ENFERMEDADES GENETICAS HUMANAS

Según el tipo de célula

Germinales Somáticas (cáncer no hereditario) Cromosómicas

Según el tipo de alteración

numéricas estructurales

Mutaciones puntuales Génicas Inserciones y deleciones Grandes deleciones

Según el genoma y cromosoma afectados

nucleares

autosómicas Ligadas al sexo

mitocondrial

Complejas o multifactoriales: en parte exógenas y en parte genéticas

MUTACIONES SOMATICAS Y GERMINALES

Mutaciones somáticas - Ocurren en tejidos no germinales - No se heredan

Mutaciones germinales - Presentes en ovulos y esperma - Son heredables - Causa del cáncer familiar

CROMOSOMOPATIAS  Se definen como cambios que resultan en una alteración visible de los cromosomas Son muy frecuentes (abortos espontáneos, recién nacidos muertos...) Se producen por una mala reparación de cromosomas rotos o dañados o por fallos en la recombinación o en la segregación de los cromosomas durante mitosis o meiosis Se clasifican en :  alteraciones numéricas  alteraciones estructurales Alteración dosis génica: aumento o pérdida. Se identifican por observación de los cromosomas del paciente mediante distintas técnicas: bandeo cromosómico con distintos colorantes, FISH, CGH...

CROMOSOMOPATIAS • ALTERACIONES NUMÉRICAS: – POLIPLOIDIA (triploidia: 69XXX, XXY ó XYY) LETAL – ANEUPLOIDIA (pérdida) • AUTOSÓMICAS • CROMOSOMAS SEXUAES 

Características CLINICAS GENERALES:

• • • • •

Retraso mental Retraso en el crecimiento Anomalías congénitas múltiples Viabilidad baja, alta letalidad Asociadas a abortos espontáneos

Diagnóstico prenatal posible

Alteraciones numéricas autosómicas  Monosomía: letal  Trisomía: usualmente letal Excepciones:

 Trisomy 21 - Down Syndrome (1:1000)  Trisomy 13 - Patau Syndrome (1:20.000)  Trisomy 18 - Edward Syndrome (1: 8.000)

Alteraciones numéricas de los cromosomas sexuales  Características generales: • • • • •

Retraso en el crecimiento problemas reproducción viabilidad alta Asociadas a abortos espontáneos diagnóstico prenatal posible

Ejemplos:  Monosomía X: Síndrome de Turner (45, X)  Trisomía (47, XXY): S. de Klinefelter

Alteraciones estructurales

deleción (pérdida)

duplicación (ganancia)

inversión

CITOGENÉTICA MOLECULAR METODOS PARA LA DETECCION DE DELECIONES, INSERCIONES Y DUPLICACIONES EN DNA GENOMICO  METODOS CITOGENETICOS: CARIOTIPO Y FISH COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION: CGH MULTIPLEX LIGATION PROBE AMPLIFICATION: MLPA

Caracterización de los cromosomas  G bands (Giemsa)  C bands (centrómero)  Q bands (quinacrina, fluorescente equivalente a G)  R bands (patrón opuesto a G y Q)  Bandeo de alta resolución (>400 bands)  FISH (fluorescent in situ hybridization)  CGH (comparative genomic hybridization)  MLPA (multiplex ligation amplification probe)

FISH:FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION

FISH: hibridación in situ fluorescente

TIPOS DE SONDAS

centromérica

pintado cromosómico

secuencia única

telomérica

pintado cromosómico

secuencia única

Cromosoma Filadelfia: translocación entre el cromosoma 9 y el 22

ENFERMEDADES MONOGÉNICAS  Frecuencia estimada de 10:1000  Defecto en un único gen  Se clasifican según el patrón de herencia en :  Autosómicas recesivas  Autosómicas dominantes  Ligadas al sexo

PREVALENCIA APROXIMADA DE LAS ENFERMEDADES GENETICAS EN LA POBLACION GENERAL (10/1000)

Tipo de enfermedad

Prevalencia (1000 nacimientos)

Autosómica dominante

3-9,5

Autosómica recesiva

2-2,5

Ligada al cromosoma X

0,5-2

Anomalías cromosómicas

6-9

ALGUNAS CIFRAS: Un 30% de todas las enfermedades humanas están influidas por genes Se calculan unas 7.000 enfermedades con base genética Un 5% de las personas 90 años. Promedio: 40 Herencia autosómica dominante Gen en 4p : Huntingtina Expansión del triplete CAG (polyGln) Número de copias normal: 10-35 Premutación: 36-39 Acumulación de agregados proteicos tóxicos y que causan la muerte neuronal prematura, consecuencia de las interacciones de la larga serie de residuos de glutamina en la proteína y pueden estar relacionados con la muerte neuronal.

Tipos de enfermedades genéticas. Patrones de herencia.  Cromosomopatías  Enfermedades monogénicas o de herencia mendeliana autosómicas recesivas autosómicas dominantes ligadas al sexo. Enfermedades producidas por mutaciones inestables (expansión de tripletes) Impronta genética y disomías uniparentales  Enfermedades de DNA mitocondrial Enfermedades complejas o multifactoriales

IMPRONTA GENETICA  modificaciones epigenéticas del material genético (silenciamiento génico) que ocurren dependiendo de si el alelo proviene del padre o de la madre  Resultan en una expresión diferencial según sea la copia materna o paterna 

identificados en mamiferos y plantas superiores



Mutaciones en los genes con impronta genética dan un patron inusual de herencia



Puede deberse a presión evolutiva en genes implicados en crecimiento y desarrollo.

-en humanos hay ~60 genes con impronta genética, la mayoría implicados en desarrollo y crecimiento -Genes imprinteados estan en cromosoamas 6,7, 8,14,15 19 y 20. -Existen dos clusters de genes con impronta: en el crom. 11 (síndrome de Beckwith-Wiedemann) y en el crom. 15 (S. de Prader-Willi y de Angelman) -En estos clusters hay genes de expresión paterna y otros de expresión materna, algunos son genes RNA no traducidos reguladores de la traducción

ENFERMEDADES ASOCIADAS A GENES CON IMPRONTA GENÉTICA

AS: falta de función de la copia materna UBE3A, la paterna no se expresa PWS: falta de función de la copia paterna SNURF y snoRNA, la materna no se expresa

CAUSAS DE LA ENFERMEDADES DE PW Y S. ANGELMAN •Pérdida de función de genes en el cromosoma 15 que sólo se expresan del cromosoma paterno (PW) o materno (Angelman) •La pérdida de función puede deberse a deleciones, disomias uniparentales, mutaciones o errores en la impronta.

PW

AS

Deleciones

75%

75%

Disomía uniparental

20%

3%

Errores en la impronta

2%

5%

Mutaciones puntuales

-

15% (gen UBE3A)

Disomía uniparental  ambos cromosomas homólogos provienen del mismo progenitor  Usualmente el origen está en una recuperación o compensación de una trisomía que sería letal

 disomia uniparental : PWS resulta de dos crom. 15 maternos AS resulta de dos crom. 15 paternos

Disomia uniparental

Tipos de enfermedades genéticas. Patrones de herencia.  Cromosomopatías  Enfermedades monogénicas o de herencia mendeliana autosómicas recesivas autosómicas dominantes ligadas al sexo.  Enfermedades complejas o multifactoriales  Enfermedades producidas por mutaciones inestables (expansión de tripletes)  Impronta genética y disomías uniparentales  Enfermedades de DNA mitocondrial

DNA mitocondrial Tasa de mutación 20 veces la del DNA nuclear

•Expuesto a radicales libres •No está protegido por histonas •No hay intrones •No hay sistemas de reparación

Enfermedades del DNA mitocondrial ~ 1/15000 adultos

 HERENCIA MATERNA  HETEROPLASMIA = diferente % de mitocondrias normales

y mutantes en cada célula o tejido. Las células reciben diferentes poblaciones de mitocondrias normales y mutantes

Enfermedades complejas o multifactoriales: causadas por factores genéticos y ambientales

ambiente Potencial Genotipo (genes)

Actual Fenotipo (expresión visible)

Enfermedades complejas o multifactoriales: -Causadas por >1 gen -Influencia de factores ambientales -Cada gen implicado puede tener un efecto pequeño -No hay una herencia clara en familias -Posibles interacciones entre los genes implicados (epistasis) -Posibles interacciones ambiente-genes -“medida” de la enfermedad (fenotipo) a veces dificil

Umbral que hace puede variar por adicion o sustraccion de algun caracter

Efecto acumulativo: los alelos de varios loci interaccionan de manera que el efecto de la combinación de alelos es la suma de los efectos individuales. epistasis: interaccion entre genes en la que un gen interfiere con la expresión del otro. En general, el efecto combinado de alelos en más de un locus es diferente de lo esperado según sus efectos

Enfermedades metabólicas hereditarias

Las Enfermedades Metabólicas Hereditarias (EMH) se definen como alteraciones bioquímicas de origen genético causadas por un defecto específico en la estructura y función de una proteína (ENZIMA, RECEPTOR, TRANSPORTADOR)

Se han identificado más de 500 EMH diferentes Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM):

http://www3.ncbi.nlm.nih.gov:80/omim

Las EMH individualmente tienen una frecuencia baja, menos de 5 casos cada 10.000 habitantes, por lo que de acuerdo con el criterio de la Unión Europea son consideradas Enfermedades Raras

Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): http://www3.ncbi.nlm.nih.gov:80/omim

Cromosoma

gen

Lisina

Proteína

Cofactor (vitamina)

SUSTRATO

PRODUCTO

CONCEPTO DE EIM (1908)

OH CH2- COOH

Ácido homogentísico

Alcaptonuria

INDIVIDUALIDAD BIOQUÍMICA: HERENCIA MENDELIANA

FRECUENCIA DE ALGUNOS ECM Y TIPO DE HERENCIA AUTOSÓMICA DOMINANTE

AUTOSÓMICA RECESIVA

Hipercolesterolemia familiar Huntington Síndrome de Marfan

1:500 1:5.000 1:20.000

Fibrosis quística Enfermedad de Tay-Sachs Deficiencia de acil-CoA Deshidrogenasa de cadena media Fenilcetonuria Enfermedad de Canavan Mucopolisacaridosis Jarabe de Arce

1:2.500 (población caucasiana) 1:3.000 (Judíos Ashkenazi) 1:10.000 (población caucasiana) 1:50.000 (población española) 1:12.000 1:14.000 (Judíos Ashkenazi) 1:25.000 1:40.000 (población española) 1:226.000 (población general) 1:48.000 1:50.000 1:62.000 1:110.000

Acidemia Metilmalónica Glucogenosis (todos los tipos) Galactosemia Deficiencia en Biotinidasa

LIGADOS AL X

Distrofia muscular de Duchenne Adrenoleucodistrofia Síndrome de Lesch-Nyhan Enfermedad de Hunter

1:3.000 1:20.000 1:380.000 (población canadiense) 1:111.000

DETECCIÓN PRECOZ DE ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS

DETECCIÓN NEONATAL MASIVA    

HIPERFENILALANINEMIAS HIPOTIROIDISMO CONGÉNITO HIPERPLASIA ADRENAL CONGÉNITA HEMOGLOBINOPATÍAS

SCREENING AMPLIADO (Madrid desde 2011)

Acilcarnitinas (LC/MS/MS)  AMINOACIDOPATIAS  β‐OXIDACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS  ACIDURIAS ORGÁNICAS -

 CICLO DE LA CARNITINA

Sospecha de EIM basados en los síntomas clínicos

SÍNTOMAS Intoxicación aguda Intervalos libres de síntomas Relación con ingesta e intercurrencias Hipotonía generalizada; Miopatía; Cardiomiopatía Miopatía; Cardiomiopatía Hipoglucemia; (PC, PDH)

Progresivos Independientes de ingesta e intercurrencias

DISMORFIAS

ALTERACIÓN METABÓLICA Acumulación de metabolitos tóxicos

POSIBLE DEFECTO Aminoacidopatías Enf. ciclo de la urea Acidemias orgánicas Galactosemia

Defecto en la producción o utilización de energía

Síntesis y/o degradación moléculas complejas

Def. b-oxidación de ácidos grasos Glucogenosis Acidosis Láctica ALC Def. Cadena respiratoria Enf. Lisosomales Enf. Peroxisomales Síndrome CDG

DEFECTOS EN LA SÍNTESIS DE COLESTEROL Paciente SLO HMGHMG-CoA HMGHMG-CoA Reductasa Mevalonato

Mevalonato Quinasa IsopentenilIsopentenil-PP

IsopentenilIsopentenil-tRNA; tRNA; Proteinas Geranilgeraniladas y Farsiladas; Farsiladas; HaemHaem-a; DolicolDolicol-PP; Ubiquinona. Ubiquinona.

Escualeno

Lanosterol

Desm osterol reductas Desmosterol

EsterolEsterol- 8 isomerasa isomerasa

• Aciduria Mevalónica • Smith-Lemli-Opitz • Condrodisplasia Puntata (ligada al X) • Desmoesterolemia

Deshidrogenasa

8-DihidroDihidro-colesterol

Desmosterol

7-DihidroDihidro-colesterol

COLESTEROL

Membrana celular Hormonas esteroideas VitaminasVitaminas-D Acidos Biliares

EsterolEsterol- 7 reductasa

MUCOPOLISACARIDOSIS Sindrome de HURLER

 L-iduronidasa

Degradación del DERMATAN SULFATO

DEFECTOS del MOLIBDENO Acido Úrico

SCy s

Taurin a

Xan

Hyp

20

523

85

600-1600

< 37

< 47

< 20

< 100

1

18

6

54.2

38

130-240

a

Mutación silenciosa (SNP) L385L

EFECTO DE MUTACIONES DE SPLICING

EXON SKIPPING

FENILCETONURIA ( PKU ) GEN PAH 12q22.1-q24.2

FENILALANINA HIDROXILASA FENILALANINA

TIROSINA

O2

Hiperfenilalaninemia

H2O

NH2

NH2 CH2 - CH - COOH

CH2 - CH - COOH

PAH OH

Organos afectados: • Cerebro Desmielinización Neurotransmisión alterada • Piel y pelo más claros SIN TRATAMIENTO DAÑO NEUROLÓGICO RETRASO DESARROLLO

L-Phe

L-Tyr BH4

BH2

Tetrahidrobiopterina

NADP+

Dihidrobiopterina

DHPR

NADPH+H+

TRATAMIENTO PRECOZ DESARROLLO NORMAL

FENILCETONURIA

PERFIL METABÓLICO DE FENILCETONURIA

Fenilalanina

Ác. Fenilpirúvico

Ác.2-OH-Fenilacético

Ác. Fenilláctico

Ác. Fenilpirúvico

Ác. Fenilláctico

Patrón Interno

Ác. 2-OHFenilacético

Ác. Mandélico

Tirosina Ác. Fenilacético

Ác. Fenilacético

FENILCETONURIA (PKU)

Missense Deleción Splicing Silenciosas Nonsense Inserciones

62% 13% 11% 6% 5% 2%

> DE 600 MUTACIONES

Cromosoma 12 q22-q24.1

http//:www.pahdb.mcgill.ca

CORRECCIÓN METABÓLICA BASADA EN EL FENOTIPO Chr 13

Cromosoma

DNA

Restricción del sustrato (DIETA) cDNA

Terapia enzimática Proteína

Suplemento del Cofactor Transplante de órganos Cofactor (vitamina)

q32.3

terapia génica y terapia celular

SUSTRATO

PRODUCTO

TRATAMIENTO DIETÉTICO

APLICABLE A TODOS LOS EIM DONDE EL SUSTRATO SEA EXÓGENO

• AMINOACIDOPATÍAS • ACIDEMIAS ORGÁNICAS • DEFECTOS HIDRATOS DE CARBONO • DEFECTOS DE -OXIDACIÓN…

Restricción del sustrato

(DIETA)

TRATAMIENTO DIETÉTICO EN FENILCETONURIA NH2 HOOC

+O2

L-Fenilalanina

• RESTRICCIÓN DE LA PHE DE FORMA INDIVIDUALIZADA y SUPLEMENTACIÓN con TIROSINA. • Componentes de la dieta en cantidades normales, según edad • Requerimientos proteicos (ESPGAN en neonatos: 2.8g proteinas/100Kcal • Comprobación del equilibrio calórico de la dieta: 100-120 Kcal/Kg/día ( de las que el 10% las aportan las proteinas; 50-60% los carbohidratos y 30-40% las grasas) • Suplementar con vitaminas y minerales. (Con carnitina solo en caso se deficiencia)

(BH4)

Fenilalanina Hidroxilasa (PAH)

NH2

SEGUIMIENTO BIOQUÍMICO Y CLÍNICO DEL TRATAMIENTO OH

•

Control Phe plasmática (Niveles de phe terapeúticos < 6mg%). • Revisiones clínicas periódicas (control estatuponderales, Evaluación desarrollo psicomotor, test de IQ).

HOOC L-Tirosina

Restricción del sustrato

Tratamiento para toda la vida (DIETA)

ANALISIS FUNCIONAL DE MUTANTES Terapia Génica Enzimática

Estructura/ Función

Nuevas Posibilidades Terapéuticas

Tratamiento con cofactor p.e. BH4 en PKU KUVAN®

REEMPLAZO ENZIMATICO “PAL” (PEGYLASE®)

¿qué es la terapia génica?

Enfermedades genéticas incurables: gen es el agente terapéutico

TERAPIA GENICA: GEN PMM2

Ex vivo: células manipuladas en cultivo y reinsertadas en el paciente (hematopoyéticas) In vivo: introducir directamente el gen terapéutico

Virus que introducen el gen en a célula Nanopartículas

BH4

MUTATIONS ASOCIATED WITH BH4 RESPONSIVENESS IN PKU PATIENTS Oligomerization domain

E178

I65 P244 R68

BH4

F39

Fe

Y414

Regulatory domain

A313

R261 A300 L308

R408A309

A373 V388

Catalytic domain

GENOTYPE-SPECIFIC THERAPIES: COFACTORS AND VITAMINS

BH4

NH2

+O2

HOOC

L-Phenylalanine

(BH4)

L-Phe (mmol/L)

PHARMACOLOGICAL TREATMENT USING BH4: OVERLOADING TEST (CLINICAL ASSAY) 1800

BH4

12562 12528 10637

1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

0

1

2

3

4

6

8

12

16

20

24

time (h)

PAH

NH2

OH

POSITIVE RESPONSE TO BH4

NEGATIVE RESPONSE TO BH4

Reduction of Phe levels > 30% (at 8 h) compared to basal levels (t=0)

No reduction of Phe levels

HOOC

L-Tyrosine

GENOTYPE-SPECIFIC THERAPIES: COFACTORS AND VITAMINS

SLOW RESPONSE BH4 Reduction of Phe levels > 30% (at 12-16 h) compared to basal levels (t=0)

TERAPIA ENZIMÁTICA EN REEMPLAZO ENZIMÁTICO Fenilalanina hidroxilasa humana (PAH) NH 2

+O2

HOOC

SUSTITUCIÓN ENZIMÁTICA Fenilalanina amonio liasa(PAL) NH2 HOOC

L-Fenilalanina

L-Fenilalanina

PAH Dominio de Oligomerización

PKU

+O2

PLANTAS Y LEVADURAS

PAL

BH4

(BH4)

No Cofactor Dominio Regulador Dominio Catalítico

NH2

OH

+Tyr Amonio (cantidades insignificantes) Ácido Transcinámico (metabolito inócuo)

HOOC L-Tirosina

Ácido benzoico (rápidamente excretado en orina como hipurato) Gamez et al. Mol. Ther (2005)

Terapia enzimática

ACIDEMIAS ORGANICAS Valine Isoleucine Threonine Methionine Odd-chain fatty acids Cholesterol

Propionyl-CoA Carboxilase (PCC)

H2C-CH3 CO-S-CoA +

HCO3

PROPIONIC ACIDEMIA

X

COOH HC-CH3 CO-S-CoA

Biotina ATP D-Methylmalonyl-CoA Mg2+ Methylmalonyl-CoA epimerase

Methylmalonyl-CoA Mutase (MCM) COOH

METHYLMALONIC ACIDEMIA

Krebs cycle

H2C-CH2 CO-S-CoA Succinyl-CoA

X

AdoCbl

COOH H3C-CH CO-S-CoA L-Methylmalonyl-CoA

PERFIL METABÓLICO DE ACIDURIA METILMALÓNICA

Propionil-CoA

Succinil-CoA

Patrón Interno

Metilmalonil-CoA

Ác. 3-OHPropiónico

Ác. Metilmalónico

Ác. Metilcítrico (2 picos)

DNA

TRANSCRIPCION RNA Intrón

R

Exón

aminoácido

Splicing mRNA

L A F T

mRNA D L

D tRNA

M

CODON ATG

TAG

R

S

W

Proteína truncada TAG

TRADUCCION Proteína Completa mal plegada

TERAPIAS ESPECÍFICAS DE MUTACIÓN TRATAMIENTO ES ESPECÍFICO DEL TIPO DE MUTACIÓN LOS PACIENTES DEBEN SER GENOTIPADOS MUTACIONES DEBEN SER FUNCIONALMENTE ANALIZADAS

TERAPIA ANTISENTIDO BLOQUEO DE SITIOS DE SPLICING

MUTACIONES QUE ACTIVAN INSERCIÓN DE PSEUDOEXONES

TERAPIA ANTISENTIDO Blocking exonic splice sites

Blocking intronic splice sites

normal splicing

normal splicing

El AO bloquea del sitio

Pseudoexon exclusion

nuevo de splicing

normal splicing

Exon

pseudoexon

Exon

Los sitios naturales de splicing están intactos Pérez et al. et al JIMD 2010

•

TERAPIA ANTISENTIDO OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO tipo MORFOLINOS

 Moléculas antisentido modificadas complementarias al mRNA  Son moléculas estables en sangre  Resistentes a nucleasas  Atraviesan la membrana por endocitosis, entran el la célula y llegan al núcleo donde actúan.  Permiten la traducción del mRNA  Llegan a todos los tejidos y atraviesan la BBB

TRATAMIENTO MUTACIONES SIN SENTIDO nonsense mutation 5’

3’

PTC

EJC

transcription

mRNA

disease gene

translation

NMD

degraded mRNA

- TRATAMIENTO FARMACOS SUPRESORES

PROTEINA TRUNCADA INACTIVA

PROTEINA COMPLETA ACTIVA

PROTEINA COMPLETA INAACTIVA

CHAPERONAS FRAMACOLÓGICAS. •10000 compuestos de alta pureza •MW 120-500 •Criterios de química médica •Sillares químicos susceptibles de modificaciones para desarrollar fármacos •Librería de compuestos con potencial actividad de chaperona química o farmacológica

LAS CHAPERONAS FARMACOLÓGICAS SON PEQUEÑAS MOLECULAS QUE ESTABILIZAN LAS PROTEINAS DE FORMA ESPECÍFICA

VENTAJAS • Atravesarían la barrera hematoencefálica • Llagarían a todos los tejidos • Son muchos los pacientes a tratar • Fácilmente administrables

PASOS A SEGUIR EN LAS TERAPIAS

Estudio in vitro en células en cultivo (proof-of-concept) MODELOS CELULARES (iPS)

Animales de experimentación y verificar su eficiencia así como ausencia de toxicidad o efectos secundarios

Probar en un pequeño número de pacientes voluntarios (ENSAYOS CLINICOS)