SISTEMAS INTEGRALES DE CALIDAD Prácticas de empresa Sheila Estévez Martín

SISTEMAS INTEGRALES DE CALIDAD Memoria de prácticas

Las enfermedades provocadas por los alimentos en mal estado son, en el menor de los casos, desagradables, y pueden llegar a ser fatales. Para evitar casos de intoxicaciones alimentarias existen leyes que controlan los niveles máximos permitidos de agentes contaminantes en los alimentos y que garantizan la salud de los consumidores. SIC Calidad es una empresa dedicada el control de calidad de alimentos y aguas. Entres sus funciones están las de la realización de APPCCs, análisis en el laboratorio de las muestras recogidas y asesoramientos alimentarios. Mis prácticas se centraron en el área del laboratorio y mi labor era la de analizar las muestras que los consultores recogían de los distintos lugares de muestreo. Estos lugares eran principalmente fábricas y cocinas de restaurantes, hoteles e incluso hospitales. Como la recogida de muestras llevaba a los consultores toda la mañana, en el laboratorio se dedicaba ese tiempo a la lectura de los cultivos de las muestras de días anteriores, siembra de esos cultivos en otros medios si era necesario, y a preparar los medios de cultivo. La cantidad y el tipo de microorganismos a analizar en cada muestra venía determinado por el tipo de alimento (carne, cereales, verduras,…), pero de forma general se hacían distinción en dos tipos: alimentos con tratamiento térmico (CTT) y alimentos sin tratamiento térmico (STT).

Tratamiento de las muestras Ambos tipos de alimentos recibían el mismo tratamiento previo, que consistía en la dilución y triturado de las muestras. Se pesaban 25 gramos de la muestra en una bolsa stomacher y se añadía agua de peptona hasta los 250 gramos. Después esta bolsa se colocaba en un triturador de paletas que golpeaban el alimento y el diluyente para poner las bacterias en suspensión. Además, de los CTT se pesaban otros 25 gramos en otra bolsa y se añadía en este caso caldo Fraser hasta los 250 gramos para el estudio de Listeria monocytogenes. Todas las bolsas se dejaban incubar durante un día en estufa a 37ºC. Pasado ese día se utilizaba la bolsa de agua de peptona para inocular los medios de cultivo para el

resto de microorganismos, y para realizar las distintas diluciones se utilizaban pocillos comerciales de agua de peptona. Las bolsas de caldo Fraser se utilizaban únicamente para el estudio de Listeria.

Según la naturaleza del alimento los microorganismos a analizar eran diferentes, y también se usaban diluciones diferentes para el mismo patógeno. Sin embargo, algunas de las bacterias eran comunes a todos o casi todos los alimentos. A continuación explicaré los procedimientos para el estudio de las principales bacterias.

Mesófilos aerobios totales El estudio de los mesófilos aerobios estima la flora total sin especificar el tipo de germen. Altos recuentos se consideran desaconsejables, pero un número elevado no significa necesariamente presencia de microorganismos patógenos. A partir de la bolsa de agua de peptona (AP) se toma un mililitro y se echa en una placa de petri vacía. Se añade medio PCA (agar nutritivo de recuento) previamente calentado y licuado, y que se ha dejado atemperar. Con movimientos circulares sobre la superficie de trabajo se mezclan la muestra y el medio y se deja solidificar el agar. Se incuban en estufa a 30ºC durante 3 días. Para el recuento se cuentan todas la colonias que han crecido y se multiplica por el factor de dilución.

Enterobacterias lactosa-positivas Son bacterias Gram- que fermentan lactosa. Se encuentran en el intestino de los animales y se usan como indicador de contaminación fecal. De la bolsa de AP se toma un mililitro y se echa en una placa de petri vacía. Se añade medio VRBL (agar lactosado con bilis al cristal violeta y rojo neutro) licuado y atemperado. Se mezcla con movimientos circulares y se deja solidificar. Las placas se incuban un día en estufa a 30ºC. Normalmente se hacían dos placas con diferentes diluciones. Para el recuento se contabilizan las colonias de color rojo púrpura rodeadas de un halo violeta y se multiplica por el factor de dilución.

Escherichia coli La mayoría de las bacterias de la especie E. coli forman parte de la flora intestinal de animales de sangre caliente. Su presencia en los alimentos se utiliza como índice de contaminación fecal. De forma general, las cepas de E. coli son inocuas para el hombre, pero existen algunas cepas que causan diarreas de mayor o menor gravedad. En los casos más graves, la bacteria puede causar hemorragias gastrointestinales, fallo renal y afectar al sistema nervioso central. Los alimentos más peligrosos en este sentido son la carne mal cocinada, la leche cruda y el agua contaminada. Dependiendo de si el alimento era CTT o STT se realizaban dos procedimientos diferentes, ya que en los CTT solo se estudiaba la presencia/ausencia de E. coli y en los STT era necesario el recuento. Estudio de la presencia/ausencia de E. coli: De la bolsa de AP se toma una muestra de un mililitro y se siembra en tubos de lauril sulfato con campana Durham. Se incuban 1-2 días en estufa a 37ºC. Transcurrido un día se comprueban los tubos. Aquellos que tengan más de un cuarto de la campana con gas se siembran en el siguiente medio. Los que no llegan a un cuarto de la campana con gas se incuban otro día más. Los tubos en los que después de dos días no he ha producido más de un cuarto de la campana de gas son tomados como negativos en E. coli. Los tubos con producción de gas son seleccionados para el siguiente paso. Con el asa de siembra se inoculan tubos de caldo EC (Escherichia coli) que también contienen campana Durham. Se incuban a 44ºC durante 1-2 días en los que también se comprueba la producción de gas. Los tubos de EC con producción de gas se siembran con el asa de siembra en tubos de AT (agua de triptona) atemperados en un baño a 44ºC. Se incuban en estufa a 44ºc durante un día. Pasado ese tiempo se añaden tres gotas del reactivo de Kovacs. Los tubos con presencia de E. coli se evidencian por la aparición de una fase no acuosa de color rojo en la superficie del agua de triptona. En los tubos negativos la fase no acuosa no adquiere ningún color. Recuento de E. coli: De la bolsa de AP se toma un mililitro y se echa en una placa de petri vacía. Se añade medio PTX licuado y atemperado y se mezcla con movimientos circulares. Se deja solidificar el agar y se incuban las placas en estufa a 44ºC. El recuento se lleva a cabo contando las colonias de color azul y multiplicando por el factor de dilución.

Salmonella sp. Esta bacteria se encuentra en productos crudos de origen animal y puede originar brotes de salmonelosis. Dado que, a veces, un número bajo de Salmonella puede causar enfermedad, lo importante es asegurar su ausencia en los alimentos listos para el consumo. De la bolsa de AP se toma un mililitro de la muestra y se siembra en tubos con caldo Rappaport. Se incuban en estufa a 44ºC durante un día. Pasado este tiempo, se siembra cada tubo en placas de VB (agar verde brillante) y XLD (agar xilosa-lisinadesoxicolato). Se siembra en estría con el asa de siembra y se incuban las placas durante un día en estufa a 37ºC. Las colonias de Salmonella crecidas sobre VB son de color rosado con halo rojo. Las colonias de Salmonella que crecen en XLD son rojas con centro negro o negras casi completamente. Cuando las dos placas son positivas, se seleccionan varias colonias y se realiza un test API que nos confirma si las colonias son de Salmonella. Los resultados se dan en forma de presencia/ausencia del microorganismo.

Staphyylococcus aureus Esta bacteria se encuentra en la piel y mucosas de los animales de sangre caliente, y los alimentos expuestos a la manipulación humana tienen la posibilidad de contaminarse. Produce enterotoxinas que provocan nauseas, vómitos, dolor abdominal y diarrea. De la bolsa de AP se toma un mililitro, se echa en una placa de petri con medio BP (Baird Parker) y se extiende con el asa de vidrio. Se incuba durante dos días en estufa a 37ºC. El recuento se realiza contando las colonias típicas que son negras, convexas, brillantes, de borde blanco y rodeadas de una zona opaca y un halo claro. Se multiplica por el factor de dilución.

Listeria monocytogenes Es un patógeno ubicuitaro que actúa como oportunista cuando las condiciones del huésped le son favorables para su desarrollo. Produce listeriosis y el germen actúa por vía digestiva. Es una enfermedad con alta tasa de mortalidad. Los síntomas van desde una gripe benigna a meningitis o meningoencefalitis. En mujeres embarazadas puede atravesar la placenta y llegar al feto pudiendo producir un aborto.

A partir de 0.1 mililitro de las bolsas con caldo Fraser, se inoculan tubos de Fraser que se incuban durante un día en estufas de 30ºC. Los tubos en los que el medio se ha oscurecido o vuelto negro se siembran en placas de agar Palcam y agar Oxford que se incuban durante un día en estufa a 37ºC. En Palcam las colonias que crecen son de color verde irisado un halo negro. En Oxford son de aspecto gris con halo negro. Estas colonias se siembran en forma de i en placas de TYSEA (agar triptona de soja-extracto de levadura), que se incuban a 37ºC durante un día. En este medio las colonias de Listeria son de incoloras y pequeñas. Sobre las colonias en la placa de TYSEA se realiza la prueba de la catalasa sobre el palo de la i. Si da positivo, a partir del punto de la i se siembran en agar sangre. Se incuba a 37ºC durante un día. Si en la placa de agar sangre se ha producido hemolisis, se realiza una prueba bioquímica tipo API específica para Listeria.