Proyecto Nº 9551

ENZIMAS PARA LA INDUSTRIA LACTEA: PRODUCCION Y APLICACIONES EN MADURACION ACELERADA Y EN OBTENCION DE NUEVAS VARIEDADES DE QUESOS

Equipo Investigador: Manuel Núñez Gutiérrez (Dr. I.A.) Margarita Medina Fernández-Regatillo (Dra. C.B.) Pilar Gaya Sicilia (Dra. C.B.) Ana María Guillén Scapardini (L.Q.) Antonia María Picón Gálvez (Dra.C.Q.) José Javier Fernández Alvarez (Dr. Far.) Angel Fernández Mohedano (L.Q.) Equivalente de jornada completa: 2,70

Centro de Investigación: Centro de Investigación y Tecnología. (C.I.T.). INIA. Area de Tecnología de los Alimentos Ctra. de La Coruña, Km. 7 28040 MADRID Tel: 91/347 67 77 - Fax: 91/357 22 93

Duración: Enero 1992 - Diciembre 1995

Coste: Miles de pesetas: 30.350 Financiación INIA 100 %

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PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS El empleo de enzimas en elaboración de queso data posiblemente de hace unos 8.000 años, aunque su modo de acción no fue conocido hasta el presente siglo. Las enzimas utilizadas para conseguir la coagulación de la leche han sido hasta hace 40 años preparados de proteinasas de origen animal y vegetal. En la década 1960-70 se descubren los coagulantes microbianos, proteinasas de Mucor pusillus, Mucor miehei y Endothia parasitica, que presentan con relativa frecuencia problemas debido a su inespecificidad en la hidrólisis de las caseínas con liberación de péptidos de sabor amargo. En el período 1980-85 se desarrollan técnicas de ADN recombinante que han permitido la producción de quimosina en fermentador por microorganismos genéticamente modificados tales como Kluyveromyces fragilis, Escherichia coli y Aspergillus niger, quimosina que ya ha sido comercializada. Las enzimas tienen otras aplicaciones en tecnología láctea, tales como el desarrollo de nuevos productos y la aceleración de la maduración de quesos. Mediante la adición de enzimas a leche o cuajada se pueden obtener ingredientes alimentarios, p. ej., sabores y aromas de queso curado, en 1-3 días frente a los 3-12 meses del proceso convencional. Se pueden también desarrollar nuevas variedades de queso, con características peculiares de sabor y textura. Finalmente, se puede acortar el período de maduración de aquellas variedades de queso en las que el proceso resulte especialmente costoso por su larga duración. Algunas variedades españolas de queso tienen períodos de maduración largos, en ocasiones próximos al año. El acortar su maduración representaría un considerable ahorro en costes financieros, en necesidades de cámaras de maduración, en mermas por pérdida de peso y en una menor aparición de defectos asociados a procesos largos. Por otra parte, existen en España variedades de queso elaboradas con cuajo vegetal en cuya elaboración se produce una notable disminución del rendimiento quesero por pérdidas de nitrógeno soluble en el suero, con la consiguiente repercusión económica. La elección de proteinasas y peptidasas adecuadas para acelerar la maduración de quesos y para el desarrollo de nuevos productos es un problema complejo, ya que el tiempo de reacción en términos enzimáticos es extremadamente largo, al actuar generalmente lejos de las condiciones (pH, temperatura, humedad) óptimas de actividad. Si la actividad enzimática se acelera excesivamente puede llegar a ser incontrolable, con pérdida de las características propias del producto final deseado. No resulta pues sorprendente que la mayoría de las proteinasas ensayadas para acelerar el proceso de maduración, insuficientemente caracterizadas, ocasionasen problemas de amargor y de textura defectuosa cuando se añadían en forma libre a la leche de fabricación. Resulta necesario a la vista de los trabajos sobre el tema caracterizar previamente la actividad de las enzimas a emplear. Podrían ser adecuadas proteinasas que degradasen la caseína a nivel de péptidos en las primeras fases de elaboración, permaneciendo posteriormente poco activas al bajo pH del queso, próximo o 2

incluso inferior a 5.0. Por otra parte, sería fundamental que no produjesen a partir de las caseínas niveles elevados de péptidos hidrófobos, responsables del sabor amargo en el queso. La inclusión de peptidasas junto con proteinasas produciría un efecto sinérgico, permitiendo la formación de aminoácidos libres en niveles suficientes para influenciar significativamente la intensidad del sabor del queso. Finalmente, la aplicación de enzimas mediante técnicas que impidiesen una proteolisis prematura en exceso evitaría la disminución del rendimiento por pérdida de nitrógeno soluble en suero y los problemas de amargor generalmente asociados a una fuerte proteolisis en la misma cuba de elaboración. La encapsulación de proteinasas en liposomas fosfolipídicos constituye un procedimiento prometedor a la vista de los resultados alcanzados en maduración acelerada de queso Cheddar. La producción de nuevas enzimas y el desarrollo de nuevos procedimientos de adición de dichas enzimas a la leche en tecnología quesera permitiría afrontar con éxito su empleo en la aceleración de la maduración de quesos existentes y en la obtención de nuevas variedades. El presente proyecto de investigación se planteó con los siguientes objetivos: - La obtención y caracterización de nuevas enzimas destinadas a la industria láctea, fundamentalmente proteinasas y peptidasas. - La optimización de las condiciones de producción en fermentador de proteinasas y peptidasas. - La aplicación en maduración acelerada de enzimas que eviten la formación de sabor amargo y mejoren la textura del queso. - El empleo de enzimas en el desarrollo de nuevas variedades de queso con destino a la industria láctea española. RESULTADOS Como principales resultados originales del presente proyecto merecen ser mencionados: - La encapsulación por vez primera de quimosina recombinante, producida por Kluyveromyces fragilis y de ciprosinas, proteinasas presentes en el coagulante vegetal de cardo (Cynara cardunculus L.), en liposomas fosfolipídicos. - El desarrollo de un nuevo tipo de liposoma fosfolipídico: un liposoma de liberación programada que permite una salida controlada del contenido al medio exterior. - La encapsulación en este liposoma de liberación programada de tres proteinasas: 3

quimosina producida por Kluyveromyces fragilis, proteinasa neutra de Bacillus subtilis y ciprosinas de Cynara cardunculus. - La aceleración de la maduración del queso Manchego elaborado a partir de leche pasterizada de oveja mediante quimosina encapsulada en liposomas convencionales y en liposomas de liberación programada. - La aceleración de la maduración del queso Manchego elaborado a partir de leche pasterizada de oveja mediante proteinasa neutra de Bacillus subtilis encapsulada en liposomas convencionales y en liposomas de liberación programada. - La obtención de una nueva variedad de queso con características intermedias entre las del queso Manchego (elaborado con cuajo animal) y las del queso de La Serena (elaborado con cuajo vegetal) mediante ciprosinas encapsuladas en liposomas convencionales y en liposomas de liberación programada. - La purificación y caracterización de una cisteína proteinasa sintetizada por Micrococcus sp. INIA 528, de características interesantes en tecnología quesera. - La optimización del medio de cultivo y de las condiciones de fermentación para la producción de la cisteína proteinasa sintetizada por Micrococcus sp. INIA 528. - La aceleración de la maduración del queso Manchego elaborado a partir de leche pasterizada de oveja mediante la adición de la cisteína proteinasa sintetizada por Micrococcus sp. INIA 528 a la leche de elaboración. INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR EL PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES De los resultados del presente proyecto se desprende la siguiente información científica y técnica, de interés para la industria láctea: - La encapsulación conjunta de la proteinasa neutra de Bacillus subtilis y la fosfolipasa C tipo V de Bacillus cereus en liposomas fosfolipídicos permitió una liberación programada de la proteinasa al medio, con un 58% de proteinasa liberada al cabo de 3 horas de incubación en tampón a 30°C frente al 1% de proteinasa liberada por los liposomas convencionales. Los efectos de la proteinasa liberada por los liposomas de liberación programada incubados en leche a 30°C sobre la ß-caseína eran ya patentes a los 30 minutos, mientras que en el caso de los liposomas convencionales los efectos sobre la ß-caseína no fueron significativos hasta los 60 minutos de incubación. - La adición de quimosina encapsulada en liposomas convencionales y de liberación programada (12,6% y 12,8% de encapsulación, respectivamente) permitió duplicar la cantidad de quimosina retenida en la cuajada sin modificar la composición del queso. La adición de liposomas de quimosina aumentó la degradación de la αs-caseína (21,9% de αs-caseína residual en el queso con liposomas convencionales, 27,0% en el queso con liposomas de liberación 4

programada y 30,2% en el queso control a los 60 días) y de la ß-caseína (43,4% de ß-caseína residual en el queso con liposomas convencionales, 47,2% en el queso con liposomas de liberación programada y 46,9% en el queso control a los 60 días). Los niveles de N soluble a pH 4,6, en ácido tricloroacético y en ácido fosfotúngstico fueron 16,66, 9,48 y 3,79% en el queso con liposomas convencionales, 14,48, 9,22 y 3,50% en el queso con liposomas de liberación programada y 14,43, 8,31 y 3,19% en el queso control a los 60 días. Los quesos con liposomas mostraban una textura más blanda que la del queso control (33,92 N y 0,374 J para el queso con liposomas convencionales, 35,98 N y 0,381 J para el queso con liposomas de liberación programada y 41,27 N y 0,477 J para el queso control a los 60 días), debido a su mayor proteolisis. La adición de liposomas no influyó sobre los niveles de péptidos hidrófobos e hidrófilos ni sobre las características sensoriales (calidad de sabor, intensidad de sabor y amargor) del queso Manchego. - La adición de proteinasa neutra de Bacillus subtilis encapsulada en liposomas convencionales y de liberación programada (21,2% y 20,9% de encapsulación, respectivamente) no modificó la composición del suero pero favoreció el desuerado de los quesos con liposomas, dando mayores valores de extracto seco (68,99 % en el queso con liposomas convencionales, 70,08 % en el queso con liposomas de liberación programada y 65,79 % en el queso control a los 60 días). La adición de liposomas aceleró desde las primeras horas la degradación de la αs-caseína (48,7% de αs-caseína residual en el queso con liposomas convencionales, 51,9% en el queso con liposomas de liberación programada y 73,5% en el queso control a las 24 h) y de la ß-caseína (16,5% de ß-caseína residual en el queso con liposomas convencionales, 16,3% en el queso con liposomas de liberación programada y 46,6% en el queso control a las 24 h), y también produjo un aumento significativo en los niveles de péptidos hidrófobos e hidrófilos. Los niveles de N soluble a pH 4,6, en ácido tricloroacético y en ácido fosfotúngstico fueron 28,79, 13,91 y 8,11% en el queso con liposomas convencionales, 24,36, 14,11 y 6,37% en el queso con liposomas de liberación programada y 20,01, 12,58 y 5,57% en el queso control a los 60 días. A pesar de la mayor proteolisis, los quesos con liposomas eran más duros (38,26 N para el queso con liposomas convencionales, 44,17 N para el queso con liposomas de liberación programada y 32,74 N para el queso control a los 60 días), más firmes (0,383 J para el queso con liposomas convencionales, 0,416 J para el queso con liposomas de liberación programada y 0,335 J para el queso control a los 60 días) y más elásticos (1,676 N/mm2 para el queso con liposomas convencionales, 1,866 N/mm2 para el queso con liposomas de liberación programada y 1,212 N/mm2 para el queso control a los 60 días) que el respectivo queso control. La adición de liposomas aumentó la intensidad del sabor (7,40 para el queso con liposomas convencionales, 7,42 para el queso con liposomas de liberación programada y 7,14 para el queso control a los 60 días), con puntuaciones similares de calidad de sabor a los 60 días (7,56 para el queso con liposomas convencionales, 7,36 para el queso con liposomas de liberación programada y 7,46 para el queso control). En ningún caso se detectó la presencia de sabor amargo. - La adición de ciprosinas encapsuladas en liposomas convencionales y de 5

liberación programada (9,6% y 8,4% de encapsulación, respectivamente) no modificó la composición del suero pero retrasó el desuerado, dando lugar a un mayor contenido en humedad en el queso de 24 h. La adición de liposomas de ciprosinas aumentó la degradación de la ß-caseína (46,3% de ß-caseína residual en el queso con liposomas convencionales, 43,7% en el queso con liposomas de liberación programada y 48,0% en el queso control a los 60 días) y aumentó los niveles de N soluble a pH 4,6 desde las primeras horas (15,70% en el queso con liposomas convencionales, 13,03% en el queso con liposomas de liberación programada y 9,32% en el queso control a las 24 h). Los niveles de N soluble en ácido tricloroacético y en ácido fosfotúngstico de los quesos con liposomas fueron mayores que los del queso control durante el primer mes de maduración (8,52 y 3,23% en el queso con liposomas convencionales, 9,26 y 3,28% en el queso con liposomas de liberación programada y 8,50 y 2,97% en el queso control a los 30 días), aumentando en el queso control más rápidamente que en los quesos con liposomas durante el segundo mes. Se observó una tendencia similar para los péptidos hidrófobos e hidrófilos. Los quesos con liposomas eran más blandos a las 24 h que el queso control (14,93 N y 0,137 J para el queso con liposomas convencionales, 19,69 N y 0,179 J para el queso con liposomas de liberación programada y 23,91 N y 0,203 J para el queso control). La adición de liposomas de ciprosinas aumentó la intensidad de sabor de los quesos con liposomas (7,01 para el queso con liposomas convencionales, 6,99 para el queso con liposomas de liberación programada y 6,63 para el queso control a los 60 días), no detectándose sabor amargo en ningún queso. - Se ha aislado, purificado y caracterizado una proteinasa extracelular producida por Micrococcus sp. INIA 528. La proteinasa presente en el sobrenadante de un cultivo se purificó a homogeneidad, con un incremento de 29 veces de la actividad específica y una recuperación del 28% de la actividad proteinásica. El peso molecular era de 19,4 kDa estimado por espectrometría de masas. Los resultados obtenidos con diversos inhibidores y activadores indican que se trata de una cisteína proteinasa. Sus condiciones óptimas de actividad con azocaseína como sustrato son una temperatura de 34°C y un pH de 7,0. La proteinasa degradaba preferentemente la ß-caseína, aunque con un mayor tiempo de incubación se hidrolizaba también fuertemente la αs-caseína. La proteinasa tenía un valor Km de 6,12 g/l para la caseína y de 2,20 g/l para la azocaseína. Con caldo tripticasa soja como medio basal se obtuvo el máximo crecimiento de Micrococcus sp. INIA 528 a 34°C y pH 7,5 en fermentación aerobia discontinua, mientras que la máxima producción de proteinasa tenía lugar a 31°C y pH 6,25, al final de la fase logarítmica de crecimiento y principio de la fase estacionaria. La adición de extracto de levadura, glucosa, MgSO4 o K2HPO4 daba lugar a una menor producción de enzima, pero la adición al medio de 2,5 g/l de (NH4)2SO4 aumentaba la producción en un 45%. La siembra del medio de cultivo enriquecido con un fuerte inóculo aumentaba la cantidad de enzima producida en otro 19%. - La adición de la cisteína proteinasa de Micrococcus sp. INIA 528 en niveles de 0,5, 1,0 y 2,0 unidades/litro a leche pasterizada de oveja destinada a la fabricación de queso Manchego dió lugar a mayores niveles de extracto seco y proteína en los 6

sueros experimentales que en los sueros control. El nivel de αs-caseína residual en los quesos experimentales fue significativamente menor que en el queso control desde el dia 30, y el nivel de ß-caseína desde el dia 15. El nitrógeno soluble a pH 4,6 fue más elevado en los quesos experimentales que en el queso control desde el dia 1, y el nitrógeno soluble en ácido tricloroacético y en ácido fosfotúngstico desde el dia 15. Los péptidos hidrófobos e hidrófilos fueron significativamente más altos en los quesos experimentales desde el dia 15. Los quesos experimentales mostraron una textura más blanda, con valores menores de fracturabilidad, elasticidad y firmeza desde el dia 30, debido a su proteolisis más acentuada. La calidad del sabor mejoró con la adición de la cisteína proteinasa a la leche y no se registraron diferencias en amargor entre los quesos experimentales y control. La intensidad del sabor aumentó significativamente con la adición de proteinasa a la leche desde el dia 15. El queso Manchego elaborado a partir de leche con 2,0 unidades de proteinasa/litro alcanzaba en 36 dias la intensidad de sabor que tenía el queso control a los 60 dias. FORMACION DE PERSONAL Elaboración y presentación de la tesis doctoral de Antonia María Picón Gálvez, titulada "Microencapsulación de proteinasas en liposomas: aplicación en la maduración acelerada del queso Manchego", en la Universidad Complutense de Madrid. Junio, 1995. Apto "cum laude". PUBLICACIONES Artículos científicos Picón A., Gaya P., Nuñez M. (1993) Quantitative determination of chymosin activity by thrombelastography. Food Chemistry, 47. 209-212. Picón A., Gaya P., Medina M., Nuñez M. (1994) The effect of liposome encapsulation of chymosin derived by fermentation on Manchego cheese ripening. Journal of Dairy Science, 77. 16-23. Picón A., Gaya P., Medina M., Nuñez M. (1994) Microencapsulation of cyprosins from flowers of Cynara cardunculus L. in dehydration-rehydration liposomes. Biotechnology Letters, 16. 1031-1034. Picón A., Medina M., Nuñez M. (1995) Prediction of clotting time for milk coagulation by mixtures of proteolytic enzymes. Food Chemistry, 52. 411-414. Picón A., Gaya P., Medina M., Nuñez M. (1995) Kinetics of milk coagulation by mixtures of cyprosin and chymosin. Milchwissenschaft, 50. 393-395. Picón A., Gaya P., Medina M., Nuñez M. (1995) The effect of liposomeencapsulated Bacillus subtilis neutral proteinase on Manchego cheese ripening. Journal of Dairy Science, 78. 1238-1247. 7

Picón A., Gaya P., Medina M., Nuñez M. (1995) Release of encapsulated proteinase from dehydration-rehydration liposomes by a co-encapsulated phospholipase. Biotechnology Letters, 17. 1051-1056. Mohedano A.F., Fernández J., Gaya P., Medina M., Nuñez M. (1996) Hydrolysis of milk proteins and formation of peptides by micrococci isolated from raw milk and cheese. Milchwissenschaft, 51. 70-73. Fernández J., Mohedano A.F., Polanco M.J., Medina M., Nuñez M. (1996) Purification and characterization of an extracellular cysteine proteinase produced by Micrococcus sp. INIA 528. Journal of Applied Bacteriology 81, 27-34. Picón A., Serrano C., Gaya P., Medina M., Nuñez M. (1996) The effect of liposomeencapsulated cyprosins on Manchego cheese ripening. Journal of Dairy Science 79, 1699-1705. Mohedano A.F., Fernández J., Gaya P., Medina M., Nuñez M. (1997) Effect of pH, temperature and culture medium composition on the production of an extracellular cysteine proteinase by Micrococcus sp. INIA 528. Journal of Applied Microbiology 82, 81-86. Artículos de divulgación Nuñez M. (1992) La situación en España de la investigación aplicada a la industria láctea. Industrias Lácteas Españolas, Número especial, págs. 69-72 Libros Nuñez M. (1992) Biotecnología de Derivados Lácteos. En "Las Biotecnologías en las Industrias Agroalimentarias". Editores: B. Regueiro, R. Tojo y M. Balseiro. FEUGA, Santiago de Compostela, págs. 271-280. Trabajos presentados a congresos, reuniones o simposios Nuñez M. La situación en España de la investigación aplicada a la industria láctea. VI Simposio para la Industria Quesera. Madrid (España).1992. Picón A., Gaya P., Medina M., Nuñez M Encapsulación de quimosina recombinante en liposomas DRV: influencia de la sonicación de las vesículas multilaminares. IV Congreso Nacional de Biotecnología. Santiago de Compostela (España). 1992. Picón A., Gaya P., Nuñez M. Determination of recombinant chymosin activity in solution and in whey. 87th Annual Meeting American Dairy Science Association. Columbus (USA). 1992.

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Mohedano A.F., Gaya P., Medina M., Nuñez M. Actividad proteolítica de Micrococcus de origen lácteo sobre caseínas y proteínas del suero. XIV Congreso Nacional de Microbiología. Zaragoza (España). 1993. Mohedano A.F., Gaya P., Medina M., Nuñez M. (1993) Efecto de las proteinasas de Pseudomonas aisladas de leche de oveja sobre las caseínas y las proteínas del suero. IX Congreso Nacional de Química. Sevilla (España). Picón A., Gaya P., Nuñez M. The effect of liposome-encapsulated recombinant chymosin on cheese ripening. 6th European Congress on Biotechnology. Florencia (Italia). 1993. Picón A., Gaya P., Medina M., Nuñez M. Microencapsulation of cynarases in dehydration-rehydration liposomes for accelerated cheese ripening. 24th International Dairy Congress. Melbourne (Australia). 1994. Picón A., Medina M., Gaya P., Nuñez M. Prediction of clotting time for milk coagulation by mixtures of proteolytic enzymes. 89th Annual Meeting American Dairy Science Association. Minneapolis (USA). 1994. Picón A., Serrano C., Medina M., Gaya P., Nuñez M. (1994) Accelerated ripening of ewes' milk Manchego cheese using a liposome-encapsulated neutral proteinase. 24th International Dairy Congress. Melbourne (Australia). 1994. Carrera E., Gaya P., Medina M., Nuñez M. The effect of milk coagulant on the formation of hydrophobic peptides in cheese. 90th Annual Meeting American Dairy Science Association. Cornell (USA). 1995. Fernández J., Mohedano A.F., Gaya P., Medina M., Nuñez M. Optimización de la producción en fermentador discontinuo de una proteinasa extracelular por Micrococcus sp. INIA 528. VI Congreso de la Sociedad Española de Biotecnología. Valladolid (España). 1996. Picón A., Gaya P., Medina M., Nuñez M. Release of encapsulated proteinase from dehydration-rehydration liposomes by a co-encapsulated phospholipase. 5th Symposium on Lactic Acid Bacteria. Veldhoven (Holanda). 1996. Otros trabajos de difusión de resultados - Participación en el Grupo de Trabajo F16 "Accelerated ripening of cheese" de la International Dairy Federation. - Participación en las Jornadas de Aplicaciones de los Enzimas en la Industria Alimentaria con la ponencia "Aceleración de la maduración de quesos españoles mediante proteinasas libres y encapsuladas", el 4 de diciembre de 1996 en la Universidad de Burgos.

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