Efecto del alcohol y de polimorfismos del gen FGFR2 sobre el riesgo de cáncer de mama en mujeres mexicanas 1

2

3

4

Murillo-Zamora Efrén , Torres-Mejía Gabriela , Moreno-Macías Hortensia , Vidal-Millán Silvia

Resumen Introducción. El polimorfismo de nucleótido único (del inglés Single Nucleotide Polymorphism) rs2981582 (C>T) del gen FGFR2 (del inglés, Fibroblast Growth Factor Receptor 2) y el consumo de alcohol se han asociado consistentemente con un incremento en el riesgo de cáncer de mama (CM). Es biológicamente plausible que las variantes alélicas del polimorfismo modifiquen el efecto del alcohol sobre el riesgo de CM. Objetivo. Evaluar si las variantes alélicas del polimorfismo rs2981582 modifican el efecto de la asociación entre el consumo de alcohol y el riesgo de CM. Metodología. Se incluyeron 691 casos incidentes de CM y 911 controles con base poblacional. Mediante una entrevista las mujeres proporcionaron información sobre consumo de alcohol. La determinación de polimorfismos se realizó mediante ensayos iPlex© y protocolos para PCR Multiplex. El equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW) de las frecuencias alélicas fue evaluado. Se calcularon razones de momios (RM) e intervalos de confianza (IC) del 95% empleando modelos de regresión logística múltiple condicional. Resultados. En el grupo control las frecuencias alélicas están en EHW (p= 0.326). En los modelos de efectos principales, tanto el alcohol (RM= 2.17, IC 95% 1.56 - 3.02) como el polimorfismo rs2981582 del gen FGFR2 (RM

POR ALELO

= 1.26, IC 95% 1.07 - 1.47) se

asociaron con un incremento en el riesgo de CM. El valor P del término de interacción fue 0.040; la RM del efecto del alcohol sobre el riesgo de CM fue de 3.49 (IC 95% 1.90 6.44), 2.10 (IC 95% 1.30 - 3.37) y 1.07 (IC 95% 0.43 - 2.66) para los genotipos CC, CT y TT respectivamente. Conclusiones. El efecto del alcohol sobre el riesgo de cáncer de mama se modifica dependiendo de la variante alélica del polimorfismo rs2981582 del gen FGFR2.

1

Candidato a Maestro en Ciencias con área de concentración en Epidemiología, ESPM INSP

2

Directora de tesis, CISP INSP

3

Asesora, UAM Iztapalapa

4

Asesora, INCan

Introducción El consumo de alcohol es un factor de riesgo modificable bien documentado para el desarrollo de cáncer de mama (CM).1-4 Las últimas Encuestas Nacionales de Adicciones, en México, han evidenciado que la proporción de mujeres que consumen de alcohol se ha incrementado, además de que la edad en que inician su consumo ha disminuido.5-7 Por otra parte, recientemente dos estudios de asociación de genoma completo (del inglés genome-wide association) evidenciaron que los polimorfismos de un nucleótido único (del inglés Single Nucleotide Polymorphism, SNP) intrónicos del gen FGFR2 (del inglés Fibroblast Growth Factor Receptor 2) se asocian también con un aumento en el riesgo de CM.8,

9

En la primera mitad del año en curso, dos meta-análisis independientes

concluyeron que existe evidencia suficiente para que el polimorfismo rs2981582 (C>T) del gen FGFR2 sea considerado un factor de riesgo para CM.

10, 11

investigación publicados al respecto han incluido a mujeres chinas,

12

Los trabajos de

japonesas,13 judías

(askenazi y sephardi),14 árabes-israelíes,14 europeo-americanas,15 afro-americanas,14 rusas16 y alemanas.17 Autores como Travis et al., en estudios de asociación epidemiológica, han caracterizado al SNP rs2981582 con A como alelo menor. Este hecho no tiene una mayor repercusión metodológica. El mecanismo preciso de carcinogénesis inducida por el etanol y por los polimorfismos del gen FGFR2 aún no ha sido descrito.18, 19 Hay evidencia de que las alteraciones en el gen FGFR2 pueden producir un efecto anti-apoptótico.20 El objetivo de este estudio es evaluar si el polimorfismo de nucleótido único rs2981582 del gen FGFR2 modifica el efecto del consumo de alcohol sobre el riesgo de CM en mujeres mexicanas.

Métodos Población de estudio, Selección de los casos y controles. Un estudio de casos y controles con base poblacional fue conducido en la Ciudad de México, Monterrey y Veracruz entre enero de 2004 y octubre de 2007. Los casos (n=1000) correspondieron a mujeres entre 35 y 69 años de edad con CM invasivo con diagnóstico histopatológico confirmatorio; fueron reclutadas en 12 hospitales públicos pertenecientes al Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS, 6 hospitales), Instituto de Seguridad Social al Servicio

de Trabajadores del Estado (ISSSTE, 2 hospitales) y de la Secretaría de Salud (SS, 4 hospitales). La distribución de edad para las mujeres elegibles se basó en la distribución de edad de tumores mamarios reportada en el Registro Histopatológico de Neoplasias Malignas (RHNM) 2002. Los casos fueron pareados frecuencialmente a los controles (n=1074) por lugar de residencia, quinquenio de edad e institución de servicios de salud de adscripción. Los controles elegibles fueron seleccionados usando una técnica de muestreo probabilístico polietápico en las Áreas Geo-Estadísticas Básicas (AGEBs) consideradas en la zona de influencia para cada uno de los hospitales participantes. Secundario a observaciones faltantes en las variables estudiadas, el análisis final incluyó a 691 casos y 911 controles. Las participantes proporcionaron mediante una entrevista información sobre dieta, estilo de vida, historial reproductivo, antecedentes patológicos familiares y personales además de otros factores asociados con el riesgo de CM. La exposición a alcohol fue medida como consumo alguna vez en la vida, actual y consumo alguna vez de una o más bebidas al mes durante uno más años. Adicionalmente se registraron medidas antropométricas de las participantes y proporcionaron una muestra de sangre venosa. La variable de consumo de alcohol empleada en el análisis estadístico fue consumo alguna vez en la vida (sí/no). La decisión de usar la variable de consumo de alcohol alguna vez en la vida en el análisis estadístico se basó en lo siguiente: a) a diferencia del resto de las variables de consumo de alcohol disponibles, el consumo del mismo alguna vez en la vida refleja la exposición crónica que se ha evidenciado como necesaria en la carcinogénesis inducida por otros compuestos del Grupo 1 de la IARC (Agencia Internacional de Investigación en Cáncer, del inglés International Agency for Research on Cancer) como el arsénico21 y benceno;22 b) alta prevalencia de consumo de alcohol entre mujeres mexicanas7 y edad temprana en que las mujeres se inician en su consumo;23 c) fuerte asociación, en nuestra muestra de estudio, del consumo de alcohol alguna vez en la vida con el consumo actual (p< 0.001) y consumo alguna vez de una o más copas por mes durante uno o más años (p< 0.001). Tomando en cuenta los anteriores aspectos, trabajamos bajo el supuesto de que una mujer mexicana que ha consumido en el pasado alcohol, ha persistido en su consumo a lo largo de su vida con una determinada y frecuencia y cantidad. La exposición genética fue evaluada como una variable cuantitativa de acuerdo al número adicional de alelos menores (0, 1 y 2 para los genotipos CC, CT y TT respectivamente).

Métodos de laboratorio. La genotipificación fue realizada utilizando reactivos y protocolos iPLEX® para PCR multiplex, extensiones primers de base única (del inglés Single Base primer Extension, SBE) y generación de espectro de masa; todo de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Sequenom®).24 Los productos fueron medidos usando el sistema compacto MassARRAY®, y el espectro de masa analizado usando el programa TYPER® 4.0 (Sequenom®) para generar los genotipos y frecuencias alélicas. El control de calidad fue realizado en todas las muestras de ADN usando un procedimiento de dos fases. En caso de que el ADN no hubiese sido cuantificado previo a su arribo, fue cuantificado y normalizado usando PicoGreen® y métodos estándar, y normalizado a una concentración estándar. La primera fase del control de calidad, la fase cuantitativa, incluyó RT-PCR no-alélica usando una prueba TaqMan®, con el fin de asegurar la posterior amplificación de las muestras de ADN. El control de calidad cualitativo, la segunda fase del procedimiento, consistió en la genotipificación usando un polimorfismo balanceado presente en la mayoría de las poblaciones, con el objetivo de descartar contaminación cruzada de las muestras. Todo el procedimiento de laboratorio tuvo lugar en la UCSF (Universidad de California, San Francisco; Estados Unidos de América). Análisis estadístico. Fueron calculadas frecuencias y medias aritméticas con desviaciones estándar de las variables estudiadas. En la comparación entre los casos y controles, se emplearon pruebas de ji-cuadrada y t de Student para variables categóricas y continuas respectivamente. Se determinó el equilibrio de Hardy-Weinberg de las frecuencias alélicas en los controles de la muestra de estudio. Razones de momios (RM) e intervalos de confianza (IC) al 95% fueron estimadas usando modelos de regresión logística condicional para determinar la asociación entre las exposiciones de interés y el riesgo de CM. La construcción del modelo múltiple de regresión logística fue de acuerdo a la estrategia sugerida por David W. Hosmer y Stanley Lemeshow.25 Fueron construidos tres modelos estadísticos: dos para estimar el efecto principal del consumo de alcohol y del polimorfismo rs2981582 respectivamente sobre el riesgo de CM y un tercer modelo para evaluar la interacción entre ambas exposiciones. Adicionalmente a las variables de pareamiento, las siguientes variables fueron incluidas en el análisis: ancestralidad (porcentaje de nativo, europeo o africano), índice de masa corporal (kg/m2), actividad física moderada (horas a la semana), ingesta calórica diaria (kilocalorías), nivel socio-económico (bajo, medio y alto), paridad (número de hijos

nacidos vivos), edad de menarca (años), lactancia total (meses), historial personal de enfermedad benigna de la mama (sí/no), estado de menopausia (pre-/posmenopausia), antecedente de CM en familiares de primer grado (sí/no), tabaquismo (sí/no) e historial personal de diabetes mellitus (sí/no). La definición operacional de mujeres en la premenopausia incluyo a aquellas con menos de 12 meses de su último periodo y a aquellas con el antecedente de menopausia quirúrgica a los 48 años de edad o antes. La mujeres en la posmenopausia fueron aquellas con menopausia natural (≥ 12 meses desde su último periodo) y mujeres con menopausia quirúrgica que reportaron ooforectomía o aquellas que no conocían el tipo de cirugía al que fueron sometidas pero que tenían más de 48 años cuando fue realizada. El punto de corte (48 años) responde a la media de edad de instauración de la menopausia en mujeres mexicanas.26 El poder estadístico fue calculado usando el programa Quanto® de acuerdo a las características del diseño de este estudio epidemiológico y bajo la hipótesis de una interacción gen-ambiente. El modelo de herencia especificado fue dominante; la frecuencia del alelo ancestral (61.64%) empleada en la estimación corresponde a la estimada en nuestra muestra. La prevalencia de la exposición ambiental (46.32%) corresponde a la prevalencia nacional de “consumo de alcohol en el año previo” reportada por mujeres de zonas urbanas en la Encuesta Nacional de Adicciones 2002. En el modelo de la enfermedad, el P0 (riesgo basal) en el modelo corresponde al riesgo estimado de la enfermedad en una mujer no expuesta al alcohol y homocigoto al alelo mayor. El riesgo conferido por la alteración genética (RG) corresponde al riesgo estimado en individuos no expuestos al alcohol. El riesgo conferido por la exposición al alcohol (RE) corresponde al riesgo estimado en individuos homocigotos al alelo mayor. Por último, el riesgo de interacción (RGE) es el cociente del exponencial del coeficiente de regresión estimado para el término de interacción dividido por el producto de RG y RE. De acuerdo con las estimaciones, se requerían 111 casos para alcanzar un poder estadístico del 80% en la evaluación de la interacción aquí planteada; para estimar el efecto de la exposición genética y ambiental sobre el riesgo de CM con igual poder se requerían de 184 y 437 casos respectivamente. Resultados La comparación entre los grupos de estudio se muestra en la Tabla I. En los casos, la prevalencia de consumo de alcohol fue mayor que la de los controles (19.54% y 9.99%

respectivamente). La prevalencia del consumo de alcohol estratificada por el genotipo del polimorfismo fue, en los casos, de 33.33%, 46.67% y 20.00% para los genotipos CC, CT y TT respectivamente; en el grupo control fue de 28.57%, 50.55% y 20.88% de forma respectiva. La frecuencia del alelo menor fue de 43.63% en casos y 38.31% en el grupo control. En este último, la frecuencia alélica observada del polimorfismo rs2981582 está bajo el equilibrio de Hardy-Weinberg (p= 0.326). Dos variables de ajuste fueron excluidas del modelo estadístico final. Estas variables fueron el tabaquismo y escolaridad por su asociación con el consumo de alcohol (p< 0.001) y ancestralidad (p< 0.001) respectivamente. En los modelos de efectos principales (Tabla II), tanto el consumo de alcohol (RM= 2.17, IC 95% 1.56 - 3.02) como el polimorfismo rs2981582 del gen FGFR2 (RM

POR ALELO

= 1.26, IC 95% 1.07 - 1.47) se

asociaron con un incremento en el riesgo de CM. Cuando el rs2981582 fue analizado como una variable categórica en donde la categoría de referencia corresponde al genotipo silvestre (CC), la RM estimada fue 1.11 (IC 95% 0.86 – 1.42) y 1.67 (IC 95% 1.20 - 2.31) para los genotipos CT y TT respectivamente. En el modelo multivariado de regresión logística condicional, la el valor p del término de interacción entre el polimorfismo rs2981582 y el consumo de alcohol fue de 0.040. De acuerdo a lo anterior, la RM estimada del efecto del alcohol sobre el riesgo de CM fue de 3.49 (IC 95% 1.90 - 6.44) para homocigotos al alelo mayor, 2.10 (IC 95% 1.30 - 3.37) para heterocigotos y 1.07 (IC 95% 0.43 – 2.66) para homocigotos al alelo menor. El poder estadístico estimado fue de 80%. Discusión Nuestros hallazgos sugieren que las variantes alélicas del polimorfismo rs2981582 del gen FGFR2 modifican el efecto del alcohol sobre el riesgo de cáncer de mama. Hasta donde nuestro conocimiento nos permite decirlo, no hay evidencia científica publicada acerca del posible mecanismo implicado en dicha modificación, sin embargo consideramos que este hecho es biológicamente plausible por, al menos, los mecanismos que a continuación se describen. El mecanismo de carcinogénesis inducida por los polimorfismos del gen FGFR2 no ha sido descrito,19 pero parece ser secundario a un efecto anti-apoptótico más que a un estímulo mitogénico.20 Este efecto inhibitorio de la apoptosis celular puede estar mediado,

en parte, por una reducción en la transcripción de proteínas FOXO, un subgrupo de la familia de factores transcripcionales denominados “cabeza de tenedor” (del inglés forkhead). Las proteínas FOXO están implicadas en la inducción de apoptosis a través de la activación de Bim y FasL,27 reparación de daños al ADN por la activación de GADD45a,28 destoxificación de ROS mediante la síntesis de la enzima manganeso superóxido dismutasa en la respuesta al estress29 e inhibición de la actividad transcripcional de ER-α y ER-β.30 Los Factores de Crecimiento de Fibroblastos (del inglés Fibroblast Growth Factors, FGFs), los ligandos del receptor codificado por el gen FGFR2,19 y otros factores de crecimiento regulan a la baja la expresión y actividad de FOXOs.31 El sistema fosfoinositol 3-quinasas (del inglés Phosphoinositide 3-kinase, PI3K), un sistema de señalización intracelular activado por la activación dependiente de ligando de FGFR2,32 regula a la baja la transcripción de los factores FOXO.31 Los SNPs del FGFR2, en CM y cáncer gástrico, se asocian a amplificación del gen y sobre-expresión del receptor codificado.33 Estas alteraciones pueden ocasionar que el receptor se torne activo.34 Considerando que este evento puede conducir a una activación aberrante del sistema PI3K y subsecuentemente a la inhibición de la transcripción de FOXOs, es biológicamente plausible que los polimorfismos de nucleótido único del gen FGFR2 modifiquen el efecto del consumo de alcohol sobre el riesgo de CM mediante, entre otros, la reducción en la destoxificación de ROS, menor reparación de daños al ADN ocasionados por la acumulación de aductos y pérdida de la inhibición sobre la actividad transcripcional de los ER. Debido a las limitantes generales de un estudio de casos y controles retrospectivo, los resultados aquí presentados deben ser considerados con cautela. El tamaño muestral y el poder estadístico son una de las fortalezas de este trabajo de investigación. La prevalencia de consumo de alcohol entre mujeres en este trabajo de investigación fue menor a la reportada por las últimas Encuestas Nacionales de Adicciones. Debido a diferencias en la definición de las variables, estas encuestas y nuestro estudio no son del todo comparables entre si. La frecuencia del alelo menor que identificamos en mujeres mexicanas fue similar a la reportada en otras poblaciones. 12, 35 Previamente, la interacción gen-ambiente aquí planteada fue evaluada en mujeres japonesas13 y residentes del Reino Unido;36 en ambos casos la interacción no resultó estadísticamente significativa. En el primero de los casos, los tamaños de muestra en

dicho estudio y en el nuestro son muy similares, sin embargo la frecuencia del alelo T fue menor en mujeres japonesas que en mexicanas tanto en casos (30.26% y 43.63% respectivamente) como en controles (25.93% y 38.31% respectivamente). Consideramos que este aspecto puede haber determinado los hallazgos en mujeres de Japón. Por otra parte, la prevalencia de consumo de alcohol en mujeres japonesas37 es similar a la prevalencia reportada en mujeres mexicanas. En el último caso, el del Reino Unido, los autores consideraron a los alelos G y A como mayor y menor respectivamente. La variable de consumo de alcohol fue operacionalizada como una variable cuantitativa de acuerdo al número de copas consumidas por día ( 1 bebidas por mes durante ≥ 1 años No 263 Sí 135 Consumo actual de alcohol No 206 Sí 191 Tabaquismo, alguna vez en la vida No 502 Sí 185 Nivel socio-económico Bajo 212 Medio 171 Alto 308 Estado de menopausia Premenopausia 297 Posmenopausia 394 Edad de menarca, años (media ± DE) 12.77 Edad de primer embarazo a término, años (media ± DE) 22.76 Paridad (media ± DE) 3.01 Lactancia total, meses (media ± DE) 21.81 Antecedente personal de diabetes mellitus No 547 Sí 144 Antecedente personal de enfermedad benigna de la mama No 589.00 Sí 102.00 Ancestralidad Nativo 0.60 Europeo 0.36 Africano 0.04 Genotipo rs2981582 CC 234 CT 311 TT 146 Frecuencias alélicas C 779 T 603 DE: desviación estándar. ± Probabilidad exacta de la prueba ji-cuadrada o t según corresponda. † RM cruda.

9.75

Controles n= 911 51.12 9.16

p value±

RM†

IC 95%

p value

0.038

1.03

0.96

1.10

0.416

92.62 7.38 857.64

876 35 1833.55

96.16 3.84 708.84

0.002 < 0.001

1.00 2.04 1.00

1.30 1.00

3.22 1.00

0.002 < 0.001

12.42 5.67 5.13

15.30 30.38 0.62

16.23 5.23 2.97

< 0.001 < 0.001 0.001

0.98 0.96 1.07

0.97 0.94 1.03

0.98 0.98 1.12

< 0.001 < 0.001 0.002

66.08 33.92

314 91

77.53 22.47

< 0.001

1.00 2.15

1.53

3.02

< 0.001

51.89 48.11

213 192

52.59 47.41

0.842

1.00 1.07

0.80

1.45

0.635

73.07 26.93

721 186

79.49 20.51

0.003

1.41

1.11

1.79

0.006

30.68 24.75 44.57

318 293 300

34.91 32.16 32.93

< 0.001

1.00 0.83 1.45

0.63 1.11

1.09 1.90

0.183 0.007

42.98 57.02 1.66 5.57 2.17 28.62

408 503 12.88 21.19 3.83 31.01

44.79 55.21 1.59 4.67 2.51 35.84

0.471 0.188 < 0.001 < 0.001 < 0.001

1.00 0.90 0.95 1.06 0.81 0.99

0.65 0.89 1.04 0.77 0.99

1.25 1.02 1.08 0.86 0.99

0.535 0.139 < 0.001 < 0.001 < 0.001

79.16 20.84

769 142

84.41 15.59

0.007

1.00 1.39

1.06

1.83

0.017

85.24 14.76

848.00 63.00

93.08 6.92

< 0.001

1.00 2.75

1.93

3.90

< 0.001

0.20 0.20 0.06

0.64 0.32 0.04

0.20 0.18 0.05

< 0.001 < 0.001 0.249

0.27 3.49 10.45

0.16 1.99 1.48

0.46 6.11 73.52

< 0.001 < 0.001 0.018

33.86 45.01 21.13

354 416 141

38.86 45.66 15.48

0.008

1.00 1.17 1.67

0.93 1.25

1.47 2.25

0.174 0.001

0.56 0.44

1124 698

0.62 0.38

Tabla II: Asociación (RM) cruda y ajustada del consumo de alcohol y del polimorfismo rs2981582 del gen FGFR2 sobre el riesgo de cáncer de mama RMα CI 95% p value RMβ CI 95% p value Consumo de alcohol, alguna vez en la vida No 1.00 1.00 Sí 2.24 1.66 3.03 T)* 1.27 1.10 1.47 0.001 1.26 1.07 1.47 0.004 Genotipo rs2981582 CC 1.00 1.00 CT 1.17 0.93 1.47 0.174 1.11 0.86 1.42 0.416 TT 1.67 1.25 2.25 0.001 1.67 1.20 2.31 0.002 α RM cruda. β RM ajustada por estado de menopausia, ancestralidad, actividad física moderada a la semana, historial de CM en familiares de primer grado, antecedente de diabetes mellitus, enfermedad benigna de la mama, IMC, edad de menarca, paridad, lactancia total, nivel socio-económico, edad, institución de salud de adscripción, ingesta calórica diaria y lugar de residencia. * RM POR ALELO

Tabla III: El polimorfismo rs2981582 modifica el efecto del alcohol sobre el riesgo de cáncer de mama RMα CI 95% p value Consumo de alcohol, alguna vez en la vida Genotipo rs2981582 CC 3.49 1.90 6.44 < 0.001 CT 2.10 1.30 3.37 0.002 TT 1.07 0.43 2.66 0.887 Termino de interacción 0.040 α OR ajustado por estado de menopausia, ancestralidad, actividad física moderada a la semana, ingesta calórica diaria, historial familiar de cáncer de mama en familiares de primer grado, antecedente de diabetes mellitus, enfermedad benigna de la mama, IMC, edad de menarca, paridad, lactancia total, nivel socio-económico, edad, institución de salud de adscripción y lugar de residencia