EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS GLICÓSIDOS DE LA Stevia rebaudiana Lirged Delgado*, María Angélica Torres**, Carlos Andrés Pérez G.***, Álvaro Calero**** Evaluadores:

Raúl Alberto Cuervo Mulet***** Tiberio Augusto Mesa Gaviria******

Tipo de Artículo: Investigación Científica y Tecnológica

RESUMEN El presente trabajo, se efectúo con el fin de realizar una nueva metodología de extracción de la Stevia rebaudiana y posteriormente la

caracterización de sus

glicósidos. Se investigaron diversos métodos de extracción: basados en solventes, intercambio de iones, cromatografía de absorción, fluidos presurizados. Analizando cada procedimiento, se propone una metodología, ajustándola a un nuevo método de extracción y con reactivos de fácil adquisición, teniendo como base, las extracciones de glicósidos investigadas.

Después de realizar ensayos de extracciones (Soxhlet,

Reflujo) con solventes, a diferentes concentraciones, variación de temperaturas y presiones, se opto por aquellas condiciones que permitieron obtener la mejor pureza de la mezcla. El proceso, consiste en: secado, extracción, precipitación, clarificación y purificación. La extracción por soxhlet, permitió que durante el procedimiento de Estudiante del programa de Química, Universidad Santiago de Cali, [email protected] Estudiante del programa de Química, Universidad Santiago de Cali, [email protected] *** Director Centro de Investigaciones en Ciencias Básicas, Ambientales y Desarrollo Tecnológico (CICBA) y del Grupo de Investigación en Biotecnología y Medio Ambiente (GIBMA), es Biólogo con énfasis en Genética, especialista en Simulación Molecular, maestría en Bioinformática, estudios avanzados y doctorales en Biotecnología. Profesor de dedicación exclusiva de la Universidad Santiago de Cali. [email protected] **** Profesor programa de Química, Codirector del Grupo de Investigación en Biotecnología y Medio Ambiente (GIBMA), Es Químico, maestría en Biotecnología, exdirector de Investigaciones de la USC, coordinador del área de bio-remediación, [email protected] ***** Biólogo Universidad del Valle (1998), Mejor trabajo de investigación en biología molecular para estudiante de pregrado, Asociación Colombiana de Ciencias Biológicas - A.C.C.B. -. Maestría en Ciencias Biológicas de la Universidad del Valle (2002). Tesis de Maestría Meritoria, Universidad Del Valle. Profesor tiempo completo Universidad San Buenaventura Cali. [email protected] ****** Químico de la Universidad de Antioquia (1994), Maestría en Ciencias Químicas de la Universidad de Antioquia (1998). Director del programa de Química de la Universidad Santiago de Cali. [email protected] *

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53 purificación, su poder endulzante permaneciera en buena cantidad. Contrario a la extracción por reflujo. Los controles del proceso fueron realizados mediante los análisis de cromatografía en placa delgada e infrarrojo (IR).

Para la identificación de los

glicósidos presentes en una muestra de Stevia, se debe buscar sus estándares infrarrojos (en este caso se encontró el IR de esteviósido y rebaudiósido A) que luego sirven para comparar con el espectro de el extracto obtenido. PALABRAS CLAVE: Stevia, glicósidos, esteviósidos, rebaudiósidos.

ABSTRACT This research was performed to realize a new extraction methodology for the Stevia Rebaudiana, and characterize its glucosides. Several methods were researched: solvent based, ion exchange, absorption chromatography, and pressurized fluids; analyzing each procedure, adjusting it to a new extraction method and with reagents of easy acquisition, basing it on the researched glucoside extractions. After performing several extraction trials (Soxhlet, Reflux), with solvents at different concentrations, temperature and pressure variations, the conditions yielding the best mixture purity were chosen. The process steps are: Drying, extraction, precipitation, clarification, and purification. The Soxhlet extraction allowed for a good deal of the sweetening power to remain intact during the purification step, as opposed to the reflux extraction. The process was controlled using thin plate chromatography and IR. To identify the glucosides present in the Stevia sample, their infrared standards were looked up. In this case the stevioside and rebaudioside A infrared standards were found, which can be compared with the produced extract's spectrum. KEY WORDS: Stevia, Glucosides, Steviosides, Rebaudiosides.

54 INTRODUCCIÓN La Stevia rebaudiana, Caá-ché o hierba dulce, crece en forma silvestre en algunas zonas de Paraguay, Brasil y provincias del nordeste argentino1. Es utilizada desde hace más de 1000 años por los aborígenes del lugar para endulzar sus alimentos. Sus hojas tienen un intenso sabor dulce, propiedad que se debe al contenido de glicósidos, de los cuales el esteviósido es el que se halla en mayor proporción, seguido del rebaudiósido A, B, C, D, E, dulcósido A y B, esteviol 2. Presentan características de estabilidad al calor (198-200°C), al pH en un rango de tres a nueve, no se fermentan, y son de 200 a 300 veces más dulce que la sacarosa.3 Además, desde hace tiempo se sabe que el rebaudiósido A es el que tiene mejor propiedades sensoriales (es más dulce y menos amargo) de los cuatro4. El motivo que llevo a realizar este proyecto, es la necesidad de implementar un nuevo método de extracción del edulcorante, contenido en la hoja de la planta, debido a que en la actualidad, no se ha implementado este procedimiento a nivel nacional, sino en el exterior. Las extracciones conocidas tienen costos muy elevados y no son favorables económicamente. En Colombia, las personas se han dedicado al cultivo de Stevia tipo morita II, por ser el tipo de planta más dulce y su fácil adaptación en varias regiones del país, pero no han realizado investigaciones en la planta.

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Alicia Ester Soto1 y Susana Del Val2. Extracción de los principios edulcorantes de la stevia rebaudiana. URL: http://www2.uca.edu.ar/esp/sec-fagrarias/esp/docs-revista/volumenes/pdf/vol20_1.pdf 2 LAURA DAYANA LÓPEZ TORRES y LUIS GUILLERMO PEÑA GUEVARA. Plan Estratégico Para La Creación De Una Empresa, Dedicada A La Producción Y Comercialización De Edulcorante A Base De stevia. Tesis De Grado. Biocomercio sostenible. “Stevia Rebaudiana Bertoni” Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt. 2002. URL: http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ingenieria/tesis17.pdf 3 David I. Habeych; Catalina Giraldo1; Luz D. Marín. Universidad EAFIT. Departamento de Ingeniería de Procesos. Desarrollo de un proceso de extracción y purificación de glicósidos de Stevia rebaudiana. En: XXIII Congreso Colombiano de Ingeniería. Química. ... URL: http://www.eafit.edu.co/NR/rdonlyres/16CF7453-10B0-468D-801AD E561FF5A1F 5/0/Cuaderno41.pdf 4 Eustas, European stevia association: componente botanic de stevia. URL: http://www.eustas.org/esp/botanic_esp.htm

55 El consumo de Stevia es cada vez mayor, por lo cual se debe investigar y desarrollar una alternativa de extracción económica y socialmente viable, favoreciendo así su consumo regional y nacional. Además, existen motivos para a nivel de la salud para su consumo, por ejemplo: puede ser consumida por personas con diabetes, obesidad, ayuda a la prevención de caries, etc. La planta ha llamado la atención en un momento de incremento en la demanda de los alimentos alternativos bajos en calorías y se ha demostrado resultados prometedores en investigaciones médicas en el tratamiento de la obesidad y presión arterial. La Stevia no tiene ningún efecto en el azúcar en sangre, y es por esta razón, que resulta un edulcorante natural atractivo para el uso de pacientes diabéticos y los que se encuentran bajo dietas con control de hidratos de carbono5. Por tanto, es necesario buscar un endulzante como la Stevia, que cumpla con las necesidades actuales de las personas, y que ante todo no tiene efectos tóxicos. En Argentina y en Colombia su uso esta avalado tanto por la Liga Argentina de Protección al Diabético como por la Federación Diabetológica Colombiana respectivamente6.

1. MATERIALES Y METODOS Para el desarrollo de la investigación se utilizaron equipos a reflujo y soxhlet, rotoevaporador, plancha de calentamiento, erlenmeyer, horno, molino de cuchillas, equipo de extracción al vacio, beackers, platillo de pruebas, papel filtro, frasco lavador, balanza de precisión, espátula, varilla de agitación, agua destilada, magneto, balón aforado, pipeta, gotero, cromatografía infrarroja, carbón activado, hidróxido de calcio, etanol, cloroformo, anhídrido acético, ácido sulfúrico, dióxido de titanio.

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Todo sobre stevia. Instituto de Estudios Salud Natural de Chile. IESN-Chile. Informe del IESN - Noviembre 2001. URL: http://www.geocities.com/iesnchile/todostevia.html 6 LAURA DAYANA LÓPEZ TORRES y LUIS GUILLERMO PEÑA GUEVARA. Plan Estratégico Para La Creación De Una Empresa, Dedicada A La Producción Y Comercialización De Edulcorante A Base De stevia. Tesis De Grado. Biocomercio sostenible. “Stevia Rebaudiana Bertoni” Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt. 2002. 18. URL: http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ingenieria/tesis17.pdf

56 El método, consiste en secar las hojas de stevia en un horno aproximadamente a unos 35ºC, luego se busca obtener el extracto de la planta por los métodos de extracción soxhlet y reflujo, con el fin de determinar por cual de los dos métodos se obtiene un extracto que tenga el mejor dulzor y pureza. Una vez obtenida las muestras se precipitan sus impurezas y luego se someten a clarificación y purificación. Por ultimo se realiza a las muestras la prueba de Liebermann – Burchard (identifica la presencia de terpenos) y un análisis de infrarrojo (para la caracterización de los glicósidos de la Stevia). El proceso se inicia, secando en un horno aproximadamente a 35ºC, 671g de hojas Stevia para evaporar el agua contenida en ellas. Posteriormente se pasa a triturar a un molino de cuchillas tipo Willey Mill con el objetivo que durante la extracción se obtenga la mayor parte de los glicósidos responsable del sabor dulce. Para la obtención del extracto de Stevia, se utiliza dos métodos de extracción: Soxhlet. En este método la muestra (15.5g de hojas trituradas) se coloca en un filtro de tela poroso. El filtro se coloca en el cartucho de extracción y en el balón el solvente (150mL de etanol). Se deja trabajar el equipo durante cinco horas. El extracto obtenido, pasa por rotoevaporación recuperando parte del etanol utilizado, luego le sigue un proceso de purificación con sal de calcio que se utiliza para precipitar las impurezas que dan el sabor amargo y se filtran al vacío. El producto de la filtración pasa aun reflujo por unos 15 minutos con carbón activado que ayudara a remover algunos pigmentos y sustancias de alto peso molecular, aclarando el extracto; seguido de una filtración.

57 De nuevo, la mezcla se somete a una purificación y rotoevaporación (para eliminar agua de la muestra), pero además pasa por un proceso de fotocatálisis con el objetivo de aclarar aun más el extracto y por ultimo se le realiza la espectroscopia de infrarrojo. Reflujo. Al balón del equipo a reflujo, se le agrega 40g de hojas molidas secas, con 798mL de alcohol, y se deja cinco horas trabajando. El extracto obtenido, pasan por un proceso de filtración al vació para remover partículas en suspensión y posteriormente se pasan a rotoevaporar cuyo objetivo, es el de recuperar el etanol utilizado y dejar la muestra libre de este solvente. Luego el extracto, es tratado con una sal de calcio, y se pasa a filtrar al vació. El producto del proceso descrito anteriormente, se mezcla con carbón activado; para mejor remoción de sustancias no deseadas, se coloca a reflujo la muestra, por unos 15 minutos, seguido de una filtración. Después la muestra es sometida de nuevo a procesos de purificación y una segunda rotoevaporación, que eliminara ahora el exceso de agua en el extracto. Para aclarar aun más las muestras, se somete a un proceso fotocatalitico en muy poca cantidad. El contiguo es realizar los análisis de caracterización (espectroscopia de infrarrojo), que servirán para la identificación de grupos funcionales y el tipo de glicósido presente. Prueba de identificación de terpenos.

Para esta prueba se utilizo los extractos

obtenidos del método de reflujo, soxhlet y además el extracto de Stevia Erbal Dolce comprada en el comercio (para comparar el cambio de color de la reacción con las otras dos muestras). Estas muestras fueron sometidas a la prueba de Liebermann – Burchard que identifica los terpenos. Esta reacción consiste en agregar a un platillo de pruebas, unas gotas de los extractos, disolverlo en cloroformo y a cada una de las muestras, ponerlas en contacto con tres gotas de anhídrido acético y una gota de ácido sulfúrico concentrado. Un cambio de color rojo, rosado o violeta en las mezclas reaccionantes en

58 el platillo de pruebas, indica la presencia de triterpenos; pero un cambio de color a amarillo claro, indica la presencia de triterpenos saturados.

2. RESULTADOS

1. Obtención del extracto de Stevia El producto obtenido de los dos procedimientos (extracción por reflujo y soxhlet) presento una coloración verde oscura debido los pigmentos de las hojas, arrastrados durante el procedimiento.  Cantidad de extracto obtenido (reflujo): 607mL  Cantidad de extracto obtenido (Soxhlet) : 113mL La cantidad de muestra obtenida de los dos equipos varia, ya que se utilizaron cantidades diferentes de hojas de Stevia trituradas y de alcohol, debido a la capacidad de los equipos. 2. Rotaevaporación soxhlet  Condición de rotoevaporación: temperatura de 50ºC el baño de maría y a una presión de 131mmHg  Cantidad de alcohol recuperado: 33.5mL  Cantidad de extracto obtenido: 23Ml 3. Rotaevaporación reflujo  Condición de rotoevaporación: temperatura de 60ºC el baño de maría y a una presión de 190mmHg  Cantidad de alcohol recuperado: 538mL

 Cantidad de extracto obtenido: 50mL

59 4. Perdida de extracto y etanol  Soxhlet: 56.5mL ~ 56.5%  Reflujo: 191mL ~ 23.9% 5. Precipitación con sal de calcio Con la sal de calcio se obtuvo una buena precipitación de impurezas y clarificación del extracto, además presenta una poca reducción del sabor dulce. 6. Purificación La utilización de carbón activado, logro precipitar aun más impurezas y aclarar aun mas el extracto, pero igual que el procedimiento anterior pierde algo de dulzor el producto. Hay que tener en cuenta, que una cantidad mayor a 2g de carbón activado, logra aclarar completamente el extracto, pero a la vez hace perder todo su dulzor. Por ello se necesita utilizar poca cantidad de este reactivo.  Cantidad de extracto obtenido (reflujo): 100mL  Cantidad de extracto obtenido (soxhlet): 100mL 7. Segunda rotoevaporación

Rotaevaporación soxhlet  Cantidad rotoevaporada: 100mL de extracto  Condición de rotoevaporación: temperatura de 45ºC el baño de maria y a una presión de 250mmHg.  Cantidad de H2O recuperada: 37mL ~ 37%  Cantidad de extracto total obtenido: 40mL Rotaevaporación reflujo  Cantidad rotoevaporada: 100mL

60  Condición de rotoevaporación: temperatura de 50ºC el baño de maria y a una presión de 450mmHg.  Cantidad de H2O recuperada: 20mL ~ 20%  Cantidad de extracto total obtenido: 60mL 8. Proceso fotocatalítico Este procedimiento a base de TiO2 se utilizo para aclarar el extracto, y dio un muy buen resultado, el color paso a ser de un amarillo mucho mas claro del que se había obtenido. Se debe tener cuidado al utilizar el reactivo ya que el exceso de este, en la muestra produce la desaparición completa del sabor dulce. 9. Reacción de identificación de terpenos En este procedimiento se pudo determinar la existencia de terpenos en los extractos de reflujo, soxhlet y de la muestra comprada en el comercio por la prueba de Liebermann – Burchard. El cambio de color de la reacción amarillo, indico la presencia de terpenos. 10. Análisis de caracterización Para la caracterización de los glicósidos de la Stevia, se realizo análisis de infrarrojo a los extractos resultantes del reflujo, soxhlet, y a un extracto de Stevia (estandarizado a un mínimo de 90% de esteviósido, incluido un 60% de rebaudiósido A, según las indicaciones de la etiqueta del producto) comprado en el comercio para tener una muestra patrón. A parte se encontró los IR estándar del esteviósido y rebaudiosido A. Espectro infrarrojo de extracto de Stevia (reflujo) Al comparar el espectro del extracto obtenido a reflujo con el infrarrojo estándar de rebaudiósido A y del esteviósido, se destaca la similitud del espectro IR estándar del rebaudiósido A, con el espectro IR de la figura 1. Además si se compara con la figura 2, de nuevo se ve una similitud que indica la presencia de algún tipo de glicósido. En la figura 1, se puede observar la presencia de algunos grupos funcionales que hacen parte de la estructura de los glicósidos como son: una tensión OH entre (3300-

61 2500cm-1), tensión C-O (1232.43cm-1) y un alqueno a (2918cm-1) que puede ser el siguiente:

Figura 1. Infrarrojo de muestra obtenida por reflujo

Es posible que la falta de presencia de más grupos funcionales en los resultados de infrarrojo se deba a la presencia de agua en el extracto que interfiere en el análisis; durante el desarrollo de la investigación, los extractos se sometieron a rotoevaporación, para separar el agua de la muestra. Vale la pena señalar, que se utilizó otro método para eliminar lo que todavía existía de agua en el extracto; con un desecador al vacio con sulfato de magnesio (MgSO 4) y otra prueba con sulfato de sodio (NaSO4); pero estos procedimientos, modificaron el sabor dulce del extracto dando un sabor desagradable.

62

Figura 2. Infrarrojo de extracto liquido de Stevia, adquirido en el comercio

11.

Espectro infrarrojo de extracto de Stevia (soxhlet)

Figura 3. Infrarrojo de muestra obtenida por soxhlet

63 De acuerdo a los resultados del análisis, se plantea por similitud de los espectros de la figura 3 y el estándar de rebaudiósido A, la presencia del rebaudiósido A en la muestra obtenida. La similitud de la figura 2 con la figura 3, permite plantear la presencia de componentes dulces en la planta. Se logra identificar en la grafica, la presencia de un alqueno a 1078.13 de la forma:

También se puede ver a 1253.64 un alcohol primario (-CH2-OH), y de un alcohol secundario (-CH-OH) a 3269.12. 12. Porcentaje de rendimiento del procedimiento a reflujo

% de rendimiento

Rendimiento de la reacción x 100 rendimiento teórico

Porcentaje de rendimiento del Reflujo  Porcentaje de rendimiento: 607/798*100%=76%  Perdida de etanol y extracto: 798-607=191mL 191/798*100%=23.9% perdida de etanol y extracto. Porcentaje de rendimiento de la primera rotoevaporación  Porcentaje de rendimiento : 538/798*100% = 67.4%  Total de la mezcla obtenida: 538+50 = 588 mL  Perdida de mezcla: 607-588 = 19mL 19/607*100% = 3.1% perdida de mezcla  Perdida de etanol: 607-50 = 557mL 557/607*100% = 91.7% Porcentaje de rendimiento de filtración y purificación  Porcentaje de rendimiento de la mezcla: 100/123*100% = 81.3%

64  Perdida de mezcla: 123-100= 23mL 23/123*100% =18.7% perdida de mezcla Porcentaje de rendimiento de la segunda rotoevaporación  Porcentaje de rendimiento: 60/100*100% = 60%  Total de la mezcla obtenida: 20+60 = 80mL  Perdida de agua: 100-60 = 40mL 40/100*100% = 40% perdida de agua  Perdida de mezcla: 100-80 = 20mL 20/100*100% = 40% perdida de mezcla

13. Porcentaje de rendimiento del procedimiento en soxhlet

Porcentaje de rendimiento del soxhlet

 Porcentaje de rendimiento: 113/150*100% = 75.3%  Perdida de etanol y extracto: 150-113 = 37mL 37/150*100% = 24.6% perdida de etanol y extracto. Porcentaje de rendimiento de la primera rotoevaporación

 Porcentaje de rendimiento: 33.5/150*100 = 22.3%  Total de la mezcla obtenida: 33.5+23 = 56.5mL  Perdida de la mezcla: 113–56.5 = 56.5mL 56.5/113*100 = 50% perdida de mezcla  Perdida de etanol: 113-23 = 90mL 90/113*100% = 79.6% perdida de etanol Porcentaje de rendimiento de filtración y purificación

 Porcentaje de rendimiento: 100/123*100 = 81.3%  Perdida de mezcla: 123-100 = 23mL 23/123*100 = 18.7% perdida de mezcla

65 Porcentaje de rendimiento de la segunda rotoevaporación

 Porcentaje de rendimiento: 40/100*100 = 40%  Total de la mezcla obtenida: 37+40 = 77mL  Perdida de agua: 100-40 = 60mL 60/100*100 = 60% perdida de agua

 Perdida de la mezcla: 100-77 = 23mL 23/100*100 = 23% 14. Recuperación de solventes y reactivos El procedimiento que se ejecuto en el laboratorio tiene beneficios tales,

como la

recuperación de solventes como el etanol, carbono activado, y el agua. Siendo útiles en el proceso como reutilizables.

3. CONCLUSIONES  Durante el procedimiento de extracción se utilizaron dos métodos,

extracción por

reflujo y soxhlet, es este ultimo dio mejores resultados, ya que tiene el poder de extraer más el dulzor de la planta pero no proporcionó el mejor rendimiento con respecto al otro procedimiento.  De los dos métodos de extracción utilizados, se concluyo que la extracción a reflujo arrastra mayor componentes no deseados que provocan el mal sabor.  La extracción es económicamente rentable, ya que los reactivos principales, utilizados en el proceso, se utilizan en poca cantidad, y sus precios son asequibles.  Los análisis de infrarrojo a las muestras obtenidas durante la investigación, plantean la presencia del rebaudiósido A, ya que sus espectros tienen similitud con el estándar de este tipo de glicósido.

66  La presencia de rebaudiósido A, nos indica que el extracto líquido, tiene un buen sabor dulce y muy poca presencia de sabor amargo, ya que es característico de este glicósido.  La prueba de Liebermann – Burchard, permitió identificar los terpenos en los extractos obtenidos en el laboratorio, lo que nos indica que si existe la presencia de glicósidos (es un tipo de terpeno) causantes el sabor dulce en las muestras.  Si se compara el espectro infrarrojo del extracto de Stevia adquirido en el comercio (figura 2), que presenta rebaudiósido A y esteviósido, con los espectros infrarrojos de los extractos obtenidos en el laboratorios (figuras 1 y 3), se puede observar que presentan picos a la misma longitud de onda, así que comparten los mismos grupos funcionales, característicos de la estructura de los glicósidos de la Stevia.  Existe técnicas (ejemplo: centrifugación, variación de pH, resinas iónicas) utilizadas para obtener un mejor extracto de Stevia, pero involucran altos costos, donde a veces no se obtienen buen rendimiento y utilizan reactivos que no se pueden reutilizar; en comparación con el método implementado en esta investigación, donde existe un buen rendimiento e involucra reactivos reutilizables y de bajo costo.  El rendimiento del proceso de extracción de glicósidos depende de condiciones de cultivo de la Stevia y la eficacia del método de extracción de los componentes dulces de la planta.

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