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GUIA DE USO DEL CITÓMETRO Rev. nº: 00 FACS CANTO II Y ADQUISICIÓN CON FACS DIVA Fecha: 8/11/2012 Pág. 1 de 11

0.ÍNDICE 0. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

ÍNDICE .................................................................................................................. 1 OBJETO................................................................................................................ 2 ALCANCE ............................................................................................................. 2 RESPONSABILIDADES Y COMPETENCIAS ....................................................... 2 METODOLOGÍA ................................................................................................... 2 DOCUMENTACIÓN DE REFERENCIA ................................................................. 7 ANEXOS ............................................................................................................... 7 HOJA DE CONTROL DE MODIFICACIONES....................................................... 8

Elaborado

Revisado y Aprobado

Cargo :

RESPONSABLE DEL SERVICIO

RESPONSABLE DEL SERVICIO

Nombre :

ESTRELLA SÁNCHEZ GÓNGORA

ESTRELLA SÁNCHEZ GÓNGORA

08/11/12

15/11/12

Firma:

Fecha :

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1.OBJETO Establecer un procedimiento para la adquisición de muestras en el citómetro de flujo FACS Canto II y el análisis con el software FACS Diva, sencillo y asequible al usuario.

2.ALCANCE Adquisición y análisis de suspensiones y sobrenadantes celulares y no biológicos (microsferas por ejemplo). Experimentos multiparamétricos de superficie, marcaje intracelular, sondas para DNA, citokinas, etc. Permite realizar compensaciones automáticas así como posteriormente a la adquisición de los eventos. Los archivos obtenidos son de formato FCS 3.0 (digitales) y, opcionalmente, se pueden obtener en formato 2.0 (analógicos), exportables a cualquier otro software de manejo de datos citométricos (FlowJo, Cell Quest Pro, etc.).

3.RESPONSABILIDADES Y COMPETENCIAS El uso del FACS Canto II se realizará habitualmente con operador, durante el horario del SECI. El usuario deberá efectuar la reserva del citómetro a través de la Intranet (https://cyberlar.iib.uam.es/reservas.es.cgi) y avisar a los técnicos del servicio mediante petición o incidencia (https://cyberlar.iib.uam.es/incidencias.es.cgi). No obstante, se permitirá el uso del citómetro de manera autónoma siempre que el usuario esté autorizado por el responsable del SECI y haya realizado el cursillo de capacitación correspondiente. Es responsabilidad de los técnicos del SECI impartir dicho cursillo de formación. En el caso de utilización individual, el técnico del SECI realizará la puesta en marcha del equipo (Fluidics Startup) dejando el equipo en standby hasta su utilización por el usuario. El usuario deberá seguir correctamente los pasos citados en este manual y realizar el apagado del FACS Canto (Fluidics Shutdown) y de la estación de análisis. El mantenimiento de los niveles de fluidos y del equipo informático dependerá de los técnicos del servicio y de la empresa BD Biosciencies, según contrato de mantenimiento. Así mismo, los técnicos del SECI se encargarán del mantenimiento preventivo y verificaciones pertinentes del FACS Canto II.

4. METODOLOGÍA [Procedimiento de adquisición de muestras: modo manual]

4.1.Encendido del equipo Poner en marcha en ordenador y encender el FACS Canto pulsando el botón verde que se encuentra en el lateral izquierdo del equipo (System power). Abrir el programa Diva software (A) (B) Introducir user name y password, para los usuarios autónomos serán, respectivamente, USER y FACSCANTO.

A

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B

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GUIA DE USO DEL CITÓMETRO Rev. nº: 00 FACS CANTO II Y ADQUISICIÓN CON FACS DIVA Fecha: 8/11/2012 Pág. 3 de 11 Se abrirá el área de trabajo de Diva (Workspace) con la siguiente apariencia:

a) b) c) d) e)

BROWSER: ventana donde se organizan las carpetas, subcarpetas y archivos de cada usuario. INSTRUMENT (CYTOMETER): panel de los controles del citómetro, parámetros, compensaciones, etc. ADQUISITION DASHBOARD: panel de adquisición (comenzar adquisición, salvar eventos, regiones) INSPECTOR: información detallada sobre la ventana o plot que se encuentre seleccionado. GLOBAL WORKSHEET: plantilla de trabajo que contiene los plots, estadísticas, información sobre el experimento y anotaciones del usuario. (Como este equipo cuenta con dos pantallas, para hacer más práctico el escritorio, se ha trasladado la hoja o plantilla de trabajo (Global Sheet) a la pantalla de la derecha, ampliándose el aspecto del resto de ventanas.

En la esquina inferior derecha del workspace se encuentra la “status bar” que nos indica el tiempo de conexión, de calentamiento, si el equipo está conectado o en standby, y si se realizó el startup o el shutdown. Cuando el equipo esté ready nos aparecerá en la esquina inferior izquierda.

PASOS DE PUESTA EN MARCHA O STARTUP (de manera habitual, estos pasos serán realizados por los técnicos del SECI) Realizar los siguientes pasos para poner en marcha el citómetro, En el menú Cytometer, 1. Fluidics startup. Duración: 7 minutos. Se realiza posteriormente al precalentamiento del láser o durante el mismo. 2. Cleaning modes. Ejecutar los pasos: a) Clean Flow Cell (insertando un tubo con un mililitro de facs clean en el SIT o simple injection port), b) De-gas Flow Cell y/o c) Bubble Filter Purge and De-gas Flow Cell. PE- SECI-12-GUIA DE USO DEL FACS CANTO II Y ADQUISICIÓN CON FACS DIVA

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SIP: sample injection port. Se desplaza hacia la izquierda para poder introducir el tubo

SIT: sample injection tube. Bal seal: anilla de enganche del tubo y sellado del vacío

Niveles de fluidos: Facsflow, waste, shutdown solution y Facsclean

En la parte inferior de la ventana correspondiente al citómetro (instrument o cytometer) hay un panel indicativo de los niveles de fluidos del equipo. Colocando el puntero del ratón sobre cada uno de ellos nos indica de qué fluido se trata. En verde podemos trabajar, en rojo hay que sustituir o rellenar el tanque correspondiente. (Los técnicos del servicio mantendrán los niveles de los distintos tanques). La SHUTDOWN solution puede ser sustituida por agua destilada en caso de necesidad (rellenando el contenedor con el grifo de agua desionizada del laboratorio).

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GUIA DE USO DEL CITÓMETRO Rev. nº: 00 FACS CANTO II Y ADQUISICIÓN CON FACS DIVA Fecha: 8/11/2012 Pág. 5 de 11 Si se tuviera que rellenar alguno de los contenedores, posteriormente se debe hacer el purgado del filtro correspondiente en: Cytometer → Cleanning Modes → Prime After Tank Refil. (seleccionar el/los fluido/s correspondientes).

Crear un experimento Si el equipo no se va a utilizar inmediatamente se dejará en modo standby. (Menú: Cytometer, disconnect; standby). Cuando se vaya a adquirir el experimento se seleccionará la opción connect en el mismo menú.

4.2.Generar un experimento Seleccionar la carpeta personal de usuario o crear una nueva, si no existe, con la nomenclatura: Lab-“nick del jefe de laboratorio”. Ej: Lab-esgongora. Dentro de nuestra carpeta podemos tener tantas subcarpetas y experimentos como deseemos.

El experimento viene designado por el icono de un libro que hemos de abrir para acceder al mismo. Sólo se puede abrir un experimento a la vez. Una vez abierto, cada experimento presenta sus instruments settings, que podemos modificar en el Inspector (o importar si se han guardado de un experimento anterior), y tantos specimens como deseemos. El espécimen engloba a una serie de muestras con características similares, viene designado por una jeringuilla y contendrá tantos tubos como muestras tengamos. Por ejemplo, cada espécimen puede corresponder a un ratón o a una línea celular particular y diferente del resto.

Con las ventanas de instrument e inspector abiertas tenemos acceso a los voltajes y parámetros del experimento (o de un tubo en particular, si aplicamos un voltaje específico a un tubo en cuestión). PE- SECI-12-GUIA DE USO DEL FACS CANTO II Y ADQUISICIÓN CON FACS DIVA

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El experimento lleva asociada una plantilla o Global Worksheet. Al igual que con otros programas de citometría, podemos diseñarla en el momento (la paleta de gráficos se encuentra en la parte superior de la plantilla) o bien aplicar una plantilla desde Diva, dentro de la carpeta de Global Worksheets de nuestro experimento, seleccionamos la worksheet y con botón derecho, Apply Analysis Template. Aparecerá una ventana donde escoger una plantilla que se ajuste a nuestras necesidades. Del mismo modo, podemos exportar nuestra plantilla a esta carpeta (sobre el nombre de nuestro experimento, con botón derecho, export analysis template).

Paleta de gráficos y opciones para el diseño de nuestra plantilla.

4.3.Adquisición de las muestras Una vez diseñado el esquema de nuestro experimento (especímenes, tubos, settings, plantillas), abrimos la ventana del Experiment Layout, donde especificaremos el numero de eventos para cada tubo, ligaremos nuestras muestras a una plantilla determinada y definiremos las gates de parada y almacenamiento de eventos (menú superior, Experiment → Experiment Layout). En la pestaña labels podemos especificar el marcaje de cada tubo, si lo consideramos conveniente. En acquisition, seleccionando el/los tubos deseados, fijamos el número de eventos, la plantilla, etc.

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GUIA DE USO DEL CITÓMETRO Rev. nº: 00 FACS CANTO II Y ADQUISICIÓN CON FACS DIVA Fecha: 8/11/2012 Pág. 7 de 11 Pestaña Acquisition:

Una vez completado el panel de experiment layout, lo cerramos y nos disponemos a pasar los tubos. ……………………………….. Mantendremos siempre abierta la ventana de Acquisitión Dashboard en el Workspace.

(Browser, instrument, inspector, worksheet y Acquisition Dashboard son ventanas que es conveniente mantener abiertas en nuestro espacio de trabajo o Workspace).

Se puede elegir la velocidad de adquisición entre tres niveles. Medium equivale a la velocidad high de los equipos FACScan (≈35 l/min)

Nos vamos situando sobre cada tubo en el browser y poniendo los tubos en el SIP (sample injection port). Para colocar un tubo, giramos el soporte metálico a la izquierda e insertamos el tubo que debe quedar enganchado por su parte superior y suspendido en el aire. Colocamos el tubo con el que vamos a ajustar los settings o tubo control. En Acq. Dashboard, pulsar acquire data, visualizar como se van adquiriendo nuestros eventos, ajustar FSC y SSC si es necesario, así como el resto de voltajes, threshold, etc ( ventana cytometer → pestaña parameters, → threshold, etc). Pulsar record data para grabar la muestra. Se puede volver a grabar una muestra o añadir eventos sobre otra ya grabada (Overwrite o SIP Append, respectivamente). El FACS Canto y Diva nos permiten realizar compensaciones a posteriori, una vez adquirida la muestra y grabados los datos. También tenemos la opción de realizar una compensación automática.

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4.4.Compensación automática con FACSDiva (PE-SECI-05) Brevemente, se seguirán los siguientes pasos: Situándonos sobre nuestro experimento, en el menu superior, “Instrument/Instrument SetUp/ Create compensation controls/ ok”. Seleccionar el tubo “Unstained Control”. Pinchar en el botón “Instrument”, elegir la escala de los parámetros (logarítmica/lineal) y los voltajes de los fotomultiplicadores que se necesiten, así como el parámetro en sí (A, W o H). Adquirir sin grabar datos, las células sin teñir o con los controles isotípicos (opcional: anticuerpos isotópicos más compbeads) y ajustar: a. tamaño y complejidad (FSC y SSC) b. Umbral (Threshold) Diseñar una región P1 englobando a las células y con el botón derecho del ratón “Apply to all compensation controls”. En “Instrument” mover los voltajes de las fluorescencias hasta que los negativos queden bien ajustados (primera década logarítmica en cada caso). Cuando estén todos los voltajes ajustados grabamos los datos (record data). Quitamos el tubo, llevando el brazo hacia la izquierda y lavamos la aguja inyectora (SIT flush, en Acquisition Dashboard). Pinchamos en el botón NEXT tube y adquirimos el tubo de la primera fluorescencia (el primer control de compensación), lo grabamos (record data) y ajustamos el marcador en su histograma. Se hace lo mismo con todas las fluorescencias (células más cada uno de los anticuerpos marcados fluorescentemente). Una vez adquiridos todos los tubos de compensación, vamos a (menú superior) Instrument / instrument Setup/ Calculate compensation. Si ha salido bien nos dejará poner un nombre a la calibración y quedará grabada en la base de datos del equipo. Comprobamos si la calibración se ha realizado correctamente. Para ello necesitamos un tubo conteniendo todas las fluorescencias empleadas en nuestro experimento, bien control con células o compbeads, bien una muestra de nuestro experimento que conozcamos positiva: a. sacamos un nuevo espécimen desde el browser b. identificamos el tubo e indicamos los marcajes en (menú superior) Experiment/ Experiment layout. c. identificamos los marcajes que hemos hecho en el tubo (será un tubo positivo para todas las fluorescencias empleadas en el marcaje). d. adquirimos la muestra y revisamos dichos marcajes comprobando nuestro control positivo.

4.5.Apagado del equipo Una vez adquiridos y grabados todos nuestros tubos procedemos a realizar el lavado y apagado del citómetro. Si hemos pasado muestras con ioduro de propidio, otro agente citotóxico o partículas virales procedemos a pasar cinco minutos con la solución contrad o se comunica al técnico del SECI para que realice el apagado. Después, ejecutar el apagado automático desde el menú: Cytometer/Fluidics Shutdown. Este proceso dura cinco minutos, transcurridos los cuales el aparato se sitúa en modo standby. Apagamos el citómetro desde el botón lateral de System Power y cerramos el programa DIVA (File/Quit). NOTA: DIVA no permite analizar, exportar o manejar los datos adquiridos mientras se realiza el procedimiento de Shutdown.

4.6.Protocolo de urgencia frente a atascos Si se está trabajando dentro del horario del SECI, comunicarlo inmediatamente a los técnicos del Servicio. Se pueden realizar varias actuaciones: Menú superior cytometer → cleanning modes → de-gas flow cell. Después pasar un par de minutos de FACSclean y otro par de agua desionizada (velocidad high). Si el atasco persiste, colocando un tubo de FACSclean en el SIT, ejecutar cytometer → cleanning modes → clean flow cell. Colocar un tubo con agua y pasar un par de minutos.

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GUIA DE USO DEL CITÓMETRO Rev. nº: 00 FACS CANTO II Y ADQUISICIÓN CON FACS DIVA Fecha: 8/11/2012 Pág. 9 de 11 Tras lo anterior, probamos nuestra muestra y si continúan sin pasar eventos, realizamos un cytometer → cleanning modes → Bubble filter purge and degass Si el atasco persiste, comunicarlo a los técnicos del SECI. Si nos encontramos fuera del horario del servicio y no conseguimos seguir pasando la muestra, intentar hacer el shutdown y apagar el citómetro y la FACS station. No olvidar registrar la incidencia correspondiente.

5. DOCUMENTACIÓN DE REFERENCIA Manual de uso de FACS Diva: Diva User Guide Uso de Compbeads en BD FACSDiva Software: BD™ CompBeads plus BD FACSDiva™ Software: A Setup System. For Cytometry Controls, Instrument Setup and the Determination of Positivity Citometry Part A 69A:1037-1042 (2006)

6.ANEXOS Detalle del carro de fluidos

Detalle de los sensores led de los PMT del equipo

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GUIA DE USO DEL CITÓMETRO Rev. nº: 00 FACS CANTO II Y ADQUISICIÓN CON FACS DIVA Fecha: 8/11/2012 Pág. 10 de 11 Guía rápida de iconos del Workspace

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GUIA DE USO DEL CITÓMETRO Rev. nº: 00 FACS CANTO II Y ADQUISICIÓN CON FACS DIVA Fecha: 8/11/2012 Pág. 11 de 11

7.HOJA DE CONTROL DE MODIFICACIONES Rev. / Edic.

Fecha

Apdo. modificado

Descripción de la modificación

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