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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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˜ ESPANA

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 95903889.4 kFecha de presentaci´on : 22.12.1994 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 732 937 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 25.09.1996

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54 T´ıtulo: Adyuvante de la mucosa no t´ oxico.

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30 Prioridad: 22.12.1993 GB 9326174

24.03.1994 WO IB94/00068

Via Fiorentina, 1 53100 Siena, IT

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72 Inventor/es: Rappuoli, Rino

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74 Agente: Carpintero L´ opez, Francisco

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.02.2000

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

16.02.2000

ES 2 139 879 T3

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73 Titular/es: Chiron S.p.A.

Aviso:

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 139 879 T3 DESCRIPCION Adyuvante de la mucosa no t´ oxico. 5

Campo de la invenci´ on La presente invenci´on se refiere a un adyuvante u ´ til para la administraci´ on de vacunas a organismos. En particular, el adyuvante de la invenci´ on permite suministrar vacunas en superficies mucosas para producir una respuesta inmune secretora y sist´emica.

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Antecedentes de la invenci´ on La tecnolog´ıa actual de la vacunaci´ on se basa casi exclusivamente en t´ecnicas de vacunaci´on sist´emica en las que la vacuna se inyecta al sujeto a vacunar. S´ olo ciertas vacunas vivas/atenuadas, tales como la vacuna de la polio de Sabin, pueden tomarse por v´ıa oral. Las ventajas de las t´ecnicas de inmunizaci´ on oral son diversas. Por ejemplo, es evidente que una vacuna que puede administrarse por v´ıa oral a los sujetos es m´as f´acil de administrar a gran escala en ausencia de un equipo especializado, especialmente a sujetos que pueden ser dif´ıciles de manejar o incluso de localizar, tales como ganado y animales silvestres. De esta forma, se evitar´ıa la extensi´on de la infecci´on mediante la reutilizaci´on de agujas en los pa´ıses en desarrollo. Adem´as, una vacuna oral puede proporcionarse en forma de un s´ olido comestible, que es m´as f´acil de manipular bajo condiciones extremas y es m´as estable que las suspensiones l´ıquidas usadas actualmente. Adem´as, la liberaci´on de inmun´ ogenos en una membrana mucosa, tal como mediante la vacunaci´on oral o intranasal, permitir´ıa la producci´ on de una respuesta inmune secretora. La respuesta inmune secretora, principalmente mediada por IgA, parece estar substancialmente separada de la respuesta inmune sist´emica. La vacunaci´on sist´emica es poco eficaz para producir una respuesta inmune secretora. Esto es un inconveniente considerable cuando se considera la inmunizaci´ on contra pat´ ogenos, que a menudo entran en el sujeto a trav´es de una superficie mucosa tal como la del intestino o el pulm´ on. Desafortunadamente, no es posible producir una respuesta inmune secretora contra la inmensa mayor´ıa de ant´ıgenos simplemente exponiendo las superficies mucosas a tales ant´ıgenos. Adem´as, actualmente no se dispone de ning´ un adyuvante capaz de producir una respuesta inmune secretora a un ant´ıgeno dado. La dificultad aparente se debe en gran medida a un fen´ omeno conocido como tolerancia oral. Los revestimientos del intestino y de los pulmones son tolerantes de forma natural a los ant´ıgenos extra˜ nos, e impiden la creaci´on de una respuesta inmune contra sustancias ingeridas o inhaladas, tales como los alimentos y la materia particulada transportada por el aire. Las toxinas bacterianas que ribosilan el ADP, particularmente la toxina dift´erica, la toxina pert´ usica (PT), la toxina col´erica (CT), las toxinas termol´abiles de E. coli (LT1 y LT2), la endotoxina A de Pseudomonas, las toxinas C2 y C3 de C. botulinum, as´ı como toxinas de C. perfringens, C. spiriforma y C. difficile, son potentes toxinas en el ser humano. Estas toxinas se componen de una subunidad A monom´erica, activa enzim´aticamente, que es responsable de la ribosilaci´on del ADP de las prote´ınas que se unen a GTP, y una subunidad B no t´ oxica que se une a receptores presentes sobre la superficie de la c´elula diana y libera la subunidad A a trav´es de la membrana celular. En el caso de CT y LT, se sabe que la subunidad A aumenta los niveles de AMPc intracelular en c´elulas diana, mientras que la subunidad B es pentam´erica y se une a receptores de gangli´osidos GM1. En 1975 y 1978 se hicieron observaciones que demostraron que la CT es capaz de inducir inmunidad en la mucosa y sist´emica contra s´ı misma cuando se administra por v´ıa intraduodenal (es decir, en una superficie de la mucosa). Se demostr´ o que la funci´ on de uni´ on a la membrana de la CT era esencial para la inmunogenicidad de la mucosa, pero el toxoide col´erico, tambi´en conocido como la subunidad B de CT (CTB) era inactivo tras el aislamiento (Pierce y Gowans, J. Exp. Med 1975; 142: 1550; Pierce, J. Exp Med 1978; 148: 195-206). Posteriormente, se demostr´o que la CT induce una inmunidad sist´emica y de la mucosa contra ant´ıgenos co-administrados, en otras palabras, funciona como adyuvante de la mucosa (Elson, Curr. Top. Microbiol. Immunal, 1989; 146: 29; Elson y Ealding, J. Immunol. 1984; 133: 2892-2897; Elson y Ealding, Ibid. 1984; 132: 2736-2741; Elson y col., J. Immunol. Methods 1984; 67: 101-118; Lycke y 2

ES 2 139 879 T3 Homgren, Immunology 1986; 59: 301-338).

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Los experimentos mencionados anteriormente se realizaron en ratones, que son comparativamente resistentes a los efectos t´oxicos de la CT. Por el contrario, la CT de tipo silvestre es extremadamente t´ oxica para los seres humanos, lo que imposibilita totalmente el uso de una CT que tenga cualquier toxicidad residual como adyuvante de la mucosa en los seres humanos. En la t´ecnica anterior se han realizado dos procedimientos para tratar el problema de la toxicidad de la CT. El primer procedimiento ha implicado el uso de CTB como adyuvante de la mucosa. La CTB es totalmente no t´oxica. En una serie de experimentos, se acopl´o covalentemente CTB a peroxidasa de r´ abano picante (HRP) y se administr´ o a ratones por v´ıa intraduodenal. Esto produjo una respuesta inmune poderosa de la mucosa contra la HRP (McKenzie y Halsey, J. Immunol 1984; 133: 1818-1824).

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Posteriormente, este resultado se ha confirmado parcialmente con otros ant´ıgenos (Liang y col., J. Immunol 1988; 141: 1495-1501; Czerkinsky y col., Infect. Immun. 1989; 57: 1072-1077). Tambi´en se ha establecido que el mismo principio es eficaz cuando se han ensayado ant´ıgenos quim´ericos producidos por fusi´ on de genes con secuencias que codifican CTB (Dertzbaugh y Elson, Infect. Immun. 1993; 61: 384-390; Dertzbaugh y Elson, Ibid. 1993; 61: 48-55; Sanchez y col., Res. Microbiol 1990; 141: 971-979; Holmgren y col., Vaccine 1993; 11: 1179-1184). Sin embargo, la producci´ on de ant´ıgenos quim´ericos o acoplados introduce otra etapa en la preparaci´on de vacunas adecuadas, que esencialmente requiere que los ant´ıgenos se preparen en una forma conjugada con CTB, especialmente para uso oral. Ser´ıa m´ as sencillo y m´as econ´omico que el adyuvante se administrara en una mezcla simple con el ant´ıgeno. En varias publicaciones se ha afirmado la existencia de un efecto adyuvante para el CTB coadministrado (Tamura y col., J. Immunol 1992; 149: 981-988; Hirabayashi y col., Immunology 1992; 75: 493-498; Gizurarson y col., Vaccine 1991; 9: 825-832; Kikuta y col., Vaccine 1970; 8: 595-599; Hirabayashi y col. Ibid. 1990; 8; 243-248; Tamura y col., Ibid. 1989; 7: 314-32-; Tamura y col., Ibid. 1989; 7: 257-262; Tamura y col., Ibid 1988; 6: 409-413; Hirabayashi y col., Immunology 1991; 72: 329-335 Tamura y col., Vaccine 1989; 7: 503-505). Sin embargo, varios aspectos de las observaciones presentadas anteriormente no eran completamente convincentes. Por ejemplo, se indic´o que el efecto adyuvante atribuido a la CTB no estaba restringido a H-2. Sin embargo, se sabe que la respuesta inmune a CTB est´a restringida a H-2 (Elson y Ealding, Eur. as, se observ´o el efecto adyuvante afirmado incluso en individuos J. Immunol. 1987; 17: 425-428). Adem´ ya inmunes a CTB.

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Otros grupos no pudieron observar ning´ un efecto adyuvante de la mucosa atribuible a CTB (Lycke y Holmgren, Immunology 1986; 59: 301-308; Lycke y col., Eur. J. Immunol. 1992; 22: 2277-2281). Los experimentos con CTB recombinante (Holmgren y col., Vaccine 1993; 11: 1179-1183) confirmaron que el efecto afirmado es atribuible en gran medida, si no exclusivamente, a los bajos niveles de contaminaci´ on de las preparaciones de CTB con CT. As´ı pues, actualmente se acepta que la CTB no es u ´ til como adyuvante de la mucosa.

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Un segundo procedimiento para eliminar la toxicidad de la CT ha sido mutar la holotoxina de CT para reducir o eliminar su toxicidad. La toxicidad de CT reside en la subunidad A, y en la t´ecnica se conocen varios mutantes de CT y su hom´ologo, LT, que comprenden mutaciones puntuales en la subunidad A. V´ease, por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional WO92/19265 (Amgen). En la t´ecnica se acepta que CT y LT son generalmente intercambiables, mostrando una homolog´ıa considerable. Sin embargo, se observ´ o que el u ´ nico mutante ensayado hasta la fecha con respecto al efecto de ayuda a la mucosa, un mutante LT que ten´ıa una mutaci´on Glu→Lys en la posici´on 112, era inactivo como adyuvante de la mucosa (Lycke y col; Eur. J. Immunol. 1992; 22: 2277-2251; Holmgren y col., Vaccine on entre la 1993; 11: 1179-1183). Los autores de estas publicaciones concluyen que hay una asociaci´ actividad de ribosilaci´on del ADP de la CT y/o LT y la actividad adyuvante. Por lo tanto, por estas publicaciones parece ser que la CTB o un mutante no t´ oxico de CT o LT no ser´ıa activo como adyuvante de la mucosa.

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ES 2 139 879 T3 El documento WO95/09649 (Medeva Holdings BV) describe el uso de una forma mutante doble no t´ oxica de toxina pert´ usica para la fabricaci´ on de una composici´ on adyuvante para estimular o potenciar una respuesta inmune protectora de un ant´ıgeno co-administrado con la misma. 5

Resumen de la invenci´ on Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de un adyuvante de la mucosa activo que pueda usarse para aumentar la inmunogenicidad de un ant´ıgeno cuando se administra en una superficie de la mucosa, tal como por v´ıa oral o intranasal.

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Ahora se ha descubierto que, en contradicci´ on completa con los resultados y conclusiones presentados en la t´ecnica anterior, se pueden separar las actividades t´oxicas y adyuvantes de las toxinas de ribosilaci´ on del ADP. Se ha demostrado que un mutante completamente no t´ oxico de tal toxina es activo como adyuvante de la mucosa. 15

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Se ha demostrado que un mutante de LT que carece completamente de toxicidad es activo como adyuvante de la mucosa y protege a los sujetos contra la exposici´on posterior a una dosis letal del inmun´ ogeno. Aunque los Solicitantes no desean limitarse por ninguna teor´ıa particular, se postula que los resultados de Lycke y col. y Holmgren y col. indicados anteriormente pueden contradecirse, al menos en parte, ya que no tuvieron en cuenta la estabilidad del mutante que se estaba fabricando. Entre otras cosas, asegurando que el mutante no t´ oxico de la invenci´on es estable en el sitio de liberaci´on, se ha demostrado que el efecto adyuvante de CT y/o LT puede mantenerse mientras que se eliminan sus efectos t´ oxicos. En un primer aspecto, la presente invenci´ on proporciona una composici´ on farmac´eutica que comprende un adyuvante de la mucosa no t´ oxico en mezcla con un segundo ant´ıgeno, caracterizado porque dicho adyuvante de la mucosa no t´ oxico es una toxina bacteriana destoxificada de ribosilaci´ on de ADP que tiene una subunidad A mutante (siempre que dicho adyuvante de la mucosa no t´ oxico no sea una forma mutante doble no t´ oxica de la toxina pert´ usica - v´ease el documento WO95/09649). La toxina bacteriana destoxificada de ribosilaci´ on de ADP comprende preferiblemente una o m´ as adiciones, deleciones o sustituciones de amino´acidos.

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Son particularmente adecuados los mutantes destoxificados de CT o LT. Por ejemplo, un mutante de LT de acuerdo con la invenci´on puede poseer una sustituci´ on Arg7 a Lys7 en la posici´ on 7 de la subunidad A, el denominado mutante LTK7.

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Los especialistas en la t´ecnica conocen mutantes alternativos, y ´estos son mol´eculas preferidas para uso en la presente invenci´on. Los ejemplos incluyen la PT mutada en la posici´on 129, en particular, una PT que tiene una mutaci´ on Glu 129→Gly. Otros mutantes incluyen la PT mutada en una o en las dos posiciones Trp 26 y Arg 9, opcionalmente en combinaci´ on con la mutaci´ on Glu 129.

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El mutante usado en la invenci´ on puede ser adem´ as un mutante en el que la mutaci´ on se ha realizado en una parte de la mol´ecula que produce la prevenci´ on de la escisi´on proteol´ıtica de la subunidad A de la toxina, de tal forma que no se produzca actividad enzim´ atica. Tales mutantes se describen en Grant y col., Inf. and Immunity (1994) 62(10) 4270-4278. Por ejemplo, el mutante puede comprender una mutaci´on Arg 192→Gly en LT o una mutaci´ on correspondiente en otra toxina de ribosilaci´ on de ADP.

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El mutante de la invenci´ on est´ a preferiblemente en forma de una holotoxina, que comprende la subunidad A mutada y la subunidad B, que puede ser oligom´erica, como en la holotoxina de tipo silvestre. La subunidad B preferiblemente no est´ a mutada. Sin embargo, se prev´e el uso de una subunidad A mutada en el aislamiento de la subunidad B, en una forma esencialmente pura o complejada con otros agentes, que puede reemplazar a la subunidad B y/o a su contribuci´ on funcional.

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En la t´ecnica se conocen procedimientos para el dise˜ no y producci´ on de mutantes de CT y/o LT. Se describen procedimientos adecuados en la Solicitud de Patente Internacional WO93/13202 (Biocine Sclavo), as´ı como en el documento WO92/19265 (Amgen).

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El adyuvante de la invenci´ on se administra preferiblemente en mezcla con un ant´ıgeno adecuado contra el cual se desea producir una respuesta inmune. Si el ant´ıgeno y el adyuvante no est´ an mezclados, se prefiere que se administren dentro de un periodo de tiempo relativamente corto entre s´ı, en el mismo sitio de administraci´ on. Se ha observado que el efecto adyuvante proporcionado por la CT de tipo silvestre tiene una corta duraci´ on (v´ease Lycke y Homgren, Immunology 1986; 59: 301-308). En una realizaci´on 4

ES 2 139 879 T3 alternativa, el adyuvante de la mucosa de la invenci´ on puede administrarse, opcionalmente tras el aislamiento de otros ant´ıgenos, como un refuerzo posterior a la administraci´on sist´emica o en la mucosa de una vacuna. 5

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La formulaci´ on precisa de la vacuna puede variar de acuerdo con la naturaleza del inmun´ ogeno. Por ejemplo, si el ant´ıgeno se encierra en microesferas de liberaci´on lenta o liposomas, el adyuvante de la mucosa puede encerrarse similarmente de forma que el ant´ıgeno y el adyuvante puedan interaccionar simult´aneamente con el sistema inmune de la mucosa. Alternativamente, puede usarse la administraci´on separada en la mucosa del adyuvante de la invenci´on para aumentar la respuesta de la mucosa a las vacunas administradas por v´ıa parenteral. En un segundo aspecto, la presente invenci´ on proporciona el uso de un mutante no t´ oxico de CT o LT como adyuvante de la mucosa, en la preparaci´on de una composici´ on para la administraci´on en la mucosa.

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Preferiblemente, la composici´on es una vacuna y es u ´til para la inmunizaci´ on de un sujeto contra una enfermedad o el tratamiento de un sujeto que sufre una enfermedad.

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Preferiblemente, el mutante comprende una o m´ as adiciones, sustituciones o deleciones de amino´acidos en la secuencia de amino´acidos de la subunidad A de CT o LT, que es o son eficaces para anular la toxicidad de la toxina. De acuerdo con un tercer aspecto de la invenci´on, se proporciona el uso de un adyuvante no t´ oxico de la mucosa y un segundo ant´ıgeno durante la fabricaci´ on de una vacuna, con la condici´ on de que dicho adyuvante de la mucosa no t´ oxico no sea una forma mutante doble no t´ oxica de la toxina pert´ usica. La superficie de la mucosa puede ser cualquier superficie adecuada de la mucosa del sujeto. Por ejemplo, la administraci´on puede realizarse por inhalaci´ on, por medio de un supositorio rectal o vaginal, o un pesario, mediante la alimentaci´on u otra administraci´ on bucal, por medio de un aerosol, mediante liberaci´ on intranasal o mediante la aplicaci´on directa a las superficies de la mucosa. Se prefieren especialmente la administraci´ on oral e intranasal. El sujeto puede ser cualquier organismo susceptible de inmunizaci´ on. Est´ an indicados especialmente los seres humanos y otros mam´ıferos tales como el ganado, plagas y vida silvestre.

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Las enfermedades contra las cuales el sujeto puede inmunizarse incluyen todas las enfermedades que pueden tratarse o prevenirse por inmunizaci´ on, incluyendo enfermedades v´ıricas, manifestaciones al´ergicas, enfermedades causadas por pat´ogenos bacterianos u otros pat´ ogenos que entran a trav´es o que colonizan las superficies mucosas, SIDA, enfermedades autoinmunes tales como lupus sist´emico eritematoso, enfermedad de Alzheimer y c´anceres. Los ejemplos de infecciones v´ıricas que pueden tratarse o prevenirse usando la invenci´on incluyen la infecci´ on por virus de ADN, tales como EBV y VZV y, en particular, herpesvirus, por ejemplo, HSV y HCMV, adenovirus, papovavirus tales como HPV, hepadnavirus tales como HBV, infecci´on por virus de ARN tales como picorvavirus, especialmente polivirus y HAV, rinovirus y FMDV, togavirus, flavivirus, coronavirus, paramixovirus tales como RSV, ortomixovirus tales como el virus de la influenza, y retrovirus, especialmente HIV. Tambi´en se prev´e la vacunaci´on contra HCV y HDV.

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Los ejemplos de infecciones bacterianas adecuadas para el tratamiento o profilaxis mediante la invenci´on incluyen la infecci´ on con Helicobacter pylori, estreptococos, meningococos A, B y C, bordetella pertussis, clamidia y trachomatis.

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La formulaci´ on de vacuna adecuada para la liberaci´ on en las superficies de la mucosa pueden prepararse como se indica m´as adelante, aunque otras formulaciones ser´an evidentes para los especialistas en la t´ecnica. An´alogamente, a continuaci´ on se indican reg´ımenes de administraci´on adecuados, aunque ser´ an evidentes para los especialistas en la t´ecnica modificaciones de los valores ejemplificados.

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Adem´as, la invenci´on proporciona un mutante de CT o LT que es un adyuvante no t´ oxico de la mucosa y un segundo ant´ıgeno para la administraci´ on simult´ anea, separada o secuencial. Se prefiere particularmente la administraci´ on simult´ anea del adyuvante y el segundo ant´ıgeno cuando se combinan en un solo veh´ıculo, excipiente o part´ıcula, como se ejemplifica m´as adelante. El segundo ant´ıgeno puede ser cualquier ant´ıgeno contra el que se desea producir una respuesta 5

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inmune en el sujeto. Los ant´ıgenos adecuados comprenden ant´ıgenos bacterianos, v´ıricos y protozoarios derivados de organismos pat´ ogenos, as´ı como alergenos, alogenos y ant´ıgenos derivados de tumores y auto-ant´ıgenos. T´ıpicamente, el ant´ıgeno ser´a un ant´ıgeno proteico, polipept´ıdico o pept´ıdico, pero no se excluyen estructuras antig´enicas alternativas tales como ant´ıgenos de ´acidos nucleicos, ant´ıgenos de carbohidratos y organismos enteros atenuados o inactivados tales como bacterias, virus o protozoos. La invenci´on proporciona adem´ as un procedimiento para la fabricaci´ on de una vacuna con adyuvante que comprende las etapas de: a) realizar una mutag´enesis dirigida espec´ıfica de sitio sobre la subunidad A de una toxina bacteriana de ribosilaci´on de ADP para destoxificar la toxina; y b) asociar la toxina destoxificada con un segundo ant´ıgeno, de tal forma que funcione como un adyuvante de la mucosa.

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Los ejemplos espec´ıficos de ant´ıgenos u ´ tiles en la presente invenci´on incluyen gD, gB y otras glicoprote´ınas de HSV; gp120 y otras prote´ınas de HIV; gB o gH de CMV; ant´ıgenos de HCV; ant´ıgeno delta de HDV; ant´ıgenos de HAV; ant´ıgenos de EBV y VZV; ant´ıgenos de B. pertussis y ant´ıgenos de H. pylori. En general, el segundo ant´ıgeno puede ser el componente inmunog´enico de la vacuna destinada al uso mediante inyecci´on. Tales vacunas, y sus componentes inmunog´enicos, pueden ser vacunas de subunidades, organismos inactivados o atenuados enteros o vacunas de polinucle´ otidos. Las vacunas de acuerdo con la invenci´on pueden ser profil´ acticas (para prevenir una infecci´ on) o terap´euticas (para tratar la enfermedad despu´es de la infecci´on).

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Tales vacunas comprenden uno o m´as ant´ıgenos, normalmente en combinaci´on con “veh´ıculos farmac´euticamente aceptables”, que incluyen cualquier veh´ıculo que no induzca por s´ı mismo la producci´ on de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composici´on. 30

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Los veh´ıculos adecuados son macromol´eculas t´ıpicamente grandes, que se metabolizan lentamente, tales como prote´ınas, polisac´ aridos, a´cidos polil´acticos, ´acidos poliglic´olicos, amino´acidos polim´ericos, copol´ımeros de amino´acidos, agregados de l´ıpidos (tales como emulsiones de gotitas de aceite o liposomas) y part´ıculas v´ıricas inactivas. Tales veh´ıculos son bien conocidos para los especialistas habituales en la t´ecnica. En aspectos preferidos de la invenci´on, estos veh´ıculos pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores (“adyuvantes”). Adem´as, el ant´ıgeno puede conjugarse con un toxoide bacteriano, tal como un toxoide de difteria, o con pat´ ogenos de t´etanos, c´ olera, H. pylori, etc. Los adyuvantes preferidos para mejorar la eficacia de la composici´ on incluyen, pero sin limitaci´ on: (1) sales de aluminio (alumbre), tales como hidr´ oxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc; (2) formulaciones de emulsi´ on de agua en aceite (con o sin otros agentes inmunoestimuladores espec´ıficos tales como muramil p´eptidos (v´ease m´as adelante) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como, por ejemplo (a) MF59T M (Publ. PCT No. WO 90/14837), que contiene un 5 % de Squaleno, un 0,5 % de TweenT M 80 y un 0,5 % de Span 85 (que contiene opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE (v´ease m´as adelante), aunque no es necesario) formulada en part´ıculas submicr´ onicas usando un microfluidizador tal como un microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene un 10 % de Squalano, un 0,4 % de TweenT M 80, un 5 % de pol´ımero L121 bloqueado con pluronic, y thr-MDP (v´ease m´as adelante), microfluidizado en una emulsi´on submicr´ onica o moldeado en un aparato Vortex para generar una emulsi´ on con part´ıculas grandes, y (c) sistema adyuvante RibiTM (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene un 2 % de Squaleno, un 0,2 % de TweenT M 80 y uno o m´ as componentes de la pared de c´elulas bacterianas del grupo compuesto por monofosforil-l´ıpido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL + CWS (DetoxTM); (3) pueden usarse adyuvantes de saponina, tales como StimulonTM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o part´ıculas generadas a partir de los mismos tales como ISCOM (complejos inmunoestimuladores); (4) Adyuvante Completo de Freund (CFA) y Adyuvante Incompleto de Freund (IFA); (5) citocinas tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo, interfer´ on gamma), factor estimulador de colonias de macr´ofagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc; y (6) otras sustancias que act´uan como agentes inmunoestimuladores para mejorar la eficacia de la composici´on. Se prefiere el alumbre y el MF59. Como se ha mencionado anteriormente, los muramil p´eptidos incluyen, pero sin limitaci´ on, N - acetil muramil - L - treonil - D - isoglutamina (thr - MDP), N - acetil - normuramil - l - alanil - d - isoglutamina (nor - MDP), N - acetilmuramil - l - alanil - d - isoglutaminil - l - alanina - 2 - (1’,2’ - dipalmitoil - sn 6

ES 2 139 879 T3 glicero - 3 - hidroxifosforiloxi) - etilamina (MTP - PE), etc. Las composiciones inmunog´enicas (por ejemplo, el ant´ıgeno, el veh´ıculo farmac´euticamente aceptable y el adyuvante) t´ıpicamente contendr´ an diluyentes tales como agua, soluci´on salina, glicerol, etanol, etc. 5

Adem´as, en tales veh´ıculos pueden estar presentes sustancias auxiliares tales como agentes hidratantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras del pH y similares.

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T´ıpicamente, las composiciones inmunog´enicas se preparan en forma de inyectables, bien como soluciones o suspensiones l´ıquidas; tambi´en pueden prepararse formas s´ olidas adecuadas para la disoluci´on o suspensi´on en veh´ıculos l´ıquidos antes de la inyecci´on. La preparaci´ on tambi´en puede emulsionarse o encapsularse en liposomas para conseguir un mejor efecto adyuvante, como se ha discutido anteriormente para los veh´ıculos farmac´euticamente aceptables. Las composiciones inmunog´enicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunol´ ogicamente eficaz de los polip´eptidos antig´enicos, as´ı como cualquier otro de los componentes mencionados anteriormente, cuando sea necesario. Por “cantidad inmunol´ogicamente eficaz” se entiende que la administraci´on de esa cantidad en un individuo, bien en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevenci´ on. Esta cantidad var´ıa dependiendo de la salud y condici´ on f´ısica del individuo a tratar, del grupo taxon´ omico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), de la capacidad del sistema inmune del individuo de sintetizar anticuerpos, del grado de protecci´ on deseado, de la formulaci´on de la vacuna, de la evaluaci´ on del m´edico correspondiente de la situaci´ on m´edica y de otros factores relevantes. Es de esperar que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos rutinarios.

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Las composiciones inmunog´enicas se administran convencionalmente por la v´ıa parenteral, por ejemplo, mediante inyecci´on, subcut´ anea o intramuscular. Otras formulaciones adecuadas para otros modos de administraci´on incluyen las formulaciones orales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transd´ermicas. El tratamiento de dosificaci´on puede ser un solo programa de dosificaci´on o un programa de m´ ultiples dosis. La vacuna puede administrarse junto con otros agentes inmunorreguladores. Los ejemplos de agentes inmunoestimuladores adecuados incluyen interleucinas, tales como las interleucinas 1,2, 4-7 y 12, e interferones, especialmente el interfer´ on γ.

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La invenci´on se describe en lo sucesivo s´ olo a modo de ejemplo, haciendo referencia a las siguientes Figuras:Descripci´ on de las figuras

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La Figura 1a muestra la concentraci´on de anticuerpos totales espec´ıficos de ovoalb´ umina en ratones BALB/c inmunizados i/n o s/c con ovoalb´ umina sola o con ovoalb´ umina junto con derivados de toxinas; La Figura 1b muestra la concentraci´ on de anticuerpos totales espec´ıficos para la toxina en los ratones de la Figura 1a;

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La Figura 2 muestra una medici´ on de la IgA espec´ıfica de ovoalb´ umina en lavados nasales y pulmonares de ratones inyectados como en la Figura 1; y

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La Figura 3 muestra la presencia de anticuerpos espec´ıficos para el toxoide tet´ anico en el suero de ratones BALB/c inmunizados i/n o s/c con el Fragmento C de la toxina tet´anica solo o junto con derivados de la toxina. Descripci´ on detallada de la invenci´ on

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Se us´ o mutag´enesis dirigida espec´ıfica de sitio para reemplazar el resto de arginina en la posici´ on siete de la subunidad A de LT con una lisina, para construir un mutante de LT no t´ oxico que a´ un pudiera formar una holotoxina con actividad de uni´ on de c´elulas. La prote´ına mutante, denominada LTK7, se purific´ o y ensay´o con respecto a la actividad ribosiltransferasa del ADP y la actividad t´ oxica en varios ensayos. LTK7 a´ un pod´ıa unir el receptor de gangli´ osidos GM1, pero mostr´ o una p´erdida completa de la actividad enzim´atica, de acuerdo con los datos publicados (Lobet y col., Infect. Immun. 1991; 59: 2870-2879). Adem´ as, LTK7 era inactivo en el ensayo de asa de ´ıleon de rat´on e in vitro sobre c´elulas Y1, oxicas de LT de tipo silvestre (Tabla 1). incluso cuando se ensay´ o una dosis equivalente a 107 unidades t´ 7

ES 2 139 879 T3 TABLA 1 Propiedades In vivo e in vitro de LT y del mutante LT K-7 LT

LT-K7

LT/LTK7

CGT Arg

AAG Lys

-

0,06 µg

 20 µg

 3.10−3 ∗

10 µg 10 pg/ml +

 500µg/rat´ on  100 µg/ml +

 0,02 ∗∗  10−7 ∗∗ 1

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Cod´ on en posici´ on 7 de la subunidad A Amino´ acido en la posici´on 7 de la subunidad A Actividad ADP-ribosiltransferasa de la subunidad A In vivo en asa de ´ıleon de rat´on Toxicidad in vitro en c´elulas Y1 Uni´ on a eucariotas

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∗

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Datos publicados por Lobet y col. y confirmados en este estudio.

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Este estudio

 Significa que LT-K7 a´ un era enzim´aticamente inactivo o no t´oxico cuando se ensay´ o la mayor concentraci´on mostrada en la tabla. 25

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 indica que la diferencia real es mayor que el n´ umero mostrado que representa la diferencia ensayada. Se ensay´ o la capacidad de LTK7 para actuar como adyuvante de la mucosa en ratones. Se separaron ratones en grupos y se inmunizaron usando ovoalb´ umina como ant´ıgeno reportero. Los animales se inmunizaron por v´ıa intranasal (i/n) o subcut´ anea (s/c) usando 10 µg de ovoalb´ umina sola u ovoalb´ umina mezclada con 1 µg de CT, LT o LTK7. Los ratones se dividieron en cuatro grupos de seis ratones. Cuatro ratones de cada grupo se anestesiaron ligeramente y se inmunizaron con 10 µg de ovoalb´ umina o 10 µg de ovoalb´ umina con 1 µg de toxinas, administrados en un volumen total de 30 µl. Los dos ratones restantes se inmunizaron con la misma cantidad de prote´ınas s/c en un volumen total de 100 µl. Las prote´ınas administradas por v´ıa subcut´ anea se adsorbieron primero en un 2 % de Al(OH)3 . Los animales se inmunizaron en los d´ıas 1, 22, 36 y 61. Se recogieron muestras de sangre de 100 µl en los d´ıas 0, 21, 35 y 56 y, en el d´ıa 76, los animales se sacrificaron mediante punci´on card´ıaca. La cuantificaci´on de los anticuerpos se estim´o mediante un ELISA. Para la estimaci´on de los anticuerpos espec´ıficos de ovoalb´ umina, se recubrieron placas EIA de 96 pocillos (costar) durante una noche con 60 µg/ml de ovoalb´ umina. La medici´ on de los anticuerpos espec´ıficos de la toxina se realiz´o usando un ELISA de captura de GM1. Los anticuerpos espec´ıficos de la toxina se midieron contra el ant´ıgeno usado en las inmunizaciones. No se us´o ninguna toxina individual en las mediciones de los anticuerpos espec´ıficos de las toxinas de cada grupo y, por lo tanto, las concentraciones entre estos grupos no pueden compararse directamente.

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Se reunieron los sueros de cada grupo de cuatro y dos ratones respectivamente. Se prepararon muestras por duplicado a partir de una diluci´ on de 1:50. Las absorbancias se leyeron a 450 nm usando el programa kineticalc versi´ on 2.13 (Biotek instruments). Este programa calcula la velocidad de cambio del sustrato sobre treinta puntos de tiempo separados entre s´ı diez segundos. 50

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Las concentraciones ELISA de los anticuerpos se midieron arbitrariamente como la diluci´on de suero que dio la mitad de la absorbancia m´ axima a 450 nm. Los sueros que no mostraron una absorbancia a 450 nm 2,5 veces mayor que la observada con el suero preinmune equivalente se consideraron negativos. Los resultados mostrados en la Figura 1a y 1b representan los valores medios de concentraci´ on de los pocillos duplicados de un experimento. No se detectaron niveles significativos de anticuerpos contra la ovoalb´ umina por encima del nivel de fondo en el suero de ratones inmunizados i/n con ovoalb´ umina sola, aunque los ratones inmunizados s/c se mostraron una seroconversi´ on eficaz. Los ratones que recibieron ovoalb´ umina junto con CT o LT i/n conten´ıan niveles muy altos de anticuerpos anti-ovoalb´ umina en sus ´ sueros. Estos fueron equivalentes a los observados cuando los ratones se inmunizaron s/c. Los ratones que recibieron ovoalb´ umina con LTK7 tambi´en mostraron niveles muy elevados de anticuerpos contra ovoalb´ umina.

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ES 2 139 879 T3 Los niveles de respuestas anti-toxoide en los mismos grupos se muestran en la Figura 1b. Todos los ratones, incluyendo los inmunizados con la toxina mutante, desarrollaron altos niveles de anticuerpos contra esta toxina en sus sueros. 5

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Los niveles de anticuerpos secretores locales contra ovoalb´ umina se midieron usando lavados de pulm´ on y nasales (Fig. 2). En resumen, los animales se sacrificaron mediante punci´on card´ıaca y se diseccionaron de forma que se expuso la tr´ aquea. Despu´es se insert´ o una pipeta ultra-fina en un peque˜ no corte de la tr´aquea. Los lavados pulmonares se recogieron mediante un lavado repetido y aspiraci´ on de 1,5 ml de alb´ umina de suero bovino al 0,1 % (Sigma), en PBS, en los pulmones. Los lavados nasales se recogieron mediante lavado con 1 ml de BSA al 0,1 % en PBS a trav´es de la cavidad nasal. Los anticuerpos IgA espec´ıficos de ovoalb´ umina se midieron mediante un ELISA usando un anticuerpo conjugado espec´ıfico de cadena alfa anti-rat´ on (Serotec). Se prepararon muestras a partir de animales individuales y las columnas de esta figura representan la velocidad media de cambio del sustrato, usando kineticalc, para cuatro y dos ratones inmunizados i/n y s/c respectivamente. Las figuras se construyen usando los datos de absorbancia de partida a una diluci´ on de 1:3 con respecto a los lavados pulmonares. ´ Estos corresponden a concentraciones comprendidas entre 1:2 y 1:6 para los lavados nasales y entre 1:70 y 1:120 para los lavados pulmonares. Estas concentraciones se calcularon usando el procedimiento descrito anteriormente. Los ratones inmunizados s/c o i/n con ovoalb´ umina sola no conten´ıan IgA espec´ıfica de ovoalb´ umina detectable en los lavados muestreados. Todos los ratones individuales inmunizados con ovoalb´ umina en combinaci´ on con CT, LT o LTK7 mostraron niveles detectables de IgA anti-ovoalb´ umina. As´ı pues, en estos animales es detectable una respuesta anti-ovoalb´umina tanto local como sist´emica. En vista de estos experimentos estimuladores con ovoalb´ umina, la inmunizaci´ on se repiti´ o usando el Fragmento C, una porci´ on no t´ oxica de 50.000 daltons de la toxina tet´ anica que se hab´ıa expresado y purificado a partir de la levadura Pichia pastoris. Los ratones se inmunizaron s/c o i/n con el Fragmento C solo o mezclado con muestras individuales de LT o LTK7. Los ratones se separaron en cuatro grupos de diez ratones y cuatro grupos de cinco ratones. Diez ratones se inmunizaron i/n con a) 10 µg de Fragmento C solo; b) 10 µg de Fragmento C + 1 µg de LT; c) 10 µg de Fragmento C + 1 µg de LTK7 y d) s´ olo PBS, todos en un volumen final de 30 µl. Cinco ratones se inmunizaron i/n con a) 1 µg de LT y b) 1 µg de LTK7. Los dos grupos restantes de ratones se inmunizaron s/c con ninguna prote´ına o con 10 µg del Fragmento C en un volumen de dosificaci´ on de 100 µl. Estas vacunas se prepararon como se describe en la Figura 1. Los animales se inmunizaron en el d´ıa 1 y 22. Se recogieron muestras de sangre de 100 µl en los d´ıas 0, 21 y 35. Los anticuerpos espec´ıficos del Fragmento C se midieron mediante un ELISA usando el toxoide tet´ anico (10 µg/ml) como ant´ıgeno de recubrimiento. Se reunieron los sueros de cada grupo. Se prepararon muestras por duplicado a partir de una diluci´on de 1:50. Las concentraciones ELISA se calcularon como se ha descrito anteriormente. Los ratones inmunizados s/c con el Fragmento C mostraron una seroconversi´on eficaz produciendo altos niveles de anticuerpos anti-Fragmento C (Fig. 3). Los ratones inmunizados i/n con el Fragmento C solo no mostraron ninguna seroconversi´ on significativa. Sin embargo, los ratones inmunizados con el Fragmento C combinado con LT o LTK7 mostraron altos niveles de anticuerpos contra el Fragmento C en sus sueros (Fig. 3). Como los ratones que mostraron seroconversi´on contra el Fragmento C pueden protegerse contra la exposici´ on a la toxina, los grupos se expusieron a la toxina tet´ anica activa. Todos los ratones inmunizados s/c con el Fragmento C solo se protegieron, mientras que todos los ratones inmunizados i/n fueron muy susceptibles. Todos los ratones inmunizados i/n con el Fragmento C combinado con LT o LTK7 sobrevivieron a la exposici´ on (Tabla 2). TABLA 2

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Suero anti-Fragmento C

Muertes

— — ++ ++++ +/-

10/10 10/10 0/10 0/10 10/10

LT LTK7 LTK7 + Fragmento C LT + Fragmento C Fragmento C

La concentraci´on de anticuerpos contra el Fragmento C en el suero de los ratones estaba en un promedio de aproximadamente 1/3.000 en los ratones vacunados con el mutante K7 + Fragmento C y de 1/12.000 para LT/Fragmento C.

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ES 2 139 879 T3 Estos experimentos muestran que puede conseguirse inmunidad protectora contra el t´etanos usando el mutante LT no t´ oxico como adyuvante, y que la inmunizaci´on de la mucosa con esta mol´ecula puede generar una respuesta inmune secretora local y sist´emica contra la toxina y los ant´ıgenos co-administrados. 5

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ES 2 139 879 T3 REIVINDICACIONES

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1. Una composici´on farmac´eutica que comprende un adyuvante de la mucosa no t´ oxico en mezcla con un segundo ant´ıgeno, caracterizado porque dicho adyuvante de la mucosa no t´ oxico es una toxina bacteriana destoxificada de ribosilaci´ on de ADP que tiene una subunidad A mutante, con la condici´ on de que dicho adyuvante no t´ oxico de la mucosa no sea una forma mutante doble no t´ oxica de la toxina pert´ usica. 2. Una composici´on farmac´eutica de acuerdo con la reivindicaci´on 1, en la que dicho adyuvante no t´ oxico de la mucosa es un mutante destoxificado de CT o LT. 3. Una composici´on farmac´eutica de acuerdo con la reivindicaci´on 1 o la reivindicaci´ on 2, en la que el adyuvante no t´ oxico de la mucosa comprende una o m´as adiciones, deleciones o sustituciones de amino´acidos en la subunidad A de la holotoxina.

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4. Una composici´on farmac´eutica de acuerdo con la reivindicaci´on 3, en la que el adyuvante no t´ oxico de la mucosa es LT-K7. 5. Uso de una toxina bacteriana destoxificada de ribosilaci´on de ADP que tiene una subunidad A mutante como adyuvante de la mucosa en la preparaci´ on de una composici´ on para la administraci´on en la mucosa, siempre que dicho adyuvante no t´ oxico de la mucosa no sea una forma mutante doble no t´ oxica de la toxina pert´ usica. 6. Uso de acuerdo con la reivindicaci´on 5, en el que la composici´ on es una vacuna.

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7. Uso de acuerdo con la reivindicaci´on 6, en el que la vacuna es para uso en aplicaciones profil´acticas o terap´euticas. 8. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la composici´ on adem´ as comprende un segundo ant´ıgeno. 9. El uso de un adyuvante de la mucosa como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, durante la fabricaci´ on de una vacuna, con la condici´ on de que dicho adyuvante no t´ oxico de la mucosa no sea una forma mutante doble no t´ oxica de la toxina pert´ usica.

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10. El uso de la reivindicaci´on 10, en el que la vacuna es para la administraci´ on oral o intranasal. 11. Una composici´on farmac´eutica que comprende un adyuvante no t´ oxico de la mucosa y un segundo ant´ıgeno para la administraci´ on simult´ anea, separada o secuencial, caracterizado porque dicho adyuvante no t´ oxico de la mucosa es una toxina bacteriana destoxificada de ribosilaci´ on de ADP que tiene una subunidad A mutante, con la condici´ on de que dicho adyuvante no t´ oxico de la mucosa no sea una forma mutante doble no t´ oxica de la toxina pert´ usica. 12. Una composici´ on farmac´eutica que comprende un adyuvante no t´ oxico de la mucosa y un segundo ant´ıgeno para la administraci´ on simult´ anea, cuando se combinan en un solo veh´ıculo, excipiente o part´ıcula, caracterizado porque dicho adyuvante no t´ oxico de la mucosa es una toxina bacteriana destoxificada de ribosilaci´ on de ADP que tiene una subunidad A mutante, con la condici´ on de que dicho adyuvante no t´ oxico de la mucosa no sea una forma mutante doble no t´ oxica de la toxina pert´ usica. 13. Un procedimiento para la fabricaci´ on de una vacuna con adyuvante, que comprende las etapas de: (a) realizar una mutag´enesis dirigida espec´ıfica de sitio en la subunidad A de una toxina bacteriana de ribosilaci´on de ADP para destoxificar la toxina; y

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(b) asociar la toxina destoxificada con un segundo ant´ıgeno, de tal forma que funcione como adyuvante de la mucosa,

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ES 2 139 879 T3 con la condici´on de que dicho adyuvante no t´ oxico de la mucosa no sea una forma mutante doble no t´ oxica de la toxina pert´ usica.

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14. Una composici´on farmac´eutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 11 ´o 12, en la que el ant´ıgeno se encierra en microesferas de liberaci´on lenta.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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