14 Estudios prenatales no invasivos mediante el ADN fetal libre en sangre materna

ARTÍCULO POR INVITACIÓN

Estudios prenatales no invasivos mediante el ADN fetal libre en sangre materna Noninvasive prenatal testing through free fetal DNA in maternal blood

Dr. Justo Alonso Resumen Los obstetras enfrentan una nueva era de diagnóstico y asesoramiento prenatal. Las técnicas evolucionan velozmente y es indispensable que los médicos estén actualizados en su trabajo diario por medio de la educación médica continua. El test DPNI se presenta como un método prometedor con beneficios comprobados en comparación con otras herramientas de detección. Se debe utilizar con un profundo conocimiento de las limitaciones de la técnicas, sin despreciar otras herramientas de diagnóstico de mayor antigüedad y comprobada eficacia. Se debe buscar un enfoque personalizado con cada paciente y obtener el consentimiento informado. Se deben llevarse a cabo entrevistas personales y es obligatorio que un especialista en genética o perinatología entregue los resultados en persona, para poder contestar todas las posibles interrogantes respecto del significado de este estudio. Palabras clave: Diagnóstico genético intrauterino no invasivo. ABSTRACT Obstetricians face a new era of prenatal diagnosis and counseling. The techniques are evolving rapidly and it is essential that physicians are current in their daily work through continuing medical education. The DPNI test is presented as a promising method with proven compared to other detection tools benefits. Used with a deep understanding of the limitations of the techniques, without neglecting other diagnostic tools oldest and proven. A personalized approach to each patient and obtain informed consent should be always considered Personal interviews are mandatory to communicate a genetic or perinatal decision. Keywords: intrauterine noninvasive genetic diagnosis.

Profesor Titular de la Clínica Ginecotocológica C. Facultad de Medicina de Montevideo. Universidad de la República Oriental del Uruguay. Montevideo, Uruguay

INTRODUCCIÓN En el transcurso de su práctica, los obstetras se enfrentan continuamente a nuevos desafíos relacionados con el diagnóstico prenatal, a medida que el conocimiento científico avanza de forma exponencial en este campo. Debido a esto, es fundamental recibir una educación médica continua, tanto en este área como en otras, para poder llevar a cabo una buena práctica clínica y un correcto asesoramiento a las embarazadas. Actualmente, los defectos congénitos representan la principal causa de mortalidad infantil en el mundo desarrollado. La prevalencia declarada de defectos congénitos varía desde niveles tan bajos como 4 por cien nacidos vivos en Francia, hasta más de 8 por cien nacidos vivos en Sudán. El promedio mundial de esta cifra es de 6 por cada cien nacidos vivos (1). En países desarrollados, las anomalías cromosómicas son la causa de uno de cada diez defectos congénitos; lo que significa que 9 de cada diez bebés que nacen con un defecto mayor presentarán un cariotipo normal (2). A pesar de esto, el análisis de cariotipo fetal resulta un componente importante del diagnóstico prenatal, dado que algunas condiciones (por ejemplo el síndrome de Down) pueden no llegar a ser diagnosticadas correctamente mediante un estudio de ultrasonido, el cribado bioquímico, o una combinación de ambos (triple cribado entre las semanas 11 y 14, cribado cuádruple el segundo trimestre). En las últimas dos décadas, la medicina prenatal se ha beneficiado de algunos avances de gran importancia. Dentro de ellos, las imágenes por ecografía constituyen el avance más revolucionario y a la fecha, la herramienta más útil para el diagnóstico prenatal. La prevalencia prenatal de anomalías cromosómicas presenta la siguiente distribución según Wellesley et al (3): Trisomía 21: 53%; Trisomía 18: 13%; Trisomía 13: 5%; 45 X0 ; (Turner): 8%: Trisomía sexual: 5%; Rev. Latin. Perinat. 18 (1) 2015

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Otras anomalías de baja frecuencia: 16%. Tanto el ultrasonido como cribado bioquímico son procedimientos no invasivos sin riesgo para el feto, pero el primero depende fuertemente de la pericia del técnico a cargo del estudio. Por otra parte, previo al 2012, el análisis genético de las células fetales requería de técnicas invasivas para obtener células fetales o placentarias (amniocentesis o biopsia de vellosidades coriónicas: BVC). Estos procedimientos son costosos y requieren de una pericia considerable, y al mismo tiempo presentan riesgo de aborto y solo permiten obtener cromosomas fetales en pequeñas cantidades (4). El riesgo de aborto para estas técnicas es de 1 en 300 para la amniocentesis y de 1 en 250 para la BVC, por lo cual solo se ofrecen a aquellas mujeres cuyo riesgo de alteración del cariotipo exceda el riesgo propio de un procedimiento invasivo (5). En el 2012, sin embargo, se logró un cambio drástico en cuanto a análisis cromosómico prenatal, gracias al desarrollo de métodos más apropiados para el estudio del ADN fetal libre en la sangre materna, mediante tecnologías de secuenciación masiva. Este artículo presenta un análisis de los nuevos métodos diagnósticos disponibles para las aneuploidías más comunes, principalmente la secuenciación masiva de ADN fetal libre e intenta explicar sus implicaciones para el trabajo diario de los obstetras que realizan controles de embarazo. ANÁLISIS DE CARIOTIPO CLÁSICO Actualmente, solo es posible obtener el cariotipo completo del feto mediante tres métodos, los cuales precisan núcleos completos de células fetales. Biopsia de Vellosidades Coriónicas (BVC) La BVC se realiza idealmente a las 12 semanas de gestación. Utilizando el ultrasonido como guía, se inserta una aguja apropiada en la placenta para obtener una pequeña cantidad de tejido de vellosidades coriónicas. Las células de este tejido normalmente poseen el mismo ADN que las células somáticas, excepto en casos raros de mosaicismo (6, 7). En manos de profesionales experimentados, la tasa de complicaciones (principalmente, aborto) de esta técnica invasiva es de 1 por cada 200 a 250 CVS (8). Luego de lavar las vellosidades coriónicas y separarlas del tejido materno (decidua y sangre materna) se identifican las células fetales y se analiza su cariotipo. Los resultados se obtienen en pocos días, generalmente menos de una semana. Es preciso confirmar los resultados anómalos mediante amniocentesis debido a la posibilidad de mosaicismo. La BVC tiene una sen-

sibilidad de 99,25% en la detección de aneuploidías, con una especificidad de 98,65% (4). AMNIOCENTESIS Esta técnica consiste en obtener fluido amniótico mediante una aguja que es guiada por ultrasonido. Se puede llevar a cabo luego de 13 a 14 semanas de gestación. La amniocentesis requiere del cultivo de fibroblastos fetales, y permite analizar el cariotipo fetal. Entre profesionales con experiencia, tiene una tasa de complicaciones (principalmente aborto) de 1 por cada 300 procedimientos (5). En general lleva dos semanas realizar el cultivo de suficientes células fetales para obtener las cantidades necesarias de cromosomas para lograr un informe confiable. La amniocentesis tiene una sensibilidad del 99,4% para la detección de aneuploidías, con una especificidad del 99,5% (9). CÉLULAS FETALES DE LA SANGRE MATERNA En 1954, Chown y col. (10) detectaron el pasaje de sangre fetal hacia el sistema circulatorio materno. En 1969 se logró detectar linfocitos fetales y aislarlos de la sangre materna (11). Se ha publicado también el hallazgo de varios tipos de células fetales portadoras del genoma fetal en la circulación materna. Estos incluyen trofoblastos, linfocitos y granulocitos fetales, así como eritrocitos nucleados. Desde 1990 ha habido varios intentos exitosos de obtener células fetales a partir de la sangre materna. Sin embargo, todos los procedimientos para separar las células fetales de las maternas son complejos y costosos, debido a que, durante el embarazo, la concentración de células fetales es de aproximadamente 1 cada 1000 células maternas. A pesar de algunos prometedores resultados en un principio con la técnica de hibridación in situ con fluorescencia (FISH, por sus siglas en inglés), éstas técnicas aún tienen una reproducibilidad y fiabilidad limitadas, principalmente por la falta de marcadores celulares muy específicos y a las concentraciones muy bajas y variables de células fetales entre las numerosas células maternas (12). No han logrado una gran aceptación, por las razones detalladas y sus altos costos. Estas tres técnicas pueden lograr resultados más tempranos si se utilizan procedmientos de “pintado cromosómico” (13), consistentes en anticuerpos fluorescentes específicos que se fijan a los cromosomas buscados, en general los asociados más frecuentemente a trisomías: 21, 18 y 13. Combinación de ultrasonido y cribado bioquímico para detección de aneuploidías fetales. Rev. Latin. Perinat. 18 (1) 2015

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En los años 80 se encontró correlación de los valores elevados de Alfa-Feto-Proteína (AFP) en el suero materno con defectos del tubo neural (14). En la misma década también se demostró la correlación entre una serie de proteínas fetales o placentarias con el síndrome de Down y otras trisomías frecuentes: BetahCG (fracción beta de la gonadotropina coriónica humana), estriol y PAPP-A (proteína plasmática A asociada al embarazo) (15, 16). Estas herramientas de diagnóstico se desarrollaron en asociación con los marcadores de ultrasonido (translucencia nucal, hueso nasal, flujo del ductus venosus medido por ultrasonido Doppler) para establecer el riesgo de aneuploidías. (17, 18). Obstetras y pacientes han aceptado estos procedimientos de forma unánime en todo el mundo, gracias a tener un bajo costo y no presentar riesgos. Sin embargo, estas técnicas no poseen valor diagnóstico, ya que sus resultados expresan una probabilidad, no una certeza. Por ejemplo, las tasas de detección de aneuploidías de síndrome de Down mediante estas técnicas combinadas (cribado triple o cuádruple) varían entre 60% y 80% (19). Por lo tanto, los resultados de estas pruebas de detección solo brindan un estimativo del riesgo de aneuploidías. Un resultado negativo (bajo riesgo) puede ser malinterpretado como una determinación de que el feto es normal, mientras que un resultado positivo, basado en un alto riesgo, puede llevar a innecesarios procedimientos invasivos. Luego de un resultado anormal de un estudio de detección, se debe ofrecer un procedimiento invasivo.

Simpson y Elias lograron demostrar en 1993 la presencia de fragmentos de ADN fetal libre (cfDNA) en la sangre materna (21). En 1997, Lo y coll. aislaron fragmentos de ADN fetal en suero y plasma maternos (22), y en el 2008 Fan y col. utilizaron la secuenciación masiva para diagnosticar las aneuploidías fetales buscadas, a partir de sangre materna (23). A partir de allí se produjo una cascada de nuevos estudios que respaldaban la viabilidad de aislar y analizar el ADN fetal libre en la sangre materna (24-29) para diagnosticar anomalías cromosómicas. Con este fin se pueden aislar dos tipos de ADN fetal a partir de la sangre materna: el existente en los núcleos de las células fetales (uno en 1.000 millones de células en la circulación materna), o fragmentos libres de ADN (de 2 a 20% del ADN libre en la circulación materna (26)). El ADN fetal se libera por apoptosis hacia la sangre materna en forma de pequeños fragmentos de 150 a 200 pares de bases. Por lo tanto, la sangre materna contiene ADN libre tanto materno como fetal, el cual se puede detectar tan precozmente como en la 7ª semana de gestación, y se vuelve indetectable 2 horas después del parto (28). TABLA 1 Tasas de detección Tasas basadas en datos publicados # de

T21

T18

T13

45X

XXX/XXY

99.9%

99.9%

99.9%

99.9%

99.9%

98.6%-99.1% 100%

91.7%

N/A

N/A

referencia 31 32 33

100%

97.2%

78.6%

93.8%

N/A

34

100%

98.0%

N/A

N/A

N/A

FIGURA 1

TABLA 2

TASA DE DETECCIÓN DE SINDROME DE DOWN

Panorama Natera

Verinata Verifi

Trisomías identificadas

13, 18, 21

Monosomías identificadas

Cromosoma X

13, 18, 21 cromosomas sexuales Cromosoma X

Método

Polimorfimos de nucleótido único 92-99%

TASA de FALSOS POSITIVOS < O.1% >99%

DPNI SCREEN INTEGRADO

95%

SCREEN 1er TRIMESTRE

85% 81%

SCREEN CUADRUPLE AFP sola EDAD MATERNA

35% 30%

Limitaciones de los actuales estudios de aneuploidías: -Alta tasa de falsos positivos (5%) -Información tardía -Incertidumbre prolongada -Inconveniencia de reiteradas visitas médicas -Necesidad de ultrasonido especializado -Riesgos para el embarazo (BVC y amniocentesis) ADN fetal libre en sangre materna

Sensibilidad

Especificidad 100% Edad gestacional temprana

9W

Sequenom Materni T21Plus 13, 18, 21 cromosomas sexuales Cromosoma X

Ariosa Harmony

Secuenciación paralela masiva

Secuenciación paralela masiva

Secuenciación selectiva

87-99%

92-99%

80-99%

100%

>99%

>99%

10W

10W

10W

13, 18, 21 cromosomas sexuales Cromosoma X

Este artículo no pretende describir la metodología de la secuenciación del ADN, y se enfocará Rev. Latin. Perinat. 18 (1) 2015

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sangre materna. Cuatro de ellos están establecidos en California, EE. UU. (se pone entre paréntesis la

TABLA 3 Desempeño de DPNI – todos los métodos cfDNA Tasa de detección

TFP

Trisomía 21

590/594 (99.5%)

0.1%

Trisomía 18

222/230 (97%)

0.1%

Trisomía 13

30/38 (79%)

0.1%

TABLA 4 Resumen de estudios clínicos y publicaciones

El cfDNA no siempre se correlaciona con el genotipo fetal (mosaicismo placentario, mellizo desaparecido, mosaicismo materno)

principalmente en las implicaciones clínicas de los estudios de Diagnóstico Prenatal No Invasivo (DPNI) de las aneuploidías más frecuentes. Importancia de la fracción fetal Para que esta técnica logre resultados significativos, la fracción de ADN fetal debe ser superior al 10% del total de ADN libre en la circulación materna. Una fracción inferior al 10% puede llevar a interpretaciones erróneas (24), por lo que la mayoría de los laboratorios que ofrecen la técnica optan, en estos casos, por obtener una nueva muestra de sangre materna para realizar así un análisis correcto (30). El rol del mosaicismo placentario Como el ADN libre se origina en la placenta, más probablemente del trofoblasto, se asemeja a la preparación directa de la BVC. Es importante tener en cuenta que la composición cromosómica de la placenta y el feto pueden ser diferentes (mosaicismos placentarios). Esta situación es más frecuente con los cromosomas 13 y 18 que con el cromosoma 21. Esto puede producir falsos positivos y falsos negativos (7). FIGURA 2 DPNI para T21 – No diagnóstico. Prueba de detección Los resultados del DPNI se deben tomar en el contexto de la prevalencia de la enfermedad Ejemplo: Exactitud del estudio: 99% de detección 0,1% de falsos positivos Prevalencia de T21: 1 en 500

Estudio NICE (Evaluación cromosómica no invasiva)

Estado Publicado - Selección del Editor en The Gray Journal (ago 2012)

Descripción Estudio de validación en 50 centros, combinando mujeres de alto y bajo riesgo. Mayor estudio de cohortes de NIPT.

Riesgo promedio (Nicolaides)

Publicado - The Gray Journal (2012, disponible online)

Investigación exclusiva de riesgo promedio de estudio Harmony en embarazos de 1er trimestre

Ariosa Ciego

Publicado - Selección del Editor en The Gray Journal (abril 2012)

Estudio ciego con informe de puntaje de riesgo

Nicolaides Ciego

Publicado - Selección del Editor en The Gray Journal (abril 2012)

Investigación ciega de 1er trimestre

Prueba de concepto

Publicado - artículo de tapa en Prenatal Diagnosis (enero 2012)

Descripción inicial de enfoque de cfDNA dirigido, con combinación de mujeres de riesgo medio y elevado

Trisomía 13

Publicado - The White Journal (enero 2013)

Desempeño para detección de T13, con combinación de mujeres de riesgo medio y elevado

Fracción fetal – subestudio NICE

Publicado - J Mat Fet Med (enero 2013)

Igual fracción fetal en mujeres de riesgo alto y bajo

Fracción fetal

Publicado – Fetal Diagnosis and Therapy (2012)

Fracción fetal correlacionada con masa placentaria

NITE (Evaluación no invasiva de trisomías)

Completado y bajo revisión

Estudio ciego europeo en varios centros de salud

NEXT (Examen no invasivo de trisomías)

Realizando inscripciones

Estudio ciego en varios centros de salud sobre mujeres de riesgo medio, que compara el Harmony con el cribado combinado en 1er trimestre

1.000 mujeres

TABLA 5 2 T21 Resultado + 2

Resumen de estudio NICE

998 no-T21

Resultado 0

Resultado + 1

Resultado 997

Solo 2/3 de los resultados positivos son correctos

*50 clínicas participantes en EE. UU. y Europa. *El mayor estudio de cohortes hasta la fecha - se evaluó a todas las pacientes elegibles. *La población de estudio fueron las mujeres que estaban siendo sometidas a estudios invasivos por cualquier indicio, y por lo tanto incluyó a mujeres de bajo riesgo.

Cortesía del Dr. Thomas Musci, Ariosa Diagnostics

Implicancias clínicas Hasta hoy, solo cinco laboratorios en todo el mundo tienen la capacidad de realizar y comercializar la técnica de secuenciación para el ADN fetal libre en

Trisomía 21

Trisomía 18

Sensibilidad Especificidad Tasa de falsos positivos 0,03% 100% 99,97% (81/81) (2887/2888) (1/2888) 97% (37/38)

0,07% 99,93% (2886/2888) (2/2888)

Modificado de (35)

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marca registrada de los estudios que ofrecen): Verinata (Verifi), Natera (Panorama), Ariosa (Harmony), y Sequenom (MaternitiT21); y uno en China: BGI. Los resultados de los distintos estudios ofrecidos son muy similares tanto en sensibilidad como en especificidad para diagnosticar aneuploidías T21, T18, T31 y de cromosomas sexuales (Tablas 1, 2 y 3). Está claro que se trata de un negocio multimillonario, dado que en el futuro próximo veremos con total seguridad un veloz incremento en la cantidad de mujeres que solicitan este estudio no invasivo. Hasta la fecha, la única forma de realizar estos estudios en la sangre materna implica el envío por correo aéreo de las muestras a uno de estos pocos laboratorios de EE. UU. que tienen las patentes necesarias. En caso de desear diagnóstico definitivo, es preciso realizar un procedimiento invasivo para confirmar el resultado del estudio prenatal no invasivo (DPNI), cuyo resultado siempre debe ser interpretado en el contexto de todos los hallazgos clínicos disponibles. Se recomienda que el profesional de la salud determine el uso de la prueba, incluyendo la necesidad de asesoramiento genético.El DPNI no tiene valor diagnóstico, dado que puede arrojar resultados falsos positivos (Figura 2). Existe una abundancia de publicaciones recientes sobre este tema, y varios estudios en curso que refuerzan el valor de esta técnica (Tabla 4). El más ambicioso de esto proyectos es el estudio NICE (35) (Tabla 5), del que participaron 50 clínicas de los EE. UU. y Europa. Este estudio demostró una sensibilidad de 100% y una especificidad del 99,97% para el síndrome de Down, con una tasa de falsos positivos de tan solo 0,03%. Habiendo llegado a este punto, es necesario tomar en cuenta la opinión del Comité del ACOG (Congreso Estadounidense de Obstetras y Ginecólogos) (36): “El ADN fetal libre parece ser el estudio más efectivo para detectar aneuploidías en mujeres de alto riesgo... es una opción que puede usarse como estudio de detección primario en mujeres que presentan un mayor riesgo de aneuploidías”. “ El DPNI debe ser una opción para un paciente informado luego de un asesoramiento previo al estudio, aunque no debería ofrecerse a mujeres de bajo riesgo o con gestaciones múltiples”. “Un paciente cuyo estudio arroje un resultado positivo debe recibir asesoramiento genético y se le debe ofrecer un diagnóstico prenatal invasivo para confirmar dicho resultado.” Esta opinión sobre el DPNI se puede resumir en 6 puntos: * El DPNI debe ser una opción del paciente, a quien

se debe informar al respecto. * No debe formar parte de una evaluación prenatal de laboratorio rutinaria. * No se debe ofrecer el DPNI a mujeres de bajo riesgo o con gestaciones múltiples. * Un estudio negativo no asegura que el embarazo no se vea afectado. * Un paciente cuyo estudio arroje un resultado positivo debe recibir asesoramiento genético. * Se debe ofrecer un diagnóstico prenatal invasivo para confirmar un resultado positivo del DPNI. Distintas situaciones que devienen en falsos positivos se pueden relacionar con ADN fetal libre anormal circulando en la sangre materna que proviene de una fuente diferente al feto. Un ejemplo de esto es el caso de una mujer con cáncer, tal como ha descrito recientemente Osborne en el Encuentro anual (2013) de Genética Clínica del Colegio Estadounidense de Genética Médica (37). En este informe se describe un falso diagnóstico del DPNI tanto de la trisomía 13 como de la 18, con un resultado normal del ultrasonido. “Se realizó amniocentesis y FISH de interfase para las aneuploidías comunes, cariotipo fetal y análisis por microarray de CGH para PNU (polimorfismos de nucleótido único). Todos estos estudios arrojaron resultados normales. Luego de un parto vaginal a término de un varón clínicamente normal y no disfmórfico, se evaluó a la paciente por dolores de cadera persistentes. Posteriormente se le diagnosticó carcinoma metastásico de células pequeñas con origen en vagina o cuello uterino”. En el mismo encuentro, la Rachel Allen de Lascale Maternal Fetal Medicine en la Universidad de New York State, describió dos casos de falsos negativos. Ambos presentaban ecografías anormales y cariotipo fetal de trisomía 21. En conclusión, estas son las razones por las cuales aún se debe tener mucha cautela al aconsejar a nuestras parejas que esperan un hijo acerca de diagnóstico prenatal. El DPNI no debe considerarse una herramienta de diagnóstico. Este procedimiento debería llamarse Prueba de Screening Prenatal No Invasivo (SPNI) y se debería usar en combinación con el arsenal de diagnóstico actualmente disponible, dando prioridad a las técnicas no invasivas siempre que sea posible. El asesoramiento se debe brindar de una forma que se adapte lo mejor posible a cada paciente o pareja en particular, con un enfoque clínico estrictamente personalizado. La autonomía del paciente siempre debe primar en los actos médicos, bajo una ética basada en la virtud. Rev. Latin. Perinat. 18 (1) 2015

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CONCLUSIONES Los obstetras de hoy enfrentan una nueva era de diagnósticos y asesoramiento prenatal. Las técnicas evolucionan velozmente y es indispensable que los médicos estén actualizados en su trabajo diario por medio de la educación médica continua. El test DPNI se presenta como un método prometedor con beneficios comprobados en comparación con otras herramientas de detección. Se debe utilizar con un profundo conocimiento de las limitaciones de la técnica y sin despreciar otras herramientas de detección y diagnóstico de mayor antigüedad y comprobada eficacia. Se debe buscar un enfoque personalizado con cada paciente, y en cada caso se debe obtener el consentimiento informado. Antes de decidir realizar el estudio, deben llevarse a cabo entrevistas personales y es obligatorio que un especialista en genética o perinatología entregue los resultados en persona, para poder contestar todas las posibles interrogantes respecto del significado de este estudio. BIBLIOGRAFÍA 1. Global Report on birth defects, March of Dimes Birth Defects Foundation, White Plains, New York, 2006 2. Christianson AL, Howson CP, and Modell B. The March of Dimes Global Report on Birth Defects: The Hidden Toll of Dying and Disabled Children. New York: March of Dimes Birth Defects Foundation. 2006. 3. Wellesley, D, Dolk H, Boyd PA, Greenlees R, Haeusler M, Nelen V, Garne E, Khoshnood B, Doray B, Rissmann A, Mullaney C, Calzolari E, Bakker M, Salvador J, Addor MC, Draper E, Rankin J, Tucker D. Rare chromosome abnormalities, prevalence and prenatal diagnosis rates from population-based congenital anomaly registers in Europe. Eur J of Hum Gen, 11 January 2012. 4. Hahnemann JM, Vejerslev LO. Accuracy of cytogenetic findings on chorionic villus sampling (CVS)--diagnostic consequences of CVS mosaicism and non-mosaic discrepancy in centers contributing to EUCROMIC 1986-1992. Prenat Diagn. 1997 Sep;17(9):801-20. 5. Mid-trimester amniocentesis for prenatal diagnosis. Safety and accuracy. JAMA. 1976 Sep 27; 236(13): 1471-6. 6. Wirtz A, Gloning K, Murken J. Trisomy 18 in chorionic villus sampling: Problems and consequences. Prenatal Diagnosis. Special Issue: The 5th International Congress of Early Fetal Diagnosis, July 1990.

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Rev. Latin. Perinat. 18 (1) 2015