Revacunacion de caprinos vacunados con cepa Rev – 1 de Brucella melitensis con cepa RB51 de Brucella abortus Caprine revaccination with RB51 Brucella abortus strain previously vaccinated with Rev-1 Brucella melitensis strain Martínez Herrera, DI*a; Abeledo García, M.A.b; Percedo Abreu, M.I.b, Rodríguez Chessani, MAa; Rivera Romero, E.L.c; Molina Sánchez, B.a y Bautista Beranza, R.a a Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia – Universidad Veracruzana, Veracruz, Ver. México b Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, San José de las Lajas, Cuba c Servicios de Diagnóstico Veterinario – Laboratorio Aprobado por SAGARPA 071, Veracruz, Ver. México

Summary In order to know if a dosage of 3 X 108 to 3 X 109 CFU of RB51 Brucella abortus strain was able to induce seroconversion in previously vaccinated goats with Rev-1 Brucella melitensis strain, two caprine herds were selected from the Community of Tenextepec, Municipality of Perote, Veracruz, México, an enzootic caprine brucellosis zone. 38 goats up one year, 3% card test seronegatives and previously vaccinated with a dosage of 1 to 2 X 109 CFU Rev-1 Brucella melitensis strain were used to the present field trial. All goats selected were revaccinated with RB51 and sampled monthly 6 times 30 days after vaccination by serological tests. All serum samples were examinated by 3% card and complement fixation 50 HU. From the first herd, 2 of 28 goats seroconverted to both test since the first sampled to the last. From the second herd none of 10 was positive to any tests. It means, that positive goats previously vaccinated with Rev-1 strain due their seroconvertion because field Brucella melitensis strains exposure. Results allow to conclude that RB51 Brucella abortus strain at 3 X 108 to 3 X 109 CFU dosage does not interfere with the serological tests used on previously Rev-1 vaccinated goats. (Key Words: revaccination, previously, tests, seroconvertion, strain, RB51, Rev-1, interference)

INTRODUCCIÓN De acuerdo con los informes anuales de los Servicios de Salud en México, el comportamiento epidemiológico de la brucelosis humana transmitida por el ganado caprino durante 1997 fue del 64% (40). La brucelosis en el hombre se debe principalmente a la infección por Brucella melitensis, cuyos hospederos naturales son los pequeños rumiantes (3). El mayor número de casos humanos se encuentran en estados de Chihuahua, Coahuila, Durango, Guanajuato, Nayarit, Nuevo León, Sinaloa y Zacatecas (40). Los grupos más afectados son (14,34,40): por ocupación, las amas de casa y escolares (39%), los dedicados a actividades del campo (27%) y otras Proceedings of the 10th International Symposium on Veterinary Epidemiology and Economics, 2003 Available at www.sciquest.org.nz

actividades (7%). El grupo de edad de mayor riesgo se encuentra entre los 15 y 25 años que corresponde con las amas de casa y los escolares, por ser los principales consumidores activos de productos lácteos (3,40). Una de las formas más eficaces para prevenir la brucelosis, es a través de la vacunación. En las cabras se ha utilizado la cepa Rev-1 de Brucella melitensis, la cual se obtuvo de cepas lisas en los años 50’s y ha sido usada desde entonces para el control de la enfermedad; sin embargo, esta vacuna tiene características poco deseables como son la persistencia en linfonódulos de los animales vacunados, la inducción de seroconversión por periodos prolongados que conlleva a interferencia diagnóstica en las pruebas serológicas convencionales y su virulencia para el hombre (23,33,38). Desde hace varias décadas dio inicio la búsqueda de otra vacuna que no tuviera estas desventajas; fue así como se desarrolló la cepa RB51 de Brucella abortus, una mutante de la cepa lisa virulenta S2308 (4,37,41). La cepa obtenida, es de tipo rugoso, estable y carente de cadenas laterales “O” del lipopolisacarido de la pared celular bacteriana (37). Esta característica evita la producción de anticuerpos serológicos aglutinantes (6,24,37) detectados por las pruebas oficiales establecidas en la NOM 041- ZOO - 1995 (29). Investigaciones recientes (26,27,33,38) han demostrado resultados muy alentadores para la prevención y control de la brucelosis en cabras y ovinos mediante el uso de la vacuna RB51 de Brucella abortus. En Estados Unidos de Norteamérica, Italia y Argentina, hembras de bovino que fueron vacunadas con la cepa 19 de Brucella abortus a una dosis promedio de 5 X 1010 UFC entre los 3 y 6 meses de edad, se revacunaron con RB51 de Brucella abortus entre los 20 y 24 meses, con el objetivo de lograr un refuerzo de la inmunidad y evaluar si esta medida estimulaba seroconversión hacia cadenas laterales del antígeno “O” del lipopolisacárido presentes en la cepa 19 por acción del recuerdo inmunológico; sin que se constatara seroconversión en las mismas (17,22,36,37,41,42). La comunidad de Tenextepec, Municipio de Perote en el Estado de Veracruz, México, cuenta con una población de 3,664 habitantes y, el inventario caprino más grande del Municipio compuesto por 2,250 cabezas, lo que constituye el principal ingreso económico de las familias (13,16). En esa comunidad, cada año enferman en promedio 35.5 personas, lo que implica una tasa de 4.1 por cada 1,000 habitantes (34); la transmisión está dada por el consumo de productos lácteos no pasteurizados, así como por el manejo inadecuado de los animales, el pobre control de medidas preventivas como la ausencia de vacunación de las nuevas generaciones y la falta de eliminación de los animales enfermos (14,34). Una evaluación de la vacunación de caprinos de Tenextepec, Ver., que se realizó en 1998 (24), demostró que a pesar de que fue vacunada el 80% de la masa animal entre 1994 y 1998, la prevalencia de la enfermedad resultó ser muy elevada (84%), por lo Proceedings of the 10th International Symposium on Veterinary Epidemiology and Economics, 2003 Available at www.sciquest.org.nz

que se concluyó que la cepa Rev-1 de Brucella melitensis no indujo protección contra la enfermedad en esa comunidad. Ante esa situación, se sugirió (24,25) que se evaluaran cepas vacunales distintas a la Rev-1 de Brucella melitensis para vacunar y revacunar a las cabras de esa comunidad. Por lo que el presente trabajo pretende evaluar si las cabras que fueron vacunadas con cepa Rev-1 de Brucella melitensis, no seroconvierten al ser revacunadas con la cepa RB51 de Brucella abortus por efecto de recuerdo inmunológico. MATERIAL Y MÉTODOS Se seleccionaron dos rebaños caprinos en los que se vacunó al 100% de la masa sujeta de vacunación con cepa Rev – 1 de Brucella melitensis. Para este experimento se escogieron únicamente hembras adultas, mayores de doce meses de edad que habían sido vacunadas entre los 3 y 4 meses a dosis de 1 a 2 X 109 UFC con cepa Rev – 1 y con resultados negativos a la prueba de tarjeta al 3%. Se identificaron 28 cabras vacunadas con cepa Rev-1 de Brucella melitensis serológicamente negativas a las prueba de tarjeta al 3% en el primero de los rebaños investigados y 10 en el segundo. Las cabras seleccionadas fueron revacunadas con Brucella abortus cepa RB51 con dosis de 3 X 108 a 3 X 109 UFC, por la vía subcutánea en el tercio medio del cuello del lado derecho y se mantuvieron en condiciones de manejo y alimentación idénticas a las del resto de los animales de sus rebaños. Todas las hembras incluidas en este estudio se muestrearon cada 30 días por espacio de 6 meses después de haber sido revacunadas con la cepa RB51 de Brucella abortus. Las muestras se procesaron en paralelo a través de las técnicas de tarjeta al 3% y fijación del complemento 50 UH (1,2,11,39). RESULTADOS Y DISCUSIÓN De las 28 cabras pertenecientes al primer rebaño, dos (7.14%) mostraron seroconversión a ambas pruebas 30 días después de haber sido vacunadas y se mantuvieron como reactoras por el resto del tiempo que duró el periodo de observación. En cambio, las 10 cabras pertenecientes al segundo permanecieron como negativas por todo el periodo. La seroconversión observada en las dos cabras del primer rebaño puede atribuirse a infección por cepas de campo de Brucella melitensis biovar 1, porque los animales se mantuvieron en donde existe circulación de este tipo de cepas, además el título obtenido por la prueba de fijación del complemento se incrementó en los subsiguientes 3 muestreos (tabla 1), por lo que es posible que los animales vacunados se encontraran ya en periodo de incubación antes de haber sido inmunizados con la cepa RB51 o que los animales se hayan infectado después de haber sido vacunados, ya que como lo reportan varios trabajos realizados en otras especies (12,15,18,19,21,28,37), la vacunación no protege al 100% de la masa.

Proceedings of the 10th International Symposium on Veterinary Epidemiology and Economics, 2003 Available at www.sciquest.org.nz

Tabla 1 Titulación sérica mensual por fijación del complemento 50UH en cabras reactoras del rebaño I Cabra 1 2 3 4 5 6 A 1/16 1/128 1/512 1/512 1/512 1/512 B 1/32 1/128 1/256 1/256 1/256 1/256 La información que se obtuvo en este experimento y otros estudios realizados (4,17,20,35,37) indican que al igual que con bovinos, al revacunar cabras con la cepa RB51 de Brucella abortus, los seguimientos epidemiológicos pueden realizarse en cualquier momento sin los inconvenientes de la interferencia diagnóstica aún cuando los animales hayan sido previamente vacunados con las cepas lisas Rev-1 de Brucella melitensis o 19 de Brucella abortus. El seguimiento serológico que se ha realizado en estudios previos (7,8,10,17,30,31,32) y en este en particular, han mostrado la nula interferencia diagnóstica que presentan las cabras vacunadas utilizadas con la cepa RB51 de Brucella abortus mediante el uso de pruebas convencionales de tarjeta al 3% y fijación del complemento 50 UH, lo que coincide con esos trabajos; por ello si se emplea la revacunación como una medida para reforzar la inmunidad contra brucelosis en la cabra vacunada con cepa Rev-1 de Brucella melitensis o RB51 de Brucella abortus en zonas de alta prevalencia, el seguimiento de esta medida puede evaluarse en cualquier momento, sin los problemas de la interferencia diagnóstica. Por otra parte y sin que fuera uno de los objetivos de este estudio, permitió observar que la protección conferida a las cabras que se utilizaron en éste mediante la vacunación con cepa RB51 de Brucella abortus a dosis de 3 X 108 a 3 X 109 UFC y que se les dio seguimiento por espacio de 6 meses, es también muy similar a la de otro trabajo realizado en la zona, ya que la frecuencia de animales que permanecieron sin seroconvertir fue del 92,86% para el primer rebaño y del 100% para el segundo. Estos resultados coinciden con los reportados en otros trabajos en el bovino (5,9,12,19,35,37) en los que se ha empleado la cepa RB51 para reforzar la inmunidad de hembras previamente vacunadas con la cepa 19 de Brucella abortus en zonas de alta prevalencia. BIBLIOGRAFÍA 1) Alton, G.G., M. Jones L., Angus R. D. y Verger J.M. (1976): Las Técnicas de los Laboratorios en la Brucelosis. Organización Mundial de la Salud, 2ª Edición, Ginebra, Suiza, 11-63. 2) Argote, E., Rodríguez, O., Sánchez, I., Tabares, D. (1989): Aplicación de la técnica de ELISA en el diagnóstico de la brucelosis bovina en Cuba. Revta. Cub. Cienc. Vet. 20(2) 3) Alvarez P. Eduardo (1998): Situación de la brucelosis en América: Panorama General. Memorias del III Foro Nacional sobre Brucelosis. Acapulco, Gro. México 23- 31. Proceedings of the 10th International Symposium on Veterinary Epidemiology and Economics, 2003 Available at www.sciquest.org.nz

4) Blasco, J.M. (1998): Profilaxis vacunal de la Brucelosis en los Rumiantes: Las vacunas tradicionales y las nuevas vacunas. Memorias del III Foro Nacional sobre Brucelosis. Acapulco, Gro. México: 205 - 226. 5) Bricker B.J. & Halling S.M. (1995) Enhancerment of the Brucella AMOS PCR assay for differentiation of Brucella abortus vaccine strains S19 and RB51. J. Clin. Microbiol., 33, 1640- 1642. 6) Bowden,-R.A.; Cloeckaert,-A.; Zygmunt,-M.S.; Bernard,-S.; Dubray,-G. (1995): Surface exposure of outer membrane protein and lipopolysaccharide epitopes in Brucella species studied by enzyme-linked immunosorbent assay and flow cytometry. Infect. Immun. 63 (10), 3945-3952. 7) Colby, L A. (1997): The Humoral Immune Response of Elks (Cervus elaphus nelsoni) and Mice to Vaccination with Brucella abortus Strain RB51. Master Sciences Thesis, Viginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine. 8) Cheville, N. F., Jensen, A. E., Halling, S. M., Tatum, F. M., Morfitt, D. C., Hennager, S. G., Frerichs, W. M., and Schurig, G. (1992).: Bacterial survival, lymph node changes, and immunologic responses of cattle vaccinated with standard and mutant strains of Brucella abortus. Am. J. Vet. Res. 53:1881-1888. 9) Cheville, N. F., Olsen, S. C., Jensen, A. E., Stevens, M. G., Palmer, M. V. (1996): Effects of age at vaccination on efficacy of Brucella abortus strain RB51 to protect cattle against brucellosis. Am. J. Vet. Res. 57:1153-1156 10) Cheville, N. F., Olsen, S. C., Jensen, A. E., Stevens, M. G., Florance, A. M., Houng, H. H., Warren, R. L., Hadfield, T. L., Hoover, D. L. (1996): Bacterial persistence and immunity in goats vaccinated with a purE deletion mutant or the parental 16M strain of Brucella melitensis. Infect. Immun. 64:2431-2439. 11) Díaz, A.E., Hernández, L., Valero, E.G., Arellano, B. y colaboradores.(2001): Diagnóstico de Brucelosis Animal. Instituto de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. SAGARPA / IICA., México, D. F. 9 (13). 12) Elzer, P.H., F.M. Enright, L. Colby, S.D. Hagius, J.V. Walker, M.B. Fatemi, J.D. Kopec, V.C. Beal, and G.G. Schurig. (1999). Protection against infection and abortion induced by virulent challenge exposure after oral vaccination of cattle with Brucella abortus strain RB51. Am. J. Vet. Res., 59:1575-1578. 13) Gobierno del Estado de Veracruz Secretaria Técnica (1998): Enciclopedia Municipal de Perote. 14) Gurría, T .F. J. (1998): Conferencia magistral, Importancia de la Erradicación de la Brucelosis en México. Memoria del III Foro Nacional sobre Brucelosis Acapulco Gro. Proceedings of the 10th International Symposium on Veterinary Epidemiology and Economics, 2003 Available at www.sciquest.org.nz

15) Hernández, A.L. (1999): Vacunación con Rev-1, RB51 y rfbk, en Borregas Experimentalmente Desafiadas con Brucella melitensis. Memorias de la XXXV Reunión Nacional de Investigación Pecuaria, Mérida, Yuc., México, pp: 171. 16) Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática (1996): Séptimo Censo Agropecuario resultados preliminares México D.F. 17) lsen, SC, Evans, D, Hennager, SG, Cheville, N. F., and Stevens, MG. (1996): Serologic responses of Brucella abortus strain 19 calf-hood vaccinated cattle following adult vaccination with strain RB51. J Vet Diagn Invest 8:451-454. 18) Lopetegui, P.I. (1998): Erradicación de Brucelosis Bovina en Chile. Experiencias en el Uso de la Vacuna Cepa RB51. Memorias del III Foro Nacional sobre Brucelosis. Acapulco, Gro., México: 159 – 174. 19) Lord V.R., Schurig G.G., Cherwonogrodsky J.W., Marcano M.J. & Melendez G.E. (1998). Vaccination of cattle with Brucella abortus strain RB51 and 19: A field study under high and low disease prevalence. Am. J. Vet. Res., 59: 10161020. 20) Lord, V.R., Schurig, G.G., Cherwonogrodzky, J.W., Marcano, M.J., Melendez, G.E. (1998): Field study of vaccination of cattle with Brucella abortus strains RB51 and 19 under high and low disease prevalence. Am J Vet Res 59(8):10161020. 21) MacMillan A.P., Greiser-Wilke I., Moennig V. & Mathias L.A. (1990): A competition enzyme immunoassay for brucellosis diagnosis. Dtsch Tierarztl. Wochenschr., 97, 83-85. 22) Madsen, M. (1993): The serological response to vaccination with Brucella abortus strain 19 and Brucella melitensis Rev 1, as measured by rose bengal, serum agglutination and complement fixation tests. Zimb. Vet. J. 24(1), 13-21. 23) Mancera Martínez A. Díaz Aparicio E. Navarrete Vázquez J. Quezada Velázquez F. (1992): Vacunación de cabras con la cepa Rev-1 de Brucella melitensis en diferentes dosis: Evaluación serológica y desafío. Veterinaria México. 23 (2). 24) Martínez Herrera D.I1., Abeledo Garcia,M.A2., Moreno Monfil, M3. Romero Becerra, D. E3,Rivera Romero,E.L3., Zilli Debernardi, E1., Rodríguez Chassani,M.A1., Peniche Cardeña, A.E.J.1, Acosta Martínez, E.A4, Linares Martínez, J:E4. (2001): Evaluación de la vacuna Rev- 1 de Brucella melitensis en rebaños caprinos de Tenextepec, Mpio. de Perote, Ver., México. Memorias de 16ª Reunión Nacional sobre capricultura. Veracruz. 25) Martínez Herrera D.I. Abeledo García M.A. ,Rodríguez Chessani M.A., Rivera Romero E.L., Juárez Soya M.E. Vallecillo Maza A.J . Bautista Beranza R., Batalla Proceedings of the 10th International Symposium on Veterinary Epidemiology and Economics, 2003 Available at www.sciquest.org.nz

Campero D., Acosta Martínez E.A. Luna Martinez J.E., Alpirez Mendoza M. (2001) Aislamiento de Brucella melitensis biovar 1 en leche de cabras de la comunidad de Tenextepec Municipio de Perote Veracruz Memorias del 2° Congreso Latinoamericano de Especialistas en Pequeños rumiantes y Camélidos Sudamericanos XI Congreso Nacional de Ovinocultura Mérida Yuc. México. 26) Martínez Herrera D.I. Abeledo García M.A. ,Rodríguez Chessani M.A., Flores Castro R., Rivera Romero E.L., Juárez Soya M.E. Vallecillo Maza A.J., Millán Menesestello D.A., Bautista Beranza R., Batalla Campero D., Acosta Martínez J.E. (2001) Evaluación de la eficacia de la cepa RB51 de Brucella abortus en la prevención de brucelosis caprina. 16ª Reunión Nacional sobre caprinocultura, Veracruz, México. 27) Martínez Herrera D.I., Abeledo Garcia, M.A. Rodríguez Chessani. M.A. Linares Fuello. N.A., Rivera Romero E.L., Vallecillo Maza A.J. Juarez Soya M.E., Millan Menesenstello D.A, Bautista Beranza R., Espinosa Martínez S.M., Acosta Martínez E.A , Luna Martínez J.E., Batalla Campero D., Flores Castro R. y Alpirez Mendoza M. (2001) Experiencias de campo con la vacuna RB51 de Brucella abortus en un Rebaño ovino con cepa lisas de Brucella spp. Memorias de la XXXVII Reunión Nacional de Investigación Pecuaria Tuxtla Gutiérrez Chis. México pp. 67. 28) Nielsen K., Kelly L., Gall D., Nicoletti P. & Kelly W. (1995). Improved competitive enzyme immunoassay for the diagnosis of bovine brucellosis. Vet. Immunol. Immunopathol., 46, 285-291. 29) Norma Oficial Mexicana 041- ZOO - 1995 "Campaña Nacional contra la Brucelosis en Animales" Diario Oficial de la Federación, México 7 de noviembre de 1996. 30) Olsen SC, Cheville NF, Kunkle RA, Palmer MV, Jensen AE (1997): Bacterial survival, lymph node changes, and immunologic responses of bison (Bison bison) vaccinated with Brucella abortus strains RB51 and 19. J Wildlife Dis;33(1):146151. 31) Olsen, S.C., Bricker, B., Palmer, M.V., Jensen, A.E., Cheville, N.F. (1999): Responses of cattle to two dosages of Brucella abortus strain RB51: serology, clearance and efficacy. Res. Vet. Sci. 66(2):101-105 32) Schurig, G. (1996): Technical report on vaccination of cattle with Brucella abortus RB51. Technical Committee for Vaccination Evaluation, U.S.D.A.. 33) Schurig, G. (1998) Brucelosis y vacuna B. abortus RB51. Memorias III Foro Nacional sobre Brucelosis. Acapulco, Gro. México: 175 - 179. 34) Secretaría de Salubridad y Asistencia (1998): Informe Anual de la Jurisdicción Sanitaria Nº 5 “Xalapa”, Veracruz, México. Proceedings of the 10th International Symposium on Veterinary Epidemiology and Economics, 2003 Available at www.sciquest.org.nz

35) Stevens M.G., Hennager S.G., Olsen S.C. & Cheville N.F. (1994). Serologic responses in diagnostic tests for brucellosis in cattle vaccinated with Brucella abortus 19 or RB51. J. Clin. Microbiol., 32, 1065-1066. 36) Stevens, M. G., Olsen, S. C., Cheville, N. F. (1996): Lymphocyte proliferation in response to Brucella abortus RB51 and 2308 proteins in RB51-vaccinated or 2308-infected cattle. Infect. Immun. 64:1007-1010. 37) Stevens MG, Olsen SC, Palmer MV, Cheville NF. (1997): Brucella abortus Strain RB51: A new brucellosis vaccine for cattle. Compend Cont Ed Pract Vet; 19 (6): 766 - 774. 38) Suárez - Güemez, F, Soberón, Alicia: Díaz Aparicio, E., (1998) Evaluación de la vacuna RB51 y la vacuna experimental rfbk para uso en caprinos. Memorias del III foro Nacional sobre Brucelosis. Acapulco, Gro. México 191 - 204. 39) Thrusfield, M. (1990) Epidemiología Veterinaria. Editorial Acribia, S.A. España. 177 - 232. 40) Vázquez M. O. Domínguez O. J. Olivares L.. A . (1998) La Brucelosis como Problema de Salud Publica en México. Memorias del III Foro Nacional sobre Brucelosis, Acapulco, Gro. 41) Vemulapalli R., Y. He, Boyle S.M., Sriranganathan N., Schurig G.G. :(2000) Complementation of Brucella abortus RB51 with a functional wboA gene results in O-antigen synthesis and enhanced vaccine efficacy but no change in rough phenotype and attenuation. Infection & Immunity 68:3927-3932. 42) Uza, F.A., Samartino, L., Schurig, G., Carrasco, A., Nielsen, K., Cabrera, R.F., Tadeo, H.R. (2000): Effect of vaccination with Brucella abortus strain RB51 on heifers and pregnant cattle. Vet. Res. Commun. 24(3):143 - 151.

Proceedings of the 10th International Symposium on Veterinary Epidemiology and Economics, 2003 Available at www.sciquest.org.nz