CAPÍTULO 2.7.9.

EPIDIDIMITIS OVINA (Brucella ovis)

RESUMEN Brucella ovis produce una enfermedad clínica o subclínica en el ganado ovino que se caracteriza por lesiones genitales en los carneros y placentitis en las ovejas. Por consiguiente, las consecuencias principales de la enfermedad son una disminución de la fertilidad en los carneros, abortos poco frecuentes en las ovejas, y unincremento de la mortalidad perinatal. La enfermedad se ha descrito en Latinoamérica, América del Norte y países europeos, así como en Australia y Africa del Sur, aunque probablemente se presenta en la mayoría de los países que crían ovejas. Identificación del agente: La existencia de lesiones clínicas (epididimitis unilateral u, ocasionalmente, bilateral) en los carneros puede ser indicativa de la existencia de la infección, aunque se necesitan estudios de laboratorio para confirmar el diagnóstico. La confirmación del laboratorio puede basarse en métodos directos o indirectos. El diagnóstico directo se realiza por medio del aislamiento bacteriológico en medios selectivos adecuados para B. ovis a partir de muestras de semen o tejidos de los carneros, o flujos vaginales y leche de las ovejas. Se están desarrollando métodos de biología molecular, como la reacción en cadena de la polimerasa y la electroforesis de campo pulsado. Sin embargo, para el diagnóstico de rutina, se prefiere el diagnóstico indirecto basado en pruebas serológicas. Pruebas serológicas: Se pueden utilizar la técnica de fijación de complemento (FC), la prueba de inmunodifusión en gel de agarosa (IGDA), y el enzimoinmunoensayo (ELISA) indirecto, empleando antígenos de superficie solubles obtenidos a partir de B. ovis. Se están probando en ensayos de campo algunos ELISAS que utilizan proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales. La sensibilidad de las pruebas IGDA y ELISA es parecida y a veces la del ELISA es mayor que la de la FC. En cuestión de sensibilidad, una combinación de las técnicas IGDA y ELISA parece ofrecer los mejores resultados. Sin embargo, respecto al coste y la simplicidad, la prueba IGDA es el ensayo más factible para el diagnóstico de B. ovis. No obstante, dada la inexistencia de métodos estandarizados reconocidos internacionalmente para el ELISA y el IGDA el ensayo obligatorio para el comercio internacional continúa siendo lal FC. Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: Los cultivos del inóculo para la producción de antígeno o de vacunas deben obtenerse a partir de los laboratorios reconocidos internacionalmente. Para la prevención de la infección de los carneros por B. ovis, puede utilizarse de manera segura y efectiva una dosis única estándar de vacuna viva de B. melitensis Rev.1 (109 unidades formadoras de colonias) administrada subcutáneamente o en la conjuntiva. Esta cepa de vacuna debe cumplir los estandares mínimos de calidad: una concentración adecuada, ausencia de disociación, una adecuada virulencia residual e inmunogenicidad, y ausencia de otros agentes (véase el capítulo 2. 7. 2. Brucelosis caprina y ovina [excluyendo la infección por B. ovis]).

A. INTRODUCCIÓN Brucella ovis causa una infección genital en el ganado ovino que se manifiesta por epididimitis, abortos poco frecuentes y aumento en la mortalidad de los corderos. La transmisión pasiva a través de la oveja parece ser una

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vía de infección frecuente, aunque también lo es la transmisión de un carnero a otros1. (2). Las ovejas pueden excretar B. ovis en los flujos vaginales y la leche, y por lo tanto, la transmisión oveja-carnero y oveja lactantecarnero también pueden ser mecanismos determinantes de la infección. La demostración de la existencia de lesiones genitales (epididimitis unilateral u, ocasionalmente, bilateral) mediante la palpación de los testículos de los carneros puede ser un indicio de la presencia de esta infección en un rebaño. Sin embargo, este diagnóstico clínico no es suficientemente sensible porque solamente un 50% de los carneros infectados con B. bovis presentan epididimitis (2). Es más, el diagnóstico clínico es extremadamente inespecífico debido a la existencia de muchas otras bacterias que causan epididimitis clínica. Los microorganismos que más frecuentemente causan epididimitis en los carneros incluyen Actinobacillus seminis, A. actinomycetencomitans, Histophilus ovis, Haemophilus spp., Corynebacterium pseudotuberculosis ovis, B. melitensis y Chlamydophila abortus (antiguamente Chlamydia psittaci) (5, 6, 9, 11, 13, 25, 31, 34). Debe hacerse hincapié en que muchas lesiones del epidídimo palpables en los carneros son granulomas espermáticos estériles provocados por un trauma. Aunque el ganado vacuno, las cabras y los ciervos han demostrado ser susceptibles a B. ovis en experimentos de transmisión artificial, los casos naturales solamente se han descrito en ciervos (21). Hasta la fecha no se han descrito casos en humanos, y B. ovis se considera no-zoonósico. Sin embargo en las áreas donde la infección por B. melitensis coexiste con B. ovis, es necesario un cuidado especial cuando se manejan las muestras, las cuales deberían transportarse al laboratorio en contenedores herméticos.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

a)

Recogida de muestras Las muestras más valiosas para el aislamiento de B. ovis a partir de animales vivos son el semen, los frotis vaginales y la leche. Para la recogida de los frotis vaginales y la leche, véanse las instrucciones que se dan en el capítulo 2.7.2. La brucelosis caprina y ovina (excluyendo la infección por B. ovis). El semen (fluidos genitales) se puede recoger fácilmente en los frotis tomados de la cavidad prepucial después de la electroeyaculación. Si no se dispone de un electro-eyaculador disponible, los frotis pueden ser recogidos a partir de la vagina de ovejas libres de brucelosis inmediatamente después del apareamiento natural. Para el aislamiento de B. ovis después de la necropsia, los órganos preferidos en cuanto a la probabilidad de aislamiento son el epididimo, la vesícula seminal, las ampollas de los conductos deferentes y los nódulos linfáticos inguinales en los carneros, y el útero y los nódulos linfáticos ilíacos y supramamarios en las ovejas. Sin embargo, para obtener una sensibilidad máxima, se debe realizar una búsqueda completa que incluya otros órganos y nódulos linfáticos (del bazo, craneales, escapulares, prefemorales y testiculares). También se deben examinar los corderos muertos y las placentas. Los sitios preferidos para el aislamiento a partir de corderos abortados o nacidos muertos son el contenido del abomaso y el pulmón. Las muestras para el cultivo deben refrigerarse y transportarse al laboratorio para ser cultivadas lo antes posible después de la recogida. El microorganismo permanece viable durante al menos 72 horas a temperatura ambiente, y la supervivencia se mejora a 4°C o, preferiblemente, mediante la congelación de las muestras de tejido.

b)

Métodos de tinción Los frotis vaginales o de semen se pueden examinar mediante la tinción por el método de Stamp (1, 8) (véase el capítulo 2.7.2.), y los cocobacilos característicos deben ser visibles en muchos de los animales infectados (32). El exámen del frotis de tejidos sospechosos teñidos por el método de Stamp (el tracto genital de carnero, los nódulos linfáticos inguinales, las placentas, y los contenido del abomaso y el pulmón de los fetos) también pueden servir para un diagnóstico presuntivo rápido.

1

En los sistemas de producción semiextensivos (más frecuentes en los países de la Europa Mediterránea) los carneros normalmente se alojan juntos. La transmisión directa de carnero a carnero durante los periodos de ausencia de reproducción es bastante frecuente y se ha sugerido que tiene lugar por varias vías, incluyendo la mucosa rectal. Sin embargo, la mayoría de las infecciones de carnero a carnero se producen a través de la vía oral. Los carneros estabulados establecen jerarquías (combates de cabeza contra cabeza), y es frecuente que los carneros “dominados”, después de ser “montados” por los carneros dominantes, laman el prepucio de los carneros dominantes como un acto de sumisión. Si estos carneros dominantes están infectados, la probabilidad de tener B. ovis en el prepucio (secreción en el semen) es muy alta.

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Sin embargo, en tales muestras también pueden estar presentes otras bacterias con morfología o características tintoriales similares (B. melitensis, Coxiella burnetii y Chlamydophila abortus), haciendo difícil el diagnóstico para el personal con poca experiencia. Los resultados microscópicos siempre deben confirmarse mediante el cultivo del microorganismo.

c)

Cultivo El mejor método directo de diagnóstico es el aislamiento bacteriológico en medios de cultivo adecuados. Las muestras de semen, los frotis vaginales, o la leche se pueden extender directamente en placas con el medio de cultivo adecuado e incubarse a 37°C en una atmósfera con CO2 al 5–10%. Los tejidos deben macerarse y homogeneizarse antes de sembrarlos en una pequeña cantidad de solución salina o tampón fosfato estéril (PBS) con un homogeneizador o una licuadora. El crecimiento aparece después de 3–4 días, pero los cultivos no deben descartarse como negativos hasta que hayan transcurrido 7 días. Las colonias de B. ovis se hacen visibles (0.5–2.5 mm) después de 3 o 4 días de incubación, y son rugosas, redondeadas, brillantes y convexas. Brucella ovis puede ser aislada en medios no selectivos, tales como el agar-sangre base enriquecido con suero ovino o bovino estéril al 10%, o en medio de agar-sangre con sangre ovina estéril al 5–10%. Sin embargo, el inóculo frecuentemente contiene otras bacterias que a menudo enmascaran el crecimiento de B. ovis. Por consiguiente, puede preferirse el uso de medios selectivos. Se han descrito varios medios selectivos para B. ovis. Se recomienda el medio modificado de Thayer–Martin (4, 15). Brevemente, puede prepararse con medio base GC (38 g/litro; Biolife Laboratories, Milan, Italia) suplementado con hemoglobina (10 g/litro; Difco) y metanosulfonato de colistina (7,5 mg/litro), vancomicina (3 mg/litro), nitrofurantoina (10 mg/litro), nistatina (100.000 Unidades Internacionales [UI]/litro = 17,7 mg) y anfotericina B (2,5 mg/litro) (todos los productos de Sigma Chemical, St Louis, Estados Unidos de América) . Las soluciones de trabajo se preparan como sigue: Solución A: Se añadenr 500 ml de agua destilada al medio base GC, se calienta la mezcla cuidadosamente hasta ebullición mientras se agita continuamente y se autoclava a 120°C durante 10 minutos. Solución B: Se resuspende la hemoglobina en 500 ml de agua destilada, añadiendo el agua lentamente para evitar grumos. Una vez disuelta, se añade una varilla magnética y se autoclava a 120°C durante 20 minutos. Solución de antibiótico (preparada en el día): la colistina, nistatina y vancomicina se resuspenden en una mezcla de metanol/agua (1/1); la nitrofurantoina se resuspende en 1 ml de una solución estéril de NaOH 0,1 M. Para la anfotericina B, se recomienda preparar una solución de base de 10 mg/ml de anfotericina B con 10 mg disueltos en 1 ml de dimetil sulfóxido estéril (C2H6OS, para análisis; ACS) y añadidos después a 9 ml de PBS (10 mM , pH 7,2 ). Cualquier solución de stock que sobre puede almacenarse varios días a 4°C. Todas las soluciones de antibióticos deben filtrarse a través de filtros de 0,22 µm antes de añadirse al medio de cultivo. Una vez autoclavados, se estabiliza la temperatura de ambas soluciones (45–50°C) con agitación continua. Se mezclan ambas soluciones (añadiendo A sobre B), evitando la formación de burbujas. Se añaden las soluciones de antibióticos mientras se agita continuamente y con cuidado. Se reparte en placas estériles. Una vez preparadas, las placas no deben almacenarse durante largos periodos de tiempo, y siempre se recomienda el medio recién preparado. Este medio también es adecuado para el aislamiento de B. melitensis (véase el capítulo 2.7.2). Todos los medios de cultivo deberían someterse a un control de calidad con la cepa de referencia para asegurar que permiten su crecimiento. Otra combinación de antibiótico adecuada, aunque menos efectiva, es: vancomicina (3 mg/litro); colistina (7,5 mg/litro); nistatina (12.500 UI/litro); y nitrofurantoina (10 mg/litro). El medio de Farrell descrito para el cultivo de Brucella en fase lisa no es apropiado para el cultivo de B. ovis, puesto que este no crece habitualmente en dicho medio.

d)

Identificación y tipificación Las colonias de Brucella ovis son no-hemolíticas. Son circulares, convexas, tienen bordes enteros, son siempre de tipo rugoso cuando se obervan con iluminación indirecta, y son positivas en la prueba de la acriflavina (1, 8). Para crecer, B. ovis necesita una atmósfera enriquecida con un 5–10% de CO2. Brucella

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ovis carece de actividad ureásica, no reduce nitratos a nitritos, es catalasa positivo y oxidasa negativo, no produce H2S y, aunque no crece en presencia de violeta de metilo, generalmente crece en presencia de concentraciones estándar de fucsina básica y tionina. Los cultivos no se lisan por la dilución corriente de prueba (RTD), o 104 RTD, de los fagos de Brucella de los grupos Tbilissi (Tb), Weybridge (Wb) e Izatnagar (Iz), mientras que se lisan por el fago R/C (1, 8). La mayoría de los laboratorios no están equipados para una identificación completa, y es necesario un programa práctico para la identificación presuntiva. La mayoría de los aislamientos de B. ovis pueden identificarse correctamente por sus características de crecimiento, la observación directa empleando luz reflejada indirecta, la tinción de Gram o Stamp, y las pruebas de la catalasa, oxidasa, ureasa y acriflavina. Sin embargo, la identificación definitiva debe ser llevada a cabo por laboratorios de referencia con experiencia en la identificación y tipificación de Brucella. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) desarrollada recientemente proporciona un medio adicional para la detección e identificación de Brucella sp. (3, 14).] Un método de electroforesis en gel de campo pulsado puede servir para distinguir B. ovis de otras especies de Brucella (19). Además, B. ovis se puede distinguir de otras especies de Brucella por medio de los patrones de polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR RFLP), para los genes omp2a, omp2b, omp25 y omp31, que codifican las proteínas fundamentales de la membrana externa de todas las especies de Brucella (30). Mediante la electroforesis en gel de campo pulsado también se pueden distinguir varios subtipos de Brucella ovis (22).

2.

Pruebas serológicas

Los ensayos más eficaces y utilizados son la prueba de fijación de complemento (FC), la prueba de doble inmunodifusión en gel de agarosa (IGDA) y el enzimoinmunoensayo indirecto (ELISA). Varios países han adoptado varias técnicas diagnósticas estándar para B. ovis, pero la única prueba prescrita por la OIE y la Unión Europea para el comercio internacional es la FC. Sin embargo, se ha demostrado que el ensayo IGDA muestra una sensibilidad parecida a la de la FC, y es una prueba más fácil de realizar. Aunque se carece de una estandarización, numerosos estudios independientes han mostrado que el ELISA es más sensible que los ensayos FC o IGDA, y con la realización de estudios adicionales de validación y estandarización, el ELISA es el más adecuado para ser elegido en el futuro como la prueba prescrita para el diagnóstico de esta enfermedad. El Suero Estándar Internacional anti-Brucella ovis (Estándar Internacional 19852) es la referencia utilizada para comparar y calibrar el resto de los estándares. Este estándar de referencia está disponible para los laboratorios de referencia nacionales y debe utilizarse para establecer los estándares secundarios o nacionales aplicables en el laboratorio de diagnóstico para el uso rutinario.



Antígenos Cuando las cepas rugosas de Brucella se extraen con solución salina mediante calor (método salino caliente, HS), se consiguen extractos antigénicos solubles en agua, cuyo componente mayoritario se precipita con sueros frente a Brucella rugosa (10, 20). Por esta razón los extractos HS han sido mencionados como el “antígeno específico rugoso” o, cuando se obtienen a partir de B. ovis, como el “antígeno específico de B. ovis”. Sin embargo, la caracterización química de los extractos HS de B. ovis ha puesto de manifiesto que estos se encuentran enriquecidos con lipopolisacárido rugoso (R-LPS), con proteínas de la membrana externa del grupo 3, y con otros componentes de la membrana externa (23). Por tanto, los extractos HS contienen determinantes de LPS específicos para B. ovis, pero también componentes antigénicos adicionales, algunos de ellos compartidos con B. melitensis y otras Brucella rugosas o lisas (26). Tales componentes son responsables de la reactividad cruzada que se observa a veces con el método HS en sueros de ovejas infectadas con B. melitensis o vacunadas con Rev. 1 (23). Debido a su solubilidad en el agua y su alto contenido en epitopos relevantes de la superficie celular, el extracto HS es el mejor antígeno de diagnóstico, y ha sido muy utilizado para el diagnóstico serológico de la infección por B. ovis. Brucella ovis REO 198, que es una cepa CO2 y suero-independiente, está recomendada como la fuente de antígenos HS para ser utilizados en las técnicas serológicas. Esta cepa se puede obtener del INRA3. Los medios sólidos descritos en la sección B.1.c. son adecuados para el crecimiento de B. ovis REO 198. El antígeno HS se prepara como sigue:

2 3

4

Puede obtenerse del Laboratorio de referencia de la OIE para la brucelosis, VLA Weybridge, Addlestone, Surrey KT15 3NB, United Kingdom. Institut national de la recherche agronomique (INRA) Laboratorie de Pathologie Infectieuse et Immunologie, 37380 Nouzilly, France.

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i)

Se hace crecer exponencialmente una cepa adecuada de B. ovis, preferiblemente aeróbia y no suero dependiente, por ejemplo REO 198, de una de las siguientes formas: durante 48 horas en matraces con caldo tripticasa-soja en un incubador orbital a 37°C y 150 rpm; o en botellas de Roux o agar tripticasa-soja u otro medio adecuado, con un 5% de suero añadido (no necesario cuando se utiliza la cepa REO 198); o en un fermentador de producción como se ha descrito para B. abortus, pero con la adición al medio de suero al 5% (no necesario cuando se utiliza la cepa REO 198).

ii)

Las células se resuspenden en solución salina al 0,85% o PBS, luego se lavan dos veces en solución salina al 0,85% (12 g de células secas o 30 g de células concentradas húmedas en 150 ml).

iii)

La suspensión celular se autoclava a 120°C durante 25–30 minutos.

iv)

Después de enfriar, la suspensión se centrifuga (15.000 g, 4°C, 15 minutos) y el líquido sobrenadante se filtra y dializa frente a agua destilada (usando 100 veces el volumen de la suspensión) a 4°C; el agua debe cambiarse tres veces durante al menos 2 días.

v)

El líquido dializado se ultracentrifuga (100.000 g, 4°C, 6–8 horas) y el sedimento se resuspende en un pequeño volumen de agua destilada y se liofiliza. El uso del suero de reemplazo II (CPSRII) para el proceso de control antes del liofilizado puede ayudar en la estabilidad y en la actividad anticomplementaria.

El HS se resuspende entonces bien en agua destilada (para su uso en la prueba IGDA), tampón salino veronal (para su uso en la FC), o tampón carbonato/bicarbonato o PBS (para su uso en el ELISA), y se titula frente a un conjunto adecuado de sueros positivos y negativos. El HS resuspendido se mantiene a 4°C con fenol al 0,5% como conservante (solamente para el uso en la prueba IGDA) o liofilizado. Se debe evitar la congelación y descongelación (10). El antígeno de FC debe estandarizarse frente al Suero Estándar Internacional anti-B. ovis3.

a)

Prueba de fijación de complemento (la prueba prescrita para el comercio internacional) No existe un método estandarizado para la FC, pero es mejor realizar la técnica por el método de microtitulación. Algunas trabajos indican que la fijación fría es más sensible que la fijación caliente (7, 24, 27), pero es menos específica. Las reacciones anticomplementarias, frecuentes con suero de oveja, son, sin embargo, más frecuentes con la fijación fría. Se han propuesto varios métodos para la FC utilizando diferentes concentraciones de hematíes de oveja (SRBC) (se recomienda normalmente una suspensión al 2–3%), sensibilizadas con un volumen igual de suero de conejo anti-SRBC diluido para contener varias veces (generalmente de dos a cinco veces) la concentración mínima necesaria para producir un 100% de lisis de los SRBC en presencia de una solución titulada de complemento de cobaya. Esta última se titula independientemente (en presencia o ausencia de antígeno según el método), para determinar la cantidad de complemento necesario para producir bien un 50% o un 100% de lisis de SRBC sensibilizados en una unidad de volumen de una suspensión estandarizada; se definen como la unidad hemolítica 50% o 100% del complemento (C’H50 o C’H100), respectivamente. Generalmente se recomienda titular el complemento antes de cada grupo de ensayos y se prefiere un macrométodo para la determinación óptima del C’H50. Por lo general, en la prueba se utilizan 1,25–2 C’H100 o 5–6 C’H50. El tampón salino con barbital (veronal) (VBS) es el diluyente estándar para la FC. Se prepara a partir de comprimidos disponibles comercialmente; de lo contrario se puede preparar de acuerdo con la fórmula descrita en otro lugar (véase el capítulo 2.4.3. Brucelosis bovina). El suero de ensayo debe inactivarse durante 30 minutos en un baño de agua a 60–63°C, y diluirse (diluciones dobles) en VBS. La solución de base del antígeno HS (2,5–20 mg/ml en VBS) se diluye en VBS como se determinó previamente mediante la titulación (titulación en sistema de doble entrada). Normalmente sólo se prueba una dilución de suero (generalmente la 1/10). Utilizando placas de microtitulación estándar de 96 pocillos con fondo redondo (en U), la técnica se realiza normalmente como sigue: i)

Se colocan 25 µl del suero problema inactivado en los pocillos de la primera y segunda filas. Se añaden volúmenes de 25 µl de tampón FC en todos los pocillos excepto los de la primera fila. Se preparan diluciones seriadas dobles transfiriendo volúmenes de suero de 25 µl de la segunda fila en adelante.

ii)

Se añaden a cada pocillo, excepto a los pocillos de la primera fila, volúmenes de 25 µl de antígeno diluido hasta la concentración de trabajo y 25 µl de complemento diluido hasta el número de unidades necesarias.

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iii)

Se añaden a cada pocillo volúmenes de 25 µl de complemento, diluidos en el número de unidades requeridas.

iv)

Se preparan los pocillos control que contienen 75 µl en cada caso de sólo diluyente, complemento + diluyente, antígeno + complemento + diluyente. Se debe probar un suero que dé una mínima reacción positiva en cada conjunto de pruebas para verificar la sensibilidad de las condiciones de la prueba.

v)

Las placas se incuban a 37°C durante 30 minutos, o a 4°C durante toda la noche, y se añade en cada pocillo un volumen (25 o 50 µl, dependiendo de la técnica) de SRBC sensibilizados. Las placas se reincuban a 37°C durante 30 minutos.

vi)

Se leen los resultados después de haber centrifugado las placas a 1.000 g durante 10 minutos a 4°C, o de haberlas dejado reposar a 4°C durante 2–3 horas para permitir que se depositen las células no lisadas. El grado de hemólisis se compara con estándares correspondientes a 0, 25, 50, 75 y 100 % de lisis. El título del suero problema es la dilución más alta a la cual hay un 50% o menos de hemolisis.



Estandarización de los resultados de la prueba de fijación del complemento

Existe un sistema de unidades basado en el Estándar Internacional para el Suero anti-Brucella ovis (Estándar Internacional 1985 [véase la nota 2 al pie de página]). Este suero contiene 1.000 Ul/ml. Si este suero se prueba con un método determinado y da, por ejemplo, un título de 2.000; entonces el factor para un suero desconocido probado mediante ese método se puede hallar a partir de la fórmula: 1.000/200 × título del suero de ensayo = número de ICFTU (unidades internacionales FC) de anticuerpo en el suero de ensayo por ml. Es recomendable que cualquier país que utilice la FC a escala nacional obtenga un acuerdo entre los distintos laboratorios que realizan la prueba mediante el mismo método, para garantizar la obtención del mismo nivel de sensibilidad y especificidad frente a un conjunto adecuado de sueros procedentes de ovejas con aislamientos positivos de B. ovis, y de ovejas libres de Brucella. Los resultados deberían expresarse siempre en ICFTU, calculados con relación a aquellos obtenidos en una titulación en paralelo con un suero estándar, que a su vez puede calibrarse frente al Estándar Internacional. Interpretación de los resultados: generalmente los sueros que dan un título equivalente a 50 ICFTU/ml o más se consideran positivos en la UE.

b)

Prueba de inmunodifusión en gel de agar En la prueba IGDA (2) se utilizan los siguientes reactivos: Agar Noble o agarosa de alta calidad, cloruro sódico (NaCl), y tampón borato (preparado con ácido bórico [12,4 g]; cloruro potásico [14,5 g]; agua destilada [1.600 ml]; ajustado a pH 8,3 con una solución de NaOH 0,2 M, y llevado hasta 2.000 ml con agua destilada). Para preparar los geles, se disuelve 1g de agarosa (o agar Noble), 10 g de NaCl en 100 ml de tampón borato hirviendo mientras se agita continuamente. Se cubren los portaobjetos, colocados sobre una superficie plana, con la cantidad necesaria del gel fundido para formar un lecho de 2,5 mm de profundidad (aproximadamente 3,5 ml para los portaobjetos estándar). Después de que el gel se haya solidificado (15– 20 minutos), se recortan los pocillos utilizando un punzón para geles. Los pocillos deberán ser de 3 mm de diámetro y separados 3 mm, y estar dispuestos según un patrón hexagonal alrededor de un pocillo central que también tiene 3 mm de diámetro. La técnica se puede adaptar a las placas de Petri o a otros moldes. Los sueros a examinar se colocan en pocillos alternativos separados por un suero positivo control (infección demostrada mediante bacteriología), con el antígeno a su concentración óptima en el pocillo central. Los resultados se leen después de una incubación durante 24 y 48 horas a temperatura ambiente en una cámara húmeda. Una reacción positiva se manifiesta por la presencia de una línea claramente definida de precipitado entre el pocillo central y los pocillos de los sueros problema que muestra una identidad total o parcial con la de los controles positivos. También pueden aparecer líneas de precipitado que no dan una identidad total y pueden corresponder a componentes antigénicos minoritarios de los extractos HS (los anticuerpos frente a estos componentes pueden ser también frecuentes en las infecciones debidas a B. melitensis). Estas reacciones también deben considerarse positivas. Antes de una lectura definitiva, es importante lavar los portas durante 1 hora en una solución en agua de citrato sódico al 5% para limpiar las líneas de precipitación inespecíficas. El antígeno usado en la prueba IGDA es el HS (2,5–20 mg/ml) diluido en agua destilada, y que contiene como conservante fenol al 0,5% (este antígeno conservado se puede almacenar durante al menos 1 mes a 4°C). Las diluciones del antígeno se prueban con un conjunto de 20–30 sueros de carneros infectados naturalmente con B. ovis y con un conjunto de sueros de ovejas libres de Brucella. La concentración óptima de antígeno es aquella que da la línea de precipitación más clara con todos los sueros de los carneros infectados con B. ovis siendo negativo con los sueros de las ovejas libres de Brucella.

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c)

Enzimoinmunoensayo Se han propuesto diversas variaciones de este ensayo. La prueba que se describe aquí es un ELISA indirecto en el que se utiliza ABTS (2,2’-azino-bis-[ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico]) como cromógeno, aunque son también adecuados otros procedimientos. Los ensayos se realizan en placas de ELISA de 96 pocillos de fondo plano. Las diluciones de los reactivos y el suero se preparan en PBS, pH 7,2, mediante la adición de Twenn 20 al 0,05% (PBST). Las diluciones del antígeno se preparan en un tampón carbonato/bicarbonato, pH 9,6, o alternativamente en PBS. pH 7,2. Las placas se lavan después de cubrir con el antígeno y normalmente entre incubaciones con PBST, cuando sea necesario. El antígeno (HS) y el conjugado se titulan mediante el sistema de doble entrada, y se seleccionan las diluciones que proporcionan la mejor relación entre los sueros positivos y los negativos. Los anticuerpos secundarios (IgG anti ovina [cadenas H+L]) por lo general se conjugan a peroxidasa de rábano (HRPO), aunque se pueden usar otros enzimas o conjugados (tales como la proteína recombinante G/HRPO). También se ha encontrado un anticuerpo monoclonal frente a IgG1 bovina conjugada con HRPO que es adecuado para su uso en el ELISA (29). Si se usa un conjugado a peroxidasa, el cromógeno, normalmente ABTS, se diluye en un tampón de substrato (compuesto de ácido cítrico y citrato sódico, pH 4). Se añade el substrato, peróxido de hidrógeno (H2O2), al tampón de substrato y se incuban las placas durante 15–25 minutos a temperatura ambiente. La reacción se puede detener con azida sódica 1 mM, y el cambio de color se lee a 405–414 nm (para más detalles véase el capítulo 2.3.1.). El antígeno usado en el ELISA es el HS en la solución de base a 1 mg/ml en tampón de cobertura, titulada en un sistema de doble entrada con diferentes concentraciones de antígeno, conjugado y sustrato, frente a un suero estándar o frente a diluciones de un conjunto de sueros procedentes de ovejas con aislamientos positivos de B. ovis, y de ovejas libres de Brucella, para determinar la dilución más sensible y específica (por lo general 5–10 µg/ml). 

Procedimiento del ensayo (ejemplo)

i)

Las placas de microtitulación de poliestireno de buena calidad se antigenan mediante la adición en cada pocillo de 100 µl de una dilución de un antígeno predeterminado en tampón carbonato, pH 9,6. Las placas se incuban durante 2 horas a 37°C. Alternativamente, el antigenado puede llevarse a cabo también durante toda la noche a 4°C con 100 µl de la dilución del antígeno correspondiente en PBS, pH 7.2. Las placas se lavan después cuatro veces para eliminar el antígeno no unido, y se secan golpeando fuertemente boca abajo sobre un papel absorbente. Las placas antigenadas se pueden utilizar inmediatamente o secarse y almacenarse a 4°C (la estabilidad en estas condiciones es aceptable durante al menos un mes).

ii)

Sueros: Se diluyen las muestras del suero problema y los controles positivo y negativo al 1/200 añadiendo un mínimo de 10 µll de suero a 2 ml de PBST. Esta dilución del suero es normalmente la óptima cuando se utilizan conjugados monoclonales y policlonales. Sin embargo, cuando se utiliza el conjugado de proteína G-peroxidasa, la dilución óptima es la 1/50 (16). Añadir por duplicado volúmenes de 100 µl de suero por pocillo a las placas de microtitulación. Las placas se tapan, se incuban a 37°C durante 1 hora y se lavan tres veces con el tampón de lavado PBST.

iii)

Conjugado: El conjugado titulado se diluye en PBST, se añade en los pocillos (100 µl) y la placa se tapa y se incuba durante 1 hora 37°C. Después de la incubación, las placas se lavan de nuevo tres veces con PBST.

iv)

Substrato: Se añade a las placas la solución de ABST en tampón de substrato (100 µl/pocillo) y las placas se incuban durante 15–60 minutos a temperatura ambiente con agitación continuada.

v)

Lectura e interpretación de los resultados: La absorbancia se lee automáticamente en un espectrofotómetro a 405–414 nm. Los valores de absorbancia se pueden expresar como porcentajes de la absorbancia media del control positivo, o preferiblemente transformarse en unidades ELISA calculadas bien manualmente, o utilizando un ordenador y un programa de aproximación de curva a partir de una curva estándar construida con los resultados de las series de las diluciones control positivas.

vi)

Debe establecerse de forma adecuada el umbral de corte utilizando las técnicas de validación apropiadas (véase el capítulo 1.1.4) y una colección de sueros procedentes de animales positivos al cultivo de B. ovis y de animales libres de la enfermedad). Debe utilizarse el Estándar Internacional para el Suero anti-Brucella ovis o los correspondientes estándares secundarios o nacionales para analizar o calibrar el método de prueba concreto en cuestión.

Varios estudios comparativos han mostrado que el ensayo ELISA presenta una mejor sensibilidad que la prueba IGDA o la FC (18, 24, 28, 35, 36)). La combinación del ensayo IGDA y ELISA proporciona una sensibilidad óptima, debido a la existencia de algunos sueros ELISA-negativos e IGDA-positivos (18). Sin embargo, la combinación de las pruebas FC y ELISA o FC e IGDA no mejora la sensibilidad del ELISA (18). Además, la FC tiene otras desventajas importantes como la complejidad, la inactivación obligatoria del

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suero, la actividad anticomplementaria de algunos sueros, la dificultad de realizarlo con suero hemolisado, y los fenómenos de prozona. Debido a su sensibilidad, simplicidad y fácil interpretación, el ensayo IGDA es muy factible para el diagnóstico de rutina en los laboratorios no especializados. Se sabe poco sobre la existencia de resultados positivos falsos en los ensayos serológicos con B. ovis como consecuencia de las infecciones debidas a bacterias que muestran epitopos de reacción cruzada con B. ovis. Se ha descrito que el agente del pedero ovino (Dichelobacter nodosus) presenta reacciones cruzadas con B. ovis (33), pero se desconoce el alcance y las consecuencias prácticas de esta reactividad cruzada en de diagnóstico de B. ovis4.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO La vacunación es probablemente el método más económico y práctico para el control a medio plazo de B. ovis en áreas con una alta incidencia de la infección. Para un control a largo plazo, se debería tener en consideración el efecto de la vacunación sobre el diagnóstico serológico, y deben implementarse programas de acreditación de la ausencia de B. ovis. La cepa viva de B. melitensis Rev. 1 (véase el capítulo 2.7.2) es probablemente la mejor vacuna disponible para la profilaxis de la infección por B. ovis (2). Una sola dosis estándar (109 unidades formadoras de colonias) de Rev. 1 administrada subcutáneamente (en un volumen de 1 ml), o en la conjuntiva (en un volumen de 25–30 µl) a carneros de 3–5 meses de edad confiere una inmunidad adecuada frente a B. ovis. La vacunación conjuntival tiene la ventaja de minimizar la intensidad y duración a largo plazo de la respuesta serológica provocada por la vacunación subcutánea, mejorando de ese modo la especificidad de las pruebas serológicas (2). Cuando se usa en animales jóvenes, la seguridad de la vacuna Rev. 1 es adecuada y los efectos secundarios parecen ser poco frecuentes. Sin embargo, existe una información limitada con respecto a la inocuidad de la vacuna Rev. 1 cuando se utiliza en carneros adultos. En dos estudios se halló que la vacunación subcutánea o conjuntival de carneros de 12 o 13 meses no produjo efectos secundarios adversos, y protegió a los carneros frente a B. ovis (ref 17 y comunicación personal de J.M. Blasco). Por tanto, en países con cría extensiva y altos niveles de incidencia sería aconsejable vacunar tanto a los carneros jóvenes como a los adultos sanos. En países afectados por B. ovis pero libres de B. melitensis, antes de usar la vacuna Rev. 1, deben tenerse en cuenta las posibles secuelas serológicas y debe elegirse la vía conjuntival En la ovejas, la vacuna viva de B. abortus RB51 no ha desmostrado tener éxito frente a B. ovis (12) y actualmente no se encuentran disponibles vacunas alternativas.

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* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la epididimitis ovina (Brucella ovis) (véase el cuadro de la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consúltese la lista más actualizada en la página web de la OIE: www.oie.int).

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