c

A

.

p I T

u

L

o

4

ENZIMAS

En los tres capftulos anteriores se esquematizaron las esnplLlesitos complejos, entre los que se incluyen azucares y ~014ecutlaS que estos constituyen. Los ttes capftulos siguienlas estructuras de otros compuestos de alto y bajo muchos de estos compuestos se ha logrado en el el recuadto 3.D), pero la capacidad de los qufminaturales ha sido puesta a prueba considerablenaturaleza. Los qufmicos han empleado grupos frecuencia sOlo han obtenido rendimientos I)JDlolc!:Cula. Los mismos procesos de smtesis :inalriamente por las celulas, principalmencatalizadores de naturaleza protefnica en la sfntesis de compuestos biol6a la celula de energfa, destoxifison responsables de virtualmente las cuales se forman 0 rompen cruciales de las reaceiones biobiol6gicas mas sencillas pero una forma pura y funcional. ~oqU1nIU'CQS se han centrado de algunas de las medide enzimas para d61ares anualmen-

737

132

Enzimas

maso, 0 cuarto estomago, de un becerro mamanton contiene quimosina, Hamada originalmente renina, una enzima que degrada un glicopeptido procedente de una forma de la protefna casefna de la leche. EI resto de la molecula de casefna, que forma un complejo con calcio, precipita para formar el cuajo en la etapa inicial de produccion de quesos. La quimosina representa casi el 10% del uso de enzimas en productos industriales y domesticos. Las enzimas que degradan el almidon y que se utilizan en el procesamiento de alimentos, asf como las enzimas proteolfticas que se emplean para elaborar alimentos y fabricar detergentes de lavanderfa, representan casi tres cuartas partes del uso de las enzimas. Las enzimas se utilizan tambien como reactivos analfticos y para varios otros fines. Con frecuencia, las enzimas se emplean en solucion. No obstante, esta creciendo la aplicacion de "enzimas inmovilizadas" (v ease el recuadro 4.A) en procesos industriales .

RECUADRO 4.A

ENZIMAS INMOVILIZADAS

En 1974 la escasez hizo que aumentara considerablemente el precio del azucar de mesa, sacarosa. El azucar de mesa por si sola representaba solo una parcion del con sumo de azucar de cafia y de remolacha, ya que la sacarosa se utilizaba para endulzar y espesar pasteles, jarabes, dulces y otros alimentos . EI jarabe de mafz fue y es una fuente mucho menos costosa de azucares principal mente glucosa. Sin embargo, la glucosa no es suficientemente dulce para los prop6sitos de los reposteros. La enzima glucosa isomerasa cataliza la conversi6n de glucosa en fructosa, que es casi dos veces tan dulce como la glucosa. Las celulas liofilizadas de ciertas especies de Streptomyces (un genero de hongos), que son ricas en dicha enzima, se han utilizado para producir comercialmente "jarabe de maiz de alto contenido de fructosa". La agitaci6n de las celulas secas con la dilucion apropiada del jarabe de maiz aumenta el contenido de fructosa. Este proceso y el incremento de precio de la sacarosa en 1974 estimularon la aplicaci6n de una nueva tecnologia que se origin6 en la decada de 1950: la tecnologia de las enzimas inmovilizadas. Estas son enzimas unidas por cualquiera de varios medios a un soporte s6lido , por 10 general pequefias esferas . Es probable que la enzima inmovilizada que ha convertido en condiciones industriales el mayor numero de moles de sustrato en producto sea la glucosa isomerasa. . Las enzimas unidas a un soporte s6lido tienen varias ventajas pnicticas. Las enzimas inmovilizadas pueden separarse facilmente de una suspensi6n, con frecuencia mediante la simple sedimentaci6n; 10 que hace que virtualmente no quede ninguna cantidad de enzima que contamine el producto y permite recuperar la enzima en una forma reutilizable. Con frecuencia, las enzimas inmovilizadas son mas estables a la inactivaci6n en un arnbiente acuoso que la enzima disuelta correspondiente. En algunos procesos industriales, la enzima inmovilizada es reutizada varias veces durante varios meses antes de que deba ser sustituida. Una de las desventajas de las enzimas inmovilizadas es que no acruan sobre sustratos insolubles y pueden presentar s610 una baja eficiencia ante sustratos polimericos . Una de las aplicaciones mas frecuentes de las esferas 0 soportes con la enzima ligada es en la columna de un reactor. Las esferas se colocan en un cilindro de fondo poroso de modo que el liquido, pero no las esferas, fluyan a traves de la columna, en forma similar a como ocurre en la cromatograffa de columna (vease el recuadro 3.B), pero a una escala mucho mayor. EI reactivo, por ejemplo una soluci6n de jarabe de maiz, se hace pasar a traves del reactor para convertirlo en producto que sale en la corriente del efluenteo Este proceso continuo tiene ventajas obvias en una planta industrial. Se han descrito varios metodos para inmovilizar enzimas. Cuando la poliacrilarnida y la metil-bi-acrilarnida (recuadro 3.E) se polimeriza en una soluci6n de la enzima, esta queda atrapada en la matriz . La matriz de poliacrilamida permite que los sustratos de bajo peso molecular lleguen a la enzima, pero esta permanece en su sitio. Por supuesto, este metodo dara buenos resultados s610 con una enzima que no se inactive

Propiedodes generales de los enzimos

133

significativamente cuando tenga lugar el inicio y la extension de las cadenas de poliacrilamida. En otros procedimientos, la enzima puede ser adsorbida en (0 unirse qufmicamente a) la superficie de esferas duras o cristales de substancias casi inertes qufmicamente (en las condiciones de reaccion de la enzima) como acero inoxidable, vidrio 0 celulosa). La enzima puede encapsularse en esferas huecas hechas de un material permeable al sustrato y al producto. Se ha hecho un considerable esfuerzo por encontrar metodos que fijen 0 retengan a la enzima y permitan al mismo tiempo que esta conserve su actividad. Un proceso de inmovilizacion industrialmente importante es el acoplamiento qufmico de la glucosa isomerasa a esferas de vidrio. Con frecuencia, la enzima misma no es inmovilizada; en lugar de ello, las celulas que la contienen son las que se inmovilizan. El procedimiento de celulas intactas reduce los costos debido a que la enzima no necesita ser purificada y, con frecuencia, queda protegida al permanecer en la celula. Las nuevas tecnicas de ingenierfa genetica permiten obtener hongos y bacterias con concentraciones anormalmente altas de enzima especfficas .

4.1

PROPIEDADES GENERALES DE LAS ENZIMAS La existencia y capacidad de las enzimas se conoci6 por vez primera durante el siglo diecinueve cuando se encontr6 que las reacciones que se habfan considerado, s610 ocurrfan en presencia de celulas, tarnbien eran mediadas por extractos libres de estas. En 1860, Berthelot rompi61evaduras moliendolas en un mortero con abrasivo. Esto produjo un extracto libre de celulas. Una fracci6n de este extracto, precipitada con etanol, cataliz6 la conversi6n de sacarosa en glucosa y fructosa, una reacci6n que las levaduras intactas Bevan a cabo. Otras reacciones hidrolfticas habfan sido detectadas previamente en otras preparaciones libres de celulas e incluso mas crudas, como el juga gastrico (hidr6lisis de protefnas) y la saliva (hidr6lisis de almid6n). A principios del presente siglo, las reacciones catalizadas por enzimas eran ya tema de amHisis matematicos, pero no fue sino hasta la decada de 1920 que la naturaleza protefnica de las enzimas se hizo evidente. Este resultado se debi6 a la cristalizaci6n de la enzima ureasa (que hidroliza la urea) por Sumner y varias enzimas hidrolizantes de protefnas por Northrop. Se demostr6 que las preparaciones de enzimas ten fan una relaci6n constante de actividad enzimatica respecto a la masa de protefna a traves de cristalizaciones multiples, dando pruebas firmes de que las moleculas de protefna, en vez de constituir un contaminante, son los catalizadores reales. Como el ejemplo de la ureasa, las enzimas y grupos de enzimas se nombran en general agregando el sufijo -asa al nombre 0 nombre abreviado del compuesto sobre el cual actua la enzima. Las enzimas que causan la ruptura de la cadena polipeptfdica al reaccionar con agua se conocen, como grupo, como proteinasas. Las peptidasas muestran una especificidad similar, pero facilitan la hidr6lisis de los peptidos mas eficazmente que la hidr6lisis de las moleculas de protefna de mayor tarnano y que presentan un plegamiento compacto. Se considera que todas estas enzimas son miembros de un grupo mas grande: el de las "hidrolasas", enzimas que rompen los enlaces por la incorporaci6n de una molecula de agua. Aunque el sufijo -asa se utiliza ahora ampliamente, muchas de las enzimas mas estudiadas y que se descubrieron primeramente no se nombran de esta forma. ~Que compuesto(s) es(son) el(los) reactivo(s) en una reacci6n qufmica? Y ~cuaI(es) es(son) el(los) producto(s)? Por supuesto, esto es en gran parte un asunto de defini-

134

Enzimas

ci6n. De manera similar, en una reaccion catalizada por enzimas, la designacion de(l)(los) sustrato(s) [es decir, el(los) reactivo(s)] y el(los) producto(s) es arbitraria. No obstante, los investigadores suelen tomar en cuenta factores como los siguientes: 1. Equilibrio (a favor de los productos). 2. Direccion en la cualla reaccion catalizada por la enzima puede analizarse facilmente in vitro (del sustrato al producto). 3. 0 bien, la direccion probable que sigue la reaccion predominante in vivo (formacion neta de los compuestos que son designados como productos; vease tambien la secci6n 4.4). Los dos ultimos puntos no solo dependen de la constante de equilibrio, sino tambien de las concentraciones relativas de los sustratos y los productos. Las enzimas aumentan la rapidez 0 velocidad de las reacciones quimicas. En algunos casos, la rapidez de una reaccion particular catalizada por enzimas es tan baja en ausencia de la enzima que no puede detectarse ante la gama de reacciones con las cuales compite. Como todos los catalizadores, una enzima funcionani a una concentraci6n molar mucho menor que la del(los) reactivo(s) sobre el(los) cual(es) funciona. En estas condiciones, la enzima no altera el equilibrio de la reaccion, y un mol de enzima facilita la conversi6n de muchos moles del reactivo en producto. Este punto volveni a considerarse al desarrollar una descripcion matematica de las reacciones sencillas catalizadas por enzimas en la secci6n 4.3. Comparadas con la mayorfa de los catalizadores, las enzimas son especialmente eficaces. Son eficientes, catalizan reacciones a altas velocidades a temperaturas moderadas y en condiciones benignas, haciendo que los extremos de pH, presi6n, etc. sean innecesarios. Las enzimas son tambien catalizadores particularmente especfficos y suelen actuar sobre solo una forma de un compuesto opticamente activo, aun cuando este se encuentre en una mezcla de formas quirales. Muchas enzimas presentan tambien la capacidad de acoplar dos reacciones quimicas que tienen reactivos y productos muy distintos. Esto permite que una reaccion que no es energeticamente favorecida se acople a otra reaccion que si 10 es, de modo que se alcance un grado de conversi6n razonable en el caso de la primera reaccion. Ejemplos de reacciones acopladas se dan en la seccion 4.9 y en el capitulo 9. Por ultimo, muchas enzimas son controladas en cuanto a su eficiencia catalftica por las concentraciones del sustrato 0 producto. Tambien pueden ser controladas por compuestos metabolicamente importantes que no se asemejen ni a los sustratos ni a los productos de la enzima. Esta propiedad, que es de gran importancia para la regulacion del metabolismo, se denomina "alosterismo" y se estudia en la seccion 4.12.

4.2

COMO LAS ENZIMAS ACELERAN LAS REACCIONES Hace mucho tiempo, algunos investigadores sostenian ideas ingenuas sobre las enzimas al seiialar que de alguna manera eran capaces de facilitar la conversi6n del sustrato en producto "al actuar a distancia" , operando fuera de las leyes conocidas de la quimica y la fisica. Aunque por ahora no existe reacci6n alguna catalizada enzimaticamente que pueda explicarse del todo como una serie de reacciones quimicas, paso a paso microscopico, es axiomatico que la actividad de las enzimas pueda explicarse en terminos de los mecanismos de la quimica organica y que un elemento esencial de los mecanismos enzimaticos sea la uni6n de sustratos (y productos). Co-

Como las enzimas aceleran las reacciones

135

mo se sefiala a continuaci6n, la uni6n especffica no s610 explica la eficiencia catalftica de las enzimas, sino tambien su selectividad por el sustrato. Mucho se sabe ahora acerca de los aspectos fisicos , qufmicos y estructurales de las enzimas como moleculas de protefna, asf como de las reactividades peculiares de residuos de aminoacidos especfficos dentro de la molecula de enzima. Alguna vez se pens6 que la identificaci6n y localizaci6n de los residuos aminoacilos asociados con un sitio catalftico explicarfa la actividad catalftica de una enzima. Hoy en dfa, los bioqufmicos entienden que este punto de vista, aunque esencial, es insuficiente. En afios recientes, los qufmicos que estudian las enzimas han creado con mucho ingenio reactivos para localizar e identificar los sitios activos de las enzimas. Tecnicas fisicas altamente elaboradas como la espectrometrfa de resonancia magnetica nuclear y la cristalografia de rayos X de alta resoluci6n han proporcionado al investigador informaci6n crftica sobre la estructura de las proteinas, 10 cual tiene importantes implicaciones para entender a las protefnas como catalizadores. La eficiencia de las reacciones enzimaticas requiere claramente que la energfa de activaci6n de la reacci6n enzimatica sea significativamente menor que la de la reacci6n no enzimatica correspondiente, como se sefiala en la figura 4.1. Esta reducci6n de la energfa de activaci6n podrfa lograrse si la enzima tuviera que utilizar el mismo mecanismo que la reacci6n no enzimatica y simplemente facilitara el proceso. Sin embargo, tambien es posible, en una reacci6n enzimatica da-

, - _ . _.....

_ --- .......

....

----f " ~*

=:--_._--

----r-----t.ENE

-_._---'--------

Coordenadas de reacci6n

FIGURA 4.1 Barreras de energfa para una reacci6n catalizado enzimaticamente y 10 reaccion A - B correspondiente no catali za da. A NE , es el complejo acti va do del estado de transicion para 10 reacci6n no enzimaticai A E, es el complejo correspondiente para la reaccion catalizada enzimaticamente . .:lG es 10 diferencia entre el mayor contenido de energfa del reactivo A y el menor contenido de energfa del producto B. Para 10 reaccion no enzimatica, el sfmbolo .:lENE es 10 diferencia entre las energfas del complejo activado y el reactivo. La cantidad correspondiente para 10 reaccion enzimatica es .:lEE.

136

Enzimas

da, que la enzima uti lice un mecanisme que sea demasiado des favorable desde el punto de vista energetico para ser importante en una reaccion comun en solucion. Por ultimo, la enzima puede subdividir la reaccion en varias etapas microscopicas, cad a una con una pequefia energfa de activacion. EI que dicha subdivision ocurra se demuestra por la recuperacion de "intermediarios covalentes", compuestos formados por la reaccion de una enzima con un sustrato antes de liberar el ultimo producto de la reaccion. En la seccion 4 .5 se describe dicho intermediario. La union del sustrato ocurre en 0 cerca de una region de la molecula de enzima conocida como sitio activo. Estructuralmente, el sitio activo puede ser una hendidura como la que se encuentra en las proteinasas papafna 0 quimotripsina (figura 3.14) 0 la ribonucleasa A pancreatica, 0 bien puede ser una concavidad profunda como en la anhidrasa carbonica, en la cual el atomo de cinc cataliticamente esencial se localiza en el fondo de la depresion. Cualquiera que sea la forma del sitio activo, el sustrato adecuado se une al parecer solo en la orientacion requerida. Los residuos de aminoacidos de la enzima que forman el sitio activo derivan por 10 general de segmentos no adyacentes de la cadena polipeptfdica. En la ribonucleasa pancreatica, por ejemplo, los residuos de histidina en la posicion 12 y la posicion 119 de la cadena de 124 residuos de aminoacidos forman parte del sitio activo. Las opiniones actuales sostienen que grupos ionicos nuc1eofflicos y otros grupos reactivos de la molecula de enzima se encuentran ubicados adecuadamente en el sitio activo para la catalisis. Dentro del sitio activo, propiedades como la constante dielectrica, grado de solvatacion y. obstruccion esterica pueden ser muy distintas que en solucion. En dicho ambiente, los grupos reactivos tanto en la enzima como del sustrato pueden mostrar una reactividad especial. La forma precisa del sitio activo permite que las porciones de los sustratos se unan con firmeza, como se observa directamente a traves del analisis cristalografico con rayos X de algunos complejos de enzima y sustrato. La enzima lisozima, que se encuentra en las lagrimas y la clara del huevo asf como en muchos otros fluidos biologicos, cataliza la hidrolisis de las cadenas de polisacaridos de la capa de peptidoglicanos de la pared celular de algunas bacterias. La energfa de interaccion calculada de una pore ion del sitio activo de la lisozima con un anillo de glucopiranosa, que solo incluye enlaces no covalentes, es de aproximadamente - 59 kJ/moi. Este valor es comparable a la energfa de un enlace N- H en un ion alquil amonio. La capacidad ya mencionada que tienen las enzimas de distinguir entre dos 0 mas formas quirales de un sustrato demuestra que debe haber cuando menos tres puntos

Sustrato

I

t

ctl,~}""m'

Sitios de uni6n especificos

Sitio activo

FIGU RA 4.2 Representacion esq uem6tico del acomodamiento de un sustrato a su sitio activo en 10 estructura de una proterno enzim6tica.

Como las enzimas ace/eran las reacciones

137

de contacto entre la enzima y el sustrato para hacer una distincion quiral. En la figura 4.2 se indica como el concepto de la "union en tres puntos" permitini que una enzima rechace la forma quiral equivocada de una molecula que no es el sustrato. Los grupos a, Y a2 de la figura 4.2 pueden ser los mismos 0 distintos, yen un sustrato quiral, a" a2, by d senin distintos. Los sitios de union correspondientes para los tres grupos del sitio activo se design an por las mismas letras con dos comillas. Tres puntos de union Ie permitinin a la enzima funcionar en forma quiral aun sobre un sustrato no quiral, indicado por a, = a2 en la figura 4.2. Sin importar si a, y a2 son iguales 0 distintos, solo existe un punto de union del sustrato en el sitio activo. Es claro que la mayorfa de los sustratos tendnin mas de tres "puntos de union" a la enzima para explicar tanto la eficiencia como la especificidad de las reacciones catalizadas enzimaticamente. Es de esperarse que estas interacciones adicionales entre el sustrato y la enzima aumenten la especificidad, tanto quiral como de otro tipo, de las enzimas mas alIa de las posibles contribuciones con solo tres puntos de union. Un ejemplo de una reaccion quiralmente especifica es la catalizada por la Laminoacido oxidasa, que ataca solo a los L-aminoacidos. Las diferentes D-aminoacidos oxidasa solo acruan sobre los isomeros de D-aminoacidos. L-Aminoacido _ _ _-'-0=-2- - _ . a-cetoacidos L-Aminoacido oxidasa

+ NH3 + H20 2

O2

D-Aminoacido - - --'-=----. a-cetoacidos o-Aminmkido oxidasa

+NH 3 + H2 0 2

Algunas enzimas como las racemasas reconocen ambas formas quirales del sustrato. Las racemasas catalizan el equilibrio de las dos formas opticas. De esta manera, la alanina racemasa cataliza la reaccion: L-Alanina;;::=::: D-Alanina

Otras enzimas muestran especificidad hacia los isomeros geometricos 0 cis-trans. La fumarasa afiadira agua rapidamente a traves del sistema de doble enlace del isomero trans del acido fumarico, pero es total mente inactiva hacia el isomero cis del acido maleico. Las enzimas incluso suelen tratar en forma distinta dos grupos identicos de un sustrato. Como ejemplo de tal sustrato, considerese el citrato, que es un compuesto simetrico no quiral. El efecto neto de la actividad de la enzima aconitasa es intercambiar el grupo hidroxilo del atomo de carbono central del citrato y un proton de uno (y solo uno) de los dos grupos de acido acetico, de otra manera identicos . EI producto de esta reaccion reversible es el compuesto quiral isocitrato (acido isocitrico). OH

I Aeoni!asa HOOC-H 2 C-C-CH2 COO H ;::.====:::: I COOH Acido citrico

OH

I

H

I I

HOOC-CH-C-CH -COO H 2

COO H Acido isocftrico

Dos de los cuatro grupos en torno al atomo de carbono central de la figura 4.2 se designan como a, Y a2 para indicar la posibilidad de tratar en forma distinta dos grupos identicos, como se muestra en los siguientes esquemas.

738

Enzimas

En el caso de un sustrato simetrico general:

Para un sustrato simetrico especifico:

Acido cftrico

Y para un producto quiral especifico: H

I

c

_-----_

I ~CH2COOH) COOH --------Acido isocitrico

Como se indica en la figura 4.1, tanto la reacci6n catalizada enzimaticamente como la reacci6n comun en soluci6n deben ocurrir por activaci6n del sustrato (0 el complejo enzima sustrato) para formar el "complejo de estado de transici6n" activado, el cual presenta una conformaci6n muy especifica, de alta energia y dificil de lograr que facilmente puede degradarse en el(los) producto(s). Aumentar la concentraci6n de los complejos de estado de transici6n es un factor esencial en el proceso de catalisis. El sitio activo tiene la capacidad de unir reactivos a una concentraci6n adecuada y en una orientaci6n y conformaciones favorables. Estas condiciones puederr lograrse en soluci6n libre, cuando menos te6ricamente, pero s610 como eventos raros. Ademas, la enzima, a causa de su afinidad por diferentes porciones del sustrato (0 sustratos), puede causar deformaciones mecanicas, electrostaticas 0 ambas en el sustrato. Mediante la selecci6n adecuada de las cadenas laterales de aminoacidos y las porciones de la columna vertebral del polipeptido que forman la pared del sitio activo, probablemente la polaridad y las posiciones de los grupos reactivos, como acidos y bases, puedan optimizarse para su acci6n catalitica. Las comparaciones de la energetica de formaci6n de un complejo de estado de transici6n en una reacci6n catalizada enzimaticamente y otra que ocurre libre en soluci6n muestran que la energetica mas favorable de la primera reacci6n se debe principalmente a una disminuci6n de entropia. Es decir, parece ser que la enzima tiene la capacidad de reducir la diferencia entre la libertad de movimiento disponible para el sustrato y el disponible para el complejo de estado de transici6n. Este ultimo, por definici6n, muestra grandes limitantes en cuanto a su traslacion, vibracion y rotacion. Obviamente, el proceso de uni6n del sustrato es en sf mismo restrictivo, 10 cual reduce por tanto la diferencia de entropfa. Este fenomeno se conoce en ocasiones como "captura de entropia". La importancia de aumentar las concentraciones de los reactivos y disminuir su libertad de movimiento es ilustrada incluso por reacciones comunes de quimica organica. Comparese la hidr6lisis de la aspirina en agua con la hidrolisis de un acetil-

Como las enzimas aceleran las reacciones

139

fenol con un grupo, X, situado en la posici6n orto respecto del grupo acetoxi y seleccionado para que tenga el efecto inductivo de un grupo carboxilo. En la segunda reacci6n, se aiiade acetato como catalizador para sustituir el carboxilo del anillo de la aspirina que funciona como catalizador interno.

o

~

0

II

/I C-O-

I

( X O-C-CH /I 3

(XC-O+ HOH -

~

I

i + CH 3-C-OH

OH

o Aspirina

o

I X +HOH ( X ~ O-C-CH /I 3

H3 C- C- O-

"

o La constante de rapidez de primer orden para la hidr61isis de la aspirina tiene las unidades de seg - 1, mientras que la constante de rapidez de segundo orden para la hidr61isis del derivado de acetilfenol, promovida por el ani6n acetato, tiene las unidades M-1seg -I. jLa proporci6n de la constante de rapidez de primer orden respecto de la constante de rapidez de segundo orden es de 13M: es decir, la incorporaci6n del grupo carboxilo en la misma molecula, en la posici6n orto, parece equivaler a aumentar la concentraci6n de acetato, en la hidr6lisis promovida del derivado de acetilfenol, hasta 13M a la temperatura ambiente. Sin embargo, los efectos de la posici6n y la orientaci6n, as! como las concentraciones, pueden promover la reacci6n. El estudio de dependencia de la temperatura muestra que el termino entr6pico es el que disminuye principalmente en la reacci6n mas favorable de la aspirina. Linus Pauling estableci6 en 1948 uno de los conceptos importantes de la catalisis enzimatica: Creo que las enzimas son moleculas complementarios en cuanto a estructura a los complejos activados de las reacciones que catalizan. La atraccion de 10 enzima por el complejo activado lIevaria de esta forma a una disminucion en su energia y, como consecuencia, a una disminucion de 10 energia de activacion de 10 reaccion yo un aumento en 10 rapidez de esta.

Varias observaciones apoyan el punto de vista de Pauling de que las enzimas deben unirse firmemente a los sustratos; pero que en el caso del complejo del estado de transici6n 0 alguna estructura muy estrechamente relacionada la uni6n debe ser aun mas fuerte. En la secci6n 4.5 se dan detalles de una observaci6n de este tipo. La necesidad de un sitio activo de diseiio preciso y controlado es, sin duda, un factor que contribuye a la evoluci6n de las enzimas como macromoleculas. Es posible que s610 una mactomolecula tenga una suficiente rigidez y que excluya suficientemente al disolvente para proporcionar el ambiente necesario para que se efectue una catalisis eficiente. El gran tamaiio quiza sea necesario tambien para proporcionar sitios destinados a la uni6n de moleculas que controlen la actividad enzimatica (vease la secci6n 4.12). Por ultimo, un gran tamaiio puede ser necesario para resistir la acci6n de las proteinasas y otros agentes potencial mente nocivos .

140

Enzimas

4.3

LEY DE RAPIDEZ PARA UNA REACCION SIMPLE CAT ALiZADA POR ENZIMA Considerese una reaccion con un reactivo, el sustrato S, y un producto, P. S~P

(4.1)

Si la reaccion es catalizada por una enzima, los sustratos y productos, asf como sus concentraciones de equilibrio, permanecen iguales, 10 cual significa que la enzima, E, acelera las reacciones en los dos sentidos. E

S~P

(4.2)

Es por su union con el sustrato que la enzima efecrua la conversion a producto, y este hecho puede expresarse como un mfnimo de dos equilibrios. (4.3)

Desde luego, muchos otros intermediarios son posibles en dicha reaccion, debido a interconversiones de varias formas de la enzima, sus complejos 0 ambos con el sustrato y el producto. Por ejemplo, se espera que EP sea un intermediario entre ES y E + P. Sin embargo, puesto que por 10 general un paso limita la rapidez de la reaccion, la ecuacion 4.3, aunque incompleta, proporciona una descripcion util de los procesos de rapidez de muchas reacciones catalizadas por enzimas. Las medici ones cineticas mas comunes de las reacciones catalizadas por enzimas son las del incremento uniforme en la concentracion del producto que ocurre en una solucion diluida de la enzima, ala cual se ha afiadido un exceso de sustrato. Inmediatamente despues de que E y S se mezclan, el producto comienza a formarse a una rapidez constante. Este incremento constante en la concentracion del producto, d[P]/dt, se designa como vo, la "velocidad inicial en estado estacionario". Se considera que Vo es una velocidad inicial porque solo se consume una proporcion muy pequefia del sustrato mientras se estan haciendo las mediciones . De este modo, para fines practicos, [S] es constante, y la Vo que se mide corresponde al valor inicial de [S]. La concentracion del producto, [P], sera muy pequefia en las condiciones antes descritas. De esta manera, puede pasarse por alto la reacci6n inversa de E con P para formar ES, de tal forma que la ecuacion 4.3 se convierte en: k

k

E + S ~ ES -2.. E + P L,

(4.4)

En las ecuaciones 4.3 y 4.4 esta implicita la recirculacion de E. En estas ecuaciones, la forma de la enzima que se libera con P a partir de ES se ha designado con el mismo sfmbolo E, que la especie que reacciono con S. Esta identidad es necesaria para que E sea el catalizador. Por definicion, un catalizador no es consumido por la reaccion que cataliza. La recirculacion de E esta representada explicitamente en la ecuacion 4.5. E+ S

1

== k,

k_,

k

ES - 4 E + P

I

(4.5)

Ley de rapidez para una reacci6n simple catalizada por enzima

741

En la reaccion descrita por 1a ecuacion 4.5, habra una " fase de inducci6n" muy breve, por 10 comun con una duracion de solo una fracci6n de segundo , antes de que se alcance 1a velocidad inicia1 en estado estacionario. Por 10 general , esta fase no se detecta 0 se ignora en 1a cinetica de estado estacionario. La concentracion total de 1a enzima en todas las formas se define como Eo. Evidentemente, Eo=[E) antes de que se aiiada el sustrato. Una vez que este se ha aiiadido , Eo = [E) + [ES) . Durante la breve fase de induccion, [ES) aumenta hasta alcanzar su valor de estado estacionario y permanece constante durante esta etapa de la reacci6n , cuando Vo se mide y es constante . Briggs y Haldane uti1izaron la condici6n de estado estacionario de [ES) constante y 1a condicion de velocidad inicial de [S) constante para formular ecuaciones que relacionan Vo con las constantes cineticas y las concentraciones de enzima y sustrato , Eo y [S]. Sus resultados, esbozados aquf, se publicaron en 1925. Debido a que el producto solo puede formarse por el desdoblamiento de ES, gobernado por la constante de velocidad k2 , puede concluirse que la velocidad en las condiciones de velocidad inicial es : (4 .6)

Si se evalua [ES) en terminos de Eo, [S) y las constantes cineticas, la ecuacion 4.6 dara el resu1tado deseado de Briggs y Haldane. Un valor constante para [ES) requiere que las ve10cidades de formacion y degradacion de ES sean iguales. La velocidad de formacion de ES esta dada por la expresion k,[E][S) . Puesto que ES puede perderse en dos reacciones, desdoblandose en E + S 0 E + P, la velocidad de degradacion de ES esta dada por la expresion L ,[ES) + k2[ES). Al igualar las velocidades de formacion y degradacion de ES se tiene que:

Despejando las variables de las constantes y combinando estas ultimas se tiene que: (4.7)

donde Km se designa como la constante de Michaelis, en honor de quien desarrollo las primeras formas de la ecuacion simple de cinetica enzimatica. Dado que en la ecuacion 4.6 aparece [ES) y no [E), se sustituye (Eo-[ES]) por [E) en la ecuacion 4.7 para obtener: (Eo - [ES])[S) = K [ES)

m

Resolviendo esta ecuacion para [ES) se tiene que: [ES) =

Eo[S) [S) + Km

(4.8)

Sustituyendo este resultado en la ecuacion 4.6 se obtiene la expresion: (4.9)

Esta ecuacion es una forma del resultado de Briggs y Haldane .

742

Enzimas

4.4

LAS REACCIONES CATALIZADAS ENZIMATICAMENTE PRESENTAN ClNETICA DE SATURACION En algunos experimentos, es posible que no se conozca la concentraci6n de la enzirna Eo, por 10 que es conveniente sustituir el producto k2Eo por Vrnax , la velocidad maxima. (4.10)

La justificaci6n de esta versi6n modificada de la ecuaci6n de Briggs y Haldane es que la velocidad maxima se alcanzara cuando esencialmente toda la enzima este en la forma ES, es decir, cuando [ES] == Eo. De acuerdo con la ecuaci6n 4.10, que representa el modelo simple de la ecuaci6n 4.4, cuando [S] es igual a Krn , el denominador de la ecuaci6n 4.10 sera 2[S] y el numerador [S] Vmax. Esto significa que la velocidad Vo sera igual a la mitad de la velocidad maxima, Vmax' cuando [S] = Krn· En esta situaci6n, [ES] = 0.5Eo, como 10 indica la ecuaci6n 4.8. En la figura 4.3 se muestra la hiperbola rectangular caracteristica que se obtiene al graficar la ecuaci6n 4.10. Conforme [S] aumenta hasta varias veces el valor de K m , se aproxima a un valor de saturacion, el cual es indicado por Vo que se aproxima a Vmax. Dicha concentraci6n de sustrato, 20 6 100 veces K rn , se dice que es la concentracion de saturacion del sustrato debido a que virtualmente toda la enzima debe estar en la forma [ES]. En la velocidad de la reacci6n no es posible obtener ningun incremento adicional debido a que la concentraci6n de E libre en estado estacionario, [E], es bastante pequeiia. Se sugiere hacer enfasis en la frase "concentraci6n de estado estacionario". Por supuesto, aun cuando exista saturaci6n, la enzima debe oscilar constantemente entre las formas EyES para lograr la catalisis, como se indica en la ecuaci6n 4.5 . A las concentraciones de saturaci6n del sustrato, entonces, la ecuaci6n 4.6 se convierte en: (4.11)

De esta forma, k2 es el cociente VrnaxlEo, el cual es el mimero de moles de sustrato que se convierten en producto por unidad de tiempo dividido entre el numero de moles de la enzima . Este es el mimero de recambio para una reacci6n de un solo sustrato y un solo producto. El numero de recambio de la mayoria de las enzimas

FIGURA 4.3 G rafica de las velocidades iniciales en estado estacionario de una serie de reacciones cata lizadas por 10 misma concentracion de enzimas, variando 10 concentracion de sustrato, [S], para coda reaccion. La velocidad de reaccion se aproxima a Vmax cuando los valores de [S] son muy grandes.

Las reacc;ones cata/;zadas enz;m6t;camente presentan c;net;ca de saturac;6n

143

4

est! dentro del intervalo de 1 a 1 X 10 por segundo, aunque existen tambien algunas enzimas que tienen mimeros de recambio de 10 5 por segundo 0 mas . La anhidrasa carb6nica, que cataliza la hidrataci6n del CO2 para formar acido carb6nico, tiene un mimero de recambio de casi 10 6 por segundo. Como se senala en la secci6n 4.6, la anhidrasa carb6nica es una dentro de un pequeno grupo de enzimas que se aproxima a los lfmites te6ricos de eficiencia de la catalisis enzimatica. EI numero de recambio, que es simplemente k2 para una reacci6n enzimatica descrita por la ecuaci6n 4.4, es una funci6n mas compleja de las constantes cineticas para enzimas que tratan con sustratos y productos multiples. K m , definida por la ecuaci6n 4.7 para una reacci6n de un solo sustrato, es una relaci6n de constantes de velocidad. Para la mayoria de las enzimas, que carecen de numeros de recambio muy grandes, k2 sera mas pequeno que k I 0 k. l • En esta condici6n, Km sera aproximadamente igual a Ks=k. 1lk" la con stante de equilibrio para la disociaci6n de ES en E y S. De esta forma, los valores pequenos de Ks indican una gran afinidad de la enzima por el sustrato, es decir, la formaci6n del complejo ES se ve termodinamicamente favorecida. Los valores tipicos de k m para los sustratos naturales de enzimas esmn dentro de los limites de 10 - 2 a 10 -7M. Cuando [S] es s610 una pequena fracci6n de Km , la velocidad de la reacci6n catalizada enzimliticamente sera, en efecto, muy pequena, como se indica en la figura 4.3, y sera casi proporcional a [S] . De esta manera, es de esperarse que una reacci6n catalizada enzimaticamente sea de primer orden en cuanto a concentraci6n de sustrato a una baja [S], pero de orden cero en el caso de una gran [S], como se indica en la figura 4.3. En las vias metab61icas, varias enzimas pueden participar en la sintesis de un producto final, actuando cada enzima sobre el producto de la enzima anterior. En dicha secuencia de reacciones, una reacci6n, la reacci6n de velocidad lirnitante, puede controlar la velocidad de sintesis del producto final. Dicha limitaci6n puede deberse ala Km 0 a la Vmax (0 a ambas) de una reacci6n. Considerese la secuencia siguiente:

Si la concentraci6n de A en las celulas es de 10 -4M, la enzima Ea se saturara s610 en parte. Es muy probable que Eb presente una mayor afinidad por su sustrato B debido al valor mas pequeno de Km. El resultado sera que conforme se produce B, se consume rapidamente por su conversi6n a C en una reacci6n catalizada por la enzima Eb • De esta manera, es muy probable que la reacci6n A - B sea un factor limitante en la serie de reacciones A-D. En el caso de una serie de reacciones catalizadas por enzimas con diferentes valores de Vmax puede esgrimirse el mismo argumento. Sin embargo, tengase en cuenta que los valores de Km Y Vmax son afectados por el pH, la temperatura, la concentraci6n de iones y otras condiciones que pueden ser diferentes en la celula y en las condiciones in vitro utilizadas para determinar los valores de Km Y Vmax. Se requieren otras pruebas para determinar que reacci6n es el factor limitante de velocidad en una situaci6n in vivo. Experimentalmente, la Km puede estimarse utilizando una grafica de Vo contra [S], como en la figura 4.3, estimando un valor de Vmax Y encontrando despues el valor de [S] que corresponde a una v igual a Vmax l2. Para una reacci6n simple catalizada por enzimas, Km es este valor de [S]. Sin embargo, Vmax es un valor asint6tico y, por tanto, dificil de estimar con exactitud. Asimismo, es posible que no puedan alcanzarse valores muy grandes de [S], por ejemplo de mas de 20 veces el valor de Km , debido a la solubilidad limitada 0 al gran gasto del sustrato . La grafi-

144

Enzimas

ca de Lineweaver y Burk es uno de los varios tipos de analisis que pueden llevarse a cabo para estimar Km Y Vmax' En estos amilisis se utili zan todos los datos de v contra [S], en lugar de s610 aquellos puntos que estan pr6ximos a Vmax Y Km. La gnifica de Lineweaver y Burk se basa en una versi6n de la ecuaci6n 4. 10 que se ha modificado utilizando el recfproco de ambos lados de la ecuaci6n. EI resuItado es: 1

Km ( 1 )

1

~ = Vmax [S] + Vmax que tiene la forma de una ecuaci6n lineal simple, y = mx + b, donde m = KmlVmax y b = llVmax ' En la figura 4.4 se muestra la forma de una gnifica de Lineweaver y Burk, lIv contra 1/[S] . Uno de los inconvenientes de los amilisis donde se utiliza la gnifica de Lineweaver y Burk es que los puntos para valores pequenos de [S] tienden a influir mas marcadamente en los resultados obtenidos. Sin embargo, cualquier analisis de los datos de cinetica enzimatica tiene sus premisas y confiere valor diferente a los punt6s experimentales, por 10 que 10 anterior debe tomarse en cuenta al evaluar los resultados. En la mayorfa de los amilisis, es importante utilizar valores de [S] que sean significativamente tanto mayores como menores que Km . Ademas, el investigador siempre debe tener en cuenta que los valores de Km Y Vmax derivados de graficas de Lineweaver y Burk y analisis similares senin incorrectos, a menos que las condiciones y el metodo experimental correspondan con la teona que fundamenta el analisis. Por ejemplo, las velocidades deben ser velocidades iniciales reales, no debe haber ningun inhibidor a una concentraci6n que cause algun efecto, etc. Hasta este punto, se han puesto de relieve los estudios con enzimas purificadas. Sin embargo, los nuevos estudios de una enzima casi siempre empiezan con preparaciones que contienen la enzima de interes, otras enzimas y otros tipos de sustancias. Debe considerarse la influencia de los coittaminantes. Por fortuna, la especificidad y gran actividad de muchas enzimas permite determinar algunas de las propiedades de la enzima de interes incluso antes de ser purificada. Una de las determinaciones mas fundamentales que deben hacerse es verificar si la reacci6n bajo estudio realmente es catalizada 0 no por enzimas. Puesto que las enzimas son protefnas y estan sujetas a desnaturalizaci6n (capftulo 3), una reacci6n catalizada enzimaticamente casi siempre sera sensible al calor y otras condiciones de desnatu-

1

Ii

Intersecci6n = _ _1_

km

1 IS]

FIGURA 4.4 Grafica de Lineweaver y Burk, predicha por 10 ecuaci6n 4.1 1 . T0dos los puntos de los datos corresponderan por supuesto a valores positivos de 1Iv y 1/[S] pero, con frecuencia, 10 linea se extrapola a va lo res negativos de l/[S] para dar una estimaci6n de Km.

Las reacciones catalizadas enzimaticamente presentan cinetica de saturaci6n

145

ralizacion. La determinacion de la sensibilidad al proceso de desnaturalizacion se conoce a veces como "prueba de la enzima hervida". Una segunda prueba se bas a en el comportamiento de saturacion de las reacciones catalizadas por enzimas. A la [S] de saturacion, en ausencia de inhibidores y en condiciones constantes de pH, temperatura y otros factores, la cantidad de producto que se forme dependeni lineal mente del producto del tiempo de incubacion y la concentracion de la enzima impura. De este modo, si la reaccion se lleva a cabo a la [S] de saturacion por varios tiempos y con varias diluciones de solucion de enzima cruda, la cantidad (tiempo X concentracion de enzima cruda) debe ser proporcional a la cantidad del producto formado si la reaccion es realmente catalizada por enzimas. En general, las reacciones no enzimaticas de S no se comportan de esta manera. Por ejemplo, la hidrolisis de S catalizada por acido (reacci6n no enzimatica) a un pH con stante sera independiente de la dilucion de la solucion "enzimatica". Asimismo, es posible conocer el tamafio y forma aproximados de la proteina enzimatica activa antes de que haya sido purificada, siempre que la enzima sea suficientemente estable y se cuente con un metodo sencillo y preciso. En el recuadro 4.B se indica como puede estimarse la velocidad de sedimentacion de una enzima en campos centrifugos. La velocidad de sedimentacion depende, en parte, de la masa molecular de la enzima. El recuadro 4.C describe una tecnica que revela las dimensiones aproximadas de la enzima de nuevo sin tener necesariamente la enzima en estado puro. El conocimiento mas profundo de las enzimas como proteinas y catalizadores requerira preparaciones purificadas que a su vez, requeriran metodos de purificacion de enzimas. En esencia, la purificacion de una enzima es el proceso de eliminacion de contaminantes, de los cuales los mas importantes son proteinas. De esta manera, la actividad especffica suele utilizarse como una medida de que tan bien una determinada etapa de purificacion purifica realmente. La actividad especffica se define como el numero de unidades de actividades de la enzima dividido entre el numero de miligramos de proteina en el mismo volumen. Evidentemente, esto requiere que se determine tanto la concentracion de proteina como el numero de unidades de actividad enzimatica por unidad de volumen. Una unidad de actividad de enzima se define en terminos del numero de moles de sustrato que son convertidos en producto por unidad de tiempo. Por ejemplo, una unidad internacional, abreviada V.I., de actividad enzimatica cor responde a la cantidad de enzima que causa la perdida de 1

RECUADRO 4.B

CENTRIFUGACION CON GRADIENTE DE DENSIDAD DE SACAROSA

Las protefnas e incluso las agrupaciones complejas de estos compuestos que existen en las celulas forman . soluciones verdaderas cuando son aisladas. Es decir, producen mezclas uniformes con un disolvente, acuoso y no sedimentan en el campo gravitacional de la Tierra. Sin embargo, las centrffugas de alta velocidad, llamadas ultracentrffugas, desarrollan campos centrffugos que son cientos de miles de veces mas grandes que el campo gravitacional del planeta. Si una soluci6n de alguna protefna se coloca en un tubo cerrado en el rotor de una ultracentrffuga, y el rotor se hace funcionar a velocidades de varias decenas de miles de revoluciones por minuto durante perfodos de horas, la protefna forma una bolita en la peri feria del tubo. Si 10 anterior no sucede, por 10 menos, la soluci6n de protefna estara mas concentrada en la peri feria del tubo. De esta manera, la ultracentrffuga puede lograr una concentraci6n moderada y no desnaturalizante de una protefna 0 partfcula subcelular de gran tamaiio. Sin embargo, la concentraci6n por ultracentrifugaci6n general mente no es posible practicarla en el caso de las protefnas mas pequeiias.

746

Enzimas

EI coeficiente de sedimentacion es una constante caracterfstica de una molecula 0 partfcula, en el mismo sentido que el peso molecular es una constante caracterfstica. EI coeficiente de sedimentacion es una funcion del tamano, forma y densidad de la molecula 0 partfcula. Para una serie de moleculas de la misma densidad y forma (por ejemplo: esfericas), la sedimentacion aumenta con la masa de la molecula. La esfera es la forma mas compacta que puede adoptar un solido de una determinada masa y densidad. Por tanto, para moleculas de la misma densidad y masa, el coeficiente de sedimentacion disminuira conforme la forma de la molecula se aparte mas y mas de la forma esferica. Dado que casi todas las enzimas nativas son estructuras compactas, 10 cual es necesario para mantener el sitio activo y otras caracterfsticas estructurales, tienden a adoptar una forma que es casi esferica. Puesto que las enzimas estan formadas principalmente de aminoacidos, las diferentes enzimas tienden a tener casi la misma densidad. Por las anteriores razones, si se comparan los coeficientes de sedimentacion de varias enzimas, el orden de estos corresponde estrechamente con el orden de los pesos moleculares. En la tecnica de centrifugacion con gradiente de densidad de sacarosa, abreviada CGDS, se utiliza una ultracentrifuga para sedimentar enzimas grandes y otras particulas subcelulares en forma controlada, de modo que pueda obtenerse informacion ace rca de la molecula 0 partfcula. Si es posible analizar la enzima 0 partfcula con suficiente selectividad y sensibiIidad, pueden analizarse incluso preparaciones crudas para determinar su coeficiente de sedimentacion y peso molecular aproximados. En la CGDS, un "gradiente" de concentracion de sacarosa en solucion acuosa amortiguada se prepara en un tubo de centrffuga, como se indica con (a) en el esquema. Los gradientes se obtienen mediante cualquiera de varias tecnicas que no se describen aquf. En (b) se muestra como la concentracion de sacarosa varia en el tubo en funcion de la distancia para un "gradiente lineal del 7 al 25 %". La concentracion de sacarosa es del 7% (70 mg/ml) en el menisco y del 25% en el fondo del tubo. Dado que las soluciones de sacarosa son mas densas que el agua, el gradiente de concentracion de sacarosa tambien es un gra· diente de densidad de la solucion. La muestra de la solucion de enzimas carece de sacarosa y tiene una concentracion de proteinas que es mucho menor que la concentracion de sacarosa mas baja del gradiente. Dicha muestra se aplica con una pipeta en forma de capa delgada sobre el gradiente, como 10 indica el area negra de (a) y (b). (a), (b) y (c) estan dispuestos de modo que las distancias verticales en el esquema corresponden a la misma distancia a 10 largo del eje mayor del tubo de la centrifuga. Cuando el tubo de la centrifuga se somete a un campo centrffugo muy fuerte paralelo al eje mayor de dicho tubo, la enzima migrara en el campo centrffugo hacia el fondo del tubo. Debido al efecto estabilizador del gradiente de densidad, cuya densidad aumenta de manera continua hacia el fondo del tubo, las diferentes especies moleculares de la muestra migraran como zonas. La distancia de migracion de cada zona estara relacionada directamente con el coeficiente de sedimentacion de las moleculas de esa zona . La separacion de una muestra que contenia dos especies moleculares con diferente sedimentacion se muestra en (c). La contribucion de la concentracion de las proteinas y por ende, la contribucion de la densidad de estas, es pequeiia comparada con la de la sacarosa, 10 cual es indicado por las pequenas zonas de la muestra que estan sobrepuestas en el gradiente estabilizador de densidad de sacarosa en (c). En general, la centrifugacion se Ileva a cabo con un "rotor de cubetas oscilantes", como se indica en (d). EI tubo de centrifuga con gradiente y muestra se coloca en una cubeta, mostrada en negro, la cual esta fija al rotor en tal forma que el tubo se encuentra en posicion vertical [a la derecha de (d)] en el campo gravitacional de la Tierra cuando el rotor esta en reposo. En el campo centrifugo de un rotor en movimiento, la cubeta esta en posicion horizontal, como se muestra en ellado izquierdo de (d) . Despues de la centrifugacion, la cubeta regresa a la posicion vertical, 10 cual evita que el contenido del tubo se mezcle. El liquido del tubo se hace gotear a traves de un orificio en el fondo del tubo para separar el gradiente en fracciones, como se indica en (e) . EI analisis de la enzima, fraccion por fraccion, revel a la posicion a la cualla enzima migro en el gradiente durante la centrifugacion, como 10 indica la linea discontinua en (c). Los analisis de protefnas permiten localizar otras zonas de proteina; para esto se emplean estandares de peso molecular y coeficiente de sectimentacion conocidos. En general, dichos patrones son otras enzimas aplicadas al mismo gradiente (0 uno identico) y centrifugadas en el mismo rotor. EI coeficiente de sedimentacion y el peso molecular de la enzima en estudio pueden estimarse mediante interpolacion dentro de la escala de valores proporcionada por los estandares.

Los reocciones cotolizodos enzimoticomente presenton cinetico de soturoci6n

747

La centrifugaci6n con gradiente de densidad tam bien puede llevarse a cabo con gradientes de densidad de otros solutos , como el glicerol, en lugar de sacarosa . ~

W

~

Concentraci6n de sacarosa Concentraci6n de la muestra

Concentraci6n de sacarosa Concentraci6n de la muestra Actividad enzimatica

5

4

3

2

-----------

RECUADRO 4 .C

....

1

CROMATOGRAFiA DE EXCLUSION

En este texto ya se ha estudiado la cromatograffa en columna, pa r ejemplo , el uso de la cromatograffa de intercambio i6nico para el anal isis de aminoacidos en el recuadro 3.B. En la cromatograffa en columna, puede definirse el volumen total de Ifquido en la columna como VI. VI es simplemente el volumen total dellecho de resina en la columna menos el volumen de la matriz s61ida de resina. Para los procedimientos de cromatograffa en columna, como el intercambio i6llico, que implica adsorci6n de solutos a la resina de la columna, un soluto se separara por medio de un disolvente (elusi6n) de la columna s610 despues de que haya pasado a traves de esta un volumen del disolvente de cromatografia que exceda, por 10 general varias veces a V,. En contraste, existe un tipo de cromatografia denominado "cromatograffa de filtraci6n en gel", " cromatografia de exclusi6n por tamano molecular" 0, simplemente, cromatografia de exclusion. Las separaciones en este tipo de cromatografia se log ran por 10 general haciendo pasar un volumen igual a V, a traves de la columna. Las esferas de resina de una columna de cromatografia de exclusi6n consisten por 10 general en un gel de polfmero entrecruzado, como poliacrilamida (recuadro 3.E), agarosa (recuadro 6.B), dextrano (poli-

148

Enzimas

glucosa) 0 poliestireno (recuadro 3.B). Sin embargo, se han utilizado tambien esferas porosas de vidrio y otros materiales . Las propiedades crfticas que se requieren para que una resina se emplee en la cromatograffa de exclusion son que sea porosa y los poros sean, en promedio, de dimensiones comparables a las dimensiones de las moleculas que van a separarse. Las esferas porosas deben ser 10 bastante solidas para resistir la compresion en la corriente del disolvente para cromatograffa y, contrariamente a 10 que se requiere en la cromatograffa de adsorcion, no deben adsorber las substancias que van a separarse. EI volumen vacfo, Vo, se define como el volumen de Hquido en la columna que se encuentra por fuera de las esferas de resina u otro material. Una macromolecula que sea demasiado grande para entrar en los poros de la resina emergeni de la columna en un volumen efluente de Vo debido a que solo el volumen Vo esta disponible para dicha macromolecula. Las moleculas muy pequenas, como el agua y las sales disueltas en ella, emergenin en un volumen de VI. Las moleculas de tamano intermedio experimentaran elusion con un volumen que es mas grande que Vo pero mas pequeno que Vr• La representacion algebraica de esta idea es:

donde Ve es el volumen de elusion de una macromolecula particular; KD , el coeficiente de distribucion de esa macromolecula, fluctua entre 0 y I . KD es la fraccion promedio del volumen interno de las esferas que esta disponible para una molecula particular. De esta forma, si la molecula es tan pequena que todo el volumen interno es accesible a ella, KD sera 1 Y Ve = Vr. La figura que se muestra a continuacion representa un cromatograma, el cual es el resultado de un experimento de cromatograffa con la resina de exclusion Sephadex G-75 disponible comercialmente. EI Sephadex G-75 esta compuesto de dextrano unido transversalmente . La muestra fue un extracto de pancreas, una rica fuente de enzimas hidrolfticas. Los ensayos de actividad de la ribonucleasa (RNasa) y una proteinasa se lIevaron a cabo fraccion por fraccion eluida. En el cromatograma se muestra que las dos actividades fueron casi totalmente resueltas (separadas). Puesto que la RNasa emergio primero de la columna, tiene un valor de KD mas pequeno que la proteinasa. Muchas otras protefnas eluyeron tambien de la columna, pero la especificidad de los ensayos enzimaticos realizados no perrnitio detectarlas.

Proteasa

EI KD de una deterrninada moh!cula depende de sus dimensiones, encontrandose que las moleculas de mayores dimensiones tienen menos acceso al interior de las esferas y, por tanto, tienen un menor K D . Por las razones senaladas en el recuadro 4.B , las enzimas tienden a mostrar conformaciones similares. Por 10 tanto, para las enzimas, una mayor dimension significa en general un mayor peso molecular. La relacion teorica exacta que existe entre el peso molecular y el KD permanece sin adarar. Sin embargo, la grafica de KD contra ellogaritmo del peso molecular tiende a ser lineal para la escala de KD de alrededor de 0.15 a 0.85 . La comparacion de los valores de KD y los pesos moleculares de protefnas estandar con el KD de una enzima, deterrninados como en el esquema anterior, permite estimar el peso molecular de la enzima . A continuacion se presenta un ejemplo del tipo de curva de calibraci6n que podrfa obtenerse

Intermediarios covalentes en 10 cate/isis enzimetica

149

utilizando la resina Sephadex G-lS0, una resina de dextrano que posee poros mas grandes que los de la Sephadex G-7S. Como se indica en la figura, en esta resina un KD de 0.4 corresponde a un peso molecular de 30 000. 1.0

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I -~ Peso

.0 (ij

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I

I I Ijlll

molecular

J,tmol de sustrato por minuto en condiciones especificadas, por 10 general una concentraci6n de sustrato que satura. Otra unidad de actividad enzimatica es el katal, abreviado kat, definido como la cantidad de enzima que causa la perdida de 1 mol de sustrato por segundo en condiciones especificadas. Con mucha frecuencia se definen otras unidades mucho mas pequeiias de actividad enzimatica debido a que la sensibilidad de los estudios de rutina permite detectar cambios incluso menores de 1 micromol en la cantidad de sustrato. En la tabla 4.1 se definen algunos terminos que se utilizan ampliamente para describir las enzimas.

4.5

INTERMEDIARIOS COVALENTES EN LA CATAuSIS ENZIMATICA La quimotripsina es una proteinasa y peptidasa. En presencia de peptidos y protefnas como sustratos, cataliza mas eficazmente la hidr6lisis de los enlaces peptfdicos

TABLA 4.1 Terminos importantes en enzimologfa

1.

2. 3.

Unidad de enzima. Cantidad de una enzima que catalizara la transformaci6n de una cantidad especificada de sustrato en producto en condiciones definidas. Actividad especifica . Numero de unidades de enzima por unidad de masa de protefna, por 10 general miligramos de protefna. Numero de recambio. Numero de moles de sustrato convertidos en producto por minuto por mol de enzima. Cantidades relacionadas son la actividad del centro catalitico, que es el numero de recambio por sitio activo de la protefna enzimatica, para enzimas con mas de un sitio activo. La actividad catalitica molar es el numero de recambio en las unidades de seg - I .

150

Enzimas

en los cuales interviene el grupo carboxilo de los aminmicidos aromaticos. De este modo, la mayorfa de los nuevos peptidos formados en una reaccion de hidrolisis catalizada por la quimotripsina presentan residuos aminoacidos aromaticos en su extremo carboxilo . La quimotripsina manifiesta tambien actividad de esterasa. Un ejemplo de ester como sustrato es el ester de p-nitrofenilo de N-acetiltirosina,

OH

o II

CH 3 - C-

¢

CH 2 0

I

I

NH - CH - C-

0

-0\)

N0 2

+ H0 H

Q Ulmotnpsma ...

'

Ester de p·nitrofenilo de N·Acetiltirosina

o II

¢

CH 0 1 2 11 CH 3 -C-NH-CH-C-0-

+ 2W + -0

-0\

)

N0 2

que es hidrolizado hasta el anion coloreado p-nitrofenilato y N-acetiltirosina por accion de la quimotripsina. La velocidad de la reaccion puede seguirse convenientemente a traves de la absorbencia optica a causa del anion p-nitrofenilato. Sin embargo, existen tambien otros esteres que funcionan como sustratos, por ejemplo, los esteres de etilo y metilo. En general, la velocidad de hidrolisis de estos sustratos de esteres por accion de la quimotripsina es mayor que la velocidad para un sustrato de amida comparable, como es de esperarse a partir de las velocidades relativas de hidrolisis de los dos tipos de compuesto por catalisis acido-basica ordinaria. Para medir la velocidad de reaccion, el grupo acilo de los esteres no necesita ser aromatico. El ester de p-nitrofenilo del acido acetico es un sustrato de la quimotripsina, aunque menos conveniente que los esteres de los aminoacidos aromaticos N-acetilados. Otro ester, el ester de p-nitrofenilo del acido trimetilacetico, reacciona con la quimotripsina en una forma particularmente interesante. CH 3 CH 3 -

0

yI - CII- 0

-0\

)

N0 2

CH 3 Ester de p·nitrofenilo del acido trimetilacetico

Como en el caso de las reacciones de la quimotripsina con esteres adecuados de pnitrofenilo como sustratos, se libera el anion p- nitrofenilato. Sin embargo, solo se libera en una proporcion molar de 1: 1 con respecto a la cantidad de quimotripsina, aun cuando el ester se aiiada en un gran exceso molar. Cuando la quimotripsina se recupera de la mezc1a de reaccion, no cataliza la hidrolisis de sustratos estericos 0 amfdicos. Es decir, se ha inactivado. Puesto que en la reaccion se libera el anion de

Intermediarios covalentes en la cat6lisis enz im6tica

151

p -nitrofenilato y no el trimetilacetato, es de suponerse que ha ocurrido la acilacion de la quimotripsina. Esta suposicion se confirma al tratar la quimotripsina modificada con un nucle6filo fuente, la hidroxilamina (NH20 H) , la cual libera al derivado de acido hidroxamico del acido trimetilacetico. CH3 0

I I

I

CH -C-C-NH-OH 3

CH3 Hidroxamato de acido trimetilacetico

La quimotripsina tratada mostro de nuevo actividad de proteinasa y esterasa, 10 que demuestra que cualquiera que haya sido el sitio acilado en la enzima modi ficada, este es vital para el funcionamiento de dicha enzima. Varios analisis qufmicos indican que el sitio de acilacion es el residuo de serina en la posicion 195 de la cadena polipeptfdica de la quimotripsina. La cristalografia de rayos X de esta molecula que habfa sido inactivada al reaccionar con el ester de p-nitrofenilo del acido trimetilacetico demostro tambien que el grupo de acido trimetilacetico se une a la serina 195 como ester. Esta acilacion no solo es un resultado de un ester particular que funciona como sustrato, sino mas bien es una etapa esencial en todas las reacciones de hidrolisis catalizadas por quimotripsina, como se indica en el esquema de la figura 4.5 . En esta figura, se muestra que la quimotripsina libre (a) reacciona con una amida sustituida para formar el complejo enzima-sustrato, (b). La formacion del complejo del estado de transicion, (c), lleva a la liberacion de la porcion de amina del sustrato y a la produccion del intermediario de acil-enzima, (d). La reaccion de este intermediario con agua genera el complejo del estado de transicion para el segundo segmento de la reaccion (e). El complejo enzima-producto if> se disocia entonces para dar el acido carboxflico y la quimotripsina libre (g). La serina activa, Ser- 195 de la quimotripsina, se representa por - CH20H. La "cavidad" de union de protones que se muestra en el cuadrante superior izquierdo de cada "imagen" de la quimotripsina representa un residuo de histidina protonable, His-57, que tambien es esencial para el funcionamiento de esta enzima. Asirnismo, se muestran otros sitios de union para el oxfgeno del carbonilo del grupo carboxilo del sustrato y la cadena lateral aromatica 0 alifatica hidrOfoba, R. Las reacciones ilustradas son iguales a las de un sustrato tipo ester, excepto que R -OH sustituye a R - NH2' Y asf sucesivamente. I

I

Al parecer, cuando el ester del acido trimetilacetico es el sustrato, el intermediario acilo (figura 4.5d) que se forma se hidroliza solo muy lentamente debido al grupo R anormal presentado por el acido trimetilacetico. La hidroxilamina es un nuc1eofilo tan poderoso que tiene la capacidad de d~splazar el grupo trimetilacetilo del residuo de serina 195 de la quimotripsina, 10 que hace que la enzima recupere su forma activa original. En los esquemas de la figura 4.5 eye se muestra la disposicion tetraedrica de los enlaces en torno al carbono del grupo carbonilo del ester 0 la arnida que funciona como sustrato, como parte de una estructura que es el complejo del estado de transici6rn (0 una estructura similar). El hecho de que un intermediario tetraedrico sea importante para la reaccion de la quimotripsina es indicado por la capacidad de los aldehfdos como el siguiente

152

Enzimas

.

¢ CH 2

L

Acetil-prolil -alani l-prolil-NH-~H _ _ para inhibir fuertemente a la quimotripsina. Este aldehfdo es un amilogo del sustrato de amida de la quimotripsina, la amida de N-acetil-prolil-alanil-prolil-tirosina.

(b)

(a)

HN-C~ I I R'

(c)

0 H

,(

t

HN

I

R'

R

o

Hi)--

~

H0 '--4 H

C

I

R

(g)

(f)

(e)

FIGURA 4 .5 Un instrumento covalente en el mecanisme catalrtico de la quimotripsina . Solo se muestran algunos de los pasos documentados en la reaccion de la quimotripsino, mismos que se describen en el texto.

Intermediarios covalentes en la cat6lisis enzim6tica

153

Acetil-prolil-alanil-prolill-NHI-l

Esta es hidrolizada para dar amoniaco y el acido correspondiente, N-acetil-propilalanil-prolil-tirosina por la acci6n catalftica de la quimotripsina. El alcohol correspondiente

Acetil-prolil-alanil-prolill-NHI-(~H -t

no es ni un sustrato ni un buen inhibidor de la quimotripsina. Es probable que el aldehfdo sea un buen inhibidor debido a que en su forma hidratada, que se supone es la forma dorninante en soluci6n acuosa, tiene el carbona del grupo carbonilo en la forma tetraedrica. La estructura del aldehfdo hidratado es:

Acetil-prolil-alanil-oro 1i1--Nt-i-·Ct-l1

La estructura postulada del complejo formado por el aldehido inhibidor y la quimotripsina se muestra esquematicamente en la figura 4.6. El corolario del concepto de Pauling citado en la secci6n 4.2 es que una enzima debe unirse a un analogo del complejo activado del estado de transici6n mas firmemente que como se une a un sustrato. La fuerte inhibici6n de la quimotripsina por el aldehido hidratado esta de acuerdo con este corolario.

FIGURA 4.6 Complejo postulado entre un inhibidor del a ldeh rdo hidratado y la quimotripsina . La quimotripsina se muestra esquematicamente como en la figura 4.5 . EI comple jo tiene una configuracion tetraedrica en torno al carbo no del grupo carboni10. De esta forma, se espera que se asemeje al complejo d e estado de transicion, pero sin el grupo amino 0 alcohol de un sustrato usual de la quimotripsina.

154

Enzimas

Dicho corolario tambien concuerda con los resultados de varios sistemas enzimaticos en los cuales se compara una serie de sustratos homologos de una determinada hidrolasa. Los sustratos pueden seleccionarse con base en su estructura, de modo que presenten las mismas constantes de rapidez para la hidrolisis no enzimatica, pero diferentes afinidades esperadas para la enzima hidrolasa. Resulta sorprendente que dichos sustratos tengan valores similares de Km , pero los sustratos de "gran afinidad" de manera caracterfstica son hidrolizados enzimaticamente con mayor rapidez. La implicacion de estos resultados es que la supuesta union incrementada de los "buenos" sustratos no afecto los valores de Km , la afinidad aparente de la enzima por el sustrato . Mas bien, la enzima fue capaz de utilizar la energfa de union para deformar el complejo ES 10 mas cercanamente posible a la conformacion del complejo activado. Por supuesto que el aumento resultante en la poblacion de complejos activados acelerara la reaccion, aun cuandoel valor de k2 permanezca casi constante. Se ha seleccionado la quimotripsina como tema de estudio de esta seccion debido a que es una enzima ampliamente estudiada y, por ende, es un buen ejemplo de como puede estudiarse una enzima utilizando los conceptos y metodos experimentales de la qufmica y fisicoqufmica organicas. Dichos metodos se han aplicado a much os sistemas enzimaticos.

4.6

RAPIDEZ DE REACCION Y CONSTANTE DE EQUILIBRIO DE LAS REACCION ES Las cantidades catalfticas de una enzima no alteran la constante de equilibrio de la reaccion catalizada. Sin embargo, las constantes catalfticas para una reaccion catalizada enzimaticamente y la constante de equilibrio de esa reaccion estan interrelacionadas. Esta interrelacion impone limites sobre la rapidez de las reacciones catalizadas enzimaticamente y la concentracion de sustratos y productos en las celulas . J .B.S. Haldane derivo una relacion entre las constantes de la ecuacion de BriggsHaldane (4.10) y la constante de equilibrio de la reaccion para una reaccion reversible de un solo sustrato y un solo producto. La derivacion comienza con una ecuacion de la forma de la ecuacion 4.3. Dicha derivacion no se muestra aquf, sino solo el resultado, la relacion de Haldane. (4.12)

En esta relacion se representan las constantes cineticas tanto para las reacciones hacia adelante como hacia atras. Km(s) es la constante de Michaelis para el sustrato. Kmlp) es la constante de Michaelis para el producto . Vrnax(s) es la velocidad maxima en direccion hacia adelante, mientras que Vmax Ip) es la veloCidad maxima en la direccion opuesta, segun la ecuacion 4.3. Las ecuaciones de Briggs-Haldane para ambas direcciones son, respectivamente: \(

=

Vmax(s)[S] [S]

O(f )

+K

m(s)

y \( O( r)

=

Vmax(plS] + Km(p)

[S]

Clasificocion de las enzimas

155

donde los subindices f y r indican las reacciones hacia adelante y hacia atnis, respectivamente. Km(s) esta definida por la ecuaci6n 4.7, mientras que Km(P ) esta definida por: K m(p)

= k2

+

k

k-l

-2

Puesto que la constante de equilibrio es fija , es evidente a partir de la relaci6n de la ecuaci6n de Haldane y el algebra que un incremento en VmaxIs) requerira un incremento en Vma.:w) 0 Km(s)' una disminuci6n en Kmw) 0 bien alguna combinaci6n de ambos. Es decir, si la enzima es modificada en su estructura para aumentar la velocidad de la relaci6n hacia adelante a una determinada concentraci6n de sustrato, dicho cambio tendra consecuencias sobre otras propiedades cineticas de la enzima. Dichas consecuencias son que la velocidad en la direcci6n opuesta aumentara, las constantes de Michaelis para una 0 ambas direcciones se alteraran 0 bien habra una combinaci6n de estos cambios. El efecto sera que las bajas concentraciones de sustrato 0 las altas concentraciones de producto afectaran a la reacci6n neta hacia adelante mas adversamente de 10 que ocurriria si la Vmax en dicha direcci6n fuera mas pequefia. De esta manera, la relaci6n de Haldane debe imponer limitaciones sobre la evoluci6n de las enzimas, y las celulas no necesariamente obtienen una ventaja selectiva por el desarrollo de enzimas que puedan catalizar reacciones hacia adelante a la velocidad maxima posible. Es muy factible que la funci6n de las enzimas no s6lo sea la catalisis, sino tambien, mediante sus valores de Km, mantener sustratos y productos a concentraciones especfficas. La relaci6n de Haldane indica que una enzima no puede optimizarse independientemente con respecto a Km Y Vmax en ambas direcciones de una reacci6n. En el caso de reacciones que implican sustratos y productos multiples se han obtenido relaciones de Haldane mas complejas llegando a conclusiones similares. De este modo, la discusi6n anterior puede generalizarse a reacciones complejas catalizadas por enzimas . Ademas , la respuesta de la enzima a los cam bios en la concentraci6n del sustrato puede ser mas pronunciada que 10 que predice la ecuaci6n 4.10 si es capaz de presentar activaci6n alosterica por el sustrato . Como se indica en la secci6n 4.12, una enzima semejante debe permitir un control muy preciso sobre la concentraci6n del sustrato in vivo. Ciertas enzimas parecen haber sido optimizadas para la catalisis. Algunos ejemplos son la anhidrasa carb6nica, ya mencionada ~n la secci6n 4.4, la triosa-fosfato isomerasa y la fumarasa. Las dos ultimas catalizan la interconversi6n del fosfato de gliceraldehfdo y el fosfato de dihidroxiacetona y la hidrataci6n del acido furruirico, respectivamente. Las velocidades a las cuales estas enzimas catalizan sus reacciones corresponden con las velocidades a las cuales los sustratos respectivos pueden difundirse a traves del medio acuoso hasta la superficie de la enzima. Puesto que no existe mecanismo alguno por el cualla enzima modifique la velocidad de difusi6n, los incrementos adicionales en la eficiencia catalftica no cambiaran la velocidad de la reacci6n.

4.7 CLASIFICACION DE LAS ENZIMAS Como ya se mencion6, una caracterfstica importante de una enzima es su especificidad por el sustrato; es decir , debido a la conformaci6n de la compleja molecula de protefna, la singularidad de su sitio activo y la configuraci6n estruc-

156

Enzimas

TABLA 4.2 Clasificaci6n de las enzimas 1.

2.

3.

4.

S.

6.

Oxidorreductasas. Estas enzimas catalizan reacciones en las cuales un sustrato se oxida (por Lo que actua como un donador de hidr6geno) y otro sustrato se reduce. Las oxidorreductasas incluyen las deshidrogenasas , que convierten los enlaces simples en enlaces dobies, y las oxidasas, que utilizan oxfgeno como oxidante. Otras enzimas de este grupo son las peroxidasas, que utilizan H20 2 como oxidante, las hidroxilasas, que introducen grupos hidroxilo, y las oxigenasas, que introducen oxfgeno molecular en lugar de un doble enlace en el sustrato. Transferasas. Las enzimas de este grupo transfieren grupos de un solo atomo de carbono (por ejempLo, metilo), grupos aldehfdicos 0 cet6nicos, grupos fosforilo 0 amino, etc. de un sustrato a otro. Hidrolasas . Las hidrolasas catalizan la ruptura hidrolftica (por adici6n de agua) de los enlaces C- O, C- N, C-C, P-O Y otros enlaces simples. Este grupo incluye las enzimas peptidasas, enterasas, glucosidasas, fosfatasas y enzimas similares. Liasas. Estas enzimas rompen los enlaces sin la adici6n de agua, pero mediante reacciones de eliminaci6n para formar anillos 0 dobles enlaces . Este grupo incluye tambien enzimas que catalizan La reacci6n inversa, es decir, la adici6n de grupos transversalmente a dobles enlaces 0 anillos. En general, la actividad de estas enzimas es sobre los enlaces C=C, C=O 0 C = N, y son ejemplos de ellas; descarboxilasas, aldolasas y deshidratasas. Isomerasas. Las racemasas, epimerasas, cis-trans isomerasas, oxidorreductasas intramoleculares, mutasas y transferasas intramolecuLares forman este grupo, que altera la estructura pero no La composici6n at6mica de los sustratos al cambiar un grupo de una posici6n a otra en una molecula. Ligasas. Las enzimas de este grupo, conocidas tambien como sintetasas, acoplan la hidr6lisis de un pirofosfato del ATP u otro nucle6sido trifosfato a una segunda reacci6n en la cual se unen dos moleculas. Por ejemplo, una RNA ligasa formara un nuevo enlace fosfodiester (capitulo 6) a medida que une dos fragmentos de RNA, una reacci6n que resulta tambien en la hidr6lisis de ATP.

tural de la moIecula de sustrato con frecuencia una enzima seleccionani s6lo un compuesto especffico 0 una serie de compuestos relacionados con los cuales reaccionara. En general, una enzima presenta especificidad de grupo; es decir, un grupo general de compuestos pueden servir de sustratos. De esta forma, una serie de aldohexosas pueden ser fosforiladas por una cinasa y ATP. Si la enzima utiliza s6lo un sustrato para la fosforilaci6n (por ejemplo, glucosa, pero ningun otro monosacarido), se dice que po see especificidad absoluta de grupo. Dicha enzima se conoce como "glucocinasa". Otra cinasa puede mostrar especificidad relativa de grupo si cataliza la fosforilaci6n de dos 0 mas aldohexosas. Tal enzima podrfa recibir el nombre de "hexocinasa". A una escala mas amplia, las enzimas pueden clasificarse de acuerdo con el tipo de reacci6n que catalizan. El analisis de la tabla 4.2, donde las enzimas se clasifican en seis grandes grupos, demuestra la versatilidad de estas moleculas.

4.8

USOS ANALiTICOS Y PREPARATORIOS DE LAS ENZIMAS La especificidad de las enzimas, y su capacidad para catalizar reacciones que de otra manera serfan inmensamente lentas, permite analizar cuantitativamente las subs-

--Usos analificos y preparaforios de las enzimas

157

tancias individuales de los fluidos biologicos como la sangre y de otras mezc1as complejas. Los amilisis que han dado buenos resultados se han basado en mediciones de la velocidad de reaccion, otros en la conversion total de su sustrato en un producto que puede cuantificarse. Por ejemplo, la D-glucosa se oxida en la lactona del acido gluconico (seccion 2.5.3) en presencia de oxigeno y la enzima D-glucosa oxidasa de acuerdo con la siguiente ecuacion: D-Glucosa

+ O2

D-Glucosa oxidasa

)

H 20 2

+ Gluconolactona

(4.13)

El grado de avance de esta reaccion puede determinarse de varias formas. Por ejemplo, si en la mezc1a de reaccion se anade la enzima peroxidasa y un sustrato de peroxidasa, este ultimo es oxidado. Ciertos sustratos de peroxidasa son compuestos organic os complejos que actuan como un cromogeno, es decir, una substancia debilmente 0 no coloreada que produce color durante la reaccion. Peroxidasa

En presencia de condiciones adecuadas, entre ell as las concentraciones de enzima y oxigeno, asi como el cromogeno, la cantidad de colorante producido estara determinada por la cantidad de D-glucosa presente en la solucion. La concentracion del colorante se determina mediante espectrofotometria, 10 cual depende de la capacidad del colorante para absorber la luz de la region visible del espectro. En el analisis descrito se emplean reacciones enzimaticas acopladas para obtener cierta cantidad de un compuesto que puede medirse facilmente, el colorante, que es directamente proporcional a la cantidad de la substancia que va a determinarse, D-glucosa en este caso. Debido a la sencillez de esta y muchas otras reacciones catalizadas por enzimas que son c1inicamente utiles, se han automatizado en muchos casos para realizar el analisis eficiente y de rutina de muchas muestras biologicas. En los sistemas automatizados, instrumentos control ados por computadora trans fieren y mezc1an soluciones, hacen medici ones espectrofotometricas, electroquimicas y de otros tipos de acuerdo con un tiempo preestablecido, registran resultados y efectuan los calculos finales . Dichos sistemas son mucho mas precisos que las determinaciones manu ales correspondientes debido a la consistencia con la cual se realizan las mezc1as, transferencias y otros procesos en el sistema automatizado. Ademas, el "aguante", eficiencia y rapidez de los aparatos permiten muchos estandares, como por ejemplo la D-glucosa, de modo que la fiabilidad del sistema se prueba con frecuencia.

RECUADRO 4.D

EL ELECTRODO DE GLUCOSA

La combinaci6n de la especificidad de las enzimas con las propiedades de vigilancia continua de los electrodos electroqufmicos puede ser la base de nuevos instrumentos muy precisos. EI electrodo de Clark permite medir continuamente la concentraci6n del oxfgeno disuelto en una soluci6n. Este electrodo tiene en su interior dos electrodos, uno de platino y otro de plata recubierto con c1oruro de plata. EI electrodo de platino es negativo, y si se aplica una corriente de 0 .7 V a este par de electrodos y se ponen en contacto con una soluci6n que contiene iones c1oruro, se observa que el oxfgeno es reducido en el electrodo de platino y la plata es oxidada hasta c1oruro de plata en el electrodo de plata y c1oruro de plata. A 0.7 V, los protones y la mayorfa de los demas iones no son reducidos. El Teflon (politetrafluo-

158

Enzimas

roetileno) es un pllistico permeable al oxfgeno pero no a los iones 0 al agua. Por tanto, se utiliza una membrana de Tefl6n en el electrodo de Clark para separar una delgada capa de una solucion de sal de c1oruro de la solucion que contiene oxfgeno y que va a analizarse. Si, en el esquema que se muestra a continuaci6n, fueran removidas la membrana limftrofe y la cap a que esta marcada con GO + C, la estructura resultante serfa un electrodo de Clark. La reduccion eficiente del oxfgeno en la superficie del electrodo de platino hace que la concentraci6n de oxfgeno tenga un valor de cero. No obstante, solo ocurre una disminucion insignificante en la concentraci6n de oxfgeno de la so1uci6n fuera de la membrana de Teflon. Esta opone resistencia al flujo de oxfgeno, de modo que realmente muy poco oxfgeno de la solucion fuera de dicha membrana es reducido. Sin embargo, esta pequeiia cantidad reducida hace que fluya una corriente a partir de la fuente de 0.7 V, a traves de los electrodos y la soluci6n. Esta pequeiia corriente es proporcional al fndice de reduccion del oxfgeno. Este, a su vez, es proporcional a la concentraci6n de oxfgeno fuera de la membrana de Teflon. Es la diferencia entre la concentracion de oxfgeno en la sol uci6n y en la superficie del electrodo (cero) 10 que establece el gradiente de concentracion de oxfgeno en la membrana y, por ende, la proporcion a la cual este gas fluye a traves de la membrana. De esta manera, una medicion adecuadamente calibrada de la corriente es, en efecto, una medicion de la concentracion de oxfgeno en la solucion . EI electrodo de Clark se incorpora en una forma de "electrodo de glucosa" al incorporar dos capas a la membrana de Teflon, como se muestra en la figura. Un gel que contiene glucosa oxidasa y la enzima catalasa (GO + C) se aplica directamente a dicha membrana y se separa de la solucion mediante una membrana que es permeable a substancias de bajo peso molecular como glucosa, agua y oxfgeno pero que es impermeable a protefnas y otras substancias qLe podrfan ensuciar el electrodo. De acuerdo con la ecuacion 4.13, la glucosa y el oxfgeno que entran en la capa de GO + C reaccionan para formar gluconolactona y peroxido de hidrogeno. La catalasa cataliza la conversion de este compuesto en agua y oxfgeno. EI resultado neto es que se consume medio mol de oxfgeno por mol de glucosa oxidada. Cuanto mayor es la concentracion de glucosa, mas eficazmente es removido el oxfgeno. Por tanto, al aumentar la concentracion de glucosa disminuye la corriente en el electrodo de Clark, 10 cual se mide mediante un circuito electronico (indicado por el medidor en la figura). Si se utili zan materiales seleccionados y las dimensiones adecuadas de la membrana y la capa de gel que contiene la enzima, puede construirse un electrodo de glucosa que responda eficazmente a las concentraciones de este azucar que se encuentran dentro de los Ifmites normales para la sangre humana, 0.65 a I gil. La concentracion de glucosa puede estimarse, aun en soluciones de concentracion de oxfgeno fluctuantes, comparando la corriente producida en dos aparatos similares no identicos a los que se ilustran en la figura; el segundo equipo de control carece de glucosa oxidasa y sirve de testigo.

Uses analitices y preparetaries de las enzimas

759

Las reacciones catalizadas enzimaticamente permiten realizar incluso el monitoreo continuo de algunos compuestos biologicamente importantes. Se ha desarrollado un "electrodo de glucosa" basado en la reacci6n de la D-glucosa oxidasa (ecuaci6n 4.13). En el recuadro 4.D se describe la construccion de dicho eiectrodo, el cual tiene la capacidad de generar una corriente electrica relacionada con la concentracion de D-glucosa en la soluci6n en la cual esm inrnerso. Un uso irnportante de dicho electrodo (existe la posibilidad de fabricarlo en una forma duradera, confiable y suficientemente pequefia) serfa vigilar continuamente la concentraci6n de glucosa en la sangre de los diabeticos (con diabetes tipo I, en la que no se produce insulina) y probablemente incluso controlar la administracion de insulina mediante un "pancreas artificial". Puesto que una molecula deenzima convierte much as moleculas de sustrato en producto, es posible detectar cantidades muy pequefias de la enzima utilizando una prueba suficientemente sensible para el producto. Por 10 general, muchos metodos de anal isis cualitativos y cuantitativos sensibles para substancias biol6gicamente importantes dependen de agentes que son complejos de enzima y otra protefna qufmicamente acoplados, en los cuales la protefna tiene la capacidad de unirse a la substancia de interes. Dos de tales analisis se describen en el recuadro 4.E. EI acoplamiento qufmico de las enzimas a esferas de vidrio y otras matrices insolubles es la base de procedimientos preparatorios y anaifticos de laboratorio. Con dichas enzimas inmovilizadas puede lograrse incluso una producci6n en escala industrial, como se describe en el recuadro 4.A .

RECUADRO 4.E

ENZIMAS EN SISTEMAS DE DETECCION

Las propiedades catalfticas de las enzimas permiten utilizarlas en sistemas sensibles de detecci6n para realizar ensayos cualitativos 0 cuantitativos de moleculas que no son sustratos ni productos. Esto se logra a traves del acoplamiento de las enzimas a anticuerpos (figura 3.17) u otras protefnas de uni6n especffica . A continuaci6n sc dan dos cjcmplos de dichos sistemas de detecci6n. En ambos se utilizan protefnas inmov ilizadas, pero para aplicaciones analfticas en vez de las aplicaciones preparatorias descritas en el recuadro 4.A. En estos sistemas, se saca ventaja de pasos simples de purificaci6n, s610 mediante lavado, los cuales pueden lograrse cuando las moleculas se unen a un sustrato s6lido. EI ensayo de inmunoabsorbencia ligada a enzimas, 0 ELISA, puede detectar y cuantificar cantidades, en nanogramos, de una protefna u otro antfgeno en una mezcla compleja. Existen varias variantes de esta prueba, de las cuales s610 una de elias se describe aqu\. EI ensayo suele lIevarse a cabo en cavidades 0 pozos de unos pocos milfmetros de diametro que son moldeadas en recipientes de plastico , por 10 general en numero de 96 cavidades por recipiente. En el esquema que se muestra a continuaci6n pueden observarse dos de estos pozos, ya cubiertos con anti cuerpos IgG contra el antfgeno de interes (vease la figura 3 . 19 Y la secci6n 3.14 para la estructura y funci6n de la IgG). Dichas cavidades pueden lavarse a fondo sin remover las moleculas de anticuerpo, las cuales tienen aun disponibles sus sitios de uni6n al antfgeno, como se indica en (a) en la ilustraci6n. En (b), las cavidades se lIenan con diluciones conocidas; por ejemplo, una serie de diluciones dobles de una'soluci6n que contiene una cantidad desconocida del antfgeno . EI antfgeno esta representado por estrellas. Despues de un perfodo de incubaci6n que permite la uni6n del antfgeno a las moleculas de IgG inmovilizadas, las cavidades son lavadas para remover otras substancias (puntos en b) que existfan en las soluciones de antfgeno, quedando s610 los complejos de IgG-antfgeno, como se muestra en (c). Asimismo, en (a) se afiade a los pozos una soluci6n de la misma IgG que estaba adherida a las paredes de los mismos, excepto que ahora la IgG ha side modificada . Las moleculas de IgG se han acoplado qufmicamente a una enzima, indicada por "E" . En seguida, se deja que los conjugados de IgG-enzima se unan

160

Enzimos

[§] .

a los determinantes del antigeno que no estaban ya ocupados por su uni6n a las moleculas de IgG fijas a las cavidades. Esto s610 ocurrini en aquellas cavidades que hayan recibido una cantidarl suficiente del antigeno en la primera etapa, como se indica en (b). El complejo de IgG-enzima no ligado se remueve mediante lavado. En la ultima etapa (d), se aiiade una soluci6n de un sustrato crom6geno. Por ejemplo, si una fosfatasa es la enzima que estaba acoplada a la IgG, el p-nitrofenil-fosfato es un sustrato adecuado. Este sustrato es incoloro, pero por hidr6lisis da el ani6n coloreado p -nitrofenilato. La placa se incuba para que ocurra la reacci6n catalizada enzimaticamente. La reacci6n es inhibida por un reactivo que desnaturaliza la enzima y el grado de formaci6n del producto se determina espectrofotometricamente, por 10 general utilizando un instrumento que rnide directamente la absorbencia de luz en los pozos de la placa de ELISA. Cuando las cantidades relativas de los diferentes reactivos utilizados en el ELISA se han ajustado adecuadamente, la aparici6n de color es proporcional a la cantidad de antigeno sobre un cierto intervalo de concentraci6n de este. Por ejemplo, en la ultima etapa, la concentraci6n de sustrato debe ser saturante de modo que la rapidez de la reacci6n sea proporcional a la cantidad de enzima ligada a la IgG que exista e independiente de la concentraci6n de sustrato. La amplificaci6n que se logra a traves de la conversi6n de muchos moles de sustrato en producto por un mol de enzima permite alcanzar una sensibilidad con el ensayo de ELISA que compite con la sensibilidad de las pruebas basadas en radiois6topos. En el segundo tipo de anaIisis de detecci6n de enzimas, las prote(nas se separan mediante e1ectroforesis en gel, en condiciones desnaturalizantes 0 no desnaturalizantes, como se describe en el recuadro 3.F. Despues de la electroforesis, las zonas se transfieren a una lamina de nitrocelulosa para obtener una "impresi6n" de las zonas en el gel. Dicha transferencia puede lograrse mediante electroforesis perpendicular a la lamina de gel 0 "manchado", como se describe para las zonas de acidos nuc1eicos en el recuadro 6.G. El metoda de manchado remueve los desnaturalizantes, de modo que inc1uso las prote(nas que fueron separadas en condiciones desnaturalizantes tienden a replegarse al grado de que, con frecuencia, pueden reconocerse mediante anticuerpos especlficos. El inciso (a) de la figura al termino de este recuadro

Cinetico de los reocciones que utilizon sustratos multiples

161

representa esquematicamente un corte transversal de la lamina de nitrocelulosa, donde se observan las moleculas de protefna de dos zonas distintas impregnadas en la superficie de la nitrocelulosa, aunque en realidad, dichas protefnas estan unidas dentro de la lamina, asf como sobre la superficie. En (b), la lamina ha sido incubada con un anticuerpo especifico. Las moleculas de IgG, que son especificas para el antfgeno de interes, se unen a la proteina de la zona 2, pero no a la protefna de la zona 1. Un segundo anticuerpo unido a la enzima permite identificar cualitativamente la proteina de la zona 2, como se indica en (c). Por ejemplo, si el primer anticuerpo que se utilizo en (b) era IgG de conejo, el segundo anticuerpo unido a la enzima podrfa ser IgG de cabras a las que se les ha inyectado IgG de conejo.

De esta forma, esta "IgG anticonejo de cabra" conjugada a la enzima es un agente general que puede utilizarse con cualquiera de varios anti cuerpos de conejo, 10 que reduce el numero de conjugados de IgG-enzima que deb en prepararse . Para detectar la zona de protefna que la IgG de conejo habfa reconocido, la lamina de nitrocelulosa se sumerge en una solucion de un sustrato cromogeno. EI producto de la reaccion no solo debe ser coloreado, sino tambien ser insoluble, de modo que la zona teiiida no se extienda y permanezca en el sitio de la zona de protefna que se esta detectando .

4.9

CINETICA DE LAS REACCIONES QUE UTILIZAN SUSTRATOS MULTIPLES Muchas de las enzimas que se han estudiado mas detalladamente, como la quimotripsina, solo poseen un sustrato. Existe un segundo reactivo (agua), la cual permanece a una concentracion constante en la reacci6n. Sin embargo, entre todas las enzimas, las enzimas de un solo sustrato constituyen un caso raro. En esta parte se describen algunos de los formalismos matematicos q~e se emplean para analizar el comportamiento cinetico de las enzimas de sustratos multiples. Los especialistas en cinetica enzimatica reconocen tres mecanismos generales para los sistemas enzimaticos que emplean sustratos multiples. Dos de estos mecanismos, el ordenado

162

Enzimas

y el aleatorio, requieren que todos los sustratos se aiiadan a la enzima antes de que pueda liberarse algun producto. En el tercer mecanismo, llamado de ping pong, uno 0 mas productos son liberados de la enzima antes de que todos los sustratos hayan reaccionado con esta. Una notacion taquigrafica simplifica la descripcion de las reacciones catalizadas enzimaticamente y que utilizan sustratos multiples. Todos los sustratos, si no se senalan especfficamente, se designan como A, B, C Y D. Todos los productos se designan como P, Q y R. Las diferentes formas de la enzima se representan con las letras E, F Y G. E es la forma de la enzima que esta libre (0 cuando menos 10 mas libre posible) de cualquier forma de los sustratos 0 productos. Dicha notacion se aplica a cada uno de los tres siguientes mecanismos generales.

4.9.1

MECANISMO ORDENADO En este mecanismo general, existe un orden preciso en el cual los sustratos se asocian con los sitios activos de la enzima. Todos los productos son liberados siguiendo un orden especffico y solo despues de que todos los sustratos han reaccionado. En la reaccion:

E + A ~ EA

B

~

P

EAB

~ EPQ ~

EQ

== E + Q

A es el primer sustrato que reacciona con la enzima E. Solo entonces B puede reaccionar para formar el comrlejo EAB. Conforme ocurre la catalisis, primero P y despues Q son liberados siguiendo este orden. La notacion taquigrafica de esta reaccion es: A

B

1 1

P

Q

r

r

E---------------------------------- E EA EAB EPQ EQ Se dice que este tipo de reaccion tiene un mecanismo ordenado Bi, Bi. EI termino Bi indica dos sustratos 0 dos productos, de modo que un mecanismo ordenado Bi, Bi requiere dos sustratos y dos productos. Uni indica un solo sustrato 0 un solo producto, mientras que Ter implica tres sustratos 0 tres productos. Un buen ejemplo de un mecanismo ordenado Bi, Bi es aquel catalizado por la deshidrogenasa a1coholica. Los dos sustratos son etanol y NAD +, y los dos productos son acetaldehfdo y NADH. NAD + Y NADH son coenzimas nuc1eotfdicas que se describen en el capitulo 5. El proton que se produce en la reaccion puede ignorarse si esta se lleva a cabo en una solucion amortiguadora, es decir, a una concentracion de H + constante. CH 3CH 20 H

+ NAD+

Deshidrogenasa alcoh61ica <

CH 3 CHO

+ NADH + W

(4.14)

Los analisis experimentales de la cinetica de la deshidrogenasa a1coholica revelaron que el mecanismo es ordenado Bi, Bi, con la notacion taquigrafica especffica de:

Cinetico de las reocciones que utilizon sustrotos multiples

NAD+

CH 3CH 20H

1

CH 3CHO

1

NADH

I

+

H+

I

E --------------------~-- E

E· NAD+

163

(4.15)

(E , NAD + . CH 3CH 20H === ENADH . CH 3CHO)

4.9.2

MECANISMO ALEATORIO Cuando dos sustratos, A y B, se anaden a una enzima en forma aleatoria y los dos productos, P y Q, son liberados en la misma forma, dicha secuencia se designa como mecanismo aleatorio Bi, Bi. De esta manera, la reacci6n general serfa: E + A -~ EA

-

B ~

Q

+

B

=

EB

=

E

+

P

EPQF

AEAB E

EP

~

A

P

(4. 16) EQ

=

E

+

Q

La notaci6n taquigrafica es: Q

B

A

E

(EAB

(4.17)

EPQ)

Q

P

A

B

P

EI mecanismo aleatorio Bi, Bi describe la reacci6n catalizada por la enzima gluc6geno fosforilasa. En esta ecuaci6n, el fosfato inorganico se abrevia Pi y el producto gluc6geno es, por supuesto, una unidad de glucosa mas pequeno que el sustrato gluc6geno.

=========' glic6geno fosforilasa

Gluc6geno + Pi Gluc6geno + Pi Pi

Fosforilasa

glucosa·1-fosfato + gluc6geno

. Glucosa-1-fosfato ... Gluc6geno

Gluc6geno

Gluc6geno

E E·(gluc6geno) (Pi)

Glucosa-1 -P04 ~

(4.18)

E

===

E(glucosa,' ·P04)(gluc6geno)

Gluc6geno

4.9.3

Pi

Gluc6geno-1-P04 Gluc6geno

MECANISMO DE PING PONG Para dos sustratos y dos productos, el mecanismo general se representa como:

E

+

A

=

EA

=

P

EP

B

~F~

FB

~

EQ

~

EQ

+

Q

(4.19)

164

Enzimas

En esta secuencia, los complejos enzimaticos formados son EA, FP, FB y EQ, convirtiendose primero A en P y despues B en Q. F representa una enzima modificada (es decir , una enzima -X, don de X podria ser un grupo fosforilado 0 carboxilado o algun otro grupo funcional unido transitoriamente a la enzima). F se comb ina con By, subsecuentemente, X es transfer ida a B para formar el segundo producto Q y regenerar la forma original de la enzima E. La notaci6n abreviada para un mecanismo Bi , Bi de ping pong es: A

P

B

Q

1

r

1

r

(4.20)

E ----~------~--------------- E

EA

FP

F

FB

EQ

Un ejemplo de reacci6n de tipo ping pong es la catalizada por la enzima acetil CoA carboxilasa del hfgado de rata. Aceti l GoA

+ AT P + H GO :3 - -

Malonil GoA

+ ADP + Pi

Esta reacci6n se designa como mecanisme de ping pong Bi, Bi, uni, uni debido a que en primer termino se afiaden dos sustratos a la enzima, despues dos productos son liberados, despues se afiade otro sustrato y, finalmente, se libera el producto final. ATP

H GO:3

!

!

E (enzimabiotina)

ADP

Pi

I I

F

Aceti l GoA

Malonil GoA

!

I

(enzimabiotina-COO -)

E

(4.21)

(enzimabiotina)

La acetil CoA carboxilasa cataliza una reacci6n acoplada del tipo ya mencionado en la secci6n 4.1. Es decir, actua como mediador en la formaci6n energeticamente des favorable de un enlace carbono-carbono al acoplar la reacci6n a la reacci6n de hidr61isis, estructuralmente no relacionada pero energeticamente favorable, del ATP en ADP y fosfato inorganico. Para determinar el orden de las adiciones de sustratos y productos en una reacci6n enzimatica de sustratos y productos multiples, se requiere por 10 generaillevar a cabo varios experimentos, entre ellos el analisis cinetico detallado de las velocidades de las reacciones, en el que todos los sustratos y productos, excepto uno , se ajustan a concentraciones fijas y al mismo tiempo se hace variar la de un sustrato o la de un producto . Las constantes de equilibrio para la uni6n de sustratos y cofactores solos yen presencia de otros, la cinetica de inhibici6n por el producto (secci6n 4.11) y otras estimaciones pueden ayudar a determinar el tipo de mecanismo. Las referencias bibliograficas de estos metodos y sus aplicaciones se dan al termino de este capitulo.

4.10

EFECTOS DE LA TEMPERATURA Y EL pH Una transformaci6n qufmica A - B, como se ilustra en la figura 4.1, implica la activaci6n aleatoria de las moleculas de la poblaci6n A hacia una conformaci6n especffica de alta energia que se designa como estado de transici6n. Aquellas moleculas que esten en la conformaci6n de estado de transici6n experimentaran a una

Efectos de la temperatura y el pH

165

frecuencia relativamente fija, la transformacion al producto, B. De esta manera, la velocidad de la reaccion sera proporcional a la concentraci6n de la especie en estado de transicion. A su vez, la concentracion de esta ultima depende de la cantidad de energfa termica requerida para producir la especie en estado de transicion de las moleculas que reaccionan. Como se expJico en la seccion 4.2, en una reaccion catalizada enzimaticamente, la energfa de activacion es menor que en la reaccion no catalizada correspondiente. EI nivel de estado de transicion se alcanza mas facilmente, por 10 que un mayor numero de moleculas alcanza el estado de transicion y forma el producto B. La enzima, por supuesto, no altera la ~G de la reaccion, sino que solo reduce la energfa de activacion que la molecula A debe alcanzar antes de que pueda experimentar algun cambio. La ecuacion tan familiar de Arrhenius relaciona la constante de velocidad de reaccion especffica, k, con la temperatura, teniendose que: log k = log A - EA /23 RT

(4.22)

donde A es una constante de proporcionalidad; EA , la energfa de activacion; R, la constante de los gases y T, la temperatura absoluta. Esta ecuacion predice que la velocidad de la reaccion, sea catalizada enzimaticamente 0 no, aumentara al aumentar la temperatura. Sin embargo, puesto que las enzimas son protefnas y cualquier

i

Temperatura

-+

FIGURA 4.7 Efecto de 10 temperatura so bre 10 ra pidez de reaccion de una reaccion cata lizada enzimaticamente . (a) representa el aumento de velocidad debido a l estado de transicion coda vez mas poblado por la energia termica adicio na l. (b) representa el efecto de la desnatura lizacion term ica sobre la fraccion de las molecu las de enzima o rigi na les que permanecen activas. La curva discontinua representa la combinacion, a X b, la ve locidad neta de la reaccion.

166

Enzimas

proteina se desnaturalizani si la temperatura se eleva bastante, las reacciones catalizadas por enzimas muestran un aumento de velocidad al aumentar la temperatura s610 dentro de un intervalo de temperatura relativamente pequefia y bajo. En la figura 4.7 se muestran los efectos combinados de la temperatura sobre una reacci6n catalizada enzimaticamente y la naturaleza proteinica de la enzima. La temperatura 6ptima de una reacci6n catalizada enzimaticamente depende de varios factores, inc1uyendo el tiempo de incubaci6n de la enzima a la temperatura de prueba antes de que se afiada el sustrato y el tipo de organismo del cual se obtuvo la enzima. Las incubaciones prolongadas antes de afiadir el sustrato dan mayores oportunidades de que ocurra la inactivaci6n de la enzima; en general, las enzimas de organismos term6filos son mucho mas estables a temperaturas elevadas que las enzimas de otros organismos. Los cambios de pH afectan profundamente el grado de ionizaci6n de los residuos amino, carboxilo y de otros tipos ionizables de una protefna. Puesto que en el sitio activo de la enzima pueden hallarse residuos de aminoacidos ionizables, y otros residuos ionizables pueden tener la funci6n de mantener la conformaci6n de la protefna, no es sorprendente que el pH de la soluci6n pueda afectar marcadamente la actividad de la enzima. Ademas, dado que muchos sustratos son de caracter i6nico (por ejemplo: ATP, NAD +, aminoacidos), el sitio activo de una enzima puede requerir especies i6nicas particulares del sustrato para una actividad 6ptima. Estos efectos son quiza los determinantes principales de la forma de la curva que representa la actividad catalftica de una enzima como una funci6n del pH; un ejemplo de 10 anterior se ilustra en la figura 4.8. En general, se obtiene una curva en forma de campana. La meseta de la curva es por 10 general pequefia y la velocidad disminuye rapidamente con el pH a cualquier lado del maximo. Los decrementos de velocidad representan cambios en el estado de ionizaci6n de los grupos de la enzima 0 el sustrato (0 de ambos), cambios que son crfticos, con respecto al estado de ionizaci6n, para la reacci6n catalizada enzimaticamente. En el caso de algunas enzimas, la meseta puede ser mas amplia de 10 que se indica en la figura 4.8,0 bien la enzima puede mostrar una perdida de actividad menos pronunciada con el pH, a causa quiza de cambios compensatorios en dos 0 mas de los grupos ionizables. El pH 6ptimo de una enzima debe determinarse desde un principio en cualquier estudio de una enzima, a fin de que los ensayos puedan llevarse

pH

i

FIGURA 4.8 Efecto trpico del pH sobre

10 velocidad de reaccion para una reacpH--.

cion cata lizada por una enzima .

Inhibidores de enzimas

167

a cabo al pH optimo en soluciones amortiguadoras adecuadas. Resulta claro que la sensibilidad de las enzimas a los cambios de pH es una de las razones de que el control del pH sea un factor crftico para la supervivencia de la celula. En consecuencia, es evidente que si se tuviera un conocimiento mas profundo de como el pH es controlado 0 modificado en la estructura celular, 10 anterior serfa de gran valor para comprender la regulacion del metabolismo celular.

4.11

INHIBIDORES DE ENZIMAS Una gran variedad de compuestos naturales y sinteticos tienen la capacidad de unirse reversible e irreversiblemente a enzimas especfficas y alterar su actividad. Los inhibidores de enzimas reducen 0 eliminan la actividad catalftica de la enzima. Entre dichos inhibidores se encuentran farmacos, antibioticos, toxinas y antimetabolitos, asf como tambien muchos productos naturales de reac,jones enzimaticas. Se reconocen dos grupos generales de inhibidores de acuerdo a si su accion inhibitoria es reversible 0 irreversible.

4. 11. 1 INHIBIDORES IRREVERSIBLES Un inhibidor irreversible forma un enlace covalente con un grupo funcional especffico, por 10 general una cadena lateral de un aminoacido que, de alguna manera, se asocia con la actividad catalftica de la enzima. Ademas, existen ejemplos de inhibidores de enzimas que covalentemente no se unen de manera directa al sitio activo, sino en otro punto que bloquea ffsicamente al sitio activo 0 que de alguna otra forma evita el funcionamiento de la enzima. Un inhibidor irreversible no puede ser liberado por dilucion 0 dialisis; sus efectos no pueden ser revertidos simplemente al aumentar la concentracion del sustrato. La velocidad de la reaccion disminuye a un nivel que corresponde con la fraccion de las moleculas de enzima que han sido inactivadas. En terminos de cinetica enzimatica, el efecto de un inhibidor irreversible es comparable al de los inhibidores reversibles no competitivos que se describen en la seccion 4.11.2.2. Un ejemplo de un inhibidor irreversible de la quimotripsina tiene el nombre no sistematico de tosil-fenilalanil-clorometil cetona, 0 TPCK.

Aun a concentraciones muy bajas, el TPCK inactiva cuantitativamente a la quimotripsina. EI TPCK es un analogo qufmicamente reactivo de un sustrato de quimotripsina, en el que la amida 0 el ester usual del acido carboxflico es sustituido por el grupo clorometilo. La gran especificidad de este compuesto se demuestra por su incapacidad para inactivar la proteinasa tripsina relacionada. La tripsina, al igual que la quimotripsina, es una proteinasa de serina pero, a diferencia de ella, es espe-

168

Enzimas

cffica de los residuos de lisina y arginina de los sitios de la cadena polipeptfdica que son cortados. Los anaIisis de la quimotripsina inactivada por el TPCK indican que este compuesto reacciona con un solo residuo aminoacido de la quimotripsina, la His-57 catalfticamente crftica. El producto de la reacci6n es evidentemente el resultado del ataque nucle6filo de la histidina sobre el carbo no electropositivo del clorometilo del TPCK. Como se indica en la secci6n 4.5 y la figura 4.5, la histidina 57 se localiza cerca de la serina 195 en el sitio activo de la quimotripsina y se sabe que interviene en la reacci6n catalizada por esta ultima facilitando la transferencia de protones. De esta forma, los inhibidores irreversibles especfficos del sitio activo pueden utilizarse como medios para estudiar el sitio activo de las enzimas. Un tipo de inhibici6n irreversible particularmente interesante es el que presentan los llamados inhibidores kcat . Se dice que dicho inhibidor es latente porque s6lo muestra reactividad qufmica debil hasta que es modificado por la acci6n de una enzima especffica. Despues de unirse al sitio activo y ser activado por la actividad catalftica usual de la enzima, el nuevo inhibidor altamente reactivo reacciona qufmicamente con la enzima, causando la inhibici6n irreversible de esta. jLa enzima literalmente se suicidal Estos inhibidores poseen un gran potencial como farmacos y como medios altamente especfficos para determinar el sitio activo de las enzimas, puesto que no son llevados de la forma latente a la forma activa excepto por sus enzimas blanco especfficas. Un excelente ejemplo es la inhibici6n de la D-3-hidroxi decanoil P AA (protefna acarreadora de acilos) deshidrasa de E. coli por el inhibidor latente D-3-decinoil-N-acetil cistamina. En la secuencia de reacciones mas adelante, -S-NAC representa la fracci6n de N-acetil-cistefna que forma un enlace tioester con el acido 3-decinoico, acido graso acetilenico de 10 carbonos (vease el capitulo 7 para la nomenclatura de este compuesto) en la estructura del inhibidor latente. La acci6n de la D-3-hidroxil decanoil PAA deshidrasa convierte el grupo acetilenico en dos dobles enlaces. El ataque nucle6filo por la histidina del sitio activo de la enzima sobre uno de los dobles enlaces reactivos da como resultado la inactivaci6n irreversible de la enzima. Vease la secci6n 13.13.2 para la importancia metab6lica de la D-3-hidroxil decanoil ACP deshidrasa.

o II

CH 3 (CH 2 )sC=CCH 2 C-S-NAC Inhibidor latente

3-0H Decanoil ACP deshidrasa

H+

--.,.,.-:-:~)

~

0

II

CH 3(CH 2 )sCH=C=CHC-S-NAC Inhibidor activo

/ ~

N:J

~~

Residuo de histidil

Enz

NH ..

Sitio activo de la enzima

o II

CH 3(CH 2 )sCH=C-CH 2 C-S-NAC

~

~)

Enz

Inhibidor irreversiblemente

169

Inhibidores de enzimas

4.1 1.2 INHIBIDORES REVERSIBLES Los inhibidores reversibles s610 se asocian transitoriamente a la enzima. Como su nombre 10 indica, este tipo de inhibici6n implica un equilibrio entre la enzima y el inhibidor, siendo la constante de equilibrio de la disociaci6n (K 1) una medida de la afinidad del inhibidor por la enzima. Se conocen tres diferentes tipos de inhibici6n reversible, los cuales se reconocen por la forma en que alteran 0 no pueden alterar la dependencia de la velocidad de reacci6n por la concentraci6n del sustrato. 4.11.2.1 Inhibicion competitiva. En la inhibici6n competitiva, compuestos que pueden estar 0 no relacionados estructuralmente con el sustrato natural se combinan reversiblemente con la enzima en 0 cerca del sitio activo. En la inhibici6n por retroalimentaci6n, el producto de una reacci6n que esta uno 0 mas pasos metab6licos mas aHa de la reacci6n catalizada por la enzima de interes acrua como inhibidor de la enzima. La inhibici6n por retroalimentaci6n es de gran importancia en el control metab6lico y suele ser de tipo competitivo. La premisa que se hace en la inhibici6n competitiva es que el inhibidor y el sustrato compiten por el mismo sitio, 10 cual lleva a la serie siguiente de reacciones: E+S~ES-E+P

K,

(4.23)

EI

En la inhibici6n competitiva, se forman los complejos ES y EI, pero nunca se forman los complejos EIS. Puede concluirse que las altas .concentraciones de los sustratos superaran la inhibici6n al hacer que la secuencia de reacci6n se desplace hacia la derecha, de acuerdo con la ecuaci6n 4.23. En la tabla 4.3 se resumen los parameTABLA 4.3 Resumen de las expresiones cineticas para 10 conversion del sustrato en producto bajo varios tipos de inhibicion

Tipo de Inhibici6n Ninguna

Km Ecuaci6n v =

Vmax[S] Km

Competitiva·

observada

v =

+

[S]

+

Vmax[S]

[S]

Sin cambios

Aumentada

(Vmax[S])(Km + [S])

Disminuida

Sin cambio

Disminuida

Disminuida

Km( 1

+ ;) I

No competitiva

Incompetitiva

v =

1 + I1Ki

770

Enzimos

Sin inhibidor

com petitivo

v~---.1'

I

I

I I

I I I

I

.. I

Km (- Inhibidor)

K~ (+ Inhibidor)

(b)

FIGURA 4.9 Efectos de un inhibidor competitivo sobre 10 velocidad de reacci6n como funci6n de 10 concentraci6n de sustrato. N6tese.e1 valor sin cambios de Vm6 x Y el valor incrementado de Km que son caracterlsticos de 10 inhibici6n competitiva y que se observan tanto en 10 gr6fica directa (a) como en 10 gr6fica de Lineweaver y Burk (b).

tros cineticos de la inhibicion competitiva y en la figura 4.9 se muestran las curvas cineticas tfpicas observadas en este tipo de inhibicion. Un ejemplo clasico de inhibicion competitiva es el efecto del acido malonico sobre la succfnico deshidrogenasa, la cual oxida rapidamente el acido succfnico en acido fumarico. Si se agregan cantidades crecientes de acido malonico, que se asemeja bastante al acido succfnico en estructura, la actividad de la succfnico deshidrogenasa disminuye considerablemen-

Inhibidores de enzimos

777

teo A su vez, esta inhibici6n puede revertirse aurnentando la concentraci6n del sustrato acido succfnico.

COOH

I CH 2 I

CH2

I

COOH 2W

/,

I

CH /I

HC

I

COOH

I

CH2

I

COOH

COOH

COOH

Acido succfnico

Aci do fum arico

Acido mal6nico

Vmax

Sin inhibidor

------------------=-:=..;--;:.;:-=-=-----"t

+ Inhibidor no competitivo Vmax (sin inhibidor)

v

=

v

= Vmax (con inhibidor)

2

2

ISI---. ( a)

-l/Km

liS (b)

FIGU RA 4.10 Efectos de un inhibidor no competitivo sobre la velocidad de reaccion como una funcion de 10 concentracion de sustrato. Notese el va lor disminuido de Vmax y el valor sin cambios de Km , los cuales son caracterfsticos de 10 inhibici6n no competitiva y se observa n tanto en la grafica directa (a) como en la grafico de Lineweave r y Burk (b).

172

Enzimos

4.11 .2.2 . Inhibicion no competitiva . Los compuestos que se unen reversiblemente con la enzima 0 el complejo enzima sustrato se conocen como inhibidores no competitivos . Las reacciones son: E+S

K,

' ES ----> E + P

K,

K,

(4.24)

EI ( /

K,

EIS

S

Por 10 tanto, la inhibicion no competitiva difiere de la inhibicion competitiva en que el inhibidor puede combinarse con ES, y S puede combinarse con EI para formar, en ambos casos, el complejo EIS. Este tipo de inhibicion no es revertida completamente por la alta concentracion de sustrato, puesto que la secuencia cfclica de la ecuacion 4.24 se efectuani sin importar la concentracion del mismo. Dado que el sitio de union del inhibidor no es identico al sitio activo, ni modi fica a este directamente, la Km no se altera. Vease la tabla 4,3 para la ecuaci6n que define la inhibici6n no competitiva. En la figura 4.10 se muestran las gnificas directa y recfproca tfpicas para una reaccion que presenta este tipo de inhibicion enzimatica. Las ecuaciones que predicen estos resultados aparecen en la tabla 4.3. 4.11.2.3 Inhibicion incompetitiva. Los compuestos que se combinan reversiblemente solo con el complejo ES peto no con la enzima libre se conocen como inhibidores incompetitivos. Este tipo de inhibici6n no es superado por altas concentraciones del sustrato; 10 que resulta interesante es que la Km es decir, la Km aparente 0 SO.5 en presencia del inhibidor, es consistentemente mas pequefia que el valor de Km de la reaccion no inhibida. Esto implica que S se une mas firmemente ala enzima en presencia del inhibidor. La ecuacion 4.25 describe sistemas que presentan inhibicion incompetitiva. I,

E + S ~ ES

---->

K,

K,

E+ P

(4.25)

EIS

La comparacion de esta reaccion con la reacci6n 4.24 sugerirfa que un elemento de la inhibicion incompetitiva es siempre un componente de inhibicion no competitiva, puesto que en ambos casos se forma el complejo EIS . En la figura 4.11 se muestran las curvas tfpicas de la inhibicion incompetitiva y en la tabla 4.3 se da la ecuacion correspondiente. Los tipos de inhibicion reversible que se han observado no se limitan a los tipos competitivo, no competitivo e incompetitivo. A veces, la inhibicion parece ser de un tipo mixto, una combinacion del tipo no competitivo con uno de los otros dos tipos de inhibicion reversible. En algunos sistemas a medida que aumenta la con-

Inhibidores de enzimas

173

Vmax , - _ . _ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

-------------

,-----------.------___J S~

(a)

FIGU RA 4. 11 Efectos de un inhibidor incompetitivo sobre 10 velocidod de rea cci6n como una funci6n de 10 concentracion de sustrato . N6tese 10 disminuci6n del Km aparente que do Km' (liamado tambien 5 0 .5 ), La Vma x tambien ha disminuido. Estos resultados pueden observarse tanto en 10 gr6fica directa (a ) como en 10 gr6fica de Linewea ver y Burk (b).

centraci6n de sustrato, la velocidad de la reacci6n aumenta al principio y despues disminuye, 10 que refleja inhibicion por el sustrato. En general, esta inhibicion se debe a la union del sustrato con la enzima en un sitio que no es el sitio activo, hecho que origina la activacion de un mecanismo inhibitorio de tipo alosterico, como se describe en la seccion 4.12. Los inhibidores reversibles pueden emplearse en la purificacion eficiente y especffica de las enzimas. En la cromatografia de aflnidad, el inhibidor esta unido covalentemente a una resina, en general con alguna molecula organica que funciona como "eslabonador" 0 "espaciador" para reducir las restricciones estericas en la uni6n del inhibidor por la enzima. La resina modificada se vierte despues en una columna (veanse los recuadros 3.B y 4.A). Incluso cuando una mezcla cruzada como un extracto celular se hace pasar por la columna, la selectividad proporcionada por el inhibidor con frecuencia Ie da a la resina la capacidad de unirse s610 a la enzima de interes. El hecho de lavar la columna con una solucion amortiguada en 0 cerca

174

Enzimas

del pH optimo de la enzima elimina las impurezas pero no la enzima. En general, el lavado subsecuente de la columna pero ahora con una solucion amortiguada a un pH que no este cerca del pH optimo remueve la enzima en una forma bastante pura. Otros ejemplos de aplicaciones de la cromatografia de afinidad son la purificacion de receptores hormonales utilizando una resina de cromatografia de la hormona inmovilizada y la purificacion de enzimas que actuan sobre el DNA empleando complejos insolubles de DNA y celulosa.

4.12

EFECTOS ALOSTERICOS EN REACCIONES CATALIZADAS ENZIMATICAMENTE EI fenomeno de la inhibicion por el sustrato descrito anteriormente es un ejemplo de cooperacion homotropica negativa debido a que una determinada molecula, el sustrato , tiene la capacidad de inhibir la accion de la enzima sobre el mismo tipo de molecula, el sustrato. Ya se estudio en la seccion 3.14 la cooperacion homotropica positiva del enlazamiento de oxigeno por la hemoglobina. La enlazadora de una molecula de oxigeno por la desoxihemoglobina origina una mayor afinidad de la hemoglobina en su union con otras moleculas de oxigeno. La inhibicion por retroalimentacion de una enzima por el producto terminal de una serie de reacciones, el fenomeno de control enzimatico metabolicamente importante que se estudio brevemente en la seccion 4 .11, es un ejemplo de cooperacion heterotropica negativa. Asimismo, la activacion de una enzima por una molecula que no sea un sustrato o un producto seria un ejemplo de cooperacion heterotropica positiva. La inhibicion alosterica es el resultado de la interaccion de una molecula enzimatica con un efector biologicamente importante que inhibe a la enzima al actuar en un sitio que no es el sitio activo. La activacion alosterica es un fenomeno similar que produce la estimulacion de la velocidad de la reaccion . Originalmente, el termino "efector alosterico " se reservo para reguladores que son sustratos y productos distintos (inhibicion 0 activacion heterotropica) . Sin embargo, se considera que sustratos, productos 0 ambos (inhibicion 0 activacion homotropica) son efectores alostericos cuando actuan en sitios distintos al sitio activo. Las enzimas que estan bajo control alosterico por el sustrato se desviaran del comportamiento predicho por la ecuacion de Briggs-Haldane y ecuaciones similares para reacciones con sustratos y productos multiples. Es decir, en la cinetica de la velocidad inicial, la grafica de vo contra [S] no sera hiperbolica. En vez de esto, la activacion por el sustrato producira una curva "sigmoidal" 0 en forma de S. Por esta razon, la cantidad Km tiene poco 0 ningun significado para las enzimas que estan bajo control alosterico . En lugar de ello , la cantidad SO.5, ya mencionada en la seccion anterior , se utiliza para especificar la concentracion de sustrato que producira una velocidad de reaccion que es la mitad de Vmax. La ventaja potencial de la activacion alosterica por un sustrato se ilustra en la figura 4.12, la cual consiste en una curva normal de respuesta hiperbolica (predicha por la ecuacion de Briggs-Haldane) y la curva sigmoidal que resulta de la activacion alosterica por el sustrato. La ecuacion de Briggs-Haldane predice que la concentracion del sustrato debe ser exactamente 27 veces cuando v = 0.75 Vmax que cuando v = 0.1 Vmax , es decir, que [S]O.75/[S]o 1 = 27 . Los valores menores de 27 implican cooperacion homotropica positiva. Los ca1culos similares para la curva sigmoidal de la figura dan un valor de 2.3 para [S]O .75/ [S]O .I . De esta manera , la curva hiperbolica requiere un cambio mayor de 10 veces en la concentracion del sustrato

Efectos a/ostericos en reacciones catalizadas enzimaticamente

175

v 0.5

o

2

3

5

4

6

7

8

9

[S]

FIGURA 4.12 Efectos de la concentracion de sustrato sobre la velocidad de una reac-

m

cion catalizada por una enzima que obedece a la ecuacion de Briggs-Haldane y una enzima alosterica que es activada por su propio sustrato y muestra cinetica sigmoidal.

rn

que la curva sigmoidal, 27 veces contra 2.3 veces, para el mismo cambio en la velocidad de consumo del sustrato. EI efecto del tipo de respuesta sigmoidal es que el sustrato tendeni a mantenerse dentro de Ifmites de concentraci6n mas estrechos. Es decir, puesto que la enzima responde a un pequeno incremento en la concentraci6n del sustrato con un gran aumento en la velocidad de reacci6n, tendera a consumir el sustrato rapidamente y, por ende, a disminuir su concentraci6n. En la ecuaci6n 4.6 se describen otros aspectos de la funcion que las enzimas desempefian para mantener concentraciones relativamente fijas de moleculas en las celulas . Entre los fenomenos alostericos mas interesantes estan los que son heterotropicos, en los cuales la velocidad de una reaccion catalizada enzimaticamente es afectada por una molecula que no es ni un sustrato ni un producto de la enzima. A una determinada concentracion del sustrato , la velocidad de reaccion puede ser afectada al cambiar Vrnax 0 SO.5 0 ambos. En general, la Vrnax no es alterada por el efector

776

Enzimas

alosterico heterotropico. Los activadores alostericos suelen ocasionar que una curva sigmoidal se transforme en una curva hiperbolica, por ejemplo, convirtiendo la curva 2 en la curva 1 en la figura 4.12. Un inhibidor alosterico puede hacer que la curva de velocidad y concentracion de sustrato se haga mas sigmoidal. La importancia de los efectores alostericos para el control del metabolismo se estudia en el capitulo 18. Algunas enzimas alostericas tienen solo una cadena polipeptfdica. Es posible que la union del efector alosterico cause un cambio pequeno pero importante en la conformacion de la cadena polipeptfdica, de modo que la union del sustrato 0 la eficiencia catalftica (0 ambas) de la enzima se alteran. Sin embargo, la mayorfa de las enzimas que muestran alosterismo son protefnas oligomericas. Las protefnas de este tipo ya se han estudiado en la seccion 3.14. Las enzimas oligomericas pueden tener diferentes sitios cata[(ticos y reguladores en las mismas 0 en distintas cadenas polipeptfdicas. Asimismo, dichas enzimas con frecuencia catalizan una reaccion que en condiciones in vivo estan lejos del equilibrio y en un punto de ramificacion de una vfa metabolica. Una reaccion en un punto de ramificacion es aquella que resulta en la sfntesis de un compuesto que es el precursor de otros dos 0 mas compuestos que son sintetizados por vfas distintas (v ease el capftulo 18). Los modelos que pretend en explicar el comportamiento alosterico de las enzimas oligomeric as dependen de interacciones entre las subunidades de protefna como base del comportamiento no hiperbolico de la enzima. El modelo de "simetrfa concertada" de Monod, Wyman y Changeaux (modelo MWC) supone que la enzima oligomerica puede existir en cualquiera de dos formas, ToR, que difieren en sus

Estado R

Estado T

(a)

R

T

~

~ etc.

~

~

(b)

A3 BS

A4

£ KB

A2 B2S2

£

~

iKB

B4S4

AB 3S3

£ ijKB

~ ijhKB

FtGU RA 4. 13 Comparacion de los modelos de MWC y KN F para el control a losterico de una enzima por su sustrato. Como se describe en el texto, (a) y (b) ilustran el modelo de MWC para una enzima tetramerica y para esa enzima en presencia del sustrato, respectivamente. En el modelo secuencia l de KNF (c), 10 transicion de los protomeros no unidos al sustrato o los proto"meros unidos aI sustrato no es concertada.

Efectos aloster;cos en reacc;ones catal;zadas enz;mot;camente

177

propiedades enzimaticas. EI modelo de MWC para la activacion alosterica enzimatica se ilustra en la figura 4.13. Es identico en forma al modelo de union de oxfgeno por la hemoglobina, seccion 3.14, figura 3.16. Es probable que las dos formas de una enzima alosterica, al igual que las dos formas de la hemoglobina, puedan adoptar conformaciones distintas dentro de subunidades y diferentes orientaciones de una subunidad con respecto a otra. Todas las subunidades de cada una de estas dos formas tienen la misma conformacion, pero esta difiere en cada una de las dos formas. En la activacion alosterica homotropica, de acuerdo con el modelo de MWC, una molecula de sustrato puede unirse unicamente a la forma mas activa de las dos formas de la enzima, la forma R. De esta forma, al aumentar la concentracion de sustrato aumenta la velocidad de reaccion no solo aumentando la fraccion de E que esta en la forma ES (ecuacion 4.5), sino tambien convirtiendo una mayor cantidad de la enzima en una forma mas activa con las cuatro subunidades en la conformacion R. EI resultado es una curva sigmoidal para la velocidad de reaccion contra concentracion de sustrato. EI modelo "secuencial" de Koshland, Nemethy y Filmer (modelo de KNF, basado en sugerencias tempranas de Adair y Pauling, y el modelo de la "adaptacion inducida" de Koshland) es similar al modelo de MWC, pero permite que las dos conformaciones de las cadenas polipeptfdicas coexistan dentro de una enzima oligomerica como se indica en la figura 4.13c. EI modelo de KNF es mas complejo que el modelo de MWC y puede hacerse muy general y aplicable a la mayorfa de las enzimas alostericas, ya que sostiene la existencia de interacciones moduladas entre subunidades, segun 10 permitan las caracterfsticas geometricas de los oligomeros. Cada union consecutiva de S altera la afinidad por este, de K~ a iKm a ijKm Y a ijhKm para las especies A4 , A3BS,A2B2S2 Y AB 3S3 , respectivamente, en la figura 4 .13c. Aun cuando los modelos de MWC 0 de KNF, 0 cualquier otro modelo, se ajusten a los datos derivados de un sistema dado, esto no demuestra que el modelo sea correcto. Establecer la exactitud de un modelo requiere analisis mas directos. Un ejemplo ciasico de una prueba para determinar la interaccion entre las subunidades de una enzima oligomerica es el que se lleva a cabo con la enzima aspartato carbamoiltransferasa (ACTasa) de E. coli. La reaccion que cataliza esta enzima es:

coo-

cooI I

CH 2 +

H3N -CH -COO -

I o 0 CH2 II ACTasa II I C-OP0 3" ===' C-NH-CH- COOI I

NH2

NH2

+ Pi Acido aspMico

Carbamoil fosfato

N-Carbamoil aspartato

La citidina trifosfato (CTP: vease la seccion 6,2 para su estructura) actua .como inhibidor por retroalimentacion de la ACTasa. Gerhart y Schachman demostraron que los dos diferentes tipos de subunidades de la ACT podrfan estar disociados. La subunidad catalitica, c, tiene la actividad enzimatica de la ACTasa (vease tambien la seccion 4 .13) y presenta cinetica hiperbolica y no es inhibida por la CTP. La otra subunidad, la suhunidad reguladora, se designa como r. La combinacion de las subunidades r y c restauro el control alosterico por la CTP . La enzima completa consta de seis subunidades de cada tipo .

778

Enzimas

4.12.1

ISOENZIMAS Una isoenzima, Hamada a veces "isozima" , es una de dos 0 mas formas de una enzima que existe en el mismo organismo y cataliza la misma reaccion. La isoenzirna que se ha estudiado con mas detalle es la lactico deshidrogenasa, LDH, que cataliza la oxidacion del acido lactico en acido piruvico. Mediante la electroforesis en gel de almidon, una tecnica que es muy similar a la electroforesis en gel de poliacrilamida (recuadro 3.E), se han detectado cinco formas distintas de la LDH en los tejidos de organismos vertebrados en condiciones no desnaturalizantes. Existen dos formas predorninantes de isoenzimas LDH, la forma M, que es caracterfstica del musculo esqueletico, y la forma H, que es caracterfstica del musculo cardfaco. Estas formas son los productos de dos genes relacionados, cada uno de los cuales codifica una cadena polipeptfdica de peso molecular de 35 000. Una molecula de LDH activa consta de cuatro de estas cadenas polipeptfdicas, dando un peso molecular de 140 000 para la protefna oligomerica. Tanto el tetnimero M puro, M4 , como el tetramero H puro, H4 , se han aislado. Si se emplean condiciones de desnaturalizacion moderada, el tetramero puede disociarse, asf como renaturalizarse cuando se elirnina el agente desnaturalizante. Cuando las isozimas tetrameras M y H pllras se mezc1an y someten a desnaturalizacion moderada y renaturalizacion, se forman cinco especies: M4 , M3H, M2 H2 , MH3 Y H4 • Estos resultados indican la relacion que existe entre las formas M y H, Y son compatibles con un arreglo de las subunidades en un tetramero que coloca a cada cadena polipeptfdica en una posicion equivalente. Las tres isozimas M y H heterogeneas y las dos isozimas M y H homogeneas de la LDH se observan en extractos de tejido, asf como tambien despues de su ensamblado in vitro. Se conocen algunos cientos de sistemas de isozimas y, en muchos casos, se ha demostrado que las diferentes formas de una enzima muestran diferentes propiedades cineticas y alostericas. Estas propiedades que difieren quiza sean ventajosas para el buen funcionarniento de los diversos tejidos en los cuales existen isozimas especfficas. En el caso de varias isozimas se han obtenido colorantes de actividad muy especfficos para las mismas. Estos colorantes permiten localizar, mediante la tecnica de electroforesis en gel, todas las zonas enzimaticas que muestran un tipo de actividad particular, como por ejemplo, actividad de LDH. El colorante de actividad distingue a la enzima de interes de otras actividades que pueden haber sido resueltas en el gel, aun cuando se hayan analizado mezc1as muy crudas, como extractos celulares. Esta tecnologfa se ha aplicado ampliamente en estudios de genetica, ya que grandes poblaciones de individuos de una determinada especie pueden analizarse para una deterrninada isozima 0 una serie de isozimas con relativamente poco esfuerzo . La mayorfa de las enzimas de las glicolisis, que se describen en el capftulo 10, poseen dos 0 cuatro cadenas polipeptfdicas identicas, y con frecuencia se han observado isozimas de estas enzimas. En el recuadro 3.F se da informacion acerca de la interpretacion de los patrones de electroforesis que son caracterfsticos de las isozimas, y en el recuadro 4.E se describe una tecnica affn para localizar zonas especfficas utilizando la electroforesis en gel.

4.13

PRECURSORES ENZIMATICOS Y ASOCIACIONES DE ENZIMAS El concepto de la proprotefna se introdujo en la seccion 3.15 con el ejemplo de la proinsulina. Al igual que la proinsulina, ciertas enzimas se sintetizan en una forma,

Precursores enzimoticos y asociaciones de enzimas

179

TABLA 4.4 Conversion de zimogenos en enzimas activas

Zimogeno Pepsin6geno

Agente de activacion

Enzima activo

H+

Pepsina

0

pepsina

• Enterocinasa 0 tripsina

Tripsin6geno Quimotripsin6geno A Procarboxipeptidasa A

Tripsina

Proelastasa

Tripsina

Tripsina

• + quimotripsina

.'•

Tripsina

•

a-quimotripsina Carboxipeptidasa A Elastasa

Peptido inactivo

+ + + + +

Fragmentos Hexapeptido Residuo de aminmicidos Fragmentos Fragmentos

la proenzima, que es mas grande que la enzima madura. La proenzima es fraccionada subsecuentemente en sitios especfficos por la acci6n de una 0 mas proteinasas para generar la enzima activa. La forma de proenzima de una proteinasa se conoce como zimogeno. En la tabla 4.4 se da una \ista de algunas proteinasas que son sintetizadas como zim6genos. Estas proteinasas aduan fuera de la celula pero, por supuesto, deben ser sintetizadas en las celulas. La sintesis de la proteinasa en la forma inactiva, zim6geno, protege a la celula de los efectos potencialmente nocivos de la proteinasa. Tambien permite que las cadenas polipeptidicas de la enzima se acumulen hasta alcanzar altas concentraciones y sean activadas rapidamente hacia la forma catalitica cuando se requiere la proteinasa. Muchas enzimas activas requieren, ademas de una 0 mas cadenas polipeptidicas, uno 0 mas cofactores para ser cataliticamente activas. Los cofactores pueden agruparse en forma general en: (a) grupos prosteticos, (b) coenzimas y (c) ionesmetalicos. Los grupos prosteticos se unen firmemente. Ejemplos de estos son la fracci6n de porfirina de la peroxidasa y el flavin adenin dinucIe6tido de la enzima succfnico deshidrogenasa. Las coenzimas se unen menos firmemente y, en general, pueden ser removidas mediante el proceso de dialisis. Para llevar a cabo la dialisis, la enzima se coloca en un saco permeable a la coenzima pero no a la proteina enzimatica y se sumerge en un volumen muy grande de soluci6n amortiguadora agitada a fin de que la coenzima que se disocie de la proteina enzimatica se diluya tanto que la proteina no sea capaz de unirse a ella de nuevo. Una enzima con su coenzirna, 0 grupo prostetico, removido se conoce como apoenzima. La adici6n de la coenzima concentrada adecuada a la apoenzima, en muchos casos, restaura la actividad enzimatica. Los iones metalicos que son necesarios para la actividad enzimatica pueden unirse debil 0 firmemente, dependiendo de la enzima. Todos los iones unidos firmemente son bivalentes 0 trivalentes. En general, intervienen en el metabolismo catalftico, por ejemplo, como agentes oxidantes 0 reductores, pero algunos son necesarios para mantener la conformaci6n adecuada de la proteina enzimatica. En el capitulo 5 se estudian con gran detalle las propiedades de varias coenzimas y cofactores. En la secci6n 4.12 se dieron ejemplos de enzimas que poseen dos 0 cuatro cadenas polipeptidicas identicas. La ACTa sa fue un ejemplo de una enzima con dos tipos de subunidades: una catalitica y otra reguladora. Recientemente, H. Schachman y colaboradores encontraron que el sitio activo funcional de la ACTasa no existe en una subunidad catalftica individual. Mas bien, el sitio activo se forma en la uni6n entre subunidades catalfticas. De esta manera, s610 las subunidades catalfticas asociadas muestran actividad de ACTasa. La enzima lactosa sintetasa de la glandula mamaria, al igual que la ACTasa, es un ejemplo de enzima que posee la actividad de una subunidad catalftica modificada

180

Enzimas

por una cadena polipeptfdica no catalftica. Los precursores de la lactosa de la ghindula mamaria son la glucosa y una forma activada de galactosa, la uridina bifosfato galactosa, que se abrevia como UDP-galactosa. La estructura e importancia metab61ica de este compuesto se estudian en la secci6n 10.6.2. La reacci6n catalizada por la lactosa sintetasa es: UDP·galactosa + Glucosa

== UDP + Lactosa

(4.26)

Esta enzima tiene dos tipos de subunidades protefnicas, ninguna de las cuales cataliza la reacci6n anterior. Sin embargo, la subunidad catalftica de la lactosa sintetasa cataliza otra reacci6n relacionada, que es: UDP-galactosa +

N-acetil glucosamina

== UUf:> +

N-acetil lactosamina

(4.27)

La adici6n de la subunidad aparentemt:nte no catalftica inhibe la reacci6n 4.27 y facilita la reacci6n 4.26. Se encontr6 qUy la protefna no catalftica era la alactoalbumina, una protefna de la leche que se encuentra en la glandula mamaria pero no en otros tejidos. Al parecer, la subunidad catalftica de la lactosa sintetasa tiene dos funciones principales, la sfntesis de lactosa en la glandula mamaria y la sfntesis de N-acetil lactosamina en otros tejidos. La enzima triptofano sintetasa tambien esta compuesta de dos tipos de cadenas polipeptfdicas. La reacci6n catalizada por la enzima tetramerica completa, cd3 2 , es: Indol glicerofosfato

+ L.serina "',Ih . L·triptofano

+ Gliceraldehido 3-fosfato

Cada tipo de subunidad tambien es catalfticamente activa, pero no puede catalizar toda la reacci6n de la enzima triptofano sintetasa. Las dos "semirreacciones" que son catalizadas por subunidades separadas son las siguientes: Indol glicerofosfato

a

+:;::::::::=:

Indol

+

Gliceraldehido3-fosfato

e Indol + L·serina

~ L·triptofano

El complejo a2(32 completo tiene un numero de recambio [reacci6n (1)] que es 30 a 100 veces tan grande como el observado en el caso de las reacciones (2) 0 (3) catalizadas por las subunidades. El intermediario de indol de la reacci6n parece quedar unido a la enzima tetramerica (X2(32 activa y no se libera al medio. La retenci6n de intermediarios de reacci6n tambien es una caracterfstica de ciertos complejos multienzimaticos. Uno de los mas elaborados de estos es el complejo de la acido graso sintetasa de las celulas animales y levaduras. Las funciones del complejo de sintetasa se describen con gran detalle en la secci6n 13.9 . .Para los prop6sitos del presente estudio, es suficiente sefialar que una molecula de acetil-coenzima A y siete moleculas de malonil-coenzima A se combinan en una serie de reacciones que extienden el grupo acetilo en unidades de dos carbonos derivados del malonato, con la liberaci6n de CO2 , para generar acido palmftico, un acido de 16 carbonos. Cada adici6n de 2 carbonos requiere una serie de cinco reacciones, cada una catalizada por una enzima distinta del complejo. Asimismo, se requieren otras actividades para la sfntesis del acido palmftico, las cuales.forman parte del complejo. La cadena

Problemas de re~aso

181

de acido graso incipiente permanece unida al complejo. De manera presumible esto permite una sfntesis eficiente y "canaliza" los acidos grasos de longitud inter~ media para que permanezcan en la via de la sintetasa de modo que no se desvien a otras reacciones. En las levaduras, el complejo de acido graso sintetasa es uno de los componentes subcelulares mas elaborados de la celula.

BIBLIOGRAFiA 1.

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PROBLEMAS DE REPASO 1. Algunas reacciones de sustratos altamente i6nicos catalizadas por enzimas son casi independientes de la fuerza i6nica de la soluci6n, 10 cual contrasta notablemente con las reacciones ordinarias de compuestos i6nicos en soluci6n acuosa. l,Cwil es la explicaci6n razonable de esta observaci6n? 2.

Considerense las dos constantes Ks Y Km de la misma enzima. i,Es mas probable que estas dos constantes sean casi iguales para una enzima que casi es cataliticamente perfecta 0 para una enzima que tiene un mlmero de recambio pequeno?

3.

l,Por que casi todas las reacciones catalizadas enzimaticamente muestran un pH 6ptimo?

4. Una enzima de un solo sustratocataliza una reacci6n con una velocidad que depende de la concentraci6n de sustrato y que es a su vez predicha por la ecuaci6n de BriggsHaldane, dando una Km de 1 mM. Si la enzima se estudia cuando [S] = 0.001 mM, la velocidad observada es de 1 mM/min. i,Cual es la velocidad predicha para [S] = 0.002 roM! 5. Cierta concentraci6n fija de un inhibidor caus6 una reducci6n del 90% en la velocidad de una reacci6n enzimatica de un solo sustrato y un solo producto a la concentraci6n de saturaci6n del sustrato. En presencia del inhibidor, la concentraci6n del sustrato, menor que la de saturaci6n, a la cualla velocidad de la reacci6n disminuy6 a la mitad de su valor maximo fue la misma concentraci6n de sustrato que hizo que la reacci6n no inhibida procediera a la rnitad de Vmlix" l,Es posible 0 imposible que el inhibidor este actuando como un inhibidor competitivo? l,Que efecto debe tener el inhibidor sobre la reacci6n inversa catalizada enzimaticamente? 6.

l,Cuales son los probables significados bioqufmicos y fisiol6gicos de una curva de velocidad contra [S] que es sigmoidal en vez de hiperb6lica?