron cinco lotes de tres ratas cada uno, con pesos de 120 a 166 g. Los tratamientos fueron administrados de acuerdo a la tabla 2.

Los resultados referentes al establecimiento del modelo de diabetes tipo 2, se muestran en la tabla 3 y figuras 1 a 5. Como puede observarse, las dosis de NIC que protegen a las células β del páncreas de su destrucción total fueron de 225 y 350 mg/kg (tabla 3). A estas dosis de NIC se encontró una concentración de glucosa de 147 ± 7.8 y 136 ± 6.4 mg/dL, respectivamente, siendo significativamente menor en comparación con el testigo de SZT, en el que se indujo diabetes severa (402 ± 8.7 mg/dL), pero significativamente mayor a la del grupo testigo (110 ± 6.5 mg/dL) (p