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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k 2 189 264 kInt. Cl. : A01N 63/00

11 N´ umero de publicaci´on: 7

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˜ ESPANA

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 98954839.1 kFecha de presentaci´on: 05.11.1998 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 1 028 628 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 23.08.2000

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54 T´ıtulo: Plaguicida contra micro-organismos fitopat´ ogeno.

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73 Titular/es: KOPPERT B.V.

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72 Inventor/es: Ravensberg, Willem Jacobus;

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74 Agente: Elzaburu M´ arquez, Alberto

30 Prioridad: 05.11.1997 NL 1007457

Veilingweg 17, Postbus 155 2650 AD Berkel en Rodenrijs, NL Campina B.V.

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.07.2003

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 189 264 T3

01.07.2003

Aviso:

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Pas, Richard Karel van der; Kussendrager, Klaas Daniel y Maas, Johannes Antonius Maria

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 189 264 T3 DESCRIPCION Plaguicida contra micro-organismos fitopat´ ogeno. 5

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La presente invenci´on se refiere a una composici´ on para controlar bacterias y/u hongos pat´ ogenos en plantas, a´rboles y similares, adem´as de un m´etodo en el que se aplica la composici´on. Existen distintos tipos de plaguicidas contra organismos tales como las bacterias y los hongos. A menudo, se trata de agentes sint´eticos con posibles inconvenientes para los seres humanos, los animales y el medio ambiente. Adem´as, a menudo esos agentes tienen el inconveniente de que el organismo a controlar se hace resistente al agente. Entonces, se debe encontrar un nuevo agente para controlar el pat´ ogeno pertinente. Se sabe tambi´en que la actividad de determinados funguicidas est´a relacionada con la temperatura o que depende de un grado determinado de humedad. Tales condiciones limitadas de uso constituyen un gran inconveniente para tratar plantas y a´rboles, que crecen al aire libre. Pero tambi´en pueden ocurrir problemas semejantes en el caso de cosechas cultivadas en invernaderos. Por lo tanto, el objeto de la presente invenci´ on es proporcionar un nuevo plaguicida que no tenga los inconvenientes indicados anteriormente y que pueda usarse para controlar bacterias y hongos pat´ogenos en plantas, a´rboles y similares. Este objeto se alcanza, seg´ un la invenci´ on, con una composici´on que incluye lactoperoxidasa, tiocianato oxido de hidr´ ogeno, en particular glucosa-oxidasa (SCN− ) y/o yoduro (I− ) y un sistema donador de per´ y glucosa. Adem´ as del sistema glucosa-oxidasa/glucosa, se pueden emplear otros sistemas donadores de hidr´ ogeno tal como el percarbonato de sodio o el per´ oxido de hidr´ ogeno estabilizado. Una ventaja de este nuevo agente seg´ un la invenci´ on es que el peligro de resistencias es muy peque˜ no o incluso nulo. Adem´ as se trata de un agente de base natural.

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Se conoce de por si la actividad antimicrobiana de la lactoperoxidasa y se describe en Urs et al., 1974, Phytopatology 64, 542-545. La aplicaci´on del sistema se describe, por ejemplo, en la patente europea no. 0 514 417, en WO91/11105 y en la solicitud internacional W097/26908. Sin embargo, estos documentos se refieren al uso del denominado sistema LP (sistema lactoperoxidasa) para conservar productos cosm´eticos, de higiene oral, desodorantes o con fines m´edicos en seres humanos y animales. El uso en agricultura del sistema lactoperoxidasa se sugiere en “Anti-microbial compositions”, 1999, Research Disclosure 333, 92; sin embargo el documento no describe la adaptaci´ on del sistema para uso agr´ıcola. El tratamiento de infecciones microbianas en plantas, a´rboles y partes de ellos se realiza en condiciones completamente diferentes ( y a menudo muy variables) de las que se emplean en seres humanos y animales, as´ı que no es obvio c´omo tal sistema, basado en la lactoperoxidasa, podr´ıa aplicarse para tener un efecto biocida in situ sobre los pat´ ogenos de las plantas. Como ya se ha indicado previamente, muchas plantas y a´rboles, en especial los cultivos agr´ıcolas, crecen al aire libre y est´an sometidos, por tanto, a condiciones meteorol´ ogicas como el viento, la lluvia, la exposici´on al sol, los cambios de temperatura y otras similares. Todos estos factores pueden reducir la efectividad de un sistema que se basa en enzimas, el cual es, despu´es de todo, relativamente sensible a los plaguicidas qu´ımicos. Una persona cualificada en el campo de los plaguicidas no sabr´ a valorar inmediatamente por este documento la utilidad y el amplio campo de aplicaci´ on de un plaguicida basado en lactoperoxidasa. En una realizaci´ on preferida de la presente invenci´on se a˜ nade tambi´en a la composici´on una base de aceite. La eficacia de la composici´on se mejora adem´as de manera sorprendente incluyendo en la composici´ on una cantidad relativamente peque˜ na de una base de aceite. El aceite tiene como objetivo asegurar una buena distribuci´on de la composici´on sobre las hojas y otras partes de la planta y prevenir la evaporaci´ on del agente, el cual se encuentra, de hecho, en una composici´ on acuosa. La actividad de la composici´ on no depende de una temperatura o humedad relativa espec´ıficas. La probabilidad de resistencia a la composici´on que se desarrolla es peque˜ na, porque el sistema no tiene efecto espec´ıfico sobre los microorganismos, como lo tienen los antibi´oticos. Las c´elulas de las plantas, los animales o los seres humanos son insensibles al sistema. La composici´on seg´ un la invenci´on incluye, por ejemplo, por cada litro de disoluci´ on acuosa, como m´ınimo, 10 mg de lactoperoxidasa; como m´ınimo, 50 I.E. de glucosa-oxidasa; como m´ınimo, 0,05 % de 2

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glucosa; como m´ınimo,25 mg de yoduro (I− ); como m´ınimo 5 mg de tiocianato (SCN− ) y, opcionalmente, un m´ aximo de un 1 % de base de aceite. Adem´ as, opcionalmente, puede estar presente un m´ aximo de un 0,2 % de agente extendedor. Preferiblemente, la composici´on incluye por litro de disoluci´ on acuosa como m´ınimo 50 mg de lactoperoxidasa; como m´ınimo, 100 I.E. de glucosa-oxidasa; como m´ınimo, 0,1 % de glucosa; como m´ınimo, 50 mg de yoduro (I− ); como m´ınimo 10 mg de tiocianato (SCN− ) y, opcionalmente, un m´ aximo de 0,1 % de base de aceite. Adem´as, opcionalmente, puede estar presente un m´ aximo de un 0,1 % de agente extendedor. Se obtiene una buena actividad de la composici´ on cuando ´esta incluye por litro de disoluci´ on acuosa de 10 a 100 mg de lactoperoxidasa, preferiblemente entre 30 a 70 mg; de 50 a 1000 I.E. de glucosa-oxidasa, preferiblemente entre 100 y 250 I.E.; de 0,05 a 2 % de glucosa, preferiblemente entre 0,1 y 1 %; de 25 a 200 mg de yoduro (I− ), preferiblemente entre 50 y 100 mg; de 5 a 50 mg de tiocianato (SCN− ), preferiblemente de 10 a 20 mg y, opcionalmente, de 0,01 a 2 % de de base de aceite, preferiblemente entre 0,2 y 1 %. La cantidad de agente extendedor puede variar, opcionalmente, entre cantidades a˜ nadidas de 0,01 a 0,2 %, preferiblemente entre 0,05 y 0,07 %. La base de aceite est´a formada siempre por al menos un aceite y un agente para emulsionarlo en la disoluci´on acuosa, para formar una emulsi´ on de tipo aceite en agua. Este agente emulsionante puede ser un producto distinto pero tambi´en puede ser el propio aceite, el cual tiene propiedades autoemulsionantes. Tales aceites autoemulsionantes pueden producirse modificando el aceite, por ejemplo por etoxilaci´on. Bas´andose en sus conocimientos profesionales, una persona cualificada puede seleccionar el emulsionante m´as adecuado para un aceite determinado. El aceite usado en la base de aceite se escoge entre aceites de los grupos de aceites minerales, vegetales o animales o bien es una mezcla de uno a m´ as aceites de uno o m´as de esos grupos. Se recomienda emplear los aceites que poseen ya de forma inherente un mayor o menor grado de actividad antimicrobiana. Ejemplos de aceites vegetales son: aceite de cacahuete, de s´esamo, de semillas de colza, de linaza, de ricino, de semillas de soja, de germen de ma´ız, de semillas de algod´ on. Entre todos ellos, se encuentra que el aceite de cacahuete es especialmente adecuado para el prop´ osito de la invenci´on. En el caso de aceites animales, se escogen, por ejemplo, aceites de pescado como los de arenque o caballa. Aceites minerales adecuados son, por ejemplo, distintos tipos de aceite de parafina y aceites tipo keroseno.

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Con el fin de facilitar m´ as la distribuci´ on de la composici´on sobre la superficie a tratar, se pueden a˜ nadir adem´ as uno o m´ as agentes extendedores a la composici´ on o a la base de aceite. Una persona preparada en este campo es perfectamente capaz de seleccionar agentes extendedores adecuados. Tales agentes extendedores usualmente son sustancias no ionog´enicas reductoras de la tensi´ on superficial. Se recomiendan los alcoholes etoxilados, por ejemplo, Volpo T7T M o l´ıpidos fosfatid´ılicos, como el Nathin 130T M .

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En una realizaci´ on especialmente adecuada de la composici´on seg´ un la invenci´ on, la base de aceite est´a formada por entre 80 y 90 partes de aceite, preferentemente 85; entre 5 y 15 partes de emulsionante, preferentemente 10; opcionalmente entre 1 y 10 partes de una fracci´on de lecitina, preferentemente 5. Opcionalmente se puede a˜ nadir a la composici´ on por litro de disoluci´ on acuosa entre un 0,01 y un 0,2 % de agente extendedor, preferentemente un 0,05 %.

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En una realizaci´ on preferida, la composici´ on seg´ un la invenci´on incluye una base de aceite que est´ a formada por aceite de cacahuete, un hexaoleato de polioxietilen sorbitol, tal como el emulsificante Atlas on de lecitina formada por l´ıpidos fosfatid´ılicos, tal como Nathin 130T M (ENR), 1086T M (ICI) y una fracci´ adem´as de un agente extendedor constituido por alcoholes etoxilados, como Volpo T7T M (CRODA).

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Con el fin de prolongar la actividad de la composici´ on in situ, se pueden a˜ nadir uno o m´ as adhesivos. Los adhesivos aseguran, por ejemplo, que los constituyentes de la composici´ on no sean eliminados de la planta por la lluvia u otras condiciones. Una persona cualificada en este campo puede seleccionar de manera sencilla adhesivos de entre los disponibles. Son ejemplos el almid´ on, gomas como la goma xant´ an, la goma ar´ abiga y carboximetilcelulosas (CMC). Se puede aplicar la composici´on mediante pulverizaci´on, espolvoreo, rociado por atomizaci´on, rociado por aspersi´on, riego, inmersi´ on, riego por goteo. Un m´etodo particularmente ventajoso para aplicar la composici´ on consiste en pulverizar tanto mediante m´etodos de bajo volumen (sistemas de neblina) como 3

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de alto volumen. El riego por goteo se puede emplear en sistemas de cultivo sobre lana de roca u otros sustratos de crecimiento. El agente seg´ un la invenci´ on se puede usar tambi´en para desinfectar sistemas de riego por goteo. En los dos u ´ltimos casos, la presencia de la base de aceite no es estrictamente necesaria para una actividad o´ptima. La inmersi´on en un ba˜ no con la composici´on es particularmente adecuada para el tratamiento de partes de plantas, en especial partes recolectables como bulbos, tub´erculos, frutos y otras similares. La composici´on seg´ un la invenci´ on se puede hacer comercialmente disponible de diferentes maneras. Se recomienda una forma en la cual la actividad de la enzima lactoperoxidasa se retrase tanto como sea posible ya que esto incrementa el tiempo de durabilidad antes de la venta del producto. La actividad de la enzima lactoperoxidasa comienza tan pronto como est´e presente un donador de per´ oxido de hidr´ ogeno. En el caso presente, el sistema glucosa-oxidasa / glucosa es el donador de per´ oxido de hidr´ ogeno. Por tanto, se recomienda, al menos para determinadas aplicaciones, suministrar el donador de per´ oxido de hidr´ ogeno separadamente de la enzima lactoperoxidasa. Adem´ as, la base de aceite y el agente extendedor pueden envasarse de manera separada, si se desea.

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En una realizaci´ on concreta de la invenci´ on, se proporciona, por tanto un kit para formar la composici´on, el cual incluye una composici´ on de enzima opcionalmente concentrada formada por al menos lactoperoxidasa y aditivos opcionales, una composici´on donadora de per´ oxido de hidr´ ogeno constituida por al menos glucosa-oxidasa y glucosa, tiocianato y/o yoduro y otros aditivos opcionales y una composici´on de aceite formada por al menos aceite, un emulsionante opcional, agentes extendedores opcionales y otros aditivos opcionales, en el cual se deben mezclar entre s´ı las tres composiciones, en una proporci´ on tal de forma que se obtenga la composici´ on seg´ un la invenci´ on.

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Se puede comercializar la composici´on seg´ un la invenci´ on en una forma concentrada que puede o no ser en seco. La composici´on final se obtiene entonces por diluci´ on o disolviendo en agua, por ejemplo.

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Hongos que pueden ser tratados con ´exito con la composici´on seg´ un la invenci´ on son entre otros: Botryotinia spp (“mohos o podredumbres grises”), como por ejemplo, B. fuckeliana (anam´orfico de Botrytis cinerea), Didymella spp, como por ejemplo D. bryonia ( = Mycospherella en cucurbit´aceas), D. lycopersici ( = c´ ancer en el tomate), Puccunia spp (“royas”) como por ejemplo P. horiana (= roya japonesa), Sphaeroteca spp (“mildiu verdadero”), como por ejemplo, S. fuliginea (mildiu del pepino) y S. pannose (mildiu de la rosa), Erysiphe spp, Oidium spp y Leveillula taurica (tambi´en tipos de “verdadero” mildiu), Fusarium spp (“podredumbre del pie o marchitez”), Phytophtora spp (idem), Pythium spp (“podredumbre del pie”), Plasmopara, Peronospora, y Sclerospora spp (los tipos de mildiu velloso), Rhizoctonia, Verticillium y Sclerotinia spp (causas de manchas), Rhizopus y Penicillium spp (causas de podredumbre en el almacenamiento) y Venturia spp (causas de costras).

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Infecciones bacterianas que se pueden tratar con la composici´on seg´ un la invenci´ on son, entre otras, infecciones por Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris, Curtobactrium flaccumfaciens.

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La composici´ on y el m´etodo seg´ un la invenci´ on se pueden utilizar, en un sentido amplio, para la protecci´on de plantas y el control pe pat´ ogenos en, por ejemplo, agricultura, horticultura, crecimiento de vegetales, cultivo de plantas ornamentales, crecimiento de frutos, crecimiento de bulbos, cultivo de plantas en macetas, silvicultura, etc y como producto de consumo para plantas de interior. Adem´ as de las propias plantas y a´rboles, se pueden tratar tambi´en partes de plantas como bulbos, tub´erculos, flores, cortes, frutos y similares.

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Se entiende, seg´ un la invenci´ on, que protecci´ on de plantas y control de pat´ ogenos significa tanto actividades curativas como preventivas. Sin embargo, en la mayor´ıa de los casos, ello se refiere a la eliminaci´on de los pat´ ogenos que ya est´en presentes. No obstante, en un cierto n´ umero de otros casos, se puede concebir un tratamiento preventivo de partes de plantas. La composici´ on seg´ un la invenci´ on necesita agua libre para ser activa, pero se puede hacer activa de nuevo despu´es de estar seca a˜ nadiendo agua.

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La composici´on seg´ un la invenci´ on es un plaguicida natural y por tanto ecol´ ogico.

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La invenci´on se refiere tambi´en a un m´etodo para controlar bacterias y/u hongos pat´ ogenos para las plantas, a´rboles y sus partes, que incluye la aplicaci´ on de la composici´on seg´ un la invenci´ on a la planta, el ´arbol o sus partes. La invenci´on se aclarar´a adicionalmente mediante los ejemplos siguientes, que se dan solamente a 4

ES 2 189 264 T3 t´ıtulo de ilustraci´ on. Ejemplos 5

Ejemplo 1 Actividad directa del agente seg´ un la invenci´ on contra Verticillium lecanii

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Como organismo de prueba se emplea el hongo Verticillium lecanii , en forma de un polvo de esporas, a una concentraci´ on de aproximadamente 10x1010esporas/gramo. Se pesan 10 g y se suspenden en 100 ml de agua. Se deben dejar entonces las esporas en remojo durante al menos media hora.

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Se preparan 500 ml del agente de la invenci´ on con los ingredientes de la tabla 1. TABLA 1 Cantidad /500 ml

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lactoperoxidasa (LP)

35 mg ((1 mg = 1000 ABTS U*)

glucosa-oxidasa (GO)

12,5 mg (250 u/l **)

ioduro pot´ asico (KI)

65 mg (100 ppm I− )

tiocianato pot´ asico (KSCN)

16,5 mg (20 ppm SCN− )

Glucosa

1,25 g (0,25 %)

base de aceite

1,3 ml (1:375)

agente extendedor

0,25 ml (0,05 %)

Agua

completar hasta 500 ml

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*1 unidad LP: es la cantidad por ml de lactoperoxidasa que proporciona un aumento de extinci´ on de 4,41 por minuto a 412 nm en una disoluci´ on de sustrato de 1mM de ABTS y 0,1 mM de per´ oxido de hidr´ ogeno en 50 mM de tamp´ on de citrato a un pH de 5,0 y una temperatura de 37◦ C. (ABTS = 2,2 azino-di-(3-etilbenzotiazolina)-6-sulfonato) *1 unidad GO: es la cantidad de enzima que puede oxidar 30mg/l de glucosa en 15 minutos a 35a C y pH 5,1 La disoluci´on acuosa se ajusta a pH 6,5 con a´cido c´ıtrico. Se a˜ naden entonces 10 ml de suspensi´on de esporas a 90 ml de agente. A continuaci´on se deja actuar al sistema de lactoperoxidasa sobre las esporas 1, 3, 5 y 15 minutos, tom´andose una muestra de 1 ml en cada uno de los tiempos anteriores y diluy´endola 1000 veces con agua de grifo a fin de diluir el sistema de lactoperoxidasa. De la disoluci´ on diluida se toman 30 µl los cuales se pipetean sobre una placa SDA (placa Sabouraud dextrosa agar). Tras 24 y 48 horas se determina el porcentaje de esporas que germinan.

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Este porcentaje se compara con un blanco. El blanco contiene 10 ml de suspensi´ on de esporas con 90 ml de agua, que despu´es se diluye 1000 veces y del cual se toma una gotita de 30 µl que se coloca en una placa SDA. El experimento se realiza a una temperatura de 21◦ C.

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ES 2 189 264 T3 Se encontr´ o que, de esta forma, el agente seg´ un la invenci´ on eliminaba el 99 % de Verticillium lecanii en un minuto. Ejemplo 2 5

Actividad sobre Verticillium lecanii despu´es de que el agente ha estado activo durante 24 horas

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El experimento se realiza como se describe en el ejemplo 1 con la diferencia de que el sistema de lactoperoxidasa se almacena primero durante 24 horas en una retorta de 500 ml, de forma que solo despu´es se a˜ nade la suspensi´on de esporas. Ello tiene el prop´ osito de ver si el sistema es todav´ıa activo despu´es de 24 h. Con esta formulaci´ on y despu´es de que el sistema haya estado activo durante 24 horas, el agente elimina m´ as del 99 % de Verticillium lecanii en 1 minuto.

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Ejemplo 3 Actividad del agente contra Verticillium lecanii sin I− 20

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El experimento se realiza como se describe en el ejemplo 1 con un agente en el cual no hay KI (I− ). En esta ocasi´ on, s´ olo se examin´ o la actividad de las esporas inmediatamente despu´es de que comenzase el sistema enzim´atico. Esta composici´ on y preparaci´ on s´olo elimin´o el 25 % de Verticillium lecanii. Esto muestra que la adici´on de I− aumenta de manera significativa la actividad biocida sobre hongos. Ejemplo 4 Actividad del agente contra Verticillium lecanii sin SCN−

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El experimento se realiza como se describe en el ejemplo 1 con la diferencia de que no hay KSCN olo se examin´ o la actividad inmediata de las esporas. (SCN− ). S´ El agente seg´ un la invenci´ on elimin´o el 99 % de Verticillium lecanii. 35

Ejemplo 5 Actividad del agente contra Verticillium lecanii a diferentes temperaturas 40

El experimento se realiza como se describe en el ejemplo 1 a dos temperaturas diferentes (+- 10◦ C y 37 C). ◦

El agente elimin´o el 99 % de Verticillium lecanii a ambas temperaturas en 1 minuto. 45

Ejemplo 6 Actividad del agente contra Botrytis cinerea

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El experimento se realiza como se describe en el ejemplo 1, pero con esporas de Botrytis cinerea en lugar de esporas de Verticillium lecanii. Se determina el n´ umero de esporas supervivientes despu´es de 30 y de 60 minutos de incubaci´ on. El agente elimina m´as del 99 % de esporas de Botrytis cinerea en 30 minutos.

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Ejemplo 7 Efecto directo del agente seg´ un la invenci´ on contra Sphaerotheca fuliginea (mildiu del pepino)

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Para el bioensayo se usan placas petri de pl´ astico de 9 cm de di´ ametro. Cada placa petri se rellena con una capa de 8 a 10 mm de agar. El agar se prepara disolviendo 10 gramos de polvo de agar en 1 litro de agua y llev´andolo justo hasta ebullici´on. Despu´es el agar se decanta a un vaso de precipitados y se coloca en un ba˜ no de agua fr´ıa. Cuando la disoluci´ on de agar se ha enfriado hasta unos 50◦ C, se 6

ES 2 189 264 T3 rellenan las placas petri. Justo antes de la solidificaci´on ( a temperaturas entre 30 y 40◦ C), se colocan sobre el agar cortes redondos de hojas de pepino. Los cortes redondos de hoja tienen el mismo di´ ametro que las placas petri y se disponen sobre el agar con el env´es de la hoja hacia abajo. De esta forma, la hoja puede permanecer fresca durante unos 14 d´ıas. 5

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Posteriormente, los cortes redondos de hoja se inoculan con Sphaerotheca fuliginea. Con este prop´ osito, se roc´ıa una hoja de pepino con mildiu freco usando un pulverizador para plantas. Se recoge en un vaso de precipitados el agua de enjuague que contiene las esporas del mildiu. Las placas de bioensayo con los cortes redondos de hojas se roc´ıan con esta agua de enjuague utilizando un pulverizador Badger (2 bar). Las placas se secan al aire y se colocan con las tapas encima en un lugar con una humedad relativa (HR) del 75 %. Una HR del 75 % se obtiene disolviendo 150 gramos de NaCl en 100 ml de agua. La disoluci´ on de NaCl se coloca en un recipiente cerrado con gasa sobre el l´ıquido sobre la cual se encuentran las placas de bioensayo. Uno o dos d´ıas despu´es de la inoculaci´ on de los cortes redondos de hoja con el mildiu, las placas de bioensayo se pulverizan con diversas variaciones del agente seg´ un la invenci´ on. Se incluyen como referencias agua y un pulverizador qu´ımico. Las placas de bioensayo se pulverizan con un pulverizador Badger (2 bar) y se secan al aire. Las placas petri cerradas se colocan encima de una disoluci´ on saturada de sal con una HR del 75 %. De seis a siete d´ıas despu´es de la inoculaci´on del mildiu, las placas de bioensayo se valoran en cuanto a aparici´ on de mildiu y porcentaje de hoja cubierto por el mismo. Si es necesario, y posible, los cortes redondos de hoja se pulverizan de nuevo con el agente seg´ un la invenci´ on 7 d´ıas despu´es de la inoculaci´on del mildiu. Cinco d´ıas despu´es de la segunda pulverizaci´on, se vuelven a valorar los cortes redondos de hojas. Se preparan 500 ml del agente con los ingredientes de la tabla 2. TABLA 2

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Cantidad /500 ml 35

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Lactoperoxidasa (LP)

15 mg ((1 mg = 1000 ABTS U*)

glucosa-oxidasa (GO)

25 mg (500 u/l **)

ioduro pot´ asico (KI)

32,5 mg (50 ppm I− )

tiocianato pot´ asico (KSCN)

8,25 mg (10 ppm SCN− )

Glucosa

5,0 gramos (1,0 %)

Agua

completar hasta 500 ml

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*1 unidad LP: es la cantidad por ml de lactoperoxidasa que proporciona un aumento de extinci´ on de 4,41 por minuto a 412 nm en una disoluci´ on de sustrato de 1mM de ABTS y 0,1 mM de per´ oxido de hidr´ ogeno en 50 mM de tamp´ on de citrato a un pH de 5,0 y una temperatura de 37◦ C. (ABTS = 2,2 azino-di-(3-etilbenzotiazolina)-6-sulfonato) *1 unidad GO: es la cantidad de enzima que puede oxidar 30mg/l de glucosa en 15 minutos a 35aC y pH 5,1

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ES 2 189 264 T3 A estas concentraciones, el agente da un resultado de control sobre Sphaerotheca fuliginea de aproximadamente 20 a 25 %. Ejemplo 8 5

Actividad del agente a diferentes concentraciones de lactoperoxidasa El experimento se realiza como se describe en el ejemplo 7, con la diferencia de que en lugar de una concentraci´on de 30 mg/l de lactoperoxidasa se emplea una concentraci´ on de 100 mg/l (50 mg/500 ml). 10

A estas concentraciones, el agente da un resultado de control sobre Sphaerotheca fuliginea de aproximadamente 55 a 65 %. Ejemplo 9 15

Actividad del agente a diferentes concentraciones de lactoperoxidasa y una base de aceite

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El experimento se realiza como se describe en el ejemplo 7, con la diferencia de que, adem´ as de los componentes all´ı mencionados, se a˜ nade una base de aceite formada por aceite de cacahuete, el emulsificador Atlas 1086T M (ICI) y los agentes dispersores Nathin 130T M + Volvo T7T M . Esta base de aceite se a˜ nade en una concentraci´ on de 1:250. El agente con 30 mg/l de lactoperoxidasa + base de aceite da un resultado de control sobre Sphaerotheca fuliginea de aproximadamente 50-55 % y el agente con 100 mg/l de lactoperoxidasa + base de aceite da un resultado de control sobre Sphaerotheca fuliginea de aproximadamente 80-95 %. La referencia qu´ımica da un resultado de control sobre Sphaerotheca fuliginea de aproximadamente 80-95 %. El agua no tiene un resultado de control apreciable sobre Sphaerotheca fuliginea.

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Ejemplo 10 Experimentos en invernadero para probar la actividad del agente contra Sphaerotheca fuliginea en plantas de pepino.

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Entre 10 y 15 plantas j´ ovenes de pepino se colocan en jaulas cerradas situadas en un invernadero. Las plantas de pepino son no resistentes al mildiu y no han sido pulverizadas. Tienen una altura aproximada de 60 cm y tienen de 4 a 5 hojas de pepino. Las plantas se inoculan el d´ıa 1 con mildiu pulverizando una disoluci´ on de esporas de mildiu sobre ellas (v´ease ejemplo 7 para la obtenci´ on de las esporas de mildiu). El d´ıa 7, las plantas se tratan con el agente seg´ un la invenci´ on, agua o un control qu´ımico. Los tratamientos se pulverizan sobre las plantas con una lanza de pulverizaci´ on a unos 5 bar. El d´ıa 8 y los siguientes, las plantas se valoran en cuanto a porcentaje de da˜ no por el mildiu. Si es necesario, el d´ıa 14 se realiza una segunda pulverizaci´ on con diversos agentes seg´ un la invenci´ on. El da˜ no inicial antes de la pulverizaci´ on es del 50 % para las plantas tratadas con el agente seg´ un la invenci´on y del 50 % para las plantas tratadas con control qu´ımico. Se preparan 1000 ml de agente con los ingredientes de la tabla 3.

50

55

60

8

ES 2 189 264 T3 TABLA 3 Cantidad/litro 5

10

15

20

lactoperoxidasa (LP)

100 mg ((1 mg = 1000 ABTS U*)

glucosa-oxidasa (GO)

50 mg (500 u/l **)

ioduro pot´ asico (KI)

130 mg (100 ppm I− )

tiocianato pot´ asico (KSCN)

33 mg (20 ppm SCN− )

Glucosa

10 g (1 %)

formulaci´ on de aceite

1:250

Agua

completar hasta 1000 ml

*1 unidad LP: es la cantidad por ml de lactoperoxidasa que proporciona un aumento de extinci´ on de 4,41 por minuto a 412 nm en una disoluci´ on de sustrato de 1mM de ABTS y 0,1 mM de per´ oxido de hidr´ ogeno en 50 mM de tamp´ on de citrato a un pH de 5,0 y una temperatura de 37◦ C. (ABTS = 2,2 azino-di-(3-etilbenzotiazolina)-6-sulfonato) *1 unidad GO: es la cantidad de enzima que puede oxidar 30mg/l de glucosa en 15 minutos a 35aC y pH 5,1

25

30

A esta concentraci´on, el agente da un resultado de control sobre Sphaerotheca fuliginea de aproximadamente 80 %. 35

El control qu´ımico da un resultado de control sobre Sphaerotheca fuliginea de aproximadamente 40 %. Ejemplo 11 40

Experimentos en invernadero para probar la actividad del agente contra Sphaerotheca fuliginea en plantas de pepino con adici´on de agente extendedor

45

El experimento se realiza como se describe en el ejemplo 10, con la diferencia de que se a˜ nade un agente extendedor. La concentraci´on del agente extendedor Volpo T7TM es del 0,05 %. El da˜ no inicial por mildiu antes de la pulverizaci´ on est´ a entre el 35 y el 40 %.

50

A esta concentraci´on, el agente sin agente extendedor da un resultado de control sobre Sphaerotheca fuliginea de aproximadamente 85 % respecto del agua. A esta concentraci´on, el agente con agente extendedor como aditivo adicional da un resultado de control sobre Sphaerotheca fuliginea de aproximadamente 99 %. Ejemplo 12

55

Experimentos de campo para probar la actividad del agente contra Sphaerotheca fuliginea en plantas de pepino con y sin agente extendedor

60

El m´etodo usado para los experimentos de campo es el mismo que el descrito para los experimentos en invernadero del ejemplo 10, con la diferencia de que se emplean plantas completamente crecidas en un invernadero y que la pulverizaci´on se realiza con una mochila de pulverizaci´on o un pulverizador de carretilla.

9

ES 2 189 264 T3 Se preparan 1000 ml de agente con los ingredientes de la tabla 4. El da˜ no inicial por Sphaerotheca fuliginea en las plantas de pepino antes de la pulverizaci´ on est´ a entre el 80 y el90 %. Se realiza tratamiento con y sin agente extendedor. 5

TABLA 4 Cantidad /1000 litros

10

15

20

25

lactoperoxidasa (LP)

70 g ((1 mg = 1000 ABTS U*)

yoduro pot´ asico (KI)

130 g (100 ppm I− )

tiocianato pot´ asico (KSCN)

33 g (20 ppm SCN− )

glucosa-oxidasa (GO)

25 g (250 u/l **)

glucosa

2.500 g (0,25 %)

formulaci´ on de aceite

2.666 ml (1:375)

agente extendedor

500 ml (0,05 %)

*1 unidad LP: es la cantidad por ml de lactoperoxidasa que proporciona un aumento de extinci´ on de 4,41 por minuto a 412 nm en una disoluci´ on de sustrato de 1mM de ABTS y 0,1 mM de per´ oxido de hidr´ ogeno en 50 mM de tamp´ on de citrato a un pH de 5,0 y una temperatura de 37◦ C. (ABTS = 2,2 azino-di-(3-etilbenzotiazolina)-6-sulfonato) *1 unidad GO: es la cantidad de enzima que puede oxidar 30mg/l de glucosa en 15 minutos a 35aC y pH 5,1

30

35

El agente con agente extendedor da un resultado de control sobre Sphaerotheca fuliginea de aproximadamente 90 %. El agente sin agente extendedor da un resultado de control de aproximadamente 75 %. 40

Ejemplo 13 Actividad del agente contra Sphaerotheca fuliginea en plantas de pepino con diferentes concentraciones de lactoperoxidasa

45

50

El experimento se realiza como se describe en el ejemplo 12, con la diferencia de que la concentraci´on de lactoperoxidasa var´ıa entre los valores siguientes: 70 mg/l, 60 mg/l y 50 mg/l. En este experimento no se encuentran diferencias entre las distintas concentraciones de lactoperoxidasa. El resultado de control de las tres concentraciones de lactoperoxidasa est´ a comprendido entre 75 y 85 %. Ejemplo 14

55

Actividad del agente contra Leveillula taurica en plantas de pimiento El experimento se realiza como se describe en el ejemplo 12 con una mochila de pulverizaci´on, con la diferencia de que se emplean plantas de pimiento en vez de las de pepino, con su mildiu asociado, Leveillula taurica. No se emplea agente extendedor.

60

A esta concentraci´ on el agente da un resultado de control sobre el mildiu del pimiento (Leveillula taurica) de entre 60 y 70 %.

10

ES 2 189 264 T3 Ejemplo 15 Actividad del agente contra Oidium lycopersicum en plantas de tomate 5

10

El experimento se realiza como se describe en el ejemplo 12 con una mochila de pulverizaci´on, con la diferencia de que se emplean plantas de tomate en vez de las de pepino, con su mildiu asociado, Oidium lycopersicum. A esta concentraci´on el agente seg´ un la invenci´ on da un resultado de control sobre el mildiu del tomate (Oidium lycopersicum) de entre 80 y 85 %. Ejemplo 16 Actividad del agente contra Xanthomonas campestris

15

Se prepara una disoluci´ on de bacterias con aproximadamente 108 esporas/ml en caldo de cultivo. Se preparan 500 ml de agente con los ingredientes de la tabla 5. TABLA 5

20

Cantidad /500 ml 25

30

lactoperoxidasa (LP)

35 mg ((1 mg = 1000 ABTS U*)

glucosa-oxidasa (GO)

12,5 mg (250 u/l **)

yoduro pot´ asico (KI)

65 mg (100 ppm I− )

tiocianato pot´ asico (KSCN)

16,5 mg (20 ppm SCN− )

glucosa

1,25 g (0,25 %)

caldo de cultivo

completar hasta 500 ml

35

40

45

50

55

*1 unidad LP: es la cantidad por ml de lactoperoxidasa que proporciona un aumento de extinci´ on de 4,41 por minuto a 412 nm en una disoluci´ on de sustrato de 1mM de ABTS y 0,1 mM de per´ oxido de hidr´ ogeno en 50 mM de tamp´ on de citrato a un pH de 5,0 y una temperatura de 37◦ C. (ABTS = 2,2 azino-di-(3-etilbenzotiazolina)-6-sulfonato) *1 unidad GO: es la cantidad de enzima que puede oxidar 30mg/l de glucosa en 15 minutos a 35aC y pH 5,1 Se a˜ naden 10 ml de la suspensi´ on de bacterias a 90 ml del agente. A continuaci´on se deja actuar al agente sobre las bacterias 1, 3, 5 y 15 minutos, tom´andose una muestra de 1 ml en cada uno de los tiempos anteriores y diluy´endola 1000 veces en caldo de cultivo a fin de diluir el agente. De la disoluci´ on diluida se toman 0,1 ml los cuales se pipetean sobre una placa NUA (placa Nutriente Agar). Tras 72 horas se valora el crecimiento bacteriano en las placas. Se compara con un blanco. El experimento se realiza a una temperatura de 21◦C y a un pH de aproximadamente 7,5.

60

En este experimento se utiliza la bacteria Xanthomonas campestris. De esta forma, el agente seg´ un la invenci´ on elimina el 100 % de Xanthomonas campestris en 5 minutos.

11

ES 2 189 264 T3 Ejemplo 17 Actividad del agente contra Pseudomonas syringae 5

El experimento se realiza como se describe en el ejemplo 16, con la diferencia de que se prueba la bacteria Pseudomonas syringae en vez de Xanthomonas campestris. De esta forma, la formulaci´ on elimina el 100 % de Pseudomonas syringae en 5 minutos.

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12

ES 2 189 264 T3 REIVINDICACIONES

5

1. Uso de una composici´ on que incluye lactoperoxidasa, tiocianato (SCN− ) y/o yoduro (I− ), un sistema donador de per´ oxido de hidr´ ogeno, en particular glucosa-oxidasa y glucosa, y una base de aceite, para el control de organismos pat´ ogenos para las plantas, en especial hongos y bacterias. 2. Uso seg´ un la reivindicaci´ on 1, en el que la composici´on incluye por litro de disoluci´ on acuosa: como m´ınimo 10 mg de lactoperoxidasa;

10

como m´ınimo 50 U.I. de glucosa-oxidasa; como m´ınimo 0,05 % de glucosa;

15

como m´ınimo 25 mg de yoduro (I− ); como m´ınimo 5 mg de tiocianato (SCN− ); un m´ aximo de un 1 % de base de aceite.

20

3. Uso seg´ un las reivindicaciones 1 o 2, en el que la composici´on incluye por litro de disoluci´ on acuosa: como m´ınimo 50 mg de lactoperoxidasa; como m´ınimo 100 U.I. de glucosa-oxidasa;

25

como m´ınimo 0,1 % de glucosa; como m´ınimo 50 mg de yoduro (I− );

30

como m´ınimo 10 mg de tiocianato (SCN− ); un m´ aximo de un 0,4 % de base de aceite. 4. Uso seg´ un las reivindicaciones 1-3, en el que la composici´on incluye por litro de disoluci´ on acuosa:

35

de 10 a 100 mg de lactoperoxidasa, preferentemente entre 30 y 70 mg; de 50 a 1000 U.I. de glucosa-oxidasa, preferentemente entre 100 y 250 U.I.; de 0,05 al 2 % de glucosa, preferentemente de 0,1 al 1 %;

40

de 25 a 200 mg de yoduro (I− ), preferentemente entre 50 y 100 mg; de 5 a 50 mg de tiocianato, preferentemente entre 10 a 20 mg (SCN− );

45

de 0,01 al 2 % de base de aceite, preferentemente entre 0,2 y el 1 %. 5. Uso seg´ un las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la base de aceite est´a formada por al menos un aceite y un agente para emulsionar el aceite en la disoluci´ on acuosa para formar una emulsi´on de tipo aceite en agua , en particular un emulsionante.

50

55

6. Uso seg´ un la reivindicaci´ on 5, caracterizado porque el agente para emulsionar el aceite en la disoluci´ on acuosa es el propio aceite, el cual tiene propiedades autoemulsionantes. 7. Uso seg´ un las reivindicaciones 5 o 6, caracterizado porque el aceite se escoge entre los del grupo constituido por aceites minerales, aceites vegetales y aceites animales. 8. Uso seg´ un la reivindicaci´ on 7, caracterizado porque el aceite vegetal se escoge entre los del grupo formado por los aceites siguientes: de cacahuete, de s´esamo, de semillas de colza, de linaza, de ricino, de semillas de soja, de germen de ma´ız y de semillas de algod´ on.

60

9. Uso seg´ un la reivindicaci´ on 7, caracterizado porque el aceite animal es un aceite de pescado escogido entre los del grupo formado por: aceite de arenque y aceite de caballa.

13

ES 2 189 264 T3 10. Uso seg´ un la reivindicaci´ on 7, caracterizado porque el aceite mineral se elige entre los del grupo formado por aceites de parafina y aceites de tipo keroseno.

5

11. Uso seg´ un las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque la composici´ on incluye tambi´en uno o m´as agentes extendedores. 12. Uso seg´ un la reivindicaci´ on 11, caracterizado porque el agente extendedor es una sustancia no ion´ ogena reductora de la tensi´on superficial, elegida, por ejemplo, entre los alcoholes etoxilados, como Volpo T7T M y l´ıpidos fosfatid´ılicos, como Nathin 130T M .

10

13. Uso seg´ un las reivindicaciones 11 o 12, caracterizado porque la concentraci´on del agente extendedor est´ a entre 0,01 % y 0,2 %, siendo preferentemente de 0,05 %, por cada litro de disoluci´on acuosa.

15

14. Uso seg´ un las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque la base de aceite est´a formada por al menos: entre 80 y 90 partes de aceite, preferentemente 85; entre 5 y 15 partes de emulsionante, preferentemente 10;

20

25

opcionalmente entre 1 y 10 partes de una fracci´on de lecitina, preferentemente 5. 15. Uso seg´ un con la reivindicaci´on 14, caracterizado porque el aceite es aceite de cacahuete, el emulsionante es el Atlas 1086T M de ICI, la fracci´on de lecitina es Nathin 130T M y el agente extendedor es Volpo T7T M . 16. Uso seg´ un las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque la composici´ on incluye adem´ as uno o m´as adhesivos.

30

17. Uso seg´ un la reivindicaci´ on 16, caracterizado porque el adhesivo se escoge, por ejemplo, entre el almid´ on, gomas, como la goma xant´an, goma ar´ abiga, carboximetilcelulosas (CMC). 18. Uso seg´ un las reivindicaciones 1-17, que contiene, por litro de disoluci´ on acuosa:

35

70 mg de lactoperoxidasa; 250 U.I. de glucosa-oxidasa; 0,25 % de glucosa;

40

100 mg de yoduro (I− ); 20 mg de tiocianato (SCN− ); 0,4 % de una base de aceite que contiene:

45

85 partes de aceite de cacahuete 10 partes de emulsionante Atlas 1086T M de ICI 5 partes de fracci´ on de lecitina Nathin 130T M y

50

opcionalmente 0,5 % de agente extendedor Volpo T7T M . 19. Uso seg´ un las reivindicaciones 1-18, para el control de bacterias y/u hongos pat´ ogenos en plantas, ´arboles y sus partes, en particular partes recolectables como flores, bulbos, tub´erculos, frutos y similares.

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20. M´etodo para el control de bacterias y/u hongos pat´ ogenos en plantas, a´rboles y sus partes, que comprende aplicar a la planta, el ´arbol o sus partes de una composici´ on definida seg´ un las reivindicaciones 1-18. 21. M´etodo, seg´ un la reivindicaci´ on 20, caracterizado porque la composici´ on se aplica mediante pulverizaci´ on, espolvoreo, rociado por atomizaci´on, rociado por aspersi´ on, riego, inmersi´ on, riego por goteo.

14

ES 2 189 264 T3 22. Uso de una forma concentrada de una composici´ on, seg´ un se define en las reivindicaciones 1-18, para el control de organismos pat´ ogenos para las plantas, en concreto, hongos y bacterias.

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10

23. Kit para formar una composici´ on seg´ un se define en las reivindicaciones 1-18, que incluye una composici´ on de enzima opcionalmente concentrada que est´a formada por, al menos, lactoperoxidasa y aditivos opcionales, una composici´on donadora de hidr´ ogeno-peroxidasa, formada por, al menos, glucosaoxidasa y glucosa, tiocianato y/o yoduro y otros aditivos opcionales, y una composici´ on de aceite formada por, al menos, aceite, un emulsionante opcional, agentes extendedores opcionales y otros aditivos opcionales, en el que se deben mezclar las tres composiciones entre s´ı antes de usarse en una proporci´ on tal que se obtenga una composici´on seg´ un la invenci´ on. 24. Uso de un kit, seg´ un la reivindicaci´ on 23, para el control de organismos pat´ ogenos para las plantas, en concreto, hongos y bacterias.

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60

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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