Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1982, 1 (1), 301-310.

Clasificación del género Brucella: situación presente(**) por M . J . CORBEL y W . J . BRINLEY MORGAN(**)

El actual sistema de taxonomia relativo al género Brucella se basa en las recomendaciones formuladas por el Subcomité de Taxonomia de Brucella del Comité Internacional de Nomenclatura Bacteriológica (1963) (1) y completadas, más tarde, en más recientes informes (1967) (2) y (1971) (3). Se elaboró el sistema para eliminar los problemas que pudiesen plantearse para identificar las tres especies de origen : B. melitensis, B. abortus y B. suis, empleando para la tipificación los métodos convencionales, especialmente las necesidades de C 0 , la producción de H S , las afinidades tintóreas y las pruebas de aglutinación c o n los antisueros monoespecíficos. La introducción de otros métodos, por un lado, para evaluar la sensibilidad a la lisis por los fagos y, por otro lado, para medir el metabolismo oxidativo c o n substratos seleccionados, resolvió t o d o s estos problemas, permitiendo elaborar un sistema de identificación de la especie c o m patible con la evidencia epidemiológica. 2

2

Se suele emplear la lisis de los fagos y el metabolismo oxidativo c o m o m é t o dos básicos para identificación a nivel de la especie y los m é t o d o s convencionales para diferenciación de los biotipos. También se hizo hincapié en los criterios de identificación a nivel del género. Figuran esos criterios en las recomendaciones formuladas por el S u b c o m i t é de Taxonomia del género Brucella en el seno del Comité Internacional de Sistemática Bacteriológica el examen de las propiedades m o r f o l ó g i c a s , culturales, metabólicas y serológicas. Se puede efectuar la c o n f i r m a c i ó n — en el supuesto de g e r m e n atipico — examinando, por un lado, la c o m p o s i c i ó n de las bases purina-pirimidina del A . D . N . (5), así c o m o la secuencia de nucleótidos del A . D . N . (5, 6) y exami-

(*) Traducción del Documento original WHO/BRUC/81.370. (**) Centro colaborador FAO/OMS de consulta e investigación sobre brucelosis, Laboratorio Veterinario Central, Weybridge, Surrey, Inglaterra.

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n a n d o , por o t r o lado, los esquemas de migración electroforética producidos por las proteínas solubles en la mezcla de a g u a , f e n o l , ácido acético (7) y el espectro de adsorción de las franjas a y c del c i t r o c r o m o (8) y , por ú l t i m o , evidenciando antígenos intracelulares idénticos a los de las cepas de Brucella de referencia (9, 10). La cromatografía en fases gaseosa y líquida de los ésteres metílicos de los ácidos grasos t a m b i é n es un m é t o d o c o m p l e m e n t a r i o que se puede utilizar, por tener los ácidos grasos estructurales de las cepas de Brucella un perfil característico de elución (11). Se emplean la evaluación de la lisis de los f a g o s y el perfil m e t a b ó l i c o oxidativo para identificar las especies, pero t a m b i é n se los emplea — especialmente la lisis de los fagos — para confirmar el género, por ser específicos de Brucella. Los m é t o d o s convencionales — especialmente el e x a m e n de necesidades de C 0 , las afinidades tintóreas, la p r o d u c c i ó n de H S , la actividad ureasa y las pruebas de aglutinación con los antisueros monoespecíficos — tienen un valor suplementario para identificar la especie, empleándoselos t a m b i é n para diferenciar los biotipos de las especies m a y o r e s , B. abortus, B. melitensis y B. suis. 2

El género Brucella

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y sus especies f u e r o n definidos c o m o sigue :

Pequeños cocos inmóviles, Gram negativos, cocobacilos o bastoncillos cortos de bordes rectos o ligeramente convexos y de e x t r e m o s redondeados, de 0,5 - 0 , 7 µ m de ancho por 0,6 - 1 , 5 µ m de largo. Se presentan individualmente, más escasa vez en pares, en cadenas cortas o en pequeños racimos. No producen cápsulas, esporos ni flagelos. No suelen presentar coloración bipolar. No son ácidorresistentes, aunque pueden resistir a la decoloración por los ácidos débiles o por los álcalis c o m o en los m é t o d o s de coloración de Macchiavello o de Köster modificada. Aerobios, que poseen un metabolismo respiratorio. M u c h a s cepas exigen un suplemento (del 5 al 10 % ) de C 0 para su c r e c i m i e n t o , sobre t o d o para el primer aislamiento. Quimioorganotróficos, con necesidades nutritivas completas, incluidos m u c h o s ácidos aminados, la t i a m i n a , la n i c o t a m i d a , la biotina y el magnesio. Algunas cepas exigen suero u otros coloides para su crecimiento — pero no requieren haemina (factor X) ni nicotamida adenina dinucleótida (factor V ) . Catalasa positivas y n o r m a l m e n t e oxidasa positivas — aunque B. neotomae, B. ovis y algunas cepas de B. abortus son oxidasa negativas. No fermentan los hidratos de carbono en los medios convencionales salvo B. neotomae. Oxidan m u c h o s ácidos aminados y los hidratos de c a r b o n o . Reducen los nitratos en nitritos, salvo B. ovis. La urea se hidroliza a u n q u e a un grado variable. 2

La producción de H S varía en f u n c i ó n de las especies y de los biotipos. No se emplea el citrato c o m o única f u e n t e de c a r b o n o . No existe producción de indol. La prueba con rojo metil y las reacciones de Voges-Proskauer son negativas. La gelatina no está licuada y los hematíes no están lisados. La leche tornasolada no cambia, o bien se hace alcalina. 2

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Las temperaturas varían de 20 a 4 0 ° C, siendo el ó p t i m o 37° C. El pH ó p t i m o está comprendido entre 6,6 y 7,4 y la presión osmótica óptima entre 2 y 6 atmósferas (0,05-0,15 mole NaCl). Los sistemas de transporte de los electrones incluyen los c i t o c r o m o s a, a , b, c y O. 3

La sensibilidad a la lisis producida por los fagos específicos del género varía según la especie. Los ácidos grasos estructurales p r o d u c e n un perfil de elución característico en cromatografía gas - líquido, así c o m o los ésteres metílicos. Poseen proteínas de estructura c o m u n e s , solubles en la mezcla de agua, de ácido acético y de f e n o l que d a n , en electroforesis, resultados específicos del género. Los principales antígenos de superficie difieren según el carácter liso o non liso de las cepas, mientras que algunos antígenos intracelulares son c o m u nes para todas las especies. El contenido de guanina + citosina del A . D . N . varía entre 56 y 58 moles por ciento (densidad en equilibrio). Las secuencias de los polinucleótidos del A . D . N . ponen de manifiesto en 9 0 % de homología en los estudios de hibridación. Son parásitos intracelulares facultativos que p r o d u c e n enfermedades características en una amplia serie de animales.

ESPECIES TIPO 1. BRUCELLA

MELITENSIS

C 0 independiente. No produce H S o apenas un indicio en medio peptonado. Crecimiento habitual en presencia de fucsina básica y de tionina. Hidroliza normalmente la urea. Las cepas lisas pueden reaccionar c o n los antisueros monoespecíficos M , A o A y M según los biotipos. No es lisada por los fagos T b , Fi o W b con D.C.P. (dilución corriente de prueba) o a 1 0 D.C.P. Las cepas lisas son lisadas por el f a g o B k c o n la D.C.P. y a 104 D.C.P. 2

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Oxida la L-alanina, la L-asparagina, el ácido L-glutámico, la D-glucosa y el i-eritritol. No oxida la L-arabinosa, la D-galactosa, la D-ribosa, la D-xilosa, la L-arginina, la DL-citrulina, la DL-ornitina o la L-lisina. Suele ser patógena para ovejas y cabras, aunque puede infectar a los ovinos y al h o m b r e . Cepas de referencia F . A . O . / O . M . S . (neotipo y biotipos) : B. melitensis B. melitensis B. melitensis

16 M (biotipo 1) 6 3 / 9 (biotipo 2) Ether (biotipo 3)

NCTC 10094 10508 10509

ATCC 23456 23457 23458

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2. BRUCELLA

ABORTUS

Suele requerir un 5 % de C 0 en s u p l e m e n t o para el c r e c i m i e n t o , especialmente en el primer aislamiento. Hidroliza normalmente la urea y produce moderadas cantidades de H S , aunque algunas cepas pueden no p r o d u c i r l o . Suele crecer en presencia de fucsina básica y algunos biotipos en presencia de tionina. En c a m b i o , otras serán inhibidos por a m b o s colorantes. Las cepas lisas pueden tener antígenos de superficie A , M , o A y M que reaccionan, según el biotipo, con los antisueros monoespecíficos. Los cultivos de gérmenes en fase lisa — o en fase intermedia — son lisados por los fagos T b , Fi, W b y Bk c o n la D.C.P. Los cultivos n o lisos s o n lisados p o r el f a g o R / C c o n la D.C.P. 2

2

2

Oxida la L-alanina, la L-asparagina, el ácido L-glutámico, la L-arabinosa, la D-galactosa, la D-glucosa, la D-ribosa, y el i-eritritol. No oxida la D-xilosa, la L-arginina, la DL-citrulina, la DL-ornitina o la L-lisina. Suele ser patógena para los bovinos en los que es causa de a b o r t o ; también puede infectar a otras especies entre las cuales ovejas, cabras, camellos, yaks, búfalos, caballos, perros y el h o m b r e . Cepas de referencia F . A . O . / O . M . S . (neotipo y biotipos): B. B. B. B. B. B. B. B.

abortus abortus abortus abortus abortus abortus abortus abortus

NCTC 10093 10501 10502 10503 10504 10505 10506 10507

544 (biotipo 1) 8 6 / 8 / 5 9 (biotipo 2) Tulya (biotipo 3) 292 (biotipo 4) B3196 (biotipo 5) 870 (biotipo 6) 6 3 / 7 5 (biotipo 7) C68 (biotipo 9)

Ya no está reconocido B. abortus

ATCC 23448 23449 23450 23451 23452 23453 23454 23455

biotipo 8.

3. BRUCELLA

SUIS

C 0 independiente. Hidroliza la urea rápidamente. Produce grandes cantidades de H S o ninguna según el b i o t i p o . El crecimiento se hace en presencia de tionina y suele ser inhibida por la fucsina básica, aunque algunas cepas se multiplican en ambos colorantes. Las cepas lisas suelen reaccionar c o n el suero monoespecífico A , aunque algunas cepas pueden reaccionar en f u n c i ó n del biotipo con los antisueros monoespecíficos A y M , o bien c o n el antisuero M. Las cepas lisas no son lisadas por el f a g o T b c o n la D.C.P., pero sí son lisadas a 1 0 D.C.P. y son lisadas parcialmente por el f a g o Fi y lisadas por los fagos W b y B k con la D.C.P. Oxida la D-ribosa, la D-glucosa, el i-eritritol, la D-xilosa, la L-arginina, la DL-citrulina y la DL-ornitina. No suele oxidar la L-alanina ni la L-asparagina. La oxidación de la L-lisina, del ácido L-glutámico, de la L-arabinosa y de la D-galactosa varía según el b i o t i p o . 2

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Normalmente patógena para los cerdos con excepción del biotipo 4 que generalmente es p a t ó g e n o para los renos. También puede infectar a otras especies entre las cuales las liebres, los roedores, los perros y el h o m b r e . Cepas de referencia F . A . O . / O . M . S . (neotipo y biotipos) : B. B. B. ß.

suis suis suis suis

NCTC 10316 10510 10511 11364

1333 (biotipo 1) T h o m s e n (biotipo 2) 686 (biotipo 3) 40 (biotipo 4) 4 . BRUCELLA

ATCC 23444 23445 23446 23447

NEOTOMAE

C 0 independiente. Produce H S . Hidroliza la urea rápidamente. No se m u l t i plica en presencia de fucsina básica, pero sí se multiplicará en presencia de tionina (al 1/150.000). Las cepas lisas poseen el antígeno de superficie A que reacciona en las pruebas c o n los antisueros monoespecíficos. Las cepas lisas son lisadas parcialmente por el f a g o T b c o n la D.C.P. y t o t a l m e n t e lisadas a 10 D.C.P. También son lisadas por los fagos Fi, W b y B k con la D.C.P. Puede producir ácido a partir de la G-glucosa, D-galactosa, L-arabinosa, y D-xilosa en medio p e p t o n a d o . Oxida la L-asparagina, el ácido L-glutámico, la L-arabinosa, la D-galactosa, la D-glucosa,el i-eritritol y la D-xilosa. No oxida la L-alanina, la L-arginina, la DL-citrulina, la DL-ornitina ni la L-lisina. La oxidación de la D-ribosa es variable. A p a r e c e en el ratón campesino de las regiones desérticas del Oeste de Estados Unidos (Neotoma lepida T h o m a s ) . Se desconocen las infecciones naturales en las demás especies. 2

2

4

2

Cepa de referencia t i p o F . A . O . / O . M . S . : B. neotomae

5K33

NCTC 10084

A T C C 23459

No se reconoce n i n g ú n b i o t i p o . 5. BRUCELLA

OVIS

Requiere un c o m p l e m e n t o de C O ( 5 - 1 0 %) para el crecimiento. No hay producción de H S . No suele hidrolizar la urea, a u n q u e algunas cepas pueden presentar una pequeña actividad a los siete días. Se multiplica en presencia de fucsina básica y de t i o n i n a . No reduce el nitrato. Los cultivos no presentan el carácter liso, siempre están en la fase rugosa en el primer aislamiento. No reacciona con los antisueros monoespecíficos A y M , aunque sí se aglutina con el antisuero R. Reacciona de m o d o cruzado c o n B. canis y otras Brucella no lisas. No es lisada por los f a g o s T b , Fi ni B k cualquiera que sea la c o n c e n tración. Es lisada por el f a g o R/C c o n la D.C.P. Oxida la L-alanina, la L-asparagina y el ácido L-glutámico. No oxida la L-arabinosa, la D-galactosa, la D-glucosa, la D-ribosa, el i-eritritol, la D-xilosa, la L-arginina, la DL-citrulina, la DL-ornitina ni la L-lisina. El adonitol es o x i d a d o , lo que es útil para la identificación pues B. ovis y B. neotomae son las únicas especies n o r m a l m e n t e activas en este substrato. Es patógena para ovejas, p r o d u c e epididimitis en los carneros y aborto en las ovejas. 2

2

2

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Se desconocen las infecciones naturales en otras especies. Cepa de referencia t i p o F . A . O . / O . M . S . : B. ovis 6 3 / 2 9 0

N C T C 10512

A T C C 25840

N i n g ú n b i o t i p o está identificado. 6.

BRUCELLA

CANIS

C 0 independiente. Hidroliza la urea rápidamente. No p r o d u c e H S . Suele reducir los nitratos, aunque algunas cepas pueden n o poseer esta propiedad. Se suele multiplicar en la t i o n i n a , a u n q u e no en la fucsina básica. Los cultivos siempre están en la fase rugosa o m u c o i d e en el primer aislamiento. No reacciona con los antisueros monoespecíficos para los antígenos A y M , aunque reacciona c o n el antisuero frente al antígeno R. Reacciona d e m o d o cruzado serológicamente c o n B. ovis y las demás Brucella no lisas. No es lisado por los fagos T b , Fi, W b o B k cualquier que sea la c o n c e n t r a c i ó n . Es lisado por el f a g o R/C c o n la D.C.P. Oxida la D-ribosa, la D-glucosa, la L-arginina, la DL-citrulina, la DL-ornitina y la L-lisina. N o oxida la L-alanina, la L-asparagina, el ácido L-glutámico, la L-arabinosa, la D-galactosa o la D-xilosa. La oxidación del i-eritritol es variable. 2

2

2

Es patógena para los perros, p r o d u c i e n d o epididimoorquitis en el macho, así c o m o el aborto y la metritis en la h e m b r a . Puede ser transmitida al hombre. Cepa de referencia t i p o F . A . O . / O . M . S . : B. canis

RM/6/66

N C T C 10854

A T C C 23365

No se reconoce ningún biotipo.

T I P I F I C A C I Ó N DE L A S B R U C E L L A Dado el poder infectante para el h o m b r e , los cultivos de Brucella deberían ser examinados por un personal correctamente e n t r e n a d o , d o t a d o de las instalaciones necesarias para precaver cualquier infección accidental. Se han hecho recomendaciones especiales acerca de las medidas de precaución que se han de t o m a r para el manejo de las cepas de Brucella (10). En la mayoría de los casos, los cultivos de Brucella aisladas en las operaciones de diagnóstico o tras las encuestas pueden ser identificados con facilidad c o m o miembros del género con base, primero a la evidenciación en el microscopio de frotis coloreados con el colorante de G r a m , y a la morfología de las colonias en medio de gelosa-dextrosa-suero o cualquier otro medio semejante, poniendo después en acción la aglutinación c o n el antisuero de las especies lisas de Brucella si está la misma en la fase de colonias lisas o c o n el antisuero de una cepa rugosa de Brucella si está la misma en la fase rugosa y, por último, verificando la lisis por los fagos de Brucella. Se realiza e n t o n c e s con facilidad

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