EVALUACION DE LA ACTIVIDAD in vitro DE ANTIFUNGICOS CONTRA DERMATOFITOS AISLADOS EN ANIMALES DE COMPAÑÍA Espinosa T. Alejandra Paula (1), Castillo S. Carlos Gerardo (1), *Aguilar R. Alejandra (2).

Resumen En este estudio, se evaluó la actividad in vitro de antifúngicos contra dermatofitos aislados en animales de compañía. Se utilizaron cepas de Microsporum canis, M. gypseum, Trichophyton mentagrophytes y T. tonsuransa las cuales se les realizó pruebas de susceptibilidad a antifúngicos que incluyeron: Anfotericina B, Ketoconazol, Fluconazol, Itraconazol, Clotrimazol y Terbinafina, mediante el método de difusión en disco. El tamaño del halo de inhibición producido permitió la clasificación de las cepas en sensibles, intermedias y resistentes. Los resultados mostraron que los antifúngicos con mayor número de cepas resistentes fueron el fluconazol (10/12) y el itraconazol (7/12) y con el mayor número de cepas sensibles fueron la terbinafina (10/12) y el ketoconazol (9/12). Introducción Los dermatofitos son hongos filamentosos que provocan una micosis superficialllamada dermatofitosis o tiña(1). Los hongos pertenecientes a los géneros Microsporum, Trichophyton o Epidermophyton causan la dermatofitosis. Los dermatofitos son hongos ubicuos, cosmopolitas, queratinófilos y queratinolíticos, que pueden invadir e infectar el pelo, la piel, las pezuñas, los cuernos, las uñas y las plumas de sus hospedadores (2,3).El mecanismo de infección es por contacto directo con el agente infeccioso, aunque se requieren ciertas condiciones que favorezcan su desarrollo, como el contacto estrecho durante varias horas, humedad, calor y la maceración local(4). La dermatofitosis felina puede presentarse no sólo con distintas lesiones, sino también con distintos patrones de reacción, que son comunes a otros trastornos que se observan es esta especie. La alopecia puede ser circunscrita, difusa, con zonas de descamación, hiperpigmentación, eritema y formación de comedones, que se observan en cabeza o en extremidades. El pelo en los bordes de las lesiones puede estar roto (4,5).En los perros los signos clínicos, aunque son variables, se asocian principalmente a la pérdida de pelo, usualmente la tiña canina. Las lesiones pueden distribuirse de forma localizada o difusa. Pueden observarse zonas circulares de alopecia, descamación, hiperpigmentación, costras y/o pápulas foliculares en la cabeza y las extremidades. Generalmente, las lesiones están bien delimitadas. En los perros se observa el querión, un nódulo inflamatorio, como resultado de la infección fúngica y bacteriana concurrente (5). (1)

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El diagnóstico clínico de las micosis superficiales debe ser confirmado por técnicas como la lámpara de Wood que es considerada prueba tamiz, que permite detectar el 50% de los casos de infecciones por M. canis, el examen microscópico directo permite observar hifas y esporas en pelos o en escamas de queratina y, por último, el cultivo de la muestra permite el aislamiento para la posterior identificación del dermatofito (6) Los fármacos sistémicos (ketoconazol, fluconazol, terbinafina) se recomiendan en todos los casos de dermatofitosis en los animales de compañía. Una de las dificultades del tratamiento de la dermatofitosis es definir al punto final del mismo. Esto se debe a que las lesiones clínicas se resuelven antes de que el hongo se haya eliminado de la piel, y es importante no suspender el tratamiento hasta conseguir la curación micológica, que se define como dos cultivos fúngicos negativos realizados con un intervalo de un mes (7). Los estudios de susceptibilidad a quimioterapéuticos se realizan para detectar las resistencias de los microorganismos a los antimicrobianos. Estos estudios ayudan a elegir la mejor alternativa de tratamiento reduciendo la aparición de cepas resistentes y por consecuencia la aplicación de un tratamiento ineficaz. El desarrollo de pruebas de susceptibilidad a quimioterapéuticos que puedan determinar la resistencia in vivo es una de las necesidades más apremiantes en micología médica (8).

Materiales y métodos Cepas utilizadas Se utilizaron 12 cepas de dermatofitos distribuidas de la siguiente manera: 6 de Microsporum canis (5 pertenecientes a Caninos y 1 a Felino), 3 de Trichophyton tonsurans(2 de ellas de Caninos y 1 Felino), 2 de Trichophyton mentagrophytes (1 de Canino y 1 de Felino) y por último de 1 de Microsporum gypseum (1 perteneciente a Leporido). Prueba de susceptibilidad in vitro por el método de difusión en disco La prueba de susceptibilidad que se empleó en este trabajo fue una adaptación de la técnica M-38A de microdilución aprobada y detallada por el ClinicalLaboratoryStandardsInstitute(CLSI) para dermatofitos, con el método de Kirby-Buaer. Para observar el efecto de los antifúngicos in vitro contra los dermatofitos obtenidos se resembraron las cepas obtenidas en tubos de agar inclinado de papa dextrosa (medio que estimula la esporulación), incubados a 28°C por 7 a 15 días en la estufa de cultivo para permitir el crecimiento. Para obtener el inoculo se colocó 1 ml de Solución Salina Fisiológica estéril (SSF) a cada tubo, empleando el vortex para lograr la suspensión de los conidios, con ayuda de una cámara de Neubauer se realizó el conteo correcto y ajuste para obtener 1.0 x 106conidios/ml; cuando la suspensión se encontró saturada o muy concentrada, se realizó una dilución para facilitar el conteo de las células y la cual se tomó en cuenta al momento de continuar el ajuste. Teniendo la suspensión en SSF de las cepas y empleando un hisopo estéril se realizó el sembrado de cada cepa en duplicado, en placas de agar Mueller-Hinton adicionada con glucosa al 2% + azul de metileno 0.5 μg/ml, se permitió el secado de la superficie de la placa de agar y después de 15 min se colocó

cada disco impregnado con el antifúngico elegido, y se incubo de forma invertida a 28°C de 3 a 7 días. Los antifúngicos empleados fueron los siguientes: Anfotericina B 100 mcg, Ketoconazol 50 mcg, Fluconazol 25 mcg, Itraconazol 10 mcg, Clotrimazol 10 mcg, Terbinafina 1 mcg. Las placas inoculadas se revisaron periódicamente, observando el crecimiento de la cepa de forma confluente y la formación del halo de inhibición. Para lectura del diámetro de zona de inhibición de cada disco (IZD) se empleó un calibrador digital y la unidad de medida utilizada fue milímetros (mm); el tamaño del halo de inhibición se forma por la circunferencia del crecimiento de la cepa ante el disco impregnado de antifúngico, si se obtiene la distancia entre el crecimiento de la cepa y el disco impregnado de antifúngico se multiplica por 2 y se suman 6 mm; se debe considerar la uniformidad de la circunferencia para poder realizar la lectura (Figura 1). Resultados y discusión Los resultados fueron analizados y se clasificaron de acuerdo al tamaño del halo de inhibición producido por la especie de dermatofito contra cada antifúngico. La clasificación de las cepas, en resistentes (R), intermedias (I) y sensibles (S), se generó por la recopilación de los resultados que obtuvieron Nweze, Ansari, Esteban, Pakshir, Conceição, Karaca, Castroy Carrillo (9-16), al emplear método de Kirby-Bauer utilizando estos antifúngicos contra especies de dermatofitos (Ver figura 2). Los tamaños de los halos de inhibición se compararon con los criterios de la figura 1 obteniéndose: Para Microsporum canis (6 cepas) el 58.33% de las cepas fue sensible (S), el 19.44% intermedias (I) y 22.22% resistentes (R); la sensibilidad mostrada de mayor a menor por el número de cepas y el tamaño del halo de inhibición fue de: Terbinafina (6-S) >Clotrimazol (6-S) > Ketoconazol (6-S) >Anfotericina B (2S, 3-I, 1-R) >Itraconazol (1-S, 4-I, 1-R) > Fluconazol (6-R). En el caso de M. gypseum (1 cepa) el 16.66% fue sensible, 16.66% intermedia y 66.66% resistente; la sensibilidad mostrada de mayor a menor por el número de cepas y el tamaño del halo de inhibición fue de: Terbinafina (1-S) > Ketoconazol (1-I) >Anfotericina B (1-R) >Clotrimazol (1-R) >Itraconazol (1-R) > Fluconazol (1-R). Para Trichophyton mentagrophytes (2 cepas) el 25% fue sensible, 25% intermedia y 50% resistente a los antifúngicos; la sensibilidad mostrada de mayor a menor por el número de cepas y el tamaño del halo de inhibición fue de: Terbinafina (2-S) >Clotrimazol (1-S, 1-I) > Ketoconazol (1-S, 1-I) >Itraconazol (2-R) >Anfotericina B (2-R) > Fluconazol (2-R). Para T. tonsurans(3 cepas) el 27.77% fue sensible, 38.88% intermedia y 33.33% resistente; la sensibilidad mostrada de mayor a menor por el número de cepas y el tamaño del halo de inhibición fue de: Terbinafina (1-S, 2-I) >Clotrimazol (1-I, 1R) > Ketoconazol (2-S, 1-I) >Itraconazol (1-S, 2-R) >Anfotericina B (1-S, 2-I) > Fluconazol (1-S, 2-R). Los resultados mostraron que a pesar de que el ketoconazol es un antifúngico ampliamente utilizado(4,7), presento un porcentaje importante de cepas sensibles (75%, 9/12), lo cual podría indicar que en los tratamientos donde se incluye este medicamento se pudieran estar cumpliendo los criterios sobre la dosis y la duración de dichos tratamientos, lo cual a su vez reduciría el impacto de la presión selectiva. Del lado opuesto, el fluconazol fue el antifúngico con

mayor número de cepas resistentes (83.3%, 10/12), lo cual concuerda con los resultados obtenidos por Nweze(9); por otro lado los resultados obtenidos por Itoi(17) mostraron que todas las cepas de dermatofitos tuvieron una gran resistencia a lo azoles probados, incluyendo ketoconazol y terbinafina, en contraste con lo obtenido en este trabajo. Conclusiones La prueba de susceptibilidad in vitro con dermatofitos aislados de animales de compañía mostro que la terbinafina fue el antifúngico con mayor número de cepas sensibles y el fluconazol fue el que presento mayor número de cepas resistentes. Se deben realizar más estudios sobre pruebas de sensibilidad con el método de Kirby-Bauer para obtener puntos de corte estandarizados para cada especie de dermatofitos.

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Figura 1. Halos de inhibición formados por T. tonsurans a los antifúngicos (comenzando de abajo, hacia la derecha: Terbinafina, ketoconazol, fluconazol e itraconazol) (cepa O3-01/10).

Figura 2. Criterio de susceptibilidad y resistencia de discos antifúngicos.