Reporte Final Proyecto CGPI 20051096 “Aves Migratorias y Virus del Oeste del Nilo” RESUMEN El brote inicial del Virus del Oeste del Nilo (VON) en Norte América fue reconocido en Nueva York en Agosto de 1999, con reportes de muertes en humanos, caballos y numerosas especies de aves. Desde entonces, la distribución geográfica del VON en Norte América ha incrementado, llegando a México en el 2002, en donde un gran número de nuevos hospederos potenciales (mamíferos, reptiles y aves) se han expuesto a la enfermedad. En México las especies de mosquitos, vectores del virus, se encuentran presentes durante casi todo el año y en casi todos los estados de la República Mexicana, por lo que son serias amenazas a largo plazo, para la salud humana, caballos y poblaciones vulnerables de aves en la región. En Mayo de 2003 un cuervo (Corvus corax) cautivo de un parque zoológico en la Cd. de Villahermosa, en el Estado de Tabasco fue analizado y se realizó el aislamiento del VON en muestras de tejido. Estudios filogenéticos indican que este aislamiento, el primero en México, está relacionado con las cepas aisladas en la parte central de Estados Unidos; sin embargo, tiene un alto grado de divergencia relativamente alto en su secuencia nucleotídica. En este estudio se analizaron 143 muestras de pelícanos pardos (Pelecanus occidentalis) y 5 muestras de gaviota ploma (Larus heermanni) de la región de las Grandes Islas y Norte del Golfo de California, para la búsqueda de anticuerpos anti-VON mediante la prueba de ELISA de bloqueo, siendo estas aves nuestro grupo centinela, para conocer la distribución geográfica del virus en esta zona de México. De las 148 aves muestreadas solamente 15 presentaban anticuerpos anti-VON con título significativo lo que nos indica que estas aves han estado en contacto con el virus. Probablemente las aves sufrieron una infección leve y fueron capaces de sobreponerse a la infección generando así anticuerpos contra el VON. En el momento del muestreo las aves no se encontraban infectadas, ya que no se logró amplificar RNA viral. INTRODUCCIÓN El virus del Oeste del Nilo (VON) fue aislado por primera vez en 1937 a partir de sangre de una paciente febril en el Condado de West Nile en Uganda (Smithburn et al. 1940). La ecología de la infección por este virus fue descrita en 1950 en Egipto en donde se describió que se encontraban involucrados mosquitos, aves y humanos (Taylor et al. 1956). El virus comenzó a reconocerse como una causa severa de meningoencefalitis durante un brote en Israel en 1957 (Spigland, et al 1958). Por otra parte la enferemedad en equinos fue descrita por primera vez en Egipto y Francia a principio de 1960 (Komar, 2000). La llegada del VON en el hemisferio Oeste (Norte América) fue en 1999 (CDC, 1999), con casos de encefalitis reportados en humanos y caballos, causando una amplia discusión acerca del futuro potencial como enfermedad emergente en una región y en el mundo entero. De cualquier manera el punto principal en esa discusión ha sido en las

implicaciones que tendría en la salud pública, la introducción de un virus en un nuevo entorno con vectores y especies potenciales presenta un punto de vista fascinante en el desarrollo e integración de sistemas de enfermedades. Existen dos linajes de VON; solamente los virus que pertenecen al linaje 1 están asociados con enfermedades humanas y aquellos del linaje 2 consisten en aislados en África manteniéndose en ciclos enzoóticos. La variante del VON que circula en Norte América pertenece al linaje 1, el cual es genéticamente casi idéntica a la cepa que previamente circuló en Israel, sugiriendo su origen en el Medio Este (Lanciotti, 2002). EL VON circula en la naturaleza a través de ciclos enzoóticos continuos de transmisión entre mosquitos del género Culicinae y hospederos vertebrados aves y pueden ser introducidos en un nuevo territorio por aves migratorias. Humanos y caballos son considerados hospederos incidentales. De cualquier manera un ciclo urbano con amplificación del virus mediante transmisión continua entre aves y vectores, e incidentalmente los humanos ha sido recientemente descrito en los Estados Unidos de América (CDC, 1999). Las especies de aves que sirven como reservorio para el virus han sido estudiadas en cuanto al papel que juegan en la diseminación del VON en Norte América. La infección por VON ha dado como resultado en muertes humanas y en incontables muertes de aves, mamíferos y reptiles. El virus ha alcanzado América Central y el Caribe y se ha diseminado de Hawai a América del Sur. Aunque miles de aves han muerto, estudios de algunas especies muestran disminución tanto local como de regiones amplias las cuales pueden ser atribuidas al VON. En México Ulloa y colaboradores (2001) realizaron un estudio epidemiológico en animales domésticos (aves y mamíferos) en Chiapas y encontraron anticuerpos anti-VON neutralizantes en una sólo ejemplar de ganado vacuno sugiriendo que el VON puede haber sido introducido en la región. Recientemente se han publicado datos que evidencian la presencia de anticuerpos anti-VON en caballos del estado de Yucatán durante Julio – Octubre del 2002 (LoroñoPino et al. 2003) así como también en Coahuila en Diciembre 2002 (Blitvich, 2003). En el 2003, el VON fue aislado de un Cuervo común en el estado de Tabasco. Esta fue la primer cepa del VON aislada en México y fue llamada TM171-03. También fueron detectados anticuerpos en caballos de cindo estados mexicanos desde Julio del 2002 (Estrada-Franco, 2003). Un reporte reciente fue descrito acerca de la presencia del VON en México durante Julio 2004, en este estudio se amplificó RNA viral a partir de tejido cerebral de un caballo que mostró síntomas neurológicos y el cual fue eutanizado 7 después de haber mostrado los síntomas. El tejido cerebral fue inoculado en células Vero, sin embargo no se logró aislar el virus de la muestra. Epidemias recientes en regiones templadas del Viejo Mundo aparecieron siendo epizootias de manera aislada tanto en tiempo como en espacio. La presencia del virus en humanos en Europa ha mostrado otras características como: I) Epidemias que han ocurrido de Julio a Septiembre en o cerca de climas húmedos o sitios urbanos. II) Los vectores más comunes son los mosquitos del género Culex, hembras las cuales se

alimentan principalmente de aves y mamíferos. III) Las aves son los hospederos vertebrados principales, varias especies de las cuales pueden producir niveles de viremia suficiente para la transmisión por vectores a otros hospederos, incluyendo humanos (Hubálek, 2000). Esa característica ha permitido que investigadores propongan que las aves migratorias infectadas con el VON, durante el invierno en tierras africanas carguen el virus hacia el norte en la migración de primavera, para detenerse en sitios de Europa en donde pueden servir, bajo ciertas condiciones, como hospederos introductores (en sitios con numerosos vectores potenciales y hospederos amplificadores). Esta hipótesis podría explicar porque las epidemias frecuentemente ocurren en o cerca de tierras húmedas y áreas urbanas, con hospederos introductores, vectores, hospederos amplificadores y la co-ocurrencia de víctimas humanas (Rappole 2003). Esto podría proveer y explicar la capacidad del virus para moverse de sitio a sitio, y explicar también el tiempo de las epidemias, con aves emigrantes cargando el virus hacia el norte en Abril y Mayo durante la migración en la primavera e infectando poblaciones de aves locales las cuales sirven como hospederos amplificadores y eventualmente infectando grandes porciones de poblaciones de vectores dentro de 2-3 meses, y subsecuentemente pasando el virus a humanos en el área durante Julio o Agosto (Rappole 2003). El hecho de que individuos de varias especies son aves migratorias que han sido encontradas como transportadoras del VON cuando han sido capturadas durante la migración soportan de manera adicional esta hipótesis (Nir, 1967). Estudios de laboratorio realizados documentan que la viremia en algunas especies de aves migratorias, son de una intensidad y duración suficientes para permitir la infección de las aves y, en teoría al menos, mover el virus en forma infecciosa de un lugar a otro (Work, 1955; Rappole, 2003). Algunas especulaciones consideran que el futuro del VON en el Nuevo Mundo fue intenso después de la temporada de infección a finales de 1999. La historia de las epidemias en zonas templadas en el Viejo Mundo indica que el virus persiste de igual manera en el Nuevo Mundo, las aves pueden transportar el virus para el Nuevo Mundo en zonas tropicales o subtropicales en otoño, introducirlo a un nuevo grupo de aves, hospederos amplificadores y entonces traer el virus del norte de ésas áreas en la primavera (Rappole, 2000). Siguiendo este escenario, el virus puede morir fuera (en el ambiente) en el Nuevo Mundo a menos que un ave migratoria sea la hospedera idónea, cargue el virus hacia el sur y lo introduzca a un ambiente tropical o subtropical en donde pudiera establecerse y quedarse durante un año. Existe una hipótesis acerca del modo de entrada para el VON en el hemisferio Oeste y es que haya sido por bioterrorismo o por eclosión de mosquitos infectados en aviones (Preston 1999), por la importación de ranas (Zwerdling, 2001). Rappole y colaboradores sugieren que el modo de entrada fue vía hospedero aviar introductor, proponen tres posibles escenarios: I) Migración normal, II) Aves desviadas por tormentas o III) Importación de aves, siendo esta última la más acertada. También especula acerca de las “aves migratorias como hospedero introductor” en donde existen dos factores que soportan esta hipótesis. Primero, el virus obviamente se ha movido lejos y rápido de manera que esto no es inconsistente con el transporte mediante aves migratorias, y segundo, ha sido bien documentado que las aves migratorias son las más susceptibles al virus y comúnmente sufren de infección por VON entre todos los grupos de vertebrados.

El principal objetivo de este estudio es realizar análisis serológicos para la vigilancia y monitoreos del Virus del Oeste del Nilo y utilizar a las aves como grupo centinela para rastrear el virus debido a esto es importante conocer el estado de salud de las aves para dilucidar si el virus es realmente el causante de la mortandad de las aves. Por lo tanto en este estudio proponemos la realización del monitoreo de aves migratorias tales como los pelícanos y conocer si estos han sido expuestos o infectados con el VON. En este estudio se realizará la prueba de ELISA de bloqueo para determinar la presencia de anticuerpos contra el VON. MATERIALES Y MÉTODOS El trabajo de campo se llevó a cabo en una visita a la región de las Grandes Islas y Norte del Golfo de California. Durante la salida de campo se llevó a cabo la captura, marcaje (anillado), toma y procesamiento de muestras, en laboratorio de campo de pelícano pardo en algunas colonias de reproducción en los archipiélagos de San Lorenzo (Isla las Ánimas), Ángel de la Guarda (Isla Ángel de la Guarda Norte) y San Luis Gonzaga (Isla San Luis), y de gaviota ploma (Larus heermanni) en isla Rasa. El trabajo de campo se llevó a cabo a bordo de tres embarcaciones menores, dos pertenecientes a la Dirección Regional en Baja California del Área de Protección de Flora y Fauna Islas del Golfo de California, y una particular. Lo anterior se realizó bajo permiso de la Secretaría de Gobernación, y del Permiso Especial de Colecta expedido por la Dirección General de Vida Silvestre de la SEMARNAT. TOMA DE MUESTRA Se ubicaron las zonas en donde se llevó a cabo la captura con grupos de pelícanos juveniles y se procedió a capturar a los individuos. Se tomaron los datos merísticos: peso (kg), longitud del pico (cm) y se anillaron. Toma de muestras: Se inmovilizó al animal y se localizó la vena metartásica, yugular y/ó basílica y se extrajo de 5.5 a 7.5 sangre en tubos vacutainer con heparina de litio, posteriormente se realizó un frotis de sangre y se tomaron muestras de la cloacas con hisopos que se colocaron en medios de transporte bacteriano. Se etiquetaron adecuadamente con la identidad del animal y se transportaron en una hielera a una temperatura de 4º C lo más rápidamente posible al laboratorio de campo para su procesamiento. Se procedió a separar el plasma y los leucocitos (estos últimos se utilizaron posteriormente para realizar la RT-PCR), una vez separados se mantuvieron a 20º C hasta su uso. En caso de encontrar animales muertos (recientemente) se realizará la necropsia de los mismos y se tomarán muestras de órganos tales como: hígado, bazo y cerebro. BACTERIOLOGÍA Los hisopados de cloacas se cultivaron en diferentes medios para bacteriología específicos para patógenos y determinar así si existe algún microorganismo que pueda afectar el estado de salud de las aves migratorias. De esta manera se evaluó el estado de salud de las aves.

OBTENCIÓN DEL ANTÍGENO. A partir del Virus del Oeste del Nilo (VON), se obtuvieron extractos crudos de antígenos de cómo se explica a continuación. Se infectó una botella semiconfluente de 75 cm2 de células VERO con el VON. Las botellas se incubaron hasta obtener un efecto citopático de 3+, posteriormente se congelaron las botellas a -70º C durante 12 horas. Para cosechar el antígeno se descongelaron los cultivos y se desprenderon las células con un gendarme estéril. Se centrifugó el medio y los detritos celulares durante 15 minutos a 3000 x g, se resuspendió la fracción celular en 1.5 mL de PBS y se procedió a congelar a -70º C de 1 hora a toda la noche. Para la preparación del antígeno se descongeló la fracción celular obtenida en el paso anterior y se le agregó a cada tubo, 1.5 mL de glicina 0.2 M a pH 9.5. Se sonicó de manera indirecta colocando cada tubo bien cerrado en un baño de hielo a 100 mV durante 3 pulsos de 20 segundos cada uno, se dejó enfriar durante 1 minuto entre cada pulso. Posteriormente los tubos se colocaron en un baño de agua a 37º C durante 4.5 horas los tubos se agitaron en vortex cada 60 minutos. Para inactivar los virus se adicionó un volumen igual (3 mL) de PBS adicionado con 0.5% de Tritón X y se incubó a 4º C durante 2 horas agitándose eventualmente en vortex. Se centrifugó a 10,000 x g durante 10 minutos a 4º C y se realizaron alícuotas del sobrenadante y se congelaron a 70º C hasta su uso. Posteriormente se realizó la titulación del antígeno para determinar la dilución óptima a usar en la prueba de ELISA por bloqueo. Como testigo negativo se utilizó una botella de células VERO sin infectar y se trató de la misma manera que las botellas infectadas. El procedimiento anterior se realizó en el laboratorio de bioseguridad tipo III Wadsworth Center del Departamento de Salud de New York, lo cual se encuentra estipulado en el convenio de colaboración Wadsworth Center, New York – Instituto Politécnico Nacional, México. PRUEBA DE ELISA DE BLOQUEO Para detectar si los sueros de los pelícanos presentan anticuerpos contra el VON se utilizó la prueba de ELISA de bloqueo debido a que esta prueba nos da la oportunidad de detectar anticuerpos sin importar la especie de origen de la muestra. El protocolo a seguir para la realización de esta prueba fue el siguiente, se adsorbió la microplaca de 96 pozos de fondo plano durante 18 horas a 4º C utilizando 100 µl, por cada pozo, del antígeno (VON) a una dilución de 1:150 en un regulador de carbonatos ajustado a un pH de 9.6. Una vez terminado el tiempo de incubación se decantó el exceso del antígeno y cada pozo se lavó con 200 µl de la solución de lavado (PBS 1X pH 7.4 + 0.05 % de Tween 20).La microplaca se bloqueó con una solución de PBS1X pH 7.4 + 0.05 % Tween 20 + leche descremada al 5%, utilizando 200 µl por pozo. Se incubó a 37º C durante 40 minutos, posteriormente se decantó la solución de bloqueo y se agregaron 50 µl del suero o LCR problema (utilizando las diluciones 1:50 y 1:250), se incubó durante 1 hora a 37º C, posteriormente se decantó y se lavó 3 veces la microplaca utilizando 200 µl /pozo de la solución de lavado. Se agregaron 50 µl de una dilución

1:6000 del anticuerpo monoclonal anti-VON (Mab 8152), diluído en solución de bloqueo, se incubó a 37º C durante 1 hora y posteriormente se decantó el exceso y se lavó la microplaca 3 veces con la solución de lavado, utilizando 200 µl/pozo. Posteriormente se agregaron 50µl del anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa a una dilución apropiada (1:2000) y la placa se incubó a 37º C durante 1 hora, se realizarán 3 lavados con 200 µl/pozo de solución de lavado y se adicionaron 100µl/pozo de la solución del cromógeno ortofenilendiamina (0.4mg/10mL de regulador de citratos ajustado a un pH 5.5 al cual se le adicionaron 8µl de peróxido de hidrógeno al 30 % segundos antes de llenar los pozos) y se incubó a 37 º C hasta el desarrollo de color o hasta que el testigo de conjugado comience a desarrollar color, para detener la reacción se adicionaron 50µl de ácido sulfúrico por pozo. Y se procedió a realizar la lectura en un lector de ELISA a 492 nm. Después se realizaron los cálculos necesarios para obtener el título de anticuerpos anti-VON. EXTRACCIÓN DE RNA Se extrajo el RNA total a partir de los sueros, LCR, glóbulos blancos y/o órganos de los pelícanos utilizando el Kit RNAeasy de Qiagen. Se tomaron 140 µl de muestra y se agregaron 350 - 600 µl buffer RLT y se homogeneizó en vortex durante 1 minuto. Posteriormente se adicionó 1 volumen (350 – 600 µl) de etanol al 70% y se mezcló por pipeteo, sin centrifugar. Se adicionaron 700 µl de la mezcla a la columna la cual se colocó en un tubo de 2 mL. Se cerró la columna y se centrifugó durante 15 segundos a 8000x g, desechando el filtrado. Se adicionaron 700 µl de Buffer de RW1 a la columna y se centrifugó durante 15 segundos a 8000x g, se transfirióla columna a un tubo nuevo de 2 mL y se colocaron 500 µl Buffer RPE en la columna, se centrifugó durante 15 segundos a 8000x g, se desechó el líquido filtrado. Posteriormente se agregaron 500 µl de buffer RPE a la columna y se centrifugaron durante 2 minutos a 8000X g. Se colocó la columna en un tubo nuevo de 2 mL y se centrifugó 1 minuto a velocidad total. El RNA fue eluído con 3050 µl agua libre de RNasas centrifugando 1 minuto a 8000X g. El RNA se manuvo a -70º C hasta su uso. REACCIÓN DE LA RT-PCR Se utilizó el protocolo descrito por Shi y col. 2001. Se amplificó un fragmento de 408 pb (nt 233 al nt 640) el cual contiene la porción C-terminal del gen C y la región N-terminal del gen prM del VON, esto se llevó a cabo utilizando el kit de Qiagen “One step RT-PCR”. Los iniciadores que se utilizaron son los descritos por Lanciotti los cuales son el iniciador 3F 5’-TTGTGTTGGCTCTCTTGGCGTTCTT-3’ y el iniciador 4R 5’CAGCCGACAGCACTACATTCATA-3’. La reacción de amplificación se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante con un mínimo de modificaciones. Cada 50 µl de la mezcla de reacción contiene buffer de reacción 1X, 0.4 mM de dNTP’s, 0.6 µM de ambos iniciadores 3F y 4R, solución Q 1X y 1µl de la mezcla de las enzimas retrotranscriptasa y DNA taq polimerasa y se agregaron 5µl del RNA extraído con el Kit RNAeasy de cada una de las muestras. El ciclo térmico que se siguió es el siguiente 50º C durante 30 minutos para la síntesis de la cadena de cDNA; 95º C durante 15 minutos para inactivar la transcriptasa reversa y para activar la DNA taq polimerasa; 35 ciclos a 94º C durante 45 segundos, 56º C durante 45 segundos y 72º C durante 1 minuto para la amplificación y una elongación final de 72º C durante 10 minutos. Posteriormente se analizaron 20 µl del producto de la reacción en un gel de agarosa al 1.5% utilizando TBE 1X (Tris-Boratos-

EDTA) como regulador de corrimiento y se teñirá con una solución de bromuro de etidio a una concentración de 0.5 µg/mL. De igual manera se utilizarán iniciadores que amplifican

regiones específicas de flavivirus diferentes al VON, los cuales también son importantes patógenos importantes tales como: Fiebre Amarilla, Dengue (en sus cuatros tipo) San Luis, encefalitis equina del Este y del Oeste. PCR ANIDADO Se tomó una muestra del producto de la RT-PCR descrita anteriormente y se diluyó 10,000 veces para realizar la PCR anidada utilizando el Taq PCR Core kit de Qiagen. Se utilizó un par de iniciadores internos siendo el iniciador 5F 5’CAGTGCTGGATCGATGGAGAGG-3’ y el primer 6F 5’-CCGCCGATTGATAGCACTGGT3’. Cada mezcla de reacción de 25 µl contiene regulador de reacción 1x, 0.2mM de dNTP’s, 0.3 µM de cada uno de los iniciadores 5F y 6R, 1µl del producto de la RT-PCR siendo éste el molde y 0.625 U de DNA Taq polimerasa. El ciclo térmico que se llevó a cabo fue el siguiente 94º C durante 3 minutos, 22 ciclos de 94º C durante 45 segundos, 58º C durante 45 segundos y 72º C durante 1 minuto y una elongación final a 72º C durante 10 minutos. Se tomaron 15 µl del amplificado de la PCR para ser analizado en un gel de agarosa al 1.5% utilizando TBE 1X (Tris-Boratos-EDTA) como regulador de corrimiento y se tiñó con una solución de bromuro de etidio a una concentración de 0.5 µg/mL. RESULTADOS Toma de muestras Se tomaron 143 muestras sanguíneas de pelícanos y 5 de gaviotas ploma. Para el caso de bacteriología se muestrearon 128 pelícanos (31 en isla San Luis, 23 en isla Piojo, 36 en la isla Ángel de la Guarda y 38 en la isla San Lorenzo) (Tabla 2), no se tomaron muestras para bacteriología de las gaviotas ploma. Bacteriología De los hisopados cloacales de pelícanos, se obtuvieron un total de 205 cepas bacterianas, que corresponden a 19 géneros diferentes, de las cuales 171 cepas (74%) quedaron agrupadas en 14 géneros de bacterias Gram negativas, principalmente de la familia Enterobacteriaceae. El 26% restante corresponde a géneros de bacterias Gram positivas de las familias Micrococcaceae, Enterococcaceae, Streptococcaceae y Erysipelotrichaceae. Se encontraron de una a tres especies diferentes por cada uno de los 19 géneros bacterianos obtenidos y se obtuvo un total de 76 perfiles bioquímicos diferentes, que van desde uno hasta 18 por especie bacteriana identificada, como es el caso de Escherichia spp. (Tabla 1).

Tabla 1. Resultados generales

Cepas Bacterianas

Familia

Géneros

Citrobacter spp.

Gram negativas 74%

N=171 cepas

Enterobacteriaceae (74%)

Subtotal 1 familia Gram negativo Micrococcaceae (5%)

No. de cepas aisladas por género bacteriano

Cantidad de perfiles

4

3

Perfiles bioquímicos encontrados por género bacteriano 2, 5, 47 1, 7, 11, 12, 15, 31,42, 43, 49, 52, 53, 56, 57, 58, 59, 61, 62 4, 28, 46

Edwarsiella spp.

3

30

17

Enterobacter spp.

3

3

3

Escherichia spp.

2

88

18

Shigella spp.

2

10

4

14, 17, 18, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 34, 40, 44, 54, 55, 60, 63, 64, 65 16, 33, 51, 67

Hafnia alvei

1

1

1

45

Klebsiella spp.

1

1

1

6

Kluyvera spp.

1

1

1

30

Proteus spp.

2

5

5

35, 36, 37, 48, 66

Providencia spp

2

2

2

8, 32

Salmonella spp.

1

1

1

10

Serratia spp.

2

18

4

9, 13, 19, 20

Yersinia spp.

2

3

3

27, 41, 50

Plesiomonas spp.

1

3

1

Subtotal 26 especies 1

171 1

1

90

2 1 3 1

12 2 18 1

3 2 5 1

80, 81, 86 78, 79 82, 83, 84, 87, 88 92

Subtotal 8 especies Total 34 especies

Subtotal 34 cepas Total 205 cepas

Subtotal 14 géneros Kokuria spp.

Gram Positivas 26%

Enterococcaceae (11%)

N=34 cepas

Subtotal 4 familias Gram positivas

Subtotal 5 géneros

TOTAL

Total 5 familias

Total 19 géneros

Streptococcaceae (5%) Erysipelotrichaceae (5%)

No. de especies aisladas por cada género bacteriano 3

Enterococcus spp. Vagococcus spp. Streptococcus spp. Erysipelothrix spp.

91 Subtotal 64 perfiles

Total 12 perfiles

Total 76 perfiles diferentes

La cantidad de cepas bacterianas y géneros aislados por isla se pueden observar en la Tabla No. 2 Obtención del antígeno Una vez obtenido el antígeno se procedió a realizar la prueba de inactivación. Para lo que se tuvieron que descongelar viales al azar del antígeno, este se inoculó en botellas con cultivos de células VERO que fueron incubadas a 37ºC durante 8-15 días, revisándolas diariamente en búsqueda de efecto citopático en las células. Sin embargo como se esperaba no se observó ningún efecto citopático, lo cual nos indica que efectivamente el VON estaba completamente inactivado. Por lo que este antígeno se puede utilizar sin ningún problema en laboratorios tipo BSLII.

Tabla 2. Número de aislamientos bacterianos por cada muestra y por cada isla analizada.

Zona de muestreo

Número de muestras analizadas por isla

1. Isla San Luis

2. Isla Piojo

3. Isla A. de la Guarda

4. Isla San Lorenzo

31

23

36

38

Número de cepas aisladas por isla

47

36

57

65

Géneros de bactérias Gram negativas aislados

Citrobacter spp. Edwarsiella spp Escherichia spp. Shigella spp. Hafnia spp. Serratia spp. Yersinia spp. Citrobacter spp. Edwarsiella spp. Enterobacter spp. Escherichia spp. Proteus spp. Providencia spp. Serratia spp. Citrobacter spp. Edwarsiella spp. Enterobacter spp. Escherichia spp. Shigella spp. Klebsiella spp. Serratia spp. Yersinia spp. Citrobacter spp. Edwarsiella spp. Escherichia spp. Shigella spp. Kluyvera spp. Proteus spp. Providencia spp. Salmonella spp. Serratia spp. Yersinia spp. Plesiomonas

Géneros de bactérias Gram positivas aislados

Erysipelotrhix spp. Streptococcus spp.

Streptococcus spp.

Kokuria spp. Enterococus spp. Streptococcus spp.

Enterococus spp. Streptococcus spp. Vagococcus spp.

Prueba de ELISA de bloqueo Se realizó la prueba de ELISA par un total de 143 muestras de pelícanos y 5 de gaviota ploma, obteniéndose los resultados que se muestran en las Tablas 3, 4, 5, 6 y 7. En los cuales 15 pelícanos presentaron anticuerpos anti-VON y 128 resultaron negativos a anticuerpos anti-VON. En cuanto a las cinco muestras de gaviota ploma ninguna presentó anticuerpos anti-VON.

Tabla No. 3 Resultados Serología para la búsqueda de anticuerpos anti-Virus del Oeste del Nilo en muestras de pelícanos de la Isla San Luis

IDENTIDAD 1/1 2/1 3/1 4/1 5/1 6/1 7/1 8/1 9/1 10/1 11/1 12/1 13/1 14/1 15/1 16/1 17/1 18/1 19/1 20/1 21/1 22/1 23/1 24/1 25/1 26/1 27/1 28/1 29/1 30/1 31/1 32/1 33/1 34/1 35/1 36/1

% INHIBICION 20 25 7 19 22 21 4 24 27 14 6 11 8 11 1 5 8 8 6 8 6 3 8 7 9 0 0 9 1 0 10 16 0 0 0 0

INTERPRETACIÓN POSITIVO POSITIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

Nota: Un porcentaje de ≥14% de inhibición indica la presencia de anticuerpos anti-VON.

Tabla No. 4 Resultados Serología para la búsqueda de anticuerpos anti-Virus del Oeste del Nilo en muestras de pelícanos de la Isla El Piojo IDENTIDAD 37/2 38/2 39/2 40/2 41/2 42/2 43/2 44/2 45/2 46/2 47/2 48/2 49/2 50/2 51/2 52/2 53/2 54/2 55/2 56/2 57/2 58/2 59/2 60/2 61/2

% INHIBICIÓN 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 36 0 0 0 0 17

INTERPRETACIÓN NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

Nota: Un porcentaje de ≥14% de inhibición indica la presencia de anticuerpos anti-VON.

Tabla No. 5 Resultados Serología para la búsqueda de anticuerpos anti-Virus del Oeste del Nilo en muestras de pelícanos de la Isla Ángel de la Guarda IDENTIDAD 62/3 63/3 64/3 65/3 66/3 67/3 68/3 69/3 70/3 71/3 72/3 73/3 74/3 75/3 76/3 77/3 78/3 79/3 80/3 81/3 82/3 83/3 84/3 85/3 86/3 87/3 88/3 89/3 90/3 91/3 92/3 93/3 94/3 95/3 96/3 97/3 98/3 99/3 100/3 101/3

% INHIBICIÓN 61 7 10 18 11 20 0 7 4 1 1 11 10 3 3 10 0 6 5 3 6 5 3 13 0 6 23 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

INTERPRETACIÓN POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

Nota: Un porcentaje de ≥14% de inhibición indica la presencia de anticuerpos anti-VON.

Tabla No. 6 Resultados Serología para la búsqueda de anticuerpos anti-Virus del Oeste del Nilo en muestras de pelícanos de la Isla San Lorenzo

IDENTIDAD 102/4 103/4 104/4 105/4 106/4 107/4 108/4 109/4 110/4 111/4 112/4 113/4 114/4 115/4 116/4 117/4 118/4 119/4 120/4 121/4 122/4 123/4 124/4 125/4 126/4 127/4 128/4 129/4 130/4 131/4 132/4 133/4 134/4 135/4 136/4 137/4 138/4 139/4 140/4 141/4 142/4 143/4

% INHIBICIÓN 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 27 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

INTERPRETACIÓN NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

Nota: Un porcentaje de ≥14% de inhibición indica la presencia de anticuerpos anti-VON.

Tabla No. 7 Resultados Serología para la búsqueda de anticuerpos anti-Virus del Oeste del Nilo en muestras de gaviotas ploma de la Isla La Rasa

IDENTIDAD 144/R 145/R 146/R 147/R 148/R

% INHIBICIÓN 0 0 0 0 0

INTERPRETACIÓN NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

Nota: Un porcentaje de ≥14% de inhibición indica la presencia de anticuerpos anti-VON.

EXTRACCIÓN DE RNA Y REACCIÓN DE RT-PCR A partir de leucocitos, plasma y/o suero colectado se realizó la extracción del RNA. Y posteriormente estos RNA’s fueron utilizados como molde en la reacción de RTPCR para la identificación de la porción terminal del gen C y la región N-terminal del gen prM del VON descrita previamente. No se logró amplificar el RNA viral en ninguna de las muestras, lo que nos indicó que no se encontraba presente el virus en las muestras analizadas.

RT-PCR ANIDADO El PCR anidado ya no se realizó debido a que no se obtuvieron amplificados en la RT-PCR, sin embargo la técnica se estandarizó con los testigos positivos, para ser utilizada en estudios posteriores.

Discusión El VON es un arbovirus transmitido por mosquitos, del género Culex sp. principalmente, que adquieren la infección al alimentarse de sangre de aves infectadas manteniéndose así en la naturaleza. De las 143 pelícanos pardos muestreadas solamente 15 (10.48%) presentaron anticuerpos anti-VON con título significativo lo que nos indica que estas aves han estado en contacto con el virus. Lo que nos sugiere que las aves sufrieron una infección leve y fueron capaces de sobreponerse a la infección, generando así anticuerpos contra el VON. Sin embargo al momento del muestreo las aves no se encontraban infectadas por el virus, ya que no se logró amplificar RNA viral.

Una ventaja de la prueba de ELISA de bloqueo utilizada en este trabajo es que no se requiere de un anticuerpo específico de especie, en este caso para pelícanos y gaviotas, y la prueba puede ser utilizada para diferentes especies de animales. Hasta el momento la prueba tamiz para detectar anticuerpos anti-VON

en aves, caballos y humanos ha sido la prueba de ELISA en sus diferentes variedades. En estudios realizados en aves infectadas experimentalmente con el VON, se determinó el tiempo de viremia y el tiempo en el que se producen los anticuerpos (Fig. 3) (Comunicación personal, Kramer). Esto corresponde con los datos obtenidos en este trabajo, ya que en los pelícanos que resultaron positivos a anticuerpos anti-VON, no se amplificó RNA viral, lo que nos indica que la viremia ya había tenido lugar previamente a la producción de anticuerpos.

Títulos de virus SLE y VON

3.5

120

3

100

2.5 2

80

Viremia corta duración

Virus

60 1.5

Anticuerpos larga duración

Anticuerpos 40

1 20

0.5 0

0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Días post inoculación Fig. 3 Patrón típico de viremia (virus circulante) y respuesta de anticuerpos en aves durante una infección experimental con arbovirus. (Datos no publicados)

Por lo tanto, al analizar los sueros de individuos de una población, los que resulten con serología positiva no son los candidatos para realizar la RT-PCR, sino los que resulten con serología negativa. El impacto de este trabajo es mucho ya que es el primero llevado a cabo en México con pelícanos juveniles sanos, nacidos en la región de las Grandes Islas del Golfo de California, regiones prácticamente vírgenes, lo cual sugiere que aquellos individuos que resultaron positivos a anticuerpos anti-VON pueda ser que se haya adquirido de manera directa a través de los padres infectados ó que adquirieron la infección en México, esto puede ser posible ya que se tienen registros de la Secretaría de Salud, de la presencia de mosquitos de la especie Culex sp. que son los vectores del VON. Los pelícanos son aves acuáticas migratorias, lo cual implica un riesgo para las aves nativas del área de las Grandes Islas del Golfo de California, ya que pueden transportar el virus desde las zonas de emigración (California, EUA, en este caso) en las que ya ha sido descrito la presencia del virus como causante de gran mortandad de aves de la región; hasta las zonas de anidación en México, en las que no se tenían registros

(hasta antes de la realización de este trabajo) que indicaran la presencia del virus en esta zona de nuestro país. Como sugiere este estudio, la población de pelícanos de las Islas San Luis, El piojo, Ángel de la Guarda y San Lorenzo; que ha estado en contacto con el VON es apenas del 10.48%. Lo que nos indica que el papel de las aves migratorias en la diseminación y transmisión del VON no sólo es importante sino determinante. Se requieren de mayores estudios en un futuro para conocer si el porcentaje de la población con anticuerpos anti-VON se mantiene, aumenta o disminuye, no sólo en pelícanos sino también en otro tipo de aves, nativas por ejemplo. Así también como estudios entomológicos para conocer las especies de mosquitos que se encuentran en la región y la búsqueda del virus en estos vectores. Bibliografía 1. Spigland, I., W. Jasinska-Klingberg, E. Hofsbi and N. Goldblum.1958. Clinical and laboratory observations in an outbreak of West Nile fever in Israel. Harefuah. 54(3):275-281. 2. Schmidt, J.R., and H.K. El Mansoury.1963. Natural and experimental infection of Egyptian equines with West Nile virus. Ann. trop. Med. Parasitol. 57:415-427. 3. Taylor, R.M., T.H. Work, H.S. Hurlbut, and F. Rizk. 1956. A study of the ecology of West Nile virus in Egypt. Am J. trop. Med. 5 (4):579-620. 4. Center for Disease Control and Prevention (1999). Update, West Nile encephalitis, New York, 1999.Morb. Mort. Weekly rep., 48 (41), 944-946. 5. Lanciotti, R.S., G.D. Ebel, V. Deubel, et. al. 2002. Complete genome sequences and filogenetic analysis of West Nile virus strains isolated from the United States , Europe and Middle East. Virology. 298:96-105. 6. Loroño-Pino, M.A., J.B. Blitvich, J.A. Farfán-Ale, F.I. Puerto J.M. Blanco, N.L. Marlenee, E.P. Rosado-Paredes, J.E. García-Rejón, D. J. Gubler, C.H. Calisher, and B.J. Beaty. 2003. Serologic Evidence of West Nile Virus Infection in Horses, Yucatán State, México. Emerg. Inf. Dis. 9 (7):857-859. 7. Blitvich, J.B., I. Fernández-Salas, J.F. Contreras-Cordero, N. L. Marlene, J.I. González-Rojas, N. Komar, D.J. Gubler, C. H. Calisher and Barry Beaty. 2003. Serologic Evidence of West Nile Virus Infection in Horses, Coahuila State, México. Emerg. Inf. Dis. 9 (7):853-856. 8. Estrada-Franco, J.G., R. Navarro-Lopez, D.W.C. Beaseley, L. Coffey, A.S. Carrara, A. Travassoss da Rosa, T. Clements, E. Wang, G.V. Ludwing, A. Campomanes-Cortes, P. Paz-Ramírez, R.B. Tesh, A.D. T. Barret, and Scout C. Weaver.2003.west Nile virus in Mexico: Evidence of widespread circulation since July 2002.emerg. Infect. Dis. 9(11):16041067. 9. Blitvich, J.B., I. Fernández-Salas, J.F. Contreras-Cordero, M.A. Loroño-Pino, N. L. Marlene, F. J. Díaz, J.I. González-Rojas, N. Obregón-Martínez, J.A. Chiu-García, W. C. Black IV, and Barry Beaty. 2004. Phylogenetic Analysis of West Nile Virus, Nuevo Leon State, Mexico. Emerg. Inf. Dis. 10 (7):1314-1317. 10. Hubálek, Z. 2000. European experience with West Nile Virus ecology and epidemiology: could it be relevant for the New World? Viral Immunology 13:415-426. 11. Rappole, J.H. and Z. Hubálek. 2003.Migratory birds and West Nile virus. J. Appl. Microbiol.94:47S-58S. 12. Nyr, Y., R. Goldwasser, Y. Lasowski and A. Avivi. 1967. Isolation of arboviruses ffrom wild birds in Israel. Amer, J. of Epidem. 86:372-378. 13. Work, T. H., H.S. Hurbult and R.M. Taylor .1955 Indikgenous wild birs of the Nile Delta as potential West Nile virus circulating reservoirs. Amer.J.Trop.Med.Hyg.4:872-878.

14. Preston, R. 1999. West Nile mystery. New Yorker October18 & 25, 1999, 90-108. 15. Zwerdling, D. 2001. The West Nile virus journey to America. http://www.npr.org/programs/atc/features/2001/mar/010309.disease.html.