FEROMONA DE CONTACTO Y COMPORTAMIENTO DE APAREAMIENTO DE Monochamus galloprovincialis (COLEOPTERA: CERAMBYCIDAE). FERNANDO IBEAS MILLÁN1; DIEGO GALLEGO CAMBRONERO2; JULIO J. DÍEZ CASERO1; GERARDO SÁNCHEZ PEÑA3 Y JUAN A. PAJARES ALONSO1 1

Dto. P. Vegetal y Recursos Forestales. Entomología y patología forestales. ETSIIAA. Universidad de Valladolid. Avda. Madrid 44, 34004 Palencia 2

Dto. de Zoología y Antropol. Física. Fac. de Veterinaria. Universidad de Murcia. Campus el Espinardo, 30100 Murcia

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Dirección General para la Biodiversidad. Ministerio de Medio Ambiente. Gran Vía de S. Francisco 4, 28005 Madrid

[email protected] Resumen Los adultos de Monochamus galloprovincialis Oliver son atraídos a sus árboles hospedantes mediante una respuesta cairomonal a compuestos volátiles de éstos y a compuestos feromonales de escolítidos. Una vez en ellos, los machos y las hembras se aparean y realizan la puesta. Se observó en laboratorio el comportamiento de apareamiento de M. galloprovincialis. Se encontraron evidencias de la existencia de una feromona de contacto presente en la cutícula de las hembras que induce el reconocimiento de éstas por parte de los machos. Cuando un macho y una hembra dispuestos en una misma placa de vidrio se encontraron, el macho lamió el abdomen de la hembra con los palpos maxilares procediendo a efectuar la cópula. Posteriormente, se enfrentaron machos con hembras recién muertas. El 100% de ellos, después de lamer con los palpos la cutícula de las hembras, intentó copular con ellas. Estas hembras recién muertas fueron sumergidas en hexano puro y el extracto fue concentrado bajo un flujo de helio. Al poner a las hembras extraídas en contacto con los machos, el 100% de éstos no mostró ningún tipo de respuesta, sin embargo, el 50% de los machos intentó aparearse con hembras muertas extraídas cuando se les añadió progresivamente los extractos obtenidos. Palabras clave: cutícula, palpos, cópula, hexano, extractos. INTRODUCCIÓN Monochamus galloprovincialis es un cerambícido ampliamente distribuido por Europa central y meridional. Si bien su distribución en la Península Ibérica no es bien conocida, se encuentra en la mitad norte, en las islas Baleares y es algo más raro en la zona bética y en la vasco cantábrica (VIVES, 2000). Este cerambícido coloniza diferentes especies de árboles estresados o moribundos del género Pinus, por efecto del fuego, sequía o por la acción de otros organismos. Los huevos son depositados en grietas de la corteza de estos árboles o en heridas que los adultos realizan con las mandíbulas. Las larvas en sus primeros estadios se alimentan del floema y a medida que avanza su crecimiento también del xilema externo para luego introducirse dentro de la madera, donde construyen una característica cámara pupal y completan su desarrollo (BENSE, 1995). Muchas especies de cerambícidos son consideradas como plagas secundarias que atacan a árboles debilitados o moribundos (HANKS, 1999). El mayor daño económico producido por este tipo de cerambícidos se debe a la degradación de la madera producida por las larvas, que se alimentan en el floema y en el xilema. Sin embargo, es el papel de las especies del género Monochamus como vectores del nematodo de la madera del pino, Bursaphelenchus xylophilus, donde reside su mayor importancia. La primera noticia confirmada de la introducción de B. xylophilus en Europa ha sido en Portugal en 1998, afectando a Pinus pinaster en la península de Setúbal (MOTA et al. 1999). En este caso, el vector confirmado del nematodo resultó ser Monochamus galloprovincialis (SOUSA et al. 2001). Este insecto inocula los nematodos patógenos en los árboles sanos durante la fase de alimentación que los adultos realizan en los ramillos jóvenes. El comportamiento de apareamiento y la presencia de feromonas sexuales de contacto han sido estudiadas en varias especies de cerambícidos (FUKAYA, 2003; ALLISON & BORDEN, 2001; KIM et al,1992). FAUZIAH et al, (1987) estudiaron el comportamiento sexual de Monochamus alternatus y describieron dos tipos de comunicación química: atracción de la hembra hacia el macho mediante una feromona sexual que actúa a corta distancia, y reconocimiento de las hembras por parte de los machos

mediante una feromona sexual de contacto. Algunos hidrocarbonos constituyen feromonas de contacto en insectos (BLOMQUIST et al., 1998) y algunas feromonas de contacto han sido aisladas en varias especies de cerambícidos (WANG, 1998; KIM et al., 1992) y en algunos casos identificadas (GINZEL et al, 2003; FUKAYA, 2003, FUKAYA et al., 2000). GINZEL & HANKS (2003) estudiaron el comportamiento de apareamiento de cuatro especies de insectos cerambícidos y demostraron que en todas las especies, los machos respondían a las hembras después de que se produjera contacto antenal, indicando la intervención de quimiorreceptores en el comportamiento de apareamiento. En este trabajo se trató de estudiar el comportamiento de apareamiento de Monochamus galloprovincialis y de determinar la existencia de algún tipo de feromona de contacto que interviniese en el reconocimiento del sexo opuesto.

MATERIAL Y MÉTODOS Para conocer el comportamiento de apareamiento de Monochamus galloprovincialis se estudiaron 20 parejas de esta especie. Los insectos ensayados fueron capturados como adultos en Sierra Espuña (Murcia). Macho y hembras fueron separados y mantenidos individualmente en botes de vidrio (vol 1,5 l) con ramillos frescos de Pinus halepensis, bajo las mismas condiciones (fotoperiodo 15:9, 24ºC:17ºC de temperatura). Como arena de ensayo se utilizaron placas de vidrio de 15 cm de diámetro y 4 cm de altura en cuyo fondo se dispuso un papel de filtro. En cada placa se introdujo un macho y una hembra de M. galloprovincialis y se registró su comportamiento de apareamiento mediante cámara de video digital. Para determinar la existencia de una feromona sexual de contacto, se registró el comportamiento de los machos frente a distintos tipos de hembras: 1. Hembra recién muerta por congelación (5 minutos a –45 ºC, luego 10 minutos a temperatura ambiente). 2. Hembra recién muerta por congelación, luego sumergida durante 2 minutos en 3 ml de hexano, por dos veces (extracción de sustancias cuticulares). 3. Hembra muerta, extraída en hexano y con aplicación sobre cutícula del extracto en hexano obtenido anteriormente. Los 6 ml de extracto obtenidos en el tratamiento 2 fueron concentrados a 2 ml en corriente de helio y se aplicaron en dosis crecientes de 2 μl, es decir 0,1 EH (Equivalente Hembra) llegando hasta 1 EH o hasta obtener respuesta de apareamiento. Cada hembra fue ensayada frente a dos machos diferentes. La misma hembra fue ensayada frente a los mismos machos en cada uno de los tres tratamientos. En total se utilizaron 10 hembras y 20 machos. El comportamiento reproductivo fue registrado con cámara de video digital para su posterior análisis. RESULTADOS La figura 1 muestra la secuencia del comportamiento de apareamiento de las parejas de Monochamus galloprovincialis observadas. En 15 de las 20 parejas observadas, el macho se acercó a la hembra, que permanecía inmóvil, y contactaron con las antenas. En cuatro ocasiones, los insectos permanecieron inmóviles uno enfrente del otro, produciéndose contacto con las antenas. Después de esto, dos parejas comenzaron a copular y otras dos siguieron caminando por la superficie de ensayo. En ocho parejas, además de las dos anteriores, el macho y la hembra se tocaron con las antenas, pero no se produjo la cópula a continuación. En las 20 parejas se observó, que inmediatamente antes de la cópula, el macho y la hembra se tocaron con las antenas, el macho rodeó a la hembra lamiéndole los élitros con los palpos maxilares (figura 2), los machos montaron a las hembras, doblaron el abdomen y trataron de copular con ellas (figura 3). Durante la cópula, el macho sujetó el abdomen de la hembra con las patas delanteras y ambos miembros de la pareja orientaron sus antenas hacia delante. La cópula se repitió en varias ocasiones durante un periodo de apareamiento variable que puede durar varias horas. En el experimento llevado a cabo para determinar la existencia de una feromona sexual de contacto, se pudo observar (tabla 1) que el 100 % de los machos intentaron aparearse con hembras recién muertas, mostrando un comportamiento semejante al experimento anterior con hembras vivas. Una vez que las hembras fueron sumergidas en hexano, ninguno de los machos ensayados intentó aparearse con ellas. Sin embargo, el 50 % de los machos intentó aparearse con las hembras cuando se les añadió una cierta cantidad

de extracto de la hembra. El 25 % (la mitad de los que presentaron respuesta) de los machos, intentaron aparearse con hembras a las que se les había añadido la décima parte del extracto obtenido (0,1 EH). Cada pareja de machos respondió de forma similar a una misma hembra (ambos positiva o negativamente) excepto en dos hembras, en cada una de las cuales la respuesta de los machos fue diferente, en uno positiva y en otro negativa. En estos dos casos la respuesta positiva sólo fue obtenida tras la aplicación de dosis altas de extracto (0,4 y 0,6 EH respectivamente), mientras que en los otros machos que respondieron positivamente, éstos lo hicieron tras la aplicación de dosis de extracto más bajas (0,1 ó 0,2 EH). DISCUSIÓN Varias especies de cerambícidos han sido estudiadas para determinar su comportamiento reproductivo. GINZEL & HANKS (2003) estudiaron el comportamiento de apareamiento en laboratorio de cuatro especies de cerambícidos (Neoclytus mucronatus, Megacyllene caryae, Megacyllene robiniae y Plectrodera scalator), encontrando que en todas ellas, los machos respondieron a las hembras después de contactar primero con las antenas. Observaron que los machos no se percataban de la presencia de las hembras si no contactaban primeramente con las antenas. Una vez producido el contacto, los machos montaban a las hembras y sujetaban su abdomen con los tarsos delanteros, se producía una inclinación de su cuerpo y copulaban con las hembras. KIM et al. (1992) determinaron mediante la observación de 20 parejas de adultos de Monochamus alternatus que cuando las antenas del macho tocaban a la hembra, éste intentaba aparearse sujetando el abdomen de la hembra con las patas delanteras y lamiendo sus élitros con los palpos maxilares. En nuestras observaciones llevadas a cabo para determinar el comportamiento reproductivo de M. galloprovincialis, hubo un contacto antenal previo al apareamiento en las 20 parejas observadas. Sin embargo, en 8 ocasiones, tras el contacto antenal, no se produjo la secuencia de apareamiento. Esto puede indicar, que el contacto antenal es necesario y contribuye a detectar la presencia de la hembra, pero no resulta decisivo por sí solo en la respuesta de apareamiento. Un contacto antenal previo a la cópula podría explicar el dimorfismo en la longitud de las antenas que presentan muchas especies de cerambícidos. En otros cerambícidos observados como Psacothea hilaris (FUKAYA & HONDA, 1992), se constató como en el 71% de los insectos observados los machos tocaban con sus antenas las antenas o el cuerpo de las hembras antes de que se produjera el apareamiento. Por otro lado, el 100 % de ellos lamía los élitros de las hembras con sus palpos maxilares justo antes de producirse la cópula. Este comportamiento también ha sido observado en otros cerambícidos como Monochamus alternatus y diversas especies del género Anoplophora sp. (FUKAYA et al, 1999; FUKAYA, 2003) y podría esta relacionado con la existencia de feromonas sexuales de contacto presentes en la cutícula de la hembra que son reconocidas por los machos mediante quimiorreceptores en los palpos maxilares. GINZEL et al. (2003), confirmaron que Xylotrechus colonus usa feromonas de contacto en el reconocimiento de las hembras. En nuestro experimento se pudo observar, en todas las parejas ensayadas, como antes de que se produjera la cópula y durante ella, los machos de Monochamus galloprovincialis sujetaron el abdomen de las hembras con los tarsos delanteros y lamieron sus élitros repetidamente con los palpos maxilares. También se pudo observar como en 15 de los 20 machos estudiados se produjo el acercamiento de éstos a las hembras, contrario a lo observado en Monochamus alternatus donde antes de la cópula el macho permanece inmóvil y es la hembra quien resulta atraída (KIM et al, 1992; FAUZIAH et al, 1987). En el experimento para determinar la existencia de una feromona sexual de contacto en Monochamus galloprovincialis, se pudo observar que el 100% de los machos intentaron aparearse con hembras recién muertas pero ninguno de ellos lo intentó cuando las hembras habían sido previamente sumergidas en hexano. Sin embargo, el 50 % de los machos intentaron aparearse con las hembras muertas y extraídas cuando se les fueron añadiendo fracciones del extracto de hembras obtenido. KIM et al., (1992) observaron que los machos de Monochamus alternatus intentaron aparearse con una varilla de vidrio (0,6 cm de diámetro y 2,5 cm de largo) rociada con extractos de hembras en hexano, pero no lo hicieron cuando la varilla estuvo tratada solamente con el disolvente. Algo similar ocurre con otras especies de cerambícidos como Anoplophora chinensis. WANG (1998) observó como el 54,2% de los machos estudiados de esta especie intentó aparearse con hembras recién muertas. Sin embargo, ninguno de ellos lo hizo cuando éstas habían sido previamente sumergidas en hexano durante un periodo de tiempo. Por otro lado, el 30% de los machos respondió, intentando el apareamiento con un señuelo de filtro impregnado con extracto de las hembras. AKINO et al. (2001) encontraron diferencias en la composición de hidrocarbonos extraídos de las cutículas de machos y hembras adultos de Anoplophora malasiaca, mostrando que el dimorfismo sexual en la naturaleza de los compuestos cuticulares de esta especie, esta

implicado en el reconocimiento de las hembras por parte de los machos durante el proceso de apareamiento. GINZEL et al. (2003) identificaron una feromona de contacto presente en la cutícula de las hembras de Xylotrechus colonus formada por una mezcla de n-pentacosano, 9-methylpentacosano y 3methylpentacosano. Nuestros resultados muestran una clara evidencia de la existencia de una feromona de contacto en las hembras que permite a los machos de Monochamus galloprovincialis el reconocimiento de la pareja. Aunque la posibilidad de una feromona de atracción sexual actuando a distancia en esta especie no ha sido aún explorada, PAJARES et al. (2004) encontraron una fuerte respuesta cairomonal de ambos sexos de Monochamus galloprovincialis a una mezcla de compuestos volátiles de escolítidos. Así pues, esta respuesta cairomonal permitiría la localización de material hospedante adecuado para la reproducción y el encuentro de ambos sexos sobre él. Una vez en este material reproductivo, la existencia de una feromona sexual de contacto ayudaría los machos a localizar y reconocer a las hembras de su misma especie y permitiría el apareamiento. BIBLIOGRAFÍA AKINO, T.; FUKAYA, M.; YASUI, H.; WAKAMURA, S. 2001. Sexual dimorphism in cuticular hydrocarbons of the white-spotted longicorn meetle, Anoplophora malasiaca (Coleoptera: Cerambycidae). Entomological science. 4 (3): 271-277 ALLISON, J.D.; BORDEN, J.H. 2001. Observations on the behavior of Monochamus scutellatus (Coleoptera: Cerambycidae) in northern British Comumbia. J. Entomol. Soc. Brit. Columbia. 98:195-200 BENSE, A., 1995. Longhorn beetles: illustrated key to the Cerambycidae and Vesperidae of Europe. Margraf Verlag, Eikersheim. 512 pp. BLOMQUIST, G.J.; TILLMAN, J.A.; MPURU, S.; SEYBOLD, S.J. 1998. The cuticle and cuticular hydrocarbons of insects: structure, function and biochemistry. In Vander Meer, T. K. et al (eds). Pheromone communication in Social Insects. 34-54 FAUZIAH, B.; HIDAKA, T.; TABATA, K. 1987. The reproductive behavior of Monochamus alternatus Hope (Coleoptera: Cerambycidae). Applied Entomology and Zoology. 3: 272-285 FUKAYA, M. 2003. Recent advances in sex pheromone studies on the white-spotted longicorn beetle, Anoplophora malasiaca. Japan agricultural research quarterly. 37: 83-88 FUKAYA, M.; HONDA, H. 1992. Reproductive biology of the yellow-spotted longicorn beetle, Psacothea hilaris (Pascoe) (Coleoptera: Cerambycidae) I. Male mating behaviors and female sex pheromone. Applied Entomology and Zoology. 27 (1): 8997. FUKAYA, M.; AKINO, T.; YASUDA, T.; TATSUKI, S.; WAKAMURA, S. 1999. Mating sequense and evidence for synergistic component in female contact sex pheromone of the white-spotted longicorn beetle, Anoplophora malasiaca (Thomson) (Coleoptera: Cerambycidae). Entomological science. 2 (2): 183-187. FUKAYA, M.; AKINO, T.; YASUDA, T.; WAKAMURA, S.; SATODA, S.; SENDA, S. 2000. Hydrocarbon components in contact sex pheromone of the white-spotted longicorn beetle, Anoplophora malasiaca (Thomson) (Coleoptera: Cerambycidae) and pheromonal activity of synthetic hydrocarbons. Entomological Science. 3(2): 211-218. GINZEL, M.; BLOMQUIST, G.; MILLAR, J.; HANKS, L. 2003. Role of contact pheromones in mate recognition in Xylotrechus colonus. Journal of Chemical Ecology. Vol.29, Nº 3: 533-545 GINZEL, M.; HANKS, L. 2003. Contact pheromones as mate recognition cues of four species of longhorned beetle (Coleoptera: Cerambycidae). Journal of insect behavior. Vol. 16; Nº 2 HANKS, L.M., 1999. Influence of the larval host plant on reproductive strategies of cerambycid beetles. Annual Review of Entomology, 44: 483-505 KIM, GH.; TAKABAYASHI, J.; TAKAHASHI S.; TABATA K. 1992. Function of pheromones in mating behavior of the japanese pine sawyer beetle, Monochamus alternatus Hope. Applaid Entomology and Zoology. 4: 489-497. MOTA, M. M.; BRAASCH, H.; BRAVO, M. A.; PENAS, A. C.; BURGERMEISTER, W.; METGE, K.; SOUSA, E.; 1999. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Namatology 00(0) 1-8. PAJARES, J.A.; IBEAS, F.; DÍEZ, JJ.; GALLEGO, D. 2004. Attractive responses by Monochamus

galloprovincialis (Col.,Cerambycidae) to host and bark beetle semiochemicals. Journal of applied entomology. 128: 633-638 SOUSA, E., BRAVO, M.A., PIRES, J., NAVES, P., PENAS, A.C. BONIFACIO, L., MOTA, M.M., 2001. Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda; aphelenchoididae) associated with Monochamus galloprovincialis (Coleoptera; Cerambycidae) in Portugal. Nematology 3, 89-91. VIVES, E., 2000. Coleoptera, Cerambycidae. In: Fauna Ibérica, Vol. 12. Ed. By Ramos et al. Museo Nacional de Ciencias Naturales. CSIC. Madrid, 716 pp. WANG, Q. 1998. Evidence for contact female sex pheromone in Anoplophora chinensis (Foster) (Coleoptera: Cerambycidae: Lamiinae). The Coleopterists Bulletin, 52 (4): 363-368.

Nº de ♂♂

Respuesta a ♀

Respuesta a ♀

ensayados

muerta (%)

extraída (%)

20

100

Respuesta a ♀ con extracto (%) Respuesta Sin respuesta 0,1 EH

0,2 EH

0,4 EH

0,6 EH

25

10

10

5

0

50

Tabla 1: Respuesta de apareamiento de machos de M. galloprovincialis hacia distintos tratamientos de las hembras

♂ y ♀ se paran frente a frente

Caminando o inmóviles

♂ se aproxima a ♀

♂ inmóvil y ♀ pasa cerca

Contacto antenal Siguen caminando

Contacto antenal

Palpos maxilares del ♂ lamen los élitros de la ♀

Contacto antenal El ♂ dobla el abdomen

Cópula Figura 1. Secuencia en el comportamiento de apareamiento de M. galloprovincialis

♂ monta a la ♀

Figura 2: Contacto con los palpos maxilares del macho en los élitros de la hembra de M. galloprovincialis

Figura 3: Doblado del abdomen del macho durante la cópula en M. galloprovincialis