EFECTOS DE LOS INHIBIDORES REVERSIBLES DEL PROTEASOMA SOBRE LOS MECANISMOS INVOLUCRADOS EN LA INFLAMACIÓN Y EL REMODELADO EN EL ASMA

Investigadores principales: Dra. Laura Pujols i Tarrés Hospital Clínic i Provincial de Barcelona Dr. Cristóbal Mezquita Pla Facultat de Medicina UB Duración: 3 años

1. Resumen El asma es una enfermedad inflamatoria crónica de la vía respiratoria que afecta hasta un 10% de la población de los países industrializados y que se caracteriza por una hiperreactividad y obstrucción de las vías aéreas. En este proceso participan tanto células inflamatorias, como los eosinófilos y los linfocitos Th2, como células estructurales, como por ejemplo las células endoteliales y los fibroblastos. Los glucocorticoides son los agentes antiinflamatorios más efectivos para el tratamiento del asma. Por otra parte, hay pacientes, en especial los asmáticos graves, que no responden al tratamiento. De hecho, se piensa que el proceso de remodelado de las vías aéreas que se observa en los pacientes asmáticos, obtiene poca respuesta al tratamiento con glucocorticoides. Los inhibidores reversibles del proteasoma son unos fármacos que inhiben la actividad del proteasoma de la célula, impidiendo así la degradación de múltiples proteínas celulares que son degradadas de forma natural por este complejo celular. Los inhibidores reversibles del proteasoma son en la actualidad empleados en el tratamiento del mieloma múltiple. Existen pruebas en la bibliografía médica que indican que, además de antiangiogénicos, estos fármacos podrían tener efectos antiinflamatorios y antifibróticos. No obstante, los efectos celulares y moleculares de los inhibidores reversibles del proteasoma en células de origen no canceroso son prácticamente desconocidos. El objetivo de nuestro estudio fue determinar la capacidad del inhibidor reversible del proteasoma MG262 de disminuir las respuestas inflamatoria y angiogénica de células diana involucradas en el asma crónica, así como examinar la capacidad de MG262 de aumentar los efectos antiinflamatorios y antiangiogénicos de los 2

glucocorticoides. Como objetivos concretos nos propusimos investigar los efectos antiinflamatorios y antifibróticos del MG262, comparándolo con los glucocorticoides, en cultivos celulares de fibroblastos de individuos controles y de pacientes asmáticos (subproyecto 1), así como investigar el efecto antiangiogénico de MG262 en cultivos celulares de fibroblastos y de células endoteliales humanas (subproyecto 2).

2. Resultados SUBPROYECTO 1 1. Efecto del MG262 sobre la proliferación, la apoptosis y el ciclo celular. La incubación de fibroblastos nasales con MG262 (0,1-10.000 nM) durante 24 horas produce una disminución significativa y dosisdependiente (p < 0,01) de la proliferación celular, sin llegar a alcanzar el 50% de inhibición. Esta disminución es mucho más destacable a las 48 y 72 horas de incubación con MG262 (p < 0,001 a cada tiempo), y se produce tanto en fibroblastos de individuos controles (n= 8; IC50= 10,6 nM a las 48 h) como en fibroblastos de pacientes asmáticos (n= 8; IC50= 7,5 nM a las 48 h). La administración de dexametasona (DEX) durante 3 y 5 días provoca, en cambio, una débil disminución (25% a los 5 días) pero significativa de la proliferación celular en los fibroblastos controles (n= 8; p < 0,001) pero no en fibroblastos de pacientes asmáticos (n= 8; ns). La incubación de fibroblastos nasales con MG262 (50 nM) durante 48 h produce un aumento de la actividad caspasa-3. A las 24 h de MG262 no se observa activación de la caspasa-3, pero sí una pérdida del potencial de la membrana mitocondrial, indicativa de apoptosis

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inicial. La DEX, en cambio, no produce activación de caspasa-3 en ningún tiempo analizado. La incubación de fibroblastos nasales con MG262 (50 nM, 24 h, n= 6) provoca una destacable disminución de las fases S (2%; p < 0,05) y G2/M (4%; p < 0,05) y un aumento de la fase G0/G1 (93%; p < 0,05) del ciclo celular, comparado con las células incubadas sólo con medio (S: 12%, G2/M: 21%, G0/G1: 61%). En concordancia con estos resultados, el MG262 (10 nM, 24 h) inhibe por completo la incorporación de timidina en el DNA, provocando una paralización del ciclo celular en la fase G0/G1. La detención de la progresión del ciclo celular inducido por MG262 se produce vía acumulación de las proteínas supresoras del ciclo celular p21 y p27. Los efectos de la DEX sobre el ciclo celular son, en cambio, mucho menos destacables. Así, la DEX (1.000 nM, 3 días, n= 6) provoca una ligera disminución de la fase G2/M (5%; p < 0,05), comparado con las células incubadas con medio de cultivo (7%), sin provocar cambios significativos en las fases G0/G1 y S del ciclo celular. Esta ligera disminución de la proliferación celular inducida por DEX no va ligada al aumento de p21 y p27. 2. Efecto del MG262 sobre la expresión y la localización subcelular de RG La incubación de fibroblastos nasales con DEX (1.000 nM) durante, 6, 12 y 24 horas produce una disminución dependiente de tiempo de la expresión del ARNm y la proteína del RG . En los mismos tiempos, el MG262 (50 nM) provoca una disminución de la expresión de ARNm del RG , sin alterar significativamente los niveles de la proteína. La coincubación de DEX y MG262 impide la regulación a la baja del RG inducida por la DEX (figura 1).

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Figura 1. Imagen representativa del efecto de la coincubación de MG262 y DEX (24 h) sobre la expresión del RG

en fibroblastos

nasales. Se observa que la incubación con DEX sola, disminuye la expresión proteica del RG disminución del RG

y que la adición del MG262 impide la

inducida por la DEX. La imagen inferior muestra

la expresión de la proteína constitutiva

-actina, mostrando igual

carga proteica en todos los pozos. La incubación de fibroblastos nasales con DEX (100 nM) induce un aumento de la translocación del RG

al núcleo celular, siendo

máximo a los 60 minutos y manteniéndose en el núcleo durante todo el período de administración de DEX (180 minutos). La incubación con MG262 solo (500 nM, 3-6 h) provoca un aumento del RG

en el

núcleo celular. La coincubación con DEX y MG262 parece potenciar el efecto de cada uno de ellos por separado. 3. Efecto del MG262 sobre la activación del NF- B y la expresión de genes dependientes de NF- B La incubación de fibroblastos nasales con MG262 impide la translocación al núcleo inducida por TNF

o IL-1

de la subunidad

p65 del NF- B y provoca el acúmulo de la forma fosforilada del inhibidor del NF- B, I- B . El MG262 (500 nM, 4 h) inhibe en un 50% la producción de IL-6 tanto en los fibroblastos de individuos controles como en los de pacientes asmáticos (n= 6; p < 0,05 para cada grupo). En el mismo tiempo de 5

incubación y en los dos tipos celulares, la DEX provoca una destacable inhibición dosis-dependiente de la producción de IL-6 (p < 0,01 para cada grupo). La inhibición de la producción de IL-6 por parte de la DEX (10 nM) fue sensiblemente superior en los fibroblastos de individuos controles (35% de reducción; p < 0,05 comparado con el medio) que en los fibroblastos de pacientes asmáticos (27% de reducción; ns comparado con el medio). La coincubación con MG262 y DEX no produce una potenciación del efecto inhibitorio que se obtiene al incubar ambos fármacos por separado. 4. Efecto del MG262 sobre la expresión de genes dependientes de GRE La incubación de fibroblastos nasales con DEX (1.000 nM, 18 h) produce un aumento de la expresión de los ARNm de los genes diana de los glucocorticoides MTII (n= 9; p < 0,05) y MKP-1 (n= 5; p < 0,05) que es el doble que el de las células incubadas sólo con medio. En comparación con las células incubadas con DEX sola, la coadministración de MG262 parece aumentar la expresión de ARNm de MKP-1. 5. Efecto del MG262 sobre la síntesis de colágeno La incubación de fibroblastos nasales con MG262 durante 24 h provoca una disminución dosis-dependiente de la expresión de ARNm de los colágenos 1 1, 1 2 y 3 1 tanto en fibroblastos de individuos controles (n= 7; p < 0,01; figura 2A) como en fibroblastos de pacientes asmáticos (n= 5; p < 0,01). En cambio, en el mismo tiempo de incubación, la DEX no inhibe de forma significativa la expresión de ARNm de los colágenos 1 1 (figura 2B), 1 2 y 3 1 en ninguno de los dos tipos celulares. La coincubación con MG262 y DEX no potencia el efecto de cada uno de ellos por separado.

6

8

8

6

6

*

†

4

*

†

4

2

2

† 0

0

TGF" (5 ng/ml)

-

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

MG262 ( nM)

-

-

1

5

10

50

-

-

0,1

10

1.000

Col·lagen 1! 1 / gen const. (RPII)

B Col·lagen 1! 1 / gen const. (RPII)

A

TGF " (5 ng/ml) DEX (nM)

Figura 2. Efecto del MG262 (A) y la DEX (B) sobre la expresión de ARNm del colágeno 1 1 inducida por TGF

en fibroblastos de mucosa

nasal sana. Las células se incubaron con TGF

en ausencia o

presencia de MG262 o DEX durante 24 h. * p < 0,05 comparado con el medio de cultivo solo; † p < 0,05 comparado con el efecto del TGF

solo.

SUBPROYECTO 2 1. Efectos del MG262 sobre la expresión del receptor VEGFR-1 en fibroblastos, células endoteliales y macrófagos humanos Utilizando el análisis Northern, hemos observado que el inhibidor reversible del proteasoma MG262 disminuye la expresión del receptor VEGFR-1 en fibroblastos obtenidos de pólipos nasales, además de inhibir la expresión en células endoteliales microvasculares humanas y en macrófagos humanos. Las principales isoformas afectadas son la forma completa de membrana y las truncadas intracelulares. 2. Efectos del MG262 sobre la expresión de VEGF en células endoteliales y fibroblastos humanos

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La acción del inhibidor reversible del proteasoma MG262 sobre la expresión del VEGF depende del tipo celular: disminuye la expresión del VEGF en macrófagos humanos, pero la aumenta en fibroblastos. 3. Efectos de los inhibidores de la CDK9 (DRB, H7 y flavopiridol) sobre la expresión del receptor VEGFR-1 Los inhibidores de la CDK9 –DRB, H7 y flavopiridol– disminuyen la expresión de la isoforma soluble del receptor VEGFR-1 y mantienen la expresión de la isoforma que codifica el receptor de membrana. Este efecto es el opuesto al que se observa como consecuencia de la acción del MG262, el cual estabilizaría la CDK9. Los inhibidores de la CDK9 –DRB, H7 y flavopiridol– inhiben la fosforilación de la serina-2 de los heptapéptidos del dominio carboxiterminal de la RNA polimerasa II. Esta fosforilación, en cambio, aumenta como consecuencia de la acción del MG262. 4. Caracterización de una nueva familia de isoformas truncadas intracelulares del receptor VEGFR-1. El gen VEGFR-1 humano consta de 30 exones. Previamente se había caracterizado una isoforma con los 30 exones que codifica el receptor transmembrana del VEGF denominado VEGFR-1 y una forma soluble truncada extracelular derivada de los 13 primeros exones con una secuencia adicional derivada del intrón 13 (sVEGFR-1). Este proyecto nos ha permitido caracterizar cinco isoformas truncadas intracelulares del VEGFR-1. El análisis de las secuencias de estas isoformas (depositadas en el GenBank) muestra que codifican por proteínas que han perdido los dominios extracelulares y poseen todos o parte de los dominios intracelulares. Las nuevas isoformas han sido designadas: ti15VEGFR-1, ti15asVEGFR-1, ti18VEGFR-1, ti21VEGFR-1 y ti21asVEGFR-1. El prefijo ti- indica “truncada intracelular”, y el número que sigue al prefijo indica el intrón donde se inicia el transcrito. Las isoformas

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ti15asVEGFR-1 y ti21asVEGFR-1 resultan del splicing alternativo de las isoformas ti15VEGFR-1 ti21VEGFR-1, respectivamente. 5. Efecto del MG262 y de los glucocorticoides sobre la expresión de la isoforma Ti21VEGFR-1 en fibroblastos En fibroblastos obtenidos de pólipos nasales, el MG262 suprime la expresión de Ti21VEGFR-1 (figura 3). La Ti21VEGFR-1 es la isoforma truncada intracelular más abundante de VEGFR-1. La incubación de los fibroblastos con DEX no afecta a la expresión de VEGFR-1.

Figura 3. Expresión de ti21Flt-1 en fibroblastos obtenidos de un pólipo nasal (A) en comparación con la expresión de actina (B). La expresión por RT-PCR de izquierda a derecha corresponde a: 1) RNA de células controles cultivadas en DMEM con 0,5% FBS; 2) RNA de células tratadas con el inhibidor reversible del proteasoma MG262 50 nM. 3) RNA de células tratadas con DEX 1 M. 4) RNA de células tratadas con MG262 y DEX a las concentraciones indicadas anteriormente. 6. Función de las isoformas intracelulares de VEGFR-1 Para averiguar la función de las proteínas VEGFR-1 hemos realizado experimentos de interferencia con oligonucleótidos localizados en los exones 18 (oligonucleótido A), 21 (oligonucleótido B), 25

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(oligonucleótido D) y 27 (oligonucleótido C). El oligonucleótido A interfirió en la expresión de la isoforma ti15VEGFR-1. El oligonucléotido B interfirió en la expresión de las isoformas ti15VEGFR-1 y ti18VEGFR-1. Los oligonucléotidos C y D interfirieron en todas las isoformas. No obstante, los resultados que obtuvimos empleando estos oligonucleótidos (stealth siRNA de Invitrogen) nos sugirieron la posibilidad de estar observando falsos fenotipos, debido a presentar los oligonucléotidos efectos fuera de la diana. Para descartar esta posibilidad de los falsos fenotipos hemos utilizado un nuevo sistema de interferencia: Thermo Scientific Dharmacon ontarget plus siRNA. Estos nuevos oligonucleótidos presentan una modificación química que asegura una máxima especificidad. Los resultados de la interferencia los analizamos determinando la expresión de 384 genes involucrados en la apoptosis y en la vía del NF-kB. Los resultados indican que las formas truncadas intracelulares inhiben la expresión de genes proapoptóticos (BCL10, BIK, BNIP3, CASP1, CASP2, CASP6, CASP8, CASP14, DEDD, FAS, RIPK1, TNFRSF21, TNFSF10) y estimulan la expresión de genes antiapoptóticos (BIRC3, DAPK1). Además, las formas truncadas intracelulares activan la vía del NF-kB (CARD4, CARD15, LTB, TNFRSF). 7. Caracterización de una nueva isoforma truncada extracelular del VEGFR-1 Hemos caracterizado también una nueva isoforma extracelular con una cola C-terminal poliserina. Esta isoforma ha sido identificada recientemente por otros laboratorios, que la han relacionado con la capacidad de la musculatura lisa vascular de inhibir la acción vasodilatadora del VEGF. Esta observación sugiere la posibilidad de una acción semejante en la musculatura bronquial, que podría ser importante en la patogenia del asma bronquial y que será objeto de investigación en un nuevo proyecto. 10

3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos SUBPROYECTO 1 Los hallazgos más significativos del presente proyecto son que el inhibidor reversible del proteasoma MG262 disminuye la proliferación de los fibroblastos de la vía aérea, provoca una paralización del ciclo celular y por último la apoptosis. Además, concentraciones no citotóxicas de MG262 disminuyen la producción de la citocina proinflamatoria IL-6 y la síntesis de colágenos. Tanto la proliferación como la síntesis de colágenos de los fibroblastos son muy poco sensibles al efecto de los glucocorticoides. En conjunto, el efecto inhibidor del MG262 sobre la función del fibroblasto sugiere que este fármaco podría ser una opción potencialmente terapéutica en enfermedades que, como el asma grave, se caracterizan por poseer un destacable componente fibrótico e inflamatorio. Los resultados obtenidos en nuestro proyecto son de gran utilidad para testar la capacidad antiinflamatoria, antiangiogénica y antifibrótica de estos fármacos en modelo animal, siendo éste un ensayo obligatorio antes de realizarse ensayos clínicos en humanos. SUBPROYECTO 2 El efecto antiinflamatorio y antiangiogénico de los inhibidores del proteasoma tendría lugar en parte suprimiendo la vía extrínseca que opera a través del VEGF y otros factores de crecimiento que activan el VEGFR-1 y también suprimiendo la vía intrínseca constitutiva, caracterizada por primera vez en este proyecto, que sería independiente del VEGF y otros factores de crecimiento. Además, la caracterización en este proyecto de una nueva isoforma soluble del VEGFR-1 con una cola C-terminal poliserina que, conforme a resultados muy recientes, es capaz de bloquear el efecto vasodilatador del VEGF, sugiere que podría realizar una función 11

similar a la musculatura bronquial y contribuir a la broncoconstricción característica del asma. Esta hipótesis será objeto de investigación futura en nuestro grupo.

4. Publicaciones Pujols L, M Fuentes, L Fernández-Bertolín, I Alobid, N Agell, J RocaFerrer, J Mullol, C Picado. Little effect of glucocorticoids on fibroblast proliferation and collagen production by upper airway fibroblasts. (Manuscrito en preparación.) Pujols L, M Fuentes, L Fernández-Bertolín, I Alobid, N Agell, J RocaFerrer, J Mullol, C Picado. Inhibition of airway fibroblast proliferation and function by the proteasome inhibitor MG262. (Manuscrito en preparación.) Las secuencias de las cinco nuevas isoformas truncadas intracelulares de VEGFR-1 han sido depositadas en el GenBank con los siguientes códigos de referencia: DQ836394, DQ836395, EF491868, EF491869 y EF491870 (A new family of truncated intracellular isoforms of VEGFR1, lacking the extracellular domains of the molecule, may contribute to the malignant phenotype of breast cancer cells). La secuencia de la forma soluble extracelular con la cola C-terminal de poliserina ha sido depositada en el GenBank con el código EU360600 (A new VEGFR-1 transcript coding for the extracellular domains of the protein followed by a C-terminal polyserine tail). El manuscrito que describe la caracterización de las formas truncadas intracelulares de VEGFR-1 ha sido remitido para su publicación. La aceptación de este manuscrito es un requisito previo para la publicación de otros resultados del proyecto.

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