CAPÍTULO 2.10.7.

ENCEFALITIS DEL OESTE DEL NILO

RESUMEN El virus del Oeste del Nilo (WNV) es un miembro del género Flavivirus de la familia Flaviviridae. El arbovirus se mantiene en la naturaleza a través de aves y mosquitos; numerosas especies de aves y de mosquitos permiten la replicación del virus. En muchas especies de aves, la infección por WNV no produce síntomas evidentes mientras que en otras, como el cuervo americano (Corvus brachirhynchos) y el arrendajo azul (Cyanocitta cristata) la enfermedad es generalizada y mortal. Entre los mamíferos, la enfermedad clínica se muestra primariamente en caballos y humanos. Los síntomas clínicos de infección por WNV en caballos derivan de la encefalitis inducida por virus o encefalomielitis. Las infecciones dependen de la transmisión del mosquito y son estacionales en climas templados, alcanzando el máximo a comienzos de otoño en el Hemisferio Norte. Los caballos afectados muestran frecuentemente una ataxia benigna o grave. Los síntomas pueden variar desde ligera descoordinación hasta postración. Algunos caballos muestran debilidad, fasciculación muscular y problemas en los nervios craneales. La fiebre no es una característica normalmente presente en la enfermedad de los caballos. Identificación del agente: Los tejidos de aves contienen generalmente concentraciones más altas del virus que los de los caballos. El cerebro y la médula espinal son los tejidos preferidos para el aislamiento del virus en los caballos. En las aves, el riñón, corazón, cerebro o intestino pueden proporcionar aislamientos de virus. Los cultivos celulares (por ejemplo, de riñón de conejo o de células Vero) se usan frecuentemente para el aislamiento del virus. El WNV es citopático en sistemas de cultivo susceptibles. Se pueden detectar el ácido nucleico vírico y los antígenos víricos en tejidos de animales infectados, por la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (PCR–RT) o por inmunohistoquímica, respectivamente. El método más sensible para identificar WNV en tejidos equinos es un procedimiento de PCR–RT con formato anidado. Pruebas serológicas: El anticuerpo se puede identificar en el suero equino por enzimoinmunoensayo con IgM de captura (ELISA con IgM de captura), inhibición de la hemaglutinación (IH), ELISA con IgG o neutralización por reducción de calvas (NRC). Los métodos IH y el RNP son los que se usan con más frecuencia para identificar anticuerpos de EON en suero de aves. En algunas pruebas serológicas, se pueden encontrar reacciones cruzadas del anticuerpo con flavovirus relacionados, tales como el virus de la encefalitis de St. Louis o el virus de la encefalitis japonesa. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Existen disponibles una vacuna de WNV inactivada con formalina derivada de cultivo de tejido y una vacuna de WNV con vectores de canarypoxvirus vivos para uso en caballos.

A. INTRODUCCIÓN El virus del Oeste del Nilo (WNV) es un arbovirus zoonósico transmitido por mosquitos que pertenece al género Flavivirus de la familia Flaviviridae. El género Flavivirus incluye el virus de la encefalitis japonesa (ver Capítulo 2.5.14), el virus de la encefalitis de St. Louis, y el virus Kunjin, entre otros (5). El WNV tiene un campo geográfico amplio que incluye partes de Europa, Asia, Africa, Australia y Norteamérica. Se cree que las aves migratorias son las responsables de la dispersión del virus, incluyendo la reintroducción del WNV de áreas endémicas a regiones que experimentan brotes esporádicos (5). El WNV se mantiene por un ciclo de transmisión mosquito-pájaromosquito, mientras que los humanos y los caballos se consideran hospedadores finales. El análisis genético de los aislados de EON divide las cepas en dos clases. Los aislados del linaje 1 se encuentran en África central y

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del norte, Israel, Europa, India, Australia (virus de Kunjin) y América del Norte. Las cepas del linaje 2 son endémicas en África central y del Sur y de Madagascar, con co–circulación de los linajes de ambos virus en África Central (2, 6). Mientras que los brotes recientes en humanos y en equinos se deben a virus del linaje 1, cepas de ambos linajes han estado implicadas en la enfermedad de humanos y de animales. El WNV se ha reconocido como un patógeno humano en África durante la primera mitad del siglo 20. Aunque se han descrito varias epidemias de fiebre por EON, antes de 1996 la encefalitis como consecuencia de la infección humana por EON era rara, pero desde entonces, los brotes de encefalitis del Oeste del Nilo se han descrito en humanos en Rumania, Rusia, Israel y Norteamérica (3, 10, 11). Durante los años 1960, la encefalitis del Oeste del Nilo de caballos se describió en Egipto y Francia (17, 19). Desde 1998, se han descrito brotes de encefalitis equina por EON en Italia, Francia y Norteamérica (7, 14, 15). En Norteamérica, de 1999 a 2002, se extendió ampliamente desde una pequeña región a toda costa Este del estado de Nueva York hasta incluir la mayor parte de los Estados Continentales de América (EE.UU.) y Canadá, con un número creciente de caballos y aves salvajes afectados cada año (15, 16, 22). El periodo de incubación de la encefalitis equina por EON después de la transmisión del mosquito es de 3– 15 días. Una rápida viremia de baja titulación precede la aparición clínica (4, 19). La encefalitis por EON tiene lugar en un porcentaje pequeño de caballos infectados; la mayor parte de los infectados no exhibe síntomas clínicos (15). La enfermedad en caballos se caracteriza frecuentemente por ataxia suave o grave. Además, los caballos pueden mostrar debilidad, fasciculación muscular y problemas en los nervios craneales (7, 15, 16, 20). La fiebre no es una característica siempre presente. El tratamiento es de mantenimiento y los síntomas pueden solucionarse o progresar hasta la postración terminal. La tasa de mortalidad es aproximadamente de uno de cada tres caballos afectados clínicamente. El diagnóstico diferencial incluye otras encefalitis arbovíricas (por ejemplo la encefalomielitis equina venezolana, del este o del oeste, la encefalitis japonesa) la mielitis equina por protozoos (Sarcocystis neurona), el herpesvirus–1 equino, la enfermedad de Borna y la rabia. Aunque muchas especies de aves, incluyendo los pollos, son resistentes a la enfermedad, el resultado de la infección es generalmente mortal en aves susceptibles. Las aves pueden mostrar síntomas neurológicos antes de la muerte (21). El WNV se ha detectado como enfermedad esporádica en un número pequeño de otras especies, incluyendo ardillas, ardillas listadas, murciélagos, perros, gatos, renos, ovejas, alpacas, caimanes y focas coincidiendo la enfermedad con periodos intensos de actividad vírica. La mayoría de las infecciones en humanos se producen por transmisión natural de los mosquitos, pero se han descrito infecciones adquiridas en el laboratorio. En casos clínicos sospechosos, las muestras de diagnóstico de todos los animales, particularmente aves, deberían manejarse a nivel 3 de contención siguiendo procedimientos de laboratorio apropiados (ver Capítulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología) (18). Debido a la presencia de infecciones de EON no aparentes, los criterios de diagnóstico deben incluir una combinación de evaluación clínica y pruebas de laboratorio.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

a)

Cultivo Las muestras para el aislamiento del virus incluyen el cerebro y la médula espinal de caballos encefalíticos (15, 16); para tener éxito se debe utilizar una variedad de tejidos de aves incluyendo el corazón, cerebro e intestino (21). En general, los aislados de virus se obtienen más fácilmente de las muestras aviares. Los virus pueden propagarse en cultivos celulares susceptibles, tales como riñón de conejo (RK–13) y células de riñón de mono verde africano (Vero), o en huevos de pollo embrionados. Es menos probable que las inoculaciones intracerebrales de ratones recién nacidos produzcan aislamientos de virus en tejidos de mamíferos que los métodos de cultivo celular. Puede necesitarse más de un pase de cultivo celular para observar efecto citopático (EC). La confirmación de aislados de WNV se logra mediante tinción indirecta con anticuerpos fluorescentes de cultivos infectados o por métodos de detección del ácido nucleico (ver más adelante)

b)

Métodos inmunológicos La tinción inmunohistoquímica (TH) de tejidos aviares fijados con formalina es un método fiable para la identificación de infección por EON en aves. La especificidad de la identificación (por ejemplo flavivirus– específico o WNV–específico) depende de la selección del anticuerpo detector. Los tejidos de cerebro y la médula espinal de caballos con encefalitis por EON son positivos de modo irregular en pruebas de IHC; aproximadamente el 50% de los casos de encefalitis equina por EON producen resultados falsos negativos. La imposibilidad de identificar antígenos de WNV en el sistema nervioso central equino no excluye la infección.

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c)

Métodos de reconocimiento del ácido nucleico La detección del ácido nucleico por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (PCR– RT) aumenta significativamente la identificación de tejidos infectados por WNV, particularmente cuando se aplica la PCR anidada a muestras frescas, sin fijar, de cerebro y de médula espinal de caballos (12). El método de la PRC–RT anidada para detectar ácido nucleico de WNV que codifica una porción del gen E se describe a continuación. Este método se desarrolló utilizando un aislado de Norteamérica 1999 y ha resultado eficaz para detectar ARN de WNV en tejidos animales durante brotes recientes en Norteamérica. El virus de la encefalitis de St. Louis no se detecta por este método. Los virus del Oeste del Nilo del linaje 1 de China (República Popular de), Francia, Egipto, Israel, Italia, Kenia, México y Rusia muestran una secuencia de nucleótidos altamente conservada en la región diana, independientemente de la especies de origen. El análisis de la información de la secuencia para la cepa del linaje 2 de Uganda 1937 (Banco de Genes M12294) en la región marcada por los cebadores de la PCR indica que no es de esperar que ocurra la amplificación de las cepas del linaje 2 de WNV. No se han examinado otros virus del serogrupo de la encefalitis japonesa. Los métodos no anidados, incluyendo la PCR en tiempo real, tienen menos riesgo de contaminación cruzada en el laboratorio y pueden aplicarse con éxito a las muestras de tejido de aves (13). Los tejidos seleccionados para PCR son los mismos que los seleccionados para los intentos de aislamiento del virus. •

Procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa anidada por transcripción inversa (RT—mPCR)

La RT–nPCR aquí descrita incluye varios procedimientos: extracción de ARN, transcripción inversa para generar ADN de ARN y el primer paso de la PCR, el segundo paso de la PCR utilizando cebadores "anidados" y, finalmente, la detección de un amplicon de tamaño apropiado por electroforesis en gel. Las regiones del gen de la proteína E de EON de 445 bp (pares de bases) y 248 bp se amplifican en el primer paso y en los procedimientos de anidación, respectivamente. Los kits y reactivos descritos a continuación se proporcionan como un ejemplo. Pueden existir productos equivalentes de otras fuentes. Se requiere un cuidado extremo en el manejo de todos los materiales y es esencial la inclusión de los controles adecuados para asegurar los resultados precisos. Las precauciones que hay que tomar se han descrito en el Capítulo I.1.4. Validación y Control de Calidad de los Métodos de Reacción en Cadena de la Polimerasa utilizados para el Diagnóstico de Enfermedades Infecciosas. Se debe procesar y analizar por duplicado cada muestra de diagnóstico para aumentar la confianza en los resultados de la prueba. Se deben tener las precauciones oportunas cuando se manejen reactivos de riesgo como el bromuro de etidio. •

Extracción del ARN vírico

Extraer el ARN total de 50 a 100 mg de tejido utilizando reactivo Trizol® (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Extraer también ARN total del stock control de virus EON conteniendo 10–100 dosis infectivas de cultivo de tejido (DICT50) por 100 µl de volumen. •

Trascripción inversa y primera fase de PCR Cebadores de la primera fase: 1401: 5’–ACC–AAC–TAC–TGT–GGA–GTC–3’ 1845: 5’–TTC–CAT–CTT–CAC–TCT–ACA–CT–3’

i)

Suspender las muestras de ARN extraído en 12 µl de ARNasa libre de agua.

ii)

Desnaturalizar a 70°C durante 10 minutos.

iii)

Añadir 2 µl de cada muestra de ARN a 48 µl de mezcla para RT–PCR que tiene una composición final de: 10 mM Tris/HCl, pH 8,3 50 mM KCl 2,0 mM MgCl2 0,8 mM del conjunto de deoxinucleósidos trifosfato (dNTP) 25 unidades de RT de M–MLV (transcriptasa inversa del virus Moloney de la leucemia murina) 1,25 unidades de inhibidor de la ARNase 1,25 unidades de AmpliTaq GoldTM (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) 37.5 pmol de los cebadores de la primera fase. Incluir controles "sin ARN" usando 2 µl de ARNasa libre de agua en vez de ARN desnaturalizado.

iv)

Incubar los tubos de reacción a 45°C durante 45 minutos.

v)

Incubar los tubos de reacción a 95°C durante 11 minutos.

vi)

Amplificación por PCR durante 35 ciclos. Desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, Anillamiento del cebador a 55°C durante 45 segundos,

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Extensión del cebador a 72°C durante 60 segundos (al ciclo 35, extensión del cebador a 72°C durante 5 minutos). vii)

Mantener las muestras a 4°C hasta la segunda fase de la PCR.

•

Segunda fase (anidada) de PCR Cebadores de la segunda fase: 1485: 5’–GCC–TTC–ATA–CAC–ACT–AAA–G–3’ 5’–CCA–ATG–CTA–TCA–CAG–ACT–3’

i)

Para cada muestra y el control, añadir 1.5 µl del producto amplificado de la primera fase a 48,5 µl de mezcla PCR con una composición final de: 10 mM Tris/HCl, pH 8,3 50 mM KCl 2,0 mM MgCl2 0,8 mM del conjunto de deoxinucleósidos trifosfato (dNTP) 1,25 unidades de AmpliTaq GoldTM (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) 37,5 pmol de cada uno de los cebadores anidados.

ii)

Incubar los tubos de reacción a 95°C durante 11 minutos.

iii)

Amplificación por PCR durante 35 ciclos: Desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, Anillamiento del cebador a 55°C durante 45 segundos, Extensión del cebador a 72°C durante 60 segundos (al ciclo 35, extensión del cebador a 72°C durante 5 minutos).

iv)

Mantener las muestras a 4°C o –20°C hasta la electroforesis.

•

Análisis de los productos de PCR por electroforesis en gel

i)

Preparar una solución al 2,5% de agarosa NuSieve® 3/1 (FMC Bioproducts, Rockland, Maine, EE.UU.) en 0,045 mM de Tris/borate, pH 8,6, 1.5 mM EDTA (ácido etilén diamino tetra–acético) (1 × TBE buffer). Hervir la agarosa en un calentador o microondas hasta completa disolución. Enfriar la agarosa a 45–55°C. Añadir 5,0 µl de solución de bromuro de etidio (10 mg/ml) por 100 ml de agarosa caliente y verter la agarosa con un peine. Dejar solidificar y retirar el peine.

ii)

Añadir 5,0 µl de solución de bromuro de etidio (10 mg/ml) por 600 ml de tampón 1 × TBE de depósito. Colocar el gel en el aparato y llenar los depósitos de tampón.

iii)

Mezclar 15 µl de cada muestra y control con 5 µl de solución de carga de gel (por ejemplo, Sigma G– 2526, St Louis, MO, EE.UU.) Incluir un ADN marcador de 100 bp (por ejemplo, Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU., producto 15268–019, rango 100–1.500 bp) en al menos un pocillo del gel. Cargar las muestras en los pocillos de agar e iniciar la electroforesis a 65–75 voltios hasta que el colorante de gel de carga se desplace aproximadamente dos tercios de la longitud del gel.

iv)

Visualizar y fotografiar el gel con iluminación ultravioleta.

•

Interpretación de la prueba

Para que la prueba de PCR sea válida, los controles positivos han de mostrar la banda de tamaño adecuado (248 bp). Los controles de "no ARN" no deberían tener bandas. Se considera que las muestras son positivas si hay una banda del mismo tamaño que la del control positivo. Las muestras por duplicado deberían mostrar la misma reacción. Si existe disparidad, se debería repetir la prueba, comenzando con la extracción del tejido. Si se requiere una validación posterior, el producto de la PCR final anidada se puede secuenciar y comparar con las secuencias publicadas de WNV en el Banco de Genes.

2.

Pruebas serológicas

Se pueden identificar anticuerpos en el suero equino por enzimoinmunoensayo de captura con IgM (ELISA de captura con IgM), inhibición de la hemoaglutinación (IH), ELISA con IgG o neutralización por reducción de calvas (NRC) (1, 9). El ELISA de captura con IgM descrito a continuación es particularmente útil para detectar anticuerpos resultantes de la exposición natural a WNV. Generalmente, los anticuerpos IgM específicos de EON equino son detectables entre el periodo de 7–10 días hasta 1–2 meses después de la infección. La mayoría de los caballos con encefalitis EON dan positivo a la prueba de ELISA de captura con IgM a la vez que se observan los primeros síntomas clínicos. Los anticuerpos neutralizantes de WNV son detectables en el suero equino 2 semanas después de la infección y pueden persistir durante más de 1 año. Los métodos de NRC y HI son los más utilizados normalmente para la identificación de anticuerpos de EON en suero de aves. En algunos ensayos serológicos, se pueden encontrar reacciones cruzadas del anticuerpo con flavivirus relacionados, como el virus

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de la encefalitis de St. Louis o el virus de la encefalitis japonesa. La prueba de NRC es las más específica de las pruebas serológicas de EON; cuando sea necesario, se pueden probar en paralelo títulos de anticuerpo del suero contra flavivirus relacionados. Finalmente, se debe considerar la historia de la vacunación de EON en la interpretación de los resultados serológicos, particularmente en la prueba de NRC y ELISA con IgG. El ELISA de captura con IgM se puede utilizar en especies de aves u otras especies siempre que se disponga de anticuerpo de captura específico de la especie (por ejemplo, IgM anti–pollo). La prueba de NRC se aplica a cualquier especie, incluyendo aves.

a)

ELISA de captura con IgM equina Se pueden preparar antígenos de WNV y normales para ELISA de captura con IgM a partir de cerebro de ratón (ver Capítulo 2.5.3), cultivos de tejido, o líneas celulares recombinantes (8). En Norteamérica hay marcas comerciales de reactivos de prueba de WNV. Se puede obtener suero control equino caracterizado, aunque no es un estándar internacional, de los Laboratorios de los Servicios Veterinarios Nacionales, Ames, Iowa, EE.UU. Se deberían preparar antígenos del virus y antígenos control en paralelo para su uso en el ELISA. Las preparaciones del antígeno deben titularse con sueros control para optimizar la sensibilidad y especificidad del ensayo. Las muestras de suero equino se prueban a una dilución de 1/400 y las muestras de líquido cerebroespinal equino se prueban a una dilución de 1/2 en el ensayo. Para asegurar la especificidad, cada muestra de suero se prueba para controlar la reactividad tanto con el antígeno del virus como con el antígeno control. •

Procedimiento de la prueba

i)

Revestir placas ELISA de 96 pocillos con fondo liso (por ejemplo Immulon 2HB, Dynex Technolgoies, Chantilly, VA, EE.UU) con 100 µl por pocillo de IgM antiequina diluida en 0,5 M de tampón carbonato, pH 9,6, de acuerdo con la dilución sugerida por el fabricante para uso como anticuerpo de captura.

ii)

Incubar las placas durante la noche a 4°C en una cámara húmeda. Las placas revestidas se pueden almacenar durante varias semanas.

iii)

Antes de usarlas, lavar las placas dos veces con 200–300 µl/pocillo de solución salina tamponada con fosfato 0,01 M, pH 7,2, que contenga 0,05% de Tween 20 (PBST).

iv)

Bloquear las placas añadiendo 300 µl/pocillo de leche seca desnatada al 5% recién preparada en PBST e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, retirar la solución bloqueante y lavar las placas tres veces con PBST.

v)

Diluir los sueros problema y control 1/400 (el líquido cerebroespinal se diluye 1/2) en PBST y añadir 50 µl/pocillo de cada muestra a pocillos duplicados (total de cuatro pocillos por muestra) sobre la placa. Incluir control de suero positivo y negativo preparados de la misma forma que las muestras.

vi)

Cubrir las placas e incubar 75 minutos a 37°C en cámara húmeda.

vii)

Retirar el suero y lavar las placas tres veces en PBST.

viii) Diluir el virus y los antígenos normales en PBST y añadir 50 µl de antígeno vírico a un conjunto de pocillos de sueros problema y sueros control y añadir 50 µl de antígeno normal al segundo conjunto de pocillos de sueros prueba y control. ix)

Cubrir las placas e incubar durante la noche a 4°C en cámara húmeda.

x)

Retirar los antígenos de los pocillos y lavar las placas tres veces en PBST.

xi)

Diluir anticuerpos monoclonales anti–Flavivirus conjugados con peroxidasa de rábano 1 en PBST de acuerdo con las indicaciones del fabricante y añadir 50 µl por pocillo.

xii)

Cubrir las placas e incubar a 37°C durante 60 minutos.

xiii) Retirar el conjugado y lavar las placas seis veces en PBST. xiv) Añadir 50 µl/pocillo de substrato ABTS recién preparado (ácido 2,2'–azino–di–[3–etil–benzatiazolina]– 6–sulfónico) con peróxido de hidrógeno (0,1%) e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. xv)

1

Medir la absorbancia a 405 nm. Una muestra problema se considera positiva si la absorbancia de la muestra problema en pocillos que contienen el antígeno del virus es al menos dos veces la absorbancia del suero control negativo en pocillos que contienen el antígeno del virus y al menos dos veces la absorbancia de la muestra probada en paralelo en pocillos que contienen antígeno control.

Disponible en centros de Prevención y Control de la Enfermedad, Reactivos de Referencia Biológica, 1600 Clifton Road NE, Mail Stop C21, Atlanta, Georgia, 30000, EE.UU.

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b)

Neutralización por reducción de calvas (aplicable a suero de cualquier especie) La prueba de NRC se lleva a cabo en cultivos celulares Vero en recipientes de 25 cm2 o en placas de 6 pocillos. Los sueros se pueden analizar a una dilución final de 1/10 y 1/100 o se pueden valorar para establecer un punto final. A continuación se ofrece una descripción de la prueba llevada a cabo en matraces de 25 cm2 utilizando 100 unidades formadoras de placas o calvas (PFU) del virus. Previamente a la prueba, el suero se inactiva por calor a 56°C durante 30 minutos y se diluye en medios (por ejemplo 1/5 y 1/50). Se prepara una dilución de virus (200 PFU por 0,1 ml) en medios que contengan 10% de complemento de cobaya. Se mezclan volúmenes iguales de virus y suero y se incuban a 37°C durante 75 minutos antes de inocular 0,1 ml en monocapas de cultivos celulares confluentes. El inóculo se absorbe durante 1 hora a 37°C, y después se añaden 4,0 ml de medio primario de cobertura. Este medio primario está formado por dos soluciones que se preparan separadamente. La solución I contiene 2 x Solución Salina Básica de Earle sin rojo fenol, 4% de suero bovino fetal, 100 µl/ml de gentamicina y 0,45% de bicarbonato sódico. La solución II está formada por agar Noble al 2%, que se esteriliza y mantiene a 47°C. Se ajustan a 47°C volúmenes iguales de las soluciones I y II y se mezclan inmediatamente antes de uso. La prueba se incuba durante 72 horas a 37°C. Se aplica a cada recipiente 4,0 ml de un segundo medio de cobertura, preparado como se indicó anteriormente, pero conteniendo también rojo neutro al 0,003%. Después de otra incubación durante la noche a 37°C, se evalúa el número de calvas ocasionadas por el virus en cada matraz. Los títulos de punto final se basan en la reducción al 90% en comparación con recipientes con virus control, que deberían tener alrededor de 100 calvas.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO En Febrero de 2003, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) autorizó una vacuna de WNV inactivada con formalina y derivada de cultivos de tejidos para uso en caballos. En Diciembre de 2003, el USDA autorizó una vacuna viva de WNV que utiliza los canaripoxvirus como vector para uso en caballos. Estas vacunas han mostrado ser eficaces y seguras en caballos vacunados adecuadamente. La vacunación puede ser útil para evitar los síntomas neurológicos asociados con la infección de EON. Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se indican en el Capítulo I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias. Las normas presentadas aquí y en el Capítulo I.1.7 son de naturaleza general y puedan suplementarse con requisitos nacionales o regionales.

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo El aislado de WNV utilizado para la producción de vacunas debe acompañarse de documentación que describa su origen e historia. El aislado debe ser seguro en animales hospedadores a la edad de vacunación deseada y proporcionar protección después de un inóculo de desafío.

b)

Método de cultivo El WNV debe propagarse en líneas celulares que se sepa que mantienen el crecimiento de WNV. Las líneas celulares deben estar libres de virus extraños, bacterias, hongos y micoplasmas. La propagación vírica no debe exceder de cinco pases desde el inoculo del virus original, a menos que los pasos siguientes demuestren que proporcionan protección en el animal hospedador.

c)

Validación como vacuna El inóculo original de virus debe estar libre de bacterias, hongos y micoplasmas. Además debe probarse por la técnica de anticuerpos fluorescentes que está libre de virus extraños, incluyendo el herpesvirus equino, adenovirus equino, virus de la arteritis vírica equina, virus de la diarrea vírica bovina, reovirus, y virus de la rabia. El inóculo original de virus debe estar libre de virus extraños por ECP y hemadsorción en la línea celular Vero y en un tipo de células equinas embriónicas. En un ensayo de inmunogenicidad, el inóculo original de virus debe proteger a los caballos susceptibles contra una cepa de desafío virulenta en el nivel más alto de pases empleado para la producción. Debe protegerse de la viremia a una cantidad estadísticamente significativa de caballos vacunados si se compara con los controles. Deben realizarse estudios de ensayo de campo para determinar la seguridad de la vacuna.

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2.

Método de producción

La línea celular susceptible se inocula en recipientes adecuados. Como medio para producción, se utiliza medio mínimo esencial , suplementado con suero bovino fetal (SBF). Se incuba a 37°C. Los cultivos celulares se inoculan directamente con virus activo almacenado de EON, que generalmente presenta de 1 a 4 pasos del inóculo vírico original. Los cultivos inoculados se incuban durante 1–8 días antes de recoger el medio de cultivo. Durante la incubación, los cultivos se observan diariamente para detectar ECP y contaminación bacteriana. Las vacunas de virus muertos son inactivadas químicamente con formalina o etilenimina binaria y se mezclan con un adyuvante adecuado.

3.

Control del proceso

Los lotes de producción de EON se deben valorar en cultivos de tejido para la estandarización del producto. Los lotes de baja titulación se pueden concentrar o combinar con lotes de alta titulación para alcanzar el título correcto.

4.

Control de lotes

Las muestras de los recipientes finales se prueban para comprobar su pureza, seguridad y potencia.

a)

Pureza Las muestras se examinan para detectar la contaminación bacteriana y fúngica. Para llevar a cabo los controles de bacterias, se inoculan diez recipientes, cada uno conteniendo 120 ml de medio de soja e hidrolizado de caseína, con 0,2 ml de muestras de diez recipientes finales. Las diez pruebas se incuban a 30–35°C durante 14 días y se observan para detectar crecimiento bacteriano. Para hacer pruebas de hongos, se inoculan diez recipientes, cada uno con 40 ml de medio de soja e hidrolizado de caseína, con 0,2 ml de muestras de diez recipientes finales. Las pruebas se incuban a 20–25°C durante 14 días y se observan para detectar el crecimiento de hongos.

b)

Inocuidad Se pueden llevar a cabo pruebas de inocuidad combinando cobayas, ratones o caballos. Se deberían realizar estudios de seguridad en el campo antes de que la vacuna reciba la aprobación final. Generalmente, se emplean dos series, en tres localizaciones geográficas diferentes, y un mínimo de 600 animales. Alrededor de un tercio de los animales debería tener la edad mínima recomendada para la vacunación (correlacionada con la eficacia). Si el producto final es una vacuna viva modificada, se requieren pruebas de seguridad adicional del inóculo vírico original para demostrar la falta de virulencia.

c)

Potencia Las vacunas con virus muertos pueden utilizar pruebas de vacunación/serológicas de animales de laboratorio o de animales hospedadores o pruebas de vacunación/desafío para determinar la potencia del producto final. Para determinar la potencia relativa de un producto, se consideran aceptables ensayos paralelos utilizando técnicas ELISA de cuantificación del antígeno para comparar un estándar con el producto final. Debe demostrarse que el estándar es protector en el animal hospedador (22). Los productos víricos vivos se titulan en cultivos celulares para determinar la potencia del producto final. El título de potencia final a la hora de expedir el producto debería incluir un 0,7 log10 adicional para compensar la variabilidad de la prueba y un 0,5 log10 para la estabilidad a la fecha de caducidad, respecto a la dosis protectora mínima establecida en la prueba de inmunogenicidad.

d)

Duración de la inmunidad Los estudios de duración de la inmunidad se llevan a cabo antes de que la vacuna reciba la aprobación final. La duración debería ser la misma que la de la estación del mosquito en las áreas infectadas.

e)

Estabilidad Inicialmente, todas las vacunas tienen una validez de 24 meses antes de caducar. Se deben realizar estudios de estabilidad en tiempo real para confirmar que las fechas de caducidad son las apropiadas.

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f)

Conservantes Durante la producción se añaden antibióticos, generalmente sulfato de gentamicina o neomicina, que no deben exceder de 30 µg/ml.

g)

Precauciones (riesgos) Únicamente se recomienda la vacunación en caballos de zonas positivas al EON. Los caballos vacunados pueden desarrollan un título serológico que podría interferir con la capacidad de exportación del caballo.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad Ver la Sección C.4.b.

b)

Potencia Ver la Sección C.4.c.

REFERENCIAS 1.

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Capítulo 2.10.7. — Encefalitis del Oeste del Nilo

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* * * NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la fiebre del Oeste del Nilo (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar el sitio Web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int).

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