Evolución de las herramientas del Laboratorio en el diagnostico de enfermedades infecciosas Patricia Bravo Asesoria Microbiología

Enfermedades infecciosas y Microbiología

El hombre ha evolucionado también los microbios, de ahí la necesidad de Innovar y avanzar

Enfermedades infecciosas causa muerte 24%

Cuatro Etapas de la Microbiología









Primer periodo, especulativo, antigüedad a los primeros microscopistas. Segundo periodo, lenta acumulación de observaciones (desde 1675 aprox. hasta mitad del siglo XIX), inicia con descubrimiento de Leeuwenhoek. Tercer periodo, de cultivo de microorganismos, llega hasta finales del siglo XIX, Pasteur y Koch posicionan Microbiología como ciencia experimental. Cuarto periodo (inicios siglo XX hasta nuestros días), estudio de microorganismos por fisiología, bioquímica, genética, epidemiología; Surgimiento de microbiología especializada (Virología, Inmunología, etc), inclusión de microbiología como Ciencia Biológica.

Microbiología Clínica ¿Que nos espera? Necesidad:










Rapidez en Diagnóstico Mayor estandarización Capacidad respuesta a nuevos desafíos: agentes de bioterrorismo y patógenos emergentes. Costo razonable Presentación unitaria Pruebas en la misma consulta médica o “pie de cama”, fuera del laboratorio. Sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo.

¿Que se espera de Resultados de

microbiología?:Obtener un organismo "culpable", la visualización. ◦ Confirmación de diagnostico clínico:  Identificación del agente  Detección Serológica ◦ Identificación de cepa/aislamiento/subtipo ◦ Caracterización de sensibilidad a antimicrobianos. ◦ Identificación de sero-conversiones o portadores en la población. ◦ Colección de datos epidemiológicos

PACIENTE SOSPECHOSO DE ENFERMEDAD INFECCIOSA RUTA MICROBIOLOGICA

RUTA INMUNOLOGICA

Sangre, Heces Orina Biopsia de Tejido Escobillón secreción MICROBIOLOGIA CONVENCIONAL

Cultivo enriquecido, Selectivo, Medios diferenciales

Muestra de Sangre (Búsqueda de Ac contra patógeno sospechoso

MICROBIOLOGIA MOLECULAR

Búsqueda e identificación del Genoma del patógeno Por Hibridación Acido Nucleico PCR Susceptibilidad antibiótica

Aislamiento en cultivo Puro

Identificación, con ensayos Cultivo Dependientes, Identificación Inmunológica, Identificación Molecular

Susceptibilidad Antibiótica (Decisión en eficacia de Terapia)

Inmunológica (Búsqueda de patógenos microbianos o partículas virales) Anticuerpos Fluorescentes

Ensayos de Anticuerpos (Aglutinación, RIA, ELISA)

Métodos disponibles en microbiología: tradicionales y modernos ◦ Microscopia: Tinciones. – Cultivo ◦ Métodos Bioquímicos: Identificación Fenotípica y Susceptibilidad Antimicrobiana ◦ Métodos inmunológicos ◦ Métodos Moleculares en bacterias, virus, hongos.

Microscopia: Tinciones. - Cultivo Características microscópicas: ◦ Estudio microscópico en fresco ◦ Tinciones: forma, agrupación, estructura y tamaño.



Tinciones primarias: Gram y Ziehl Neelsen. Microscopia óptica, electrónica, de barrido, fluorescente, campo oscuro.

Microscopia: Tinciones. - “Cultivo”: ◦ Características fenotípicas: tamizaje primario: Gram, morfología en cultivo, catalasa, oxidasa, atmosfera de crecimiento, movilidad, medios de cultivo básicos, selectivos y diferenciales. ◦ Pruebas secundarias: Determinar género del microorganismo. Cultivos medios especiales, oxido-fermentación, producción de esporas, fermentación de glucosa y pruebas primarias.

Métodos Bioquímicos: Identificación Fenotípica y Susceptibilidad Antimicrobiana

Métodos Bioquímicos: Identificación Fenotípica y Susceptibilidad Antimicrobiana





ID y sensibilidad automatizada: bioquímicas, ABO por MIC. Mecanismos de resistencia. Aplicación de marcadores epidemiológicos. Datos analizados en un ordenador, que proporciona, la identificación del microorganismo y antibiograma.

Automatización Hemocultivos Bactec 9000 BD

BacTAlert 3D BioMerieux

Versa Trek Trek Diagnostic System

Sistema

Tecnología

Sistema detecta producción de CO2 por fluorescencia

Medición de produccion de CO2 por colorimetria

Sistema con detección de gases orgánicos (02, CO2, N2,H2), por cambios de presión.

Conección a LIS

Si por EpiCenter

Si con Copernico

Si, no opcion manejo de curvas.

Control de calidad

Automatico

Semi-Automatico

ND *

Neutralización de antibioticos

Resinas polimericas de intercambio iónico y cationico.

Carbón activado y tierra de Neón

Solo inhibe aminoglicosidos

Interferencia Coloración de Gram

Las particulas de resinas no interfieren en la coloración.

Interferencia en las botellas FAN

No inteferencia.

Métodos inmunológicos - Aparición precoz de IgM persiste poco tiempo. Indica infección en fase aguda. (No siempre es detectable).
- Aparición más tardía de IgG, persiste a altas concentraciones periodos prolongados y en ocasiones de por vida. Ayuda detección de seroconversión .
Permiten diagnósticos indirectos y estudios epidemiológicos.


Métodos inmunológicos - diagnostico indirecto:







-Cultivos negativos: Tratamiento ABO o agente no es cultivable. -Toma de muestra tardía el patógeno ya no se recupera. -En fases sub-agudas microorganismos son difíciles de recuperar. -Interpretación de un aislamiento en portadores sanos difícil. - Casos atípicos o asintomáticos. -En los casos de aislamientos mixtos

Ventajas de los métodos tradicionales ◦ Pueden captar todo lo que crece, mejor detección de infecciones mixtas ◦ Sensibilidad de los métodos establecida ◦ Organismos viables pueden ser recuperados

Desventajas de métodos tradicionales Labor intensiva
Costoso
Toma tiempo: lento
Una actividad ‘habilidad’ dependiente de operador
Resultados pueden no tener una identificación definitiva.


Métodos Moleculares en bacterias, parásitos; virus, hongos.

Métodos Moleculares en bacterias, parásitos, virus, hongos. Aplicación: • Cepas escasa descripción, Nuevos patógenos • Cepas baja frecuencia de aislamiento • Cepas con fenotipos atípicos • Cepas difícil identificación fenotípica • Cepas de crecimiento lento o fastidioso • Bacterias de difícil cultivo • Antibioticoterapia • Bacterias de impacto comunidad Tomado de Rodicio M, Mendoza MC. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2004

Biología Molecular: Evolución de métodos analíticos 1993

2000

2008

GeneXpert

TIEMPOS DE METODOS DIAGNOSTICOS Tiempo de diagnostico 1 – 7 dias

Sensibilidad Alta*

Alta**

- Hibridizacion

3 – 4 hrs

Alta1

Buena

- PCR

3 – 4 hrs

Alta2

Buena

30 min

Baja3

Alta

3 – 5 hrs

Buena4

Alta

- ELISA

3 – 4 hrs

Alta

Baja

Immunofluorescencia - Immunoblot

2 – 4 hrs

Bueno

Buena

2 – 4 hrs

Bueno

Buena

- Neutralizacion

4 – 7 dias

Bueno

Alta

- HIA

2 – 4 hrs

Baja

Buena

Deteccion Virus - Aislamiento virus

MicroscopiaElectronica - ELISA de captura

Especificidad

Serologia

1

ca. 104 part/ml,

2

ca. 200 genoma equival/ml, 3 4 ≥ 106 particula/ml, ca. 0.01 µg antigeno/ml

* Dependiendo del sistema de cultivo

** Dependiendo del sistema de deteccion

Prof. Matthias Niedrig, RKI

Diagnostico Molecular – Pruebas basadas en ácidos nucleicos







Amplificación (e.j. PCR): obtiene gran numero de copias de un gen. No requiere organismos viables Puede ser muy sensible – pero sujeto a contaminación Por su rapidez requiere una secuencia blanco del gen conocida Por lo tanto se pueden perder los desconocidos Pruebas Moleculares están restringidas a detección (cualitativa), cuantificación (carga viral) y genotipificacion.

Diagnostico Molecular: Técnicas 1. Enzimas de restricción
2. Técnicas de separación electroforética de ácidos nucleicos
3. Hibridación de ácidos nucleicos
4. Amplificación enzimática del ADN (PCR)
5. Microarreglos
6. Espectrometría de masa


Enzimas de restricción: ER El actual aislamiento de ADN es sencillo involucra la ruptura de las células y la posterior purificación del componente de ADN. ◦ ER son Proteínas que reconocen secuencias especificas del ADN, con actividad de endonucleasas (hacen cortes secuenciales específicos de nucleótidos en ambas hebras del DNA). ◦ Sitio de Restricción es la secuencia de nucleótidos en una pieza de DNA que una enzima de restricción corta.

Técnicas de separación electroforética de ácidos nucleicos


Electroforesis en Gel ◦ Técnica mas utilizada para estudio de macrocromoleculas: proteínas y ácidos nucleicos ◦ Moléculas cargadas pasan a través del gel de agarosa o polímeros de poliacrilamida para ser separadas:  Las moléculas mas grandes o mas difusas se mueven mas lento, tienden a quedarse colgadas en la matriz del gel.  Moléculas con grandes cargas se mueven mas rápido debido al voltaje eléctrico que es empleado para empujar a las moléculas a través del gel.

Hibridación de ácidos nucleicos La doble cadena en ADN es separada mediante un proceso físico (calor) o químico (como soda cáustica).
Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza.
Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra de cadenas simples.
La muestra combinada se enfría lentamente, las moléculas sencillas se van emparejando por las zonas complementarias se va formando una nueva molécula hibridada


Hibridación de ácidos nucleicos Los métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físico-químico, bien sea con Radioactividad o con Fluorocromos. Esta cadena tiene una Secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como SONDA para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida.
Dos tipos de hibridaciones de ácidos nucleicos que se usan en los laboratorios de biología molecular:


◦ Método tipo Southern o Southern blot: ADN ◦ Método tipo Northern o Northern blot: ARN

Hibridación de ácidos nucleicos: PCR





La PCR, o Reacción en Cadena de la Polimerasa, se basa en secuenciación de una fracción especifica de DNA, utiliza hibridación de oligonucleotidos para completar el proceso. Amplificación : Entre la desnaturalización de hebras de ADN y antes de extensión del cebador hay una unión de los cebadores a la hebra de secuencia complementaria mediante una hibridación de ADN. Esto marca la especificidad de la reacción.

16S

Utilidad de PCR- RT Virologia Una infección viral Severa puede ser detectada en fase aguda en muestras de sangre o del sitio de infección.
Algunos virus humanos incluyen: HPV, Citomegalovirus, Herpes Simple virus, Rotavirus,Virus Influenzae A, B, H1N1, Enterovirus
Sub-tipificación o Cuantificación Viral – HSV, HPV, HCV


Utilidad de PCR- RT: Bacteriología









Resultados de Microscopia dan falsos positivos: - T.vaginalis, N.gonorrhoeae Patógenos Intracelulares – virus, Mycop.genitalium Baja Sensibilidad – Chlamydia sp.,Neisseria sp. Seropositividad es común – Chlamydia sp. Crecimiento del Microbio es lenta – M. tuberculosis Cuantificación de expresión genes Medir Eficacia de la antibioticoterapia Genotipificacion

Métodos de tipificación Genotípica
Metodos

basados en Fingerprint Perfil Plasmido, RFLP(restriction fragment length polymorphism), PFGE, AFLP
Metodos basados Character MLVA (Multiple Loci VNTR Analysis), ribotyping (fragmentos de restriccion que contienen todos o parte de los genes codificando para el rRNA 16S y 23S), microarreglos
Metodos basados en Secuenciacion ◦ MLST ◦ SNP=single nucleotide polymorphism typing

Minimum spanning tree of 240 strains Salmonella Enteritidis by MLVA

Tipos MRSA con PFGE & MLST PFGE

McDougal LK et al, 2003, J Clin Microbiol 41:5113-20

Microarreglos - Microarrays





Los chips o arrays de ADN son sondas moleculares fijadas y ordenadas sobre un soporte sólido nitrocelulosa, nylon o portaobjetos con residuos de polilisinas en disposición regular y prefijada. Las sondas, pueden ser clones de ADN, ARN, productos de PCR u oligonucleotidos sintéticos y previo a la hibridación se marca con una sustancia fluorescente o radiactiva.





La principal ventaja: en una única prueba pueden detectarse miles de genes. Aplicación de arrays en microbiología clínica es escasa: a) patogenia bacteriana; b) análisis de evolución bacteriana y epidemiología molecular; c) mecanismos de acción y de resistencia antibiótica. d) diagnóstico microbiológico de las enfermedades infecciosas.

DESARROLLO MICROARRAYS

Espectrometría de masa Identificación bacteriana mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF) Se emplea un espectrómetro de masas, para generar un perfil proteico (“huella química”) que es una representación gráfica, por orden creciente de masa frente a la abundancia relativa de las proteínas del microorganismo. Característico de cada microorganismo. a.i.

1400

1200

1000

800

600

400

200

4000

6000

8000

10000

12000

14000

m/z

Espectrometría de masa

Veamos un Ejemplo: Tuberculosis - TBC PROCEDIMIENTO

TECNICAS

EXAMEN DIRECTO

Coloración de Kinyoun Coloración de ZiehlNeelsen

TIEMPO DEL REPORTE DESDE EL DIA EN QUE SE PROCESA LA MUESTRA 2- 24 HORAS

DETECCION DE CRECIMIENTO

Lowestein-Jensen Ogawa- Kudoh

20-25 DÌAS

IDENTIFICACIÓN DE LA ESPECIE

Pbas bioquímicas tradicionales (Niacina, Catalasa, Red. Nitratos)

50-55 DIAS

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD

Método proporciones múltiples

60 DIAS

Tuberculosis - TBC Microscopía Ziehl Neelsen: Baja Sensibilidad 70 a 80%, OMS recomienda 2 o 3 frotis de muestras del caso sospechado Requiere un técnico capacitado Laborioso: 1-2 horas

Overall Sensitivity of AFB smear: 22-80%

Tuberculosis - TBC Coloraciones fluoro cromáticas: Auramina O – Rodamina 2.15 hr.

Inmunológicas: ADA, Prueba de Interferón Gamma Quantiferon TB: ensayo de liberación de cito quinas. Overall Sensitivity of AFB smear: 22-80%

Tuberculosis - TBC: Cultivo


Cultivo Medio cultivo convencional: ◦ Altamente sensible ◦ Lento: 4 a 6 semanas

Tuberculosis - TBC: Cultivo 15-18 dias MGIT 960

Positive Average TTD: 7days

Tuberculosis - TBC: Identificación fenotipica: 50 a 55 dias

Tuberculosis – TBC: Susceptibilidad 30 dias Medio Solido

MGIT 960

1. Conc. Absoluta 2. Metodos Proporciones 3. Radio Resistencia

Average TAT: 8 wks

2-3 weeks

Método MODS : (Méétodo Susceptibilidad Directa por (M Observacióón Microscó Observaci Microscópica)

J. Clinic. Microbiol. p. 1093–1097 Vol. 45, Nº4 Evaluation of Microscopic Observation Drug Susceptibility Assay for detection of Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis. Girum Shiferaw, Yimtubezinash Woldeamanue Mekdes Gebeyehu, Feven Girmachew, Daniel Demessie, and Eshetu Lemma

Tuberculosis – TBC: Molecular 2 hrs a 2 dias Métodos de Amplificación de Ácidos Nucleicos: - Gen-Probe AccuProbe® - GeneXpert - PCR - HPLC (hrs) - HAIN Altamente específicos. En muestras Clínicas desempeño variable: Altamente sensible en muestras positivas por frotis (95-100%) Hasta ahora, no tan sensible en muestras negativas por frotis (60-75%) Muy sensible en cultivo : Para identificación Para susceptibilidad a medicamentos

Identificación correcta por HPLC de M. tuberculosis según diferentes autores REFERENCIA

NO CEPAS EVALUADA S

No. confir. HPCL

CONCOR. ( %)

1 Glickman(1994)

649

648

99

2 Guthertz (1993)

122

122

100

3 Butler (1991) CIB

319

319

100

82

80

98

Tuberculosis – TBC: PCR GeneXpert Población HIV positiva n Sensibilidad

Especificidad

(IC 95%)

n

%

(IC 95%)

893/913 97,9

(96,9-98,8)

19/19

100

(98,5-100,0)

BK-C+ 293/391 74,9

(70,6-79,2)

34/71

47,9

(36,3-59,5)

852/861 99,0

(98,3-99,7)

423/429 98,6

(97,5-99,7)

BK+

%

1 Helb D et al J Clin Microbiol. 2010 ; 48:229-37

Paises Vietnan Uganda

2 Boehme CC et al N Engl J Med. 2010 9; 363:1005-15

Peu Azerbajan Sudafrica India

4 Marlowe EM et al . J Clin Microbiol. 2011 .Feb 2. [Epub ahead of print]

EEUU

5 Moure R et al. J Clin Microbiol 2011, 49:1137-9

España

6 Malbruny B et al. Int J Tuberc Lung Dis 2011, 15: 553-5

Francia

7 Bowles EC et al Int J Tuberc Lung Dis 2011, 15: 988-9

Holanda

8 Friedrich SO et al J Clin Microbiol 2011, 49:2827-31

Sudafrica

9 Ionnidis P et al J Clin Microbiol 2011, 49: 3068-70

Grecia

10 Scott LE et al PLoS Med, 2011, 8: e1001061

Sudafrica

11 Lawn SDE et al PLoS Med, 2011, 8: e1001067

Sudafrica

Tuberculosis – TBC

IMPACTO DE INNOVACION EN MICROBIOLOGIA Oportunidad de respuesta: Resultados en tiempo real (Horas – 7d). Mejora Calidad del servicio de laboratorio. Agilizar el flujo de trabajo Estandariza, promueve precisión. Mejora vigilancia epidemiológica: oportunidad Reducción de infecciones intrahospitalarias y brotes epidémicos. Ayuda a controlar Resistencia bacteriana. Disminuye DDD antibiótica. Reducción tiempo hospitalización paciente Mejor pronostico de las enfermedades infecciosas