Figura 8. Hojas de plantas regeneradas no transformadas (a) y de plantas transformadas, que expresan el gen reportero gfp en los tricomas (b). Raíces de plantas regeneradas no transformadas WT, y de plantas transformadas que expresan el gen reportero gfp WRKY (c).

El ADN de las plantas regeneradas será extraído y analizado por PCR utilizando cebadores específicos para cada transgen y por otro lado se realizarán “southern blot” para confirmar la integración y el número de copias del DNA exógeno al genoma de la planta. El objetivo del presente estudio fue determinar la función de los genes identificados en el genoma de la soja en relación a los procesos de respuesta a estrés biótico y abiótico, con énfasis en déficit hídrico y enfermedades causadas por patógenos fúngicos. Se escogieron para el estudio: 1) cuatro genes que codifican factores de transcripción de la familia WRKY; 2) Genes de la familia ASR (ABA, Stress and Ripening); 3) Genes que codifican proteínas híbridas ricas en prolina (HyPRP). Los resultados obtenidos hasta el momento se mencionan a continuación: 1) El análisis del perfil de expresión (RT-qPCR) de los cuatro genes de la familia WRKY mostró que estos poseen expresión diferencial a lo largo de la infección con Phakopsora pachyrhizi Sydow, y también que cuando se compararon los genotipos susceptibles y resistentes utilizados. Se observó también una modificación de la expresión de estos genes cuando las plantas se sometieron a estrés salino. 2) Se identificó la familia Asr de soja. El análisis del perfil de expresión reveló que un gen tiene un patrón distinto de inducción a nivel de transcriptos (mRNA), en hojas tratadas con ABA, sal y déficit hídrico; en cuanto al gen 2, presentó un patrón distinto de inducción, en raíz, tratada con ABA y déficit hídrico. El gen 2 también presentó expresión diferencial en plantas infectadas con P. pachyrhizi, al compararse los genotipos resistentes y susceptibles. 3) Se identificaron 35 genes HyPRP en el genoma de la soja. Se confirmó el patrón de expresión de tres de estos genes en plantas de soja sometidas a tratamientos de alta salinidad, ácido absícico (ABA), ácido salicílico e infección con P. pachyrhizi, siendo constatado el aumento significativo en la expresión de los genes en los tres últimos experimentos. La expresión de dos de estos genes se reprimió después del tratamiento con sal. Los resultados obtenidos refuerzan la posibilidad de que las proteínas codificadas por los genes de las tres familias en estudio (WRKY, ASR e HyPRP) estén involucradas en respuestas a estreses bióticos y abióticos. 4) Se construyeron vectores para la sobreexpresión y silenciamiento de los genes en estudio en soja. Plantas transgénicas portando estas construcciones se obtuvieron a través de bombardeo o vía sistema integrado “bombardeo/Agrobacterium”, en los cuales embriones somáticos se utilizaron como tejido blanco. Hasta el momento, se obtuvieron tres líneas que sobreexpresan los genes de interés; además de dos líneas donde se silenciaron estos genes en conjunto. Además de estas, otras líneas deben ser identificadas, una vez que embriones y plantas obtenidas en los experimentos de transformación se encuentran en diversas etapas. La confirmación de alteraciones en los niveles de expresión de esas plantas posibilitará su utilización en desafíos con patógenos y experimentos de estreses abióticos, permitiendo así un estudio completo de la caracterización funcional de estos genes en soja.

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2.2.7. Perfil de la expresión génica en la interacción de transcriptomas de soja y roya asiática.

EMBRAPA SOJA. La roya asiática, causada por Phakopsora pachyrhizi, desde su aparición viene causando serios perjuicios al agronegocio de la soja brasilera. El desarrollo de variedades resistentes es una manera económica y confiable de combatir las enfermedades. Cinco distintos genes de resistencia a roya asiática se mapearon hasta el momento: Rpp1, Rpp2, Rpp3,e Rpp4, Rpp5 (BROMFIELD & HARTWIG, 1980; MCLEAN & BITH, 1980; HARTWIG & BROMFIELD, 1983; HARTWIG, 1986; GARCIA et al., 2008). Varias otras fuentes de resistencia también se identificaron en otros países, (MILES et al., 2006) y en Brasil (LAPERUTA et al., 2008). Sin embargo, hasta el momento, hay disponibles apenas tres cultivares resistentes a roya (BRSGO 7560, TMG 801 e TMG 803), estas a su vez poseen algunas limitaciones como: regiones de siembra y resistencia apenas a algunas razas del patógeno (FUNDAÇÃO MT, 2009) debido a la gran variabilidad del patógeno, la resistencia mediada por tales genes en la mayoría de las veces está limitada, siendo fácilmente quebrada en una o dos campañas. En este sentido, el entendimiento de los mecanismos moleculares involucrados en la interacción entre la soja y el hongo P. pachyrhizi es de vital importancia en la planificación de estrategias más durables para el control de la roya asiática. El monitoreo simultáneo de la expresión génica del hospedero y del patógeno, o sea, de la interacción de los transcriptomas, viene siendo una estrategia recientemente utilizada para la elucidación detallada y simultánea del rol del patógeno y del hospedero a nivel molecular durante la interacción en diferentes sistemas patogénicos. La microdisección laser (LM) ofrece condiciones para aislar células específicas que contienen al patógeno y permiten aislar tejidos de plantas normales, haciendo la comparación de la expresión génica entre diferentes tejidos. Tal estrategia viene siendo utilizada con éxito en el enriquecimiento de secuencias expresadas en tipos celulares específicos posibilitando el acceso a genes principalmente de función regulatoria, representados por uno o pocos transcritos en la célula. Cuando se asocia esta técnica con metodologías de secuenciación de alta performance, la LCM enriquece el análisis de transcriptos raros y/o tejido-específico que se expresan durante la interacción patógeno-hospedero, causando impacto en la resolución del perfil de transcriptos expresados. Recientemente, la técnica de LCM, asociada a la hibridación por microarreglos, se utilizó para el estudio de la interacción entre la soja y el hongo Phakopsora pachyrhizi, utilizando el genotipo Williams 82 (Tremblay et al., 2009 y Tremblay et al., 2010). Aunque los resultados alcanzados en estos trabajos sean importantes para el conocimiento de genes expresados durante el ciclo de la roya, ambos se realizvaron utilizando la técnica de microarreglos lo que, consecuentemente, limita el acceso a genes y transcriptos aún desconocidos, principalmente del patógeno, y de algunos genes de función regulatoria tales como factores de transcripción y RNAs no codificantes. En este sentido, el principal objetivo de este trabajo fue analizar la interacción de los transcriptomas de la soja [Glycine max (L.) Merrill] y del hongo Phakopsora pachyrhizi, utilizando las técnicas de LCM y secuenciamiento de alto caudal, durante una interacción incompatible y tolerante.

Metodología A. Inoculación y diseño experimental. El experimento se instaló en Embrapa Soja, Londrina, Brasil, con un modelo de bloques totalmente al azar, con tres repeticiones (3 plantas/maceta). Una población de P. pachyrhizi se colectó en campos experimentales en el Estado de Mato Grosso, Brasil, y multiplicada por cinco generaciones en el cultivar brasilero susceptible BRSMS-Bacuri en invernadero preparado para a inoculaciones artificiales. La población vegetal de multiplicación del inóculo se cultivó a una temperatura diurna de 28 a 30ºC y una temperatura

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nocturna de 22 a 25ºC, 80% de humedad relativa ± 5% y 12 h de luz. La población fúngica utilizada fue altamente similar a un aislado de Zimbáue, de acuerdo con la amplificación y secuenciación de la región ITS del hongo (R. V. Abdelnoor, comunicación personal). Las urediniosporas se colectaron a partir de hojas infectadas sobre una bandeja plástica y se resuspendieron en agua destilada con 0,05% de Tween 20 (v/v) para una concentración final de 130.000 esporas/ml. Esta suspensión se pulverizó sobre plantas en el estadio de desarrollo V2 (FEHR & CAVINESS, 1977). La misma solución sin esporas se usó para el tratamiento de un grupo control de la infección, compuesto por una repetición del mismo material vegetal, en el mismo estadio fenológico sometido a falsas inoculaciones. Se utilizaron en este estudio los genotipos de soja resistente y un cultivar brasilero tolerante. Estos genotipos mostraron lesiones características de resistencia (marronesrojizas; “reddish-brown” o RB). Después de la inoculación, las plantas permanecieron cubiertas con bolsas plásticas rociadas con agua por 12 días, para estimular el proceso infeccioso, que necesita alta humedad, y para evitar contaminaciones cruzadas entre las muestras inoculadas y no inoculadas. Después de 13 días (312 h) de la inoculación ya fue posible observar un gran número de lesiones en las hojas de las plantas inoculadas, lo que posibilitó la recolección del material vegetal destinado a microdisección.

B. LCM y preparación del aRNA. Segmentos foliares con lesiones de aproximadamente 1cm2 se recortaron e inmediatamente se fijaron en solución de Farmer (75% etanol, 25% ácido acético). Las muestras se fijaron toda la noche y al día siguiente se deshidrataron e incluidas en parafina liquida siguiendo el procedimiento establecido por Cai y Lashbrook (2006). Se hicieron moldes para cada una de las tres repeticiones de las plantas INOC de ambos genotipos, varios segmentos foliares fueron incluidos en cada molde. Los moldes se mantuvieron congelados a -20ºC hasta que la confección de las laminas y la micro disección fuesen realizadas. Los segmentos foliares parafinizados se cortaron longitudinalmente con ayuda de un micrótomo rotatorio a un espesor de 12 µm y montados sobre láminas de vidrio tratadas con fucsina básica y “fast green”. Moldes de las tres repeticiones fueron seccionados para la confección de las láminas inmediatamente utilizadas en la LCM. La LCM fue realizada en un equipo PixCellTM system con CapSureTM Macro LCM caps (Arcturus Engineering). La duración de los pulsos varió de 150-170 ms con un diámetro de 7,5 µm (Figura 9). Cada “cap” se utilizó en la captura de células de por lo menos una lámina de cada repetición. En seguida, los “caps” se encajaron en micro tubos de 0,5ml conteniendo 30 µl de tampón de extracción del kit PicoPure RNA isolation (Arcturus Engineering) de forma que el film plástico del cap quedase en contacto con el tampón por 30 minutos en estufa a 42ºC. Después de este período de incubación las células blanco, células parenquimáticas de la hoja aisladas de los sitios de infección con el hongo, se desprenden del cap por a la solución de extracción en el microtubo y fueron almacenadas a -80ºC hasta la extracción del RNA. La extracción del RNA con el Kit PicoPure tuvo un rendimiento medio de 112ng. El mRNA fue amplificado en dos ciclos utilizando la estrategia de transcripción in vitro según las especificaciones del Kit RiboAmp HS Plus RNA amplification (Arcturus Engineering). Al final se obtuvieron aproximadamente 18µg de aRNA de las muestras. La calidad del RNA se determinó utilizando el Agilent Bioanalyzer (Agilent, Wilmington, DE, USA).

C. Secuenciamiento Aproximadamente 18µg de aRNA de cada muestra se destinaron al secuenciamiento con la plataforma Illumina Genome Analyzer GAAIIx utilizando la estrategia de “paired-ends”. Se generaron aproximadamente 15 millones de “reads” por genotipo.

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Resultados Parciales: A. Microdisección

Figura 9. Imágenes de la microdisección de las células parenquimáticas de plantas de soja infectadas com a Phakopsora pachyrhizi en cortes longitudinales (aumento de 40X). (A y D) imágenes antes de la microdissección, (B y E) imágenes después de la micro disección mostrando la región de donde las células fueron aisladas, (C y F) imagen del cap mostrando las células capturadas por la micro dissección, (G) imagem final del cap después del aislamiento de diferentes sitios de infección.

B. Secuenciamiento Los “reads” mostraron una calidad óptima, lo mismo que la extensión de 108 bases, teniendo 89,81% de las bases de cada “read” Q_30 (Figura 10). Los “reads” fueron mapeados contra el genoma de referencia (Tabla 12). Los análisis de anotación de las secuencias y determinación de sus niveles de expresión en las bibliotecas están en marcha.

Figura 10. Calidad media (Q) de los “basecalling” por base

Los “reads” de 108 pb (paired end) obtenidas a partir de los datos de RNASeq fueron analizados con apoyo del Equipo de Bioinformática del Proyecto. El genoma de la soja disponible (Glyma01) fue utilizado 19

como referencia para el anclaje de los tags en los GeneModels. La anotación fue basada en la disponible para el genoma de la soja, bien como con base en bancos de datos Públicos de secuencias de DNA (NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov) y de Proteínas [(Uniprot: http://www.uniprot.org/) y (Keeg: http://www.genome. jp/kegg/ )]. El esquema de “pipeline” utilizado se encuentra en la Figura

Figura 11. “Pipeline” utilizado para el análisis Bioinformático en la identificación de ESTs expresados en tejidos de soja después de la infección con roya asiática.

Se obtuvieron 80.255 y 52.496 “reads” de cada uno de los genotipos que después del mapeo contra el genoma de la soja permitió la identificación de 31.155 contigs/singlets expresados en tolerante y 28.120 contigs/singlets en resistente. De este total, 26.761 contigs se expresaron en ambos genotipos. Cerca de 4.854.281 reads que no se mapearon contra el genoma de la soja están siendo mapeados contra ESTs disponibles del hongo, asi como contra el genoma de la roya del trigo Puccinia graminis disponible en Bancos de Datos públicos. Al final de los análisis, se espera identificar tanto genes de la planta como del patógeno. En base a la categorización funcional de los contigs/singlets, fue posible identificar genes expresados relacionados con procesos biológicos y funciones moleculares previamente identificados en respuestas a patógenos en diferentes patosistemas, así como en la roya, como factores de transcripción, kinasas, peroxidasas y genes involucrados en la biosíntesis de fenilpropanoides, responsables de la formación de compuestos secundarios y fortalecimiento de la pared celular por producción de lignina. El elevado número de factores 2007 23/91   de transcripción y kinasas identificados sugiere intensa activación de genes e transducción de señales. Los datos obtenidos continúan siendo procesados con ayuda del programa Blast2go para obtención de informaciones detalladas sobre la función de los genes expresados en las dos bibliotecas y su distribución en rutas biológicas importantes en la interacción soja-Phakopsora pachyrhizi. Además de esto, se espera identificar genes del hongo relacionados con procesos de infección que puedan ayudar en la comprensión de los mecanismos moleculares durante la interacción planta patógeno. Los datos están disponibles en el sitio: http://bioinfo.cnpso.embrapa.br/biotecsoja/index.php.

Bibliografía BROMFIELD, K. R.; HARTWIG, E. E. Resistence to soybean rust (Phakopsora pachyrhizi) and mode of inheritance. Crop Science, v. 20. p. 254-255, 1980.

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Cai, S. & Lashbrook, C.C. 2006. Laser capture microdissection of plant cells from tapetransferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. The Plant Journal 48, 628–637. FUNDAÇÃO MT. Segunda geração da soja inox já está sendo desenvolvida. Disponível em Acesso em 23 nov. 2009. GARCIA, A.; CALVO, É. S.; KIIHL, R. A. de. S.; HARADA, A.; HIROMOTO, D. M.; VIEIRA, L. G. E. Molecular mapping of soybean rust (Phakopsora pachyrhizi) resistance genes: discovery of a novel locus and alleles. Theoretical And Applied Genetics, 2008. HARTWIG, E. E. Identification of a fourth major gene conferring resistance to soybean rust. Crop Science, Madison, v. 26, n. 6, p. 1135-1136, 1986. HARTWIG, E. E.; BROMFIELD, K. R. Relationships among 3 genes conferring specific resistance to rust in soybeans. Crop Science, Madison, v. 23, p. 237-239, 1983. LAPERUTA, L. di C; ARIAS, C. A. A; RIBEIRO, A. S; RACHID, B. F; PIEROZZI, P. H. B; TOLEDO, J. F. F de; PÍPOLO, A. E; CARNEIRO, G. E. de S. New genes conferring resistance to Asian soybean rust: allelic testing for the Rpp2 and Rpp4 loci. Pesq. Agropec. Bras, v. 43, n. 12, p. 1741-1747, dez. 2008. MILES, M. R.; FREDERICK, R. D.; HARTMAN, G. L. Evaluation of soybean germplasm for resistance to Phakopsora pachyrhizi. Plant Health Progress On line, Jan. 2006. doi:10.1094/PHP-2006-0104-01-RS. Disponível em: Aces s o 15 out. 2007. TREMBLAY A., LI S., SCHEFFLER B.E., MATTHEWS, B.F. 2009. Laser capture microdissection and expressed sequence tag analysis of uredinia formed by Phakopsora pachyrhizi, the causal agent of Asian soybean rust. Physiol. Mol. Plant Pathol. 73, 163–174. TREMBLAY A., HOSSEINI, P., ALKHAROUF N.W., LI S., MATTHEWS B.F. 2010.Transcriptome analysis of a compatible response by Glycine max to Phakopsora pachyrhizi infection. Plant Science, 179, 183–193. 2.2.8. Estudio de la interacción soja/Phakopsora por medio de la técnica de cDNA-AFLP.

EEAOC Se realizó una inoculación, en condiciones controladas en un invernadero, sobre los genotipos resistente y susceptible, con inóculo de Brasil. Se colectaron muestras en 6 tiempos diferentes: 6 hs, 12hs, 24 hs, 72 hs, 96hs y 192 hs incluyendo cuatro tratamientos: 1) resistente inoculada, 2) resistente no inoculada (control), 3) susceptible inoculada y 4) susceptible no inoculada (control) con tres repeticiones de cada tratamiento. Se realizó la extracción del RNA total en el laboratorio del EMBRAPA y las muestras se trasladaron hasta Tucumán en alcohol y en hielo. En el laboratorio de la EEAOC se hizo la limpieza del RNA y se verificó su calidad y cantidad. En estos momentos se está sintetizando el cDNA a partir del ARN mensajero purificado con perlitas magnéticas. Este cDNA se cuantificará para posteriormente analizarlo con la técnica de AFLP. 2.2.9. Estudio de la interacción soja/Phakopsora por medio de la técnica de microRNAs.

UBA Se llevaron a cabo en EMBRAPA Soja (Londrina, Brasil) en colaboración con la investigadora Francismar Correa ensayos de infección con Phakopsora pachyrhizi en los cultivares resistentes y susceptibles al patógeno. Se extrajo ARN total de tejido a las 6, 12, 24,72, 94 y 192 h post inoculación. Se evaluó la integridad del ARN extraído y se procedió al enriquecimiento en ARNs pequeños para el posterior análisis de los niveles de expresión de microRNAs. Se ha iniciado el estudio en conjunto con INDEAR para la puesta 21

a punto de la secuenciación de microRNAs utilizando la plataforma de secuenciación Roche 454 GS-FLX y como estrategia la obtención de bibliotecas de concatémeros. Paralelamente se llevó a cabo un ensayo de infección realizado en el CRIAEncarnación-Paraguay en colaboración con el Investigador Wilfrido Morel utilizando diferentes variedades de soja susceptibles y resistentes al patógeno. Estas muestras fueron procesadas en forma semejante a las anteriores para su el análisis de los niveles de expresión de microRNAs. A su vez se analizó en estos ensayos la expresión de diferentes genes de Phakopsora pachyrhizi identificados por screening in silico de bibliotecas de EST realizado en colaboración con el Dr. Patricio Yankilevich (INDEAR). Basados en información bibliográfica de estudios realizados en otros fitopatógenos fúngicos se seleccionó un conjunto de secuencias génicas potencialmente relevantes para la patogenicidad, con el fin de llevar a cabo experimentos de RT-PCR semicuantitativa sobre cDNA proveniente de interacciones Phakopsora pachyrhizi/ soja. Resultados preliminares muestran que aquellos genes que codifican enzimas degradadoras de pared presentan una máxima expresión a las 3hs post-infección, mientras que la expresión de otro gen presenta una expresión máxima a las 24 hs post-infección. 2.2.10. Caracterización de perfiles metabólicos de plantas de soja en respuesta a inoculación con el patógeno Phakopsora pachyrhizi.

INTA Castelar Diseño del experimento para evaluar cambios en perfiles metabólicos de plantas de sojas resistentes y susceptibles al patógeno Phakopsora pachyrhizi: A partir de información previa disponible de evaluación de cultivares resistentes (R) y susceptibles (S) al patógeno, se seleccionaron los cultivares resistentes y susceptible para conducir experimentos de análisis transcrptómico y metabolómico en forma simultanea y bajo las mismas condiciones experimentales con el fin de poder evaluar en forma concertada los cambios ocurridos tanto en interacciones hospedante-patógeno compatibles como incompatibles. El experimento se realizó en invernáculo en condiciones controladas de luz, temperatura y humedad en EMBRAPA Soja, Londrina, Brasil. El ensayo se condujo en macetas con dos plantas cada una. En el estadio V2-V3 las plántulas fueron inoculadas con el patógeno o solo asperjadas con agua (mock inoculadas) y se tomaron muestras de 100 mg de tejido a las 6, 12, 24,72, 94 y 192 h post inoculación que se utilizarán para estudios a realizarse por los siguientes socios de la acción: -INTA Cautelar: Para el análisis de perfiles metabólicos se tomaron seis replicas biológicas por muestreo (Figura 12). Las muestras han sido liofilizadas para su procesamiento en el Instituto de Biotecnología INTA Castelar. La inoculación y colecta de muestras se realizó durante el mes de noviembre de 2009. -EMBRAPA soja: microdisección láser para estudios de expresión genética. A partir de este tejido generar secuencias de ESTS por piroseceucniación. -EEAOC: estudio de la expresión genética mediante cDNA-AFLP. -El Instituto Clemente Estable, INTA Castelar, FCEyN-UBA realizarán colecciones de cDNA substractivas por la técnica SSH. -FCEN-UBA: estudio de la expresión de micro RNAs de soja. Las muestras de ARN han sido liofilizadas para su procesamiento en el Laboratorio de Agrobiotecnología, FCEN, UBA en colaboración con el grupo de investigación de la UFRGS.

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Figura 12: diseño del experimento de metabolómica para identificación de alteración de rutas metabólicas en un genotipo resistente y uno susceptible en respuesta a la infección del patógeno (I) tanto en interacciones compatibles como incompatibles en comparación con plantas no inoculadas (NI)

Validación de protocolo para identificación de metabolitos por la técnica GC-MS: a fin de determinar las condiciones óptimas de procesamiento de muestra, estado y cantidad optima de material vegetal, protocolo d extracción de metabolitos, volumen de inyección y derivatización para su posterior análisis por GC-MS, se procedió a validar el protocolo experimental a partir de hojas del cultivar susceptible control utilizando el método descrito previamente para hojas de Arabidopsis, papa y frutos tomate (Lytovchenko et al. 2002; Roessner et al 2003) y ajustado recientemente por el grupo de trabajo de INTA Castelar para girasol (Peluffo et al 2009). Se realizaron extracciones a partir de tejido fresco y liofilizado y se derivatizaron e inyectaron en un equipo GC-MS (LECO, EUA) dos volúmenes de extracto (2.5 y 5 % [v/v]) para evaluar abundancia relativa de metabolitos en las muestras (Figura 13).

Figura 13: Ejemplo de perfil metabólico de extractos de hoja de soja, cultivar BRS 184 para optimización del protocolo de extracción, cantidad y estado de muestra a utilizar y volumen de inyección.

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Validación del protocolo de análisis de metabolitos en soja por GC-MS. Se realizó un experimento para evaluar cambios en perfiles metabólicos de plantas de soja resistentes y susceptibles al patógeno Phakopsora pachyrhizi. Como primer paso para la validación del protocolo para identificación de metabolitos en soja por la técnica GC-MS se realizaron extracciones de material vegetal de ambos genotipos, cultivadas en el Invernáculo del Instituto de Biotecnología en condiciones similares a las del ensayo conducido en Londrina, pero sin inoculación con el patógeno. El tejido de ambos genotipos se liofilizó previamente para imitar las condiciones de las muestras del experimento de Brasil. Se tomaron 3 variantes de masa inicial de tejido: Tejidos liofilizado 10 mg 25 mg 35 mg

Equivalen a mg Tejido fresco 100 mg 250 mg 350 mg

Se tomaron 3 variantes de volumen a secar: - 150 ul - 200 ul - 300 ul Para cada genotipo y masa se hicieron 4 réplicas de cada volumen (2 para hacer la corrida común y la de azúcares en el GC, y 2 más de backup) siguiendo el protocolo descrito previamente para hojas de Arabidopsis, papa y frutos tomate (Lytovchenko et al. 2002; Roessner et al 2003) y ajustado recientemente por el grupo de trabajo de INTA Castelar para girasol (Peluffo et al, 2010).

Selección de tiempos post inoculación para evaluación por GC-MS: La información disponible a nivel de perfiles de expresión realizadas en plantas de soja en respuesta a Phakopsora pachyrhizi, por análisis de microarray muestran un patrón de expresión de tipo bifásico, con un aumento temprano entre las 6 y 36 hs post inoculación, una caída a las 24-72 hs y un nuevo aumento a las 72-168 hs post inoculación (van de Mortel et al. 2007). Atendiendo a este patrón de expresión, los estudios de análisis metabolómicos se focalizaron en dos etapas del proceso de infección. En tiempos tempranos: 6 y 12 hs post infección (en concordancia con la primera etapa de aumento de expresión) y un tiempo tardío, 96 hs (en concordancia con un tiempo tardío de expresión).

Extracción y derivatización de muestras para análisis por GC-MS A partir del tejido liofilizado, se pesaron 100 mg de cada replica biológica (1 a 6) de muestras colectadas a los 6, 12 y 96 días post inoculación con el patógeno (I) y de muestras inoculadas con agua (NI) para el genotipo (R) y (S). En total se procesaron 72 muestras. El tejido liofilizado fue procesado y homogenizado por molido en frío y transferido a un tubo eppendorf de 2 ml. A cada muestra se le adicionaron 1400 µl de metanol 100% y 60 µl de un stock de Ribitol (0,2 mg/ml solución stock en agua) como control interno de masa. Se agitó por 15 minutos en vortex a 70ºC, se centrifugaron 10 minutos a 14.000 rpm a temperatura ambiente, se transfirió la fase acuosa a un vial de vidrio. Se adicionaron 750 µl de cloroformo y 1.500 µl de H2O, se agitó en vortex 15 s y se centrifugó 15 minutos a 4000 rpm. La fase polar (100 µl o 40 µl) se transfirió a un nuevo tubo. Las muestras fueron concentradas en frío, se les agregó Argón y se congelaron a -80º C. Las muestras derivatizadas se analizaron por GC.MS en el Centro “Metabolomic Discoveries” Potsdam, Alemania, utilizando controles de referencia. Las muestras se analizaron en un equipo PEGASUS (LECO, USA).

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Análisis de datos Los cromatogramas y espectros obtenidos se evaluaron con el programa MASSLAB (ThermoQuest, Manchester, UK). Los niveles de los metabolitos detectados fueron normalizados por tiempo de retención y masa inicial de muestra. Se identificaron 123 metabolitos por comparación con bases de datos y por comparación individual de espectros para cada uno de ellos. Estos metabolitos pudieron cuantificarse para identificar diferencias entre genotipos, tratamientos y días post inoculación. Asimismo se encontraron otros 96 metabolitos que no pudieron ser identificados por no estar representados en las base de datos de metabolitos disponibles actualmente. Un análisis preliminar de los niveles de un grupo de 23 metabolitos seleccionados en base al rol de los mismos en este y otros sistema hospedante-patógeno, a través de análisis de varianza (ANOVA), de tres factores, con efectos fijos, permitió identificar algunos cambios en los niveles de estos metabolitos entre genotipos, días post infección y tratamientos, como también interacciones entre estos factores. Estos resultados derivan de un análisis preliminar de los perfiles metabólicos obtenidos recientemente. A partir del análisis concertado de todos los metabolitos identificados en este sistema, se podrán identificar rutas metabólicas claves involucradas en la respuesta a Phakopsora pachyrhizi. La identificación de patrones de metabolitos diferenciales entre genotipos contribuirá a la selección de biomarcadores, útiles no sólo para la selección de genes candidatos robustos, a través de la integración de perfiles metabólicos y perfiles transcripcionales, sino también para la generación de herramientas alternativas para la selección de genotipos resistentes, a través de estrategias de ingeniería metabólica.

Bibliografía Lytovchenko, A., Bieberich, K., Willmitzer, L., Fernie, A.R., 2002. Carbon assimilation and metabolism in potato leaves deficient in plastidial phosphoglucomutase. Planta 215, 802– 811. Peluffo L, Lia V, Troglia C, Maringolo C, Paniego N, Escande A, Hopp H.E, Lytovchenko A, Fernie A.R, Heinz R.A, Carrari F (2009). Metabolic profiles of sunflower genotypes with contrasting response to Sclerotinia sclerotiorum infection. Phytochemistry 71 (70–80). Roessner-Tunali, U., Hegemann, B., Lytovchenko, A., Carrari, F., Bruedigam, C., Granot, D., Fernie, A.R., 2003. Metabolic profiling of transgenic tomato plants overexpressing hexokinase reveals that the influence of hexose phosphorylation diminishes during fruit development. Plant Physiol. 133, 84–99. van de Mortel M., Reckno J., Graham M.A, Nettleton D, Dittman J., Nelson R., Godoy C., Abdelnoor R., Almeida A., Baum T., and Whitham S. (2007). Distinct Biphasic mRNA Changes in Response to Asian Soybean Rust Infection. MPMI 20, 8, 887–899. 2.2.11. Caracterización molecular de aislados de Phakopsora pachyrhizi provenientes del MERCOSUR.

EEAOC En el marco del proyecto BiotecSur se optimizó un protocolo para la extracción de ADN a partir de esporas de Phakopsora sp. Se colectaron uredinosporas a partir de hojas de soja y kudzú (K) con síntomas típicos de la enfermedad. Se procesaron muestras provenientes de Argentina de las provincias de Tucumán (Un), Salta (Mosconi: Mo) y Misiones (MS), también se incluyeron muestras de Paraguay (1P, 2P, 3P, 4P, 5P, PL2, PL5, VP, PV, SA, CC, CRIA), de Brasil (MT, RS, PR, BA) y Uruguay (RU1, RU2, RU3, RU6). La identificación del género y la especie de las muestras se realizó por amplificación por PCR usando cebadores desarrollados para ese fin. En todos los casos se confirmó que las muestras procesadas correspondían a Phakopsora pachyrhizi. Posteriormente, se ajustó la técnica de AFLP para estudiar la diversidad genética y con 34 combinaciones de cebadores, de las 64 posibles, se obtuvieron amplificaciones de buena calidad que mostraron alta diversidad genética en las muestras analizadas (Tabla 4). Se obtuvieron 1581 bandas amplificadas en todos los genotipos, a partir de estos datos se generó una matriz binaria tomando en

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cuenta la presencia (1) y ausencia (0) de las mismas. La matriz se cargó en el programa INFOGEN y se calcularon las distancias genéticas entre los aislados usando el coeficiente de similitud de Jaccard. El resultado se observa en la figura 14.

Tabla 4. Combinaciones de cebadores utilizados en los estudios de P. pachyrhizi.

Combinaciones que produjeron amplificaciones. Combinaciones que no produjeron amplificaciones.

Figura 14. Dendrograma que muestra las similitudes entre aislados de Phakopsora pachiryzhi detectada con 34 combinaciones de cebadores AFLP.

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2.3. PODREDUMBRE CARBONOSA 2.3.1. Fenotipado de la resistencia a podredumbre carbonosa (Macrophomina phaseolina). Se ajustó un procedimiento para la producción de micro esclerocios que se utilizaron para inocular los ensayos a campo y condiciones controladas como se detalla a continuación. Colocar 4000 ml de semillas de milleto o arroz integral, agregar 40 g de azúcar, 0,5 g de extracto de levadura y 1 g ácido tartárico. Llevar con agua destilada a volumen final de 5 litros, dejar en remojo durante 24 h y esterilizar en autoclave durante 30 minutos a 115ºC. Dejar enfriar y colocar porciones de micelio de Macrophomina phaseolina crecido en PDA, mezclar bien e incubar en estufa a 30°C durante 20 días para el desarrollo de los esclerocios.

(A) Evaluaciones a campo En base a reuniones previas mantenidas por los integrantes del Consorcio, fueron cedidos al BiotecSojaSur ensayos del CRIA (Paraguay) y del INTA Balcarce (Argentina), que se iniciaron antes del otorgamiento del Proyecto. Los resultados de los mismos estarán disponibles hacia fines de agosto del corriente año. El listado de los genotipos evaluados en Paraguay se muestra en la Tabla 5. La siembra se realizó en surcos de 1 m de largo con 4 repeticiones por cada genotipo. Al momento de la siembra se agregaron 1,5 g de la mezcla de semillas de milleto con esclerocios por cada metro de surco. Las evaluaciones se encuentran en marcha en base a una estimación visual del nivel de severidad. La escala va del 1 al 5, como se describe en la Figura 15. Se consideran 5 plantas por cada genotipo en estado reproductivo (R7). Se registra la severidad en el tallo y se analiza el índice de unidades formadoras de colonias (IUFC) de acuerdo a la siguiente escala (ver Figura 15): • Inmune (0) • resistente (1 a 30 a 60) • susceptible (>60) RR

CONVENCIONAL

13

CD -233 COODETEC

29

CD -214 COODETEC

45 CD -216 COODETEC

1

MK- SPRING SYNGENTA

14

DALIA 500

30

BRS -245

46 A 5543 NIDERA

2

NK- 3363 SYNGENTA

15

NA 5909 NIDERA

31

CD -225 COODETEC

47 BRS 246

3

NK- 2555 SYNGENTA

16

BRS 256

32

MARIA 54

48 CD -221 COODETEC

4

BRS -282

17

CD 235 COODETEC

33

FT 10 A

49 NA 5509

5

BRS -185

18

TMG 4001

34

MUNASGA 8.4

50 BRS 243

6

FT -FENIX

19

NA 4990 NIDERA

35

BRS -255

51 CD -231 COODETEC

7

BRS -154

20

CD 226 CO0DETEC

36

NA 5009 NIDERA

52 CANDELA 5.7

8

BRS -283

21

NUEVA MARIA 55

37

IGRA 516

53 IGRA 629

9

BRS -156

22

A 4910 NIDERA

38

BRS -242

54 ANDREA 6.6

10

BRS -284

23

A 6411 NIDERA

39

A 5920 NIDERA

55 8000 NIDERA

11

BRS -268

24

IGRA 518 IGRA

40

NA 6126

56 5.7 I DON MARIO

12

V- MAX

25

DALIA 700

41

FT CASCAVEL

57 5.1 I DON MARIO

26

A 7321 RG NIDERA

42

NA 8009 NIDERA

58 7.0 I DON MARIO

27

NUEVA MERCEDES 70

43

NA 5209 NIDERA

28

A 7118 NIDERA

44

FT CAMPO MOURAO

Tabla 5. Listado de materiales evaluados en Capitán Miranda, Paraguay durante la campaña 2009.

27

Figura 15: Escala de severidad de los daños causados por Macrophomina phaseolina en soja.

Figura 16. Placas con los diferentes Índices de Unidades Formadoras de Colonias (IUFC). 1: inmune, 2: resistente, 3: moderadamente resistente, 4: moderadamente susceptible y 5: susceptible.

Aislamiento en el laboratorio. Cuando las plantas alcanzaron la etapa reproductiva (R7) se cortaron las mismas a una altura de 10 cm, se secaron y se molieron, tanto raíz como tallo de cada muestra. Una vez terminada la molienda se colocaron en un tubo de ensayo para el posterior análisis en el medio de cultivo en el laboratorio. Las muestras molidas se desinfectaron con hipoclorito de sodio tres veces durante 1 minuto y se lavaron con agua estéril para remover el desinfectante. Las muestras a ser aisladas dispersaron sobre medio de cultivo PDA adicionado con antibiótico (Rifampimicina 0,5 g/50 ml de PDA) para eliminar contaminantes indeseables. Se utilizaron placas de petri con 5 ml del medio de cultivo donde se sembraron 0.005 g de raíz molida por cada muestra. La incubación se hizo a una temperatura de 30°C por un período de entre 4-5 días para el desarrollo de las colonias. El desarrollo de colonias en el medio, determinó el nivel de resistencia de cada material genético estudiado. En la tabla 15 podemos observar los resultados obtenidos, En Argentina se realizaron evaluaciones a campo en las localidades de Reconquista (Santa Fe), Presidente Roque Sáenz Peña (Chaco) y Anguil (La Pampa). El listado de los genotipos utilizados se muestra en la Tabla 6.

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Localidad: Reconquista (Santa Fe) y P.R.S. Peña (Chaco) * 1 Relmó 2 Don Mario 3 Relmó 4 EEAOC 5 Nidera 6 Nidera 7 Santa Rosa 8 Santa Rosa 9 Santa Rosa 10 La Tijereta 11 La Tijereta

Localidad: Anguil (La Pampa) ** 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Nidera Nidera ACA Relmó Don Mario Don Mario Don Mario SPS SPS SPS

Tabla 6. Listado de genotipos evaluados en Argentina para resistencia/susceptibilidad a podredumbre carbonosa.

Evaluación en laboratorio de genotipos sembrados en ensayos de campo de Argentina, campaña 2009/2010. En INTA Balcarce se realizó la determinación de UFC/g de tejido radical de las muestras provenientes de tres localidades de Argentina en la campaña 2009/2010 según la metodología publicada por Mengistu et al. (2007). Pese a los bajos valores de severidad registrados en el campo, se pudieron detectar UFC y elaborar el índice relativo de la campaña 2009/2010 en cada sitio. En la Tabla 18 se muestran los resultados del comportamiento relativo de los genotipos usados en cada localidad en Argentina, y a modo comparativo, se incluyen los resultados obtenidos para los genotipos usados en común con el CRIA de Paraguay en las últimas dos campañas de campo.

(B) Bajo condiciones controladas Se realizaron infecciones con Macrophomina sobre semillas, cotiledones y plántulas de soja en el INTA Balcarce (ver Figura 17). Los resultados obtenidos no fueron concluyentes y se continúa trabajando en esta línea para ajustar un protocolo definitivo.

Figura 17. Métodos de evaluación (de izquierda a derecha) en: cotiledones, semillas y plántulas de soja infectadas con Macrophomina phaseolina.

En un futuro cercano, se conducirán ensayos de hidroponía para valorar la interacción entre la resistencia/susceptibilidad a podredumbre carbonosa y el estrés hídrico.

29

2.3.2. Inoculaciones de soja con Macrophomina phaseolina en maceta y caracterización molecular de aislados.

EEAOC Se realizaron ensayos en condiciones semi controladas, en invernadero de la Sección Biotecnología de la EEAOC, usando dos genotipos de soja con respuesta contrastante, en ensayos de campo, a la infección con Macrophomina phaseolina.

Genotipos: susceptible y resistente Tratamientos: 1-Sequía + Macrophomina phaseolina 2-Sequía 3-Macrophomina phaseolina 4-Control Se realizaron 4 repeticiones por tratamientos y 3 bloques. Sustrato: se utilizó suelo de la localidad Monte Redondo, Tucumán mezclado con arena (3:1), se adicionó superfosfato triple y se esterilizó en autoclave. Macetas: de PVC de 10 cm de diámetro y 33 cm de altura. Cada maceta se llenó con aproximadamente 3000 g de sustrato. Inoculación: se realizó colocando 3 granos de arroz colonizados por el patógeno por cada semilla de soja al momento de la siembra. Se sembró una semilla por maceta. Se utilizó el aislado Mp Nº 31, proveniente de la localidad de Monte Redondo de Tucumán. En la figura 18 se muestran fotos del ensayo. A partir de este experimento se pudieron recuperar unidades formadoras de colonias del genotipo tolerante inoculado con M. phaseolina. Sin embrago, las plantas del genotipo susceptible mostraron problemas de desarrollo y los análisis fitopatológicos evidenciaron que las semillas estaban contaminadas con Fusarium sp. Para solucionar estos inconvenientes se procedió a obtener semilla nueva de alta calidad sanitaria para repetir estos ensayos.

Figura 18. Fotografía de los ensayos bajo condiciones de invernadero de dos genotipos contrastante en su respuesta a M. phaseolina. A) Ensayo al momento de la siembra. B) vista general del ensayo tres meses después de la siembra. C) comparación del estado de las plantas con riego óptimo (derecha) y plantas en estrés hídrico inoculadas con el hongo. D) Lavado de las plantas antes de la desinfección y posterior siembra para contabilizar unidades formadoras de colonias.

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