Vamos a continuar viendo cuales son las moléculas que están involucradas en la transducción de la señal intracelular y las diferentes vías intracelulares. Podemos ver una lista de moléculas que están implicadas en la transducción intracelular: – Proteínas G – Adaptadores – Enzimas - Proteínas quinasas y fosfatasas - Lipasas - Ciclasas

El último día estuvimos hablando a cerca de las proteínas G. En la imagen podemos observar que se trata de una especie de moléculas de tipo proteico, que van a tener como función fundamental la de conectar otras moléculas que forman parte de la vía de transducción de señales y que no tienen funciones específicas ni de enzimas ni de proteínas G, es decir, no son capaces ni de unir nucleótidos de guanina, ni tampoco tienen una capacidad enzimática.

En el esquema esta representado un receptor del tipo tirosin kinasa, y tiene un ligando unido, y además hay 3 moléculas que serán como adaptadores, sobretodo la Grb 2 y la SOS. La Grb 2 es el ejemplo más claro de adaptador que se puede ver. Tiene dos dominios, SH3 y un dominio SH2. Esta haciendo conexión entre la molécula del receptor, y otras moléculas como el SOS (factor de intercambio de nucleótidos de guanina para la proteína G pequeña que se denomina Ras) y el otro también es una proteína G, o proteína activadora de la actividad ATPasica (g pequeña). Este Grb 2 esta conectando por un lado el receptor con estas otras proteínas. A su vez estas proteínas están conectadas con Ras que en este caso al tener GDP estaría en una situación de inactiva, y gracias a estos activadores de la actividad de Ras va ha pasar a una situación activa. De tal manera que activado vamos a tener Ras GTP, y va ha activar a esa proteína quinasa Raf, que va ha estar involucrada en la vía de las map quinasas, y que va ha dar lugar a respuestas del tipo de activación de la transcripción o proliferación celular y por otro lado la misma proteína Ras activa va ha ser capaz de estar involucrada en otras vías intracelulares (es una proteína muy versátil). Para llegar a todo esto, han tenido que pasar la señal a través de Grb 2 y de todas esas moléculas.

Es importante saber en que punto del receptor tirosin quinasa, por ejemplo, se tienen que unir estos adaptadores. Para ello debemos decir que existen una serie de dominios en estas moléculas que se denominan dominios de homología Src o SH, o también dominios de transducción. Se encontraron en primer lugar en la proteína Src y por eso se denominaron así. Hay hasta 4 dominios, que se denominan SH, más 2 dominios diferentes pero que también tienen funciones semejantes. Los primeros dominios, el SH1,2,3,4 son los que se vieron en la proteína Src, y el dominio que se denomina SH1 tiene dominio quinasa, y es altamente conservado, es decir, vamos a encontrarlo en muchas proteínas con la misma secuencia.

El dominio SH2 va ha unir fosfotirosina, es decir, que cuando una proteína tenga un resto de tirosina fosforilado, puede ser reconocido ese resto de fosfotirosina por el dominio SH2 de una proteína que será probablemente un adaptador, aunque también puede ser una enzima (que tienen ese dominio). El dominio SH3 interacciona con motivos ricos en prolina, osea que puede haber secuencias que tengan muchos residuos de prolina juntos, y que sean reconocidos por este SH3. Por último, el dominio SH 4, dominio que regula la miristoilación de glicina (que sucede en muchas de las proteínas) y solo se encuentra en las familias de Src. Es un poco más exclusivo de esa familia, y lo vamos a encontrar con menos frecuencia en otras proteínas. Los dominios serían secuencias de aa que están en un punto concreto de la molécula. Hay unos dominios que se denominan de señalización, y se denomina PTB y PH. El PTB tiene una secuencia diferente del SH 2, pero también une fosfotirosina. El PH une fosfolípidos, y por tanto esta relacionado con la unión de determinadas moléculas a fosfolípidos de membrana que tengan que ser de alguna manera modificados. Esos son los dominios que van a permitir que unas moléculas reconozcan puntos de otras moléculas y se unan a ellos.

Podemos observar un esquema donde aparecen algunas proteínas que van a llevar alguno de los dominios nombrados anteriormente. Por ejemplo, la PI 3 kinasa, va ha llevar dos dominios que serían el SH2, y un dominio que sería el SH 3. La proteína GAP, que activa la actividad ATP asa de las proteínasG, lo que lleva son 2 dominios SH2, y uno SH3. En una fosfolipasas sucede lo mismo. Tienen una actividad enzimática. Estos dominios las van ha permitir unirse a las proteínas, para si van a fosforilar o si van a ser activadas por ellas.

Podemos observar la estructura del Grb 2, y veríamos un dominio SH 2 que esta entre medias de dos dominios SH3, uno cerca del extremo Cterminal y otro cerca del extremo N-terminal. Los dominios SH 2 hemos dicho que unía fosfotirosinas, por lo que se va a unir a un resto de fosfotirosina del receptor. El SH 3 une prolinas, o reconoce prolinas. Así van a conectar ambas.

Aquí, podemos observar la misma molécula, en un esquema distinto.

El dominio SH2, y dos domios SH3. El Grb 2 solamente sirve para unir moléculas.

Podemos observar el sitio de unión a la fosfotirosina, y a las prolinas.

Tenemos el dominio PH, que es en concreto de la fosfolipasa C, y que es capaz de unirse a fosfolipidos. La proteína es una fosfolipasa, por lo que es una enzima, y su función principal va ha ser romper fosfolipidos, y tiene lo que se denomina el dominio Ph. Aquí podemos ver representado este dominio de la fosfolipasa C, y como se une a un fosfolipido de membrana, el fosfatidil inositol, 4,5 bifosfato, lo cual es necesario para que este en el punto concreto y pueda activarse la actividad fosfolipasa de la fosfolipasa C y pueda romper ese fosfolipido.

Se puede observar como se une a la proteína Ras, y en este caso al contactar con la proteína Ras, va ha ser capaz de activarla.

Podemos observar en esta imagen el dominio SH 3 del adaptador Grb 2, y como se une a SOS.

Este es otro esquema interesante porque tiene diferentes moléculas, y se ve como se ensamblan entre sí. Vemos la proteína Src, que tiene distintos dominios. Vemos también la fosfolipasa C gamma, con sus dominios.

Podemos observar también una parte de la PI 3 kinasa, el Grb 2, que no tiene ningún otro dominio excepto los de unión, y la proteína K que es activadora de la actividad ATPasa cerca del extremo terminal, y por el extremo N-terminal, los dominios de unión a otras proteínas. Este esquema habla de como se reclutan las proteínas señalizadoras. Vemos receptores que están activados y fosforilados, por lo tanto estaremos hablando de receptores del tipo receptores con actividad enzimática intrínseca. La parte roja, quiere decir que esta activo, además tiene restos fosforilados, que son restos de tirosina fosforiladas. Este tipo de comportamiento corresponde a los receptores que tienen actividad enzimática intrínseca. Por ejemplo, los receptores que tiene 7 hélices transmembrana, no se fosforilan en el momento de activarse, pero sin embargo en este tipo si.

Resumiendo, están activados y tienen restos de fosfotirosina, y lo que indican es que hay una serie de moléculas que van ha reconocer esos restos de fosfotirosinas, y por tanto van ha tener unos dominios o secuencias de los denominados SH 2 que se van a unir. Cuando se unen y están cerca van a resultar activadas, algunas veces como en este caso resultan fosforiladas. Una vez que están fosforiladas o activadas de forma perfecta, por unión, entonces se puede transmitir la señal y esa es la forma en la que se va a ir activando una proteína después de otra. Aquí tenemos un conjunto de la forma en que van a funcionar todas estas proteínas que se van a ir activando unas a otras. Podemos observar la membrana, un receptor con su ligando, un resto de fosfotirosina, una proteína señalizadora 1 genérica.

Esta proteína tiene una zona PH, una zona PTB, y una zona SH 2, y además tiene un dominio quinasa. Se va a unir a fosfolipidos de membrana, el PTB se va a unir a un grupo de fosfotirosina de otra molécula, y el SH 2 se va a unir a la fosfotirosina del receptor. Se activa y es capaz de fosforilar otra molécula, a la molécula señalizadora 2, que llegara después y se unirá a la zona PTB porque al principio iba a estar inactiva. Si también tiene un dominio quinasa, va a ser capaz de fosforilar a otras proteínas y de activarlas para seguir con la señal intracelular. Podemos ver una proteína adaptadora, que no tienen ninguna otra actividad, que aportar esos dominios SH 2 y SH 3, que une fosfotirosina por un lado, y prolina, o una secuencia rica en prolina por otro lado.

Hay tres grupos de enzimas: – Las proteínas kinasas y fosfatasas: hay muchas de ellas y de diferentes tamaños, es el grupo más numeroso, y aunque todas tengan la misma función, van a actuar en muchas vías de transducción de señales. – Ciclasas – Lipasas SEÑALIZACIÓN POR FOSFORILACIÓN:

Simplemente, es una diapositiva para recordar, se tiene el ATP y una proteína, se puede tener un grupo serina treonina o tirosina, y en este grupo es donde va a resultar fosforilado, es decir, toma un grupo fosfato del ATP y se desprende ADP. Esto es igual en todos, nosotros nos vamos a ocupar de ver en que casos la proteína fosforilada es activa, o bien al fosforilarse se desactiva, lo cual depende de la proteína.

Tenemos un esquema donde podemos observar que es lo que sucede cuando una proteína se fosforila. Cuando una proteína se fosforila cambia su conformación, cuando no esta fosforilada, tiene una forma, y cuando esta fosforilada (en este caso activada) cambia su conformación, y como siempre se cierra un poco la zona en que se sitúa ese grupo fosfato. PROTEINAS KINASAS:

En cuanto a las proteínas quinasas que tienen que ver con la transducción de la señal, tenemos las que son protein quinasas. Aquí tenemos algunas, y la mayoría están atravesando la membrana, y por tanto son receptores. Tienen actividad quinasa, son receptores tirosin quinasa, y vemos de una forma muy esquemática por ejemplo la EFG que es el factor de crecimiento epidérmico. Tiene una parte extracelular, una hélice alfa transmembrana y en el interior, tienen la actividad quinasa.

Hay algunas diferencias, ya que en otros receptores como es el factor del crecimiento derivado de plaquetas tiene la actividad quinasa dividida en dos segmentos, siempre en la zona intracelular. El receptor de insulina, es un caso a parte, ya que aunque se representen como monómeros, cuando se les une el ligando se van a dimerizar. Sin embargo, el receptor de la insulina ya se biosintetiza en forma de dímero, por lo que su activación no incluye la dimerización del receptor porque ya esta terminada la forma quinasa. Consta de 2 subunidades, pero tiene 4 cadenas polipeptídicas, cada subunidad lleva dos cadenas polipeptídicas, la que se denomina alfa, y la que se denomina beta, que estaría unidas por un puente disulfuro. Pero las dos subunidades entre si, también se unen por un puente disulfuro, y cuando se biosintetiza el receptor de la insulina, ya se biosintetiza así, se sitúa en la membrana, y esta preparado para recibir a su ligando. La cadena alfa de cada una de las subunidades es enteramente extracelular, mientras que la cadena beta es la que lleva la hélice alfa transmembrana y también la actividad quinasa en el interior. Siempre la posición es el extremo N-terminal hacia fuera, o hacia arriba en los esquemas. Tenemos como ejemplos tres receptores, pero tenemos también otras proteínas quinasas que son solubles que están en el interior de la célula y que forman parte de la cadena de transducción de señales. Tenemos la proteína Src que es una proteína quinasa, mas bien pequeña, que tiene un resto de ácido Palmítico y que hace que se una en la membrana. Situada cerca de la parte interior de la membrana plasmática. Hay otra proteína denominada.... que es otro ejemplo de proteína soluble que va aparecer más adelante en algunas vías de transducción de señales, y son todas ellas tirosin quinasas al activarse. Hay otras proteínas quinasas que son serin treonin quinasas, de estas la mayoría, son proteínas solubles que forman parte de las cadenas intracelulares. Aparece una que atraviesa la membrana y que es el receptor del factor de crecimiento transformante beta, que es un poco especial ya que no tiene actividad tirosin quinasa (como otros factores de crecimiento), sino actividad serin treonin quinasa. Hay otras serin treonin quinasas importantes en las cadenas de transducción, como serían la Pka (quinasa dependiente del AMPc), la Pkg (quinasa dependiente del GMP c), la PK c (quinasa C) tenemos además la calmodulina quinasa, que va ha estar relacionada con los niveles de calcio, la proteina quinasa B, y la Map quinasa de la que ya hemos hablado.

Todas estas son solubles y forman parte de las cadenas, pero más adelante, más cerca de las respuestas, no al principio.

SUBFAMILIAS DE TIROSIN-QUINASAS SOLUBLES:

Muchas de estas tirosin quinasas solubles de las que vemos en este esquema, están representadas de tal manera que podemos ver diferentes dominios con características diferentes. Por ejemplo, vemos las que tienen dominios SH 2 y SH 3, en algunos casos coinciden y en otros no. Tiene además el dominio PH, e incluso tiene algún dominio capaz de unirse a DNA, otros tienen que ver con la unión a integrina.

Nos vamos a fijar en la proteína Src que también es pequeña, y actúa en muchas vías importantes. En el extremo N-terminal tiene un dominio SH 3, después un dominio SH 2, después un dominio protein quinasa, y al final, cerca del extremo C-terminal, esta representada una tirosina quinasa concreta que puede estar fosforilada o no. todas estas proteínas cuando pasan de activas a inactivas tienen diferentes formas de activarse, en este caso se conoce que hay varios mecanismos, pero uno de ellos se basa en que si tiene fosfotirosina, esta inactivada, por lo que podemos verla en la imagen inactivada, porque tiene un resto de fosfotirosina cerca del extremo C-terminal. SH 3, se uniría a restos de prolinas de otras moléculas, mientras que SH 2 se uniría a restos de fosfotirosina para poder actuar. La estructura es globulosa, y tiene un ácido Palmítico.

Podemos ver la forma en la que se activa. Observamos el extremo N-terminal y los dominios, (SH 3, SH2, dominio C-terminal, con el dominio protein kinasa).

Aquí encontramos a la proteína autoinhibida, porque la fosfotirosina esta unida al segmento SH 2, y al estar en esta conformación tiene el dominio de fosforilación (donde ella tiene su actividad quinasa) lo tiene cerrado, y no permite la entrada de un péptido. La clave esta en que la fosfotirosina la tiene unida a su propio segmento SH 2.

En la forma activa lo que sucede es que esta fosfotirosina desaparece, desaparece el grupo fosfato, y cambia la conformación a una situación abierta.

Esta situación abierta permite por un lado, que el SH 2 reconozca un resto de fosfotirosina de una proteína a la que puede fosforilar, y se una a ella. El SH 3 también va a unnirse a restos de prolinas, a lo mejor de la misma proteína. A esto se le denomina un activador se Src. Al cambiar la conformación se permite la entrada de un sustrato en su dominio tirosin quinasa, y la posibilidad de fosforilar en este sustrato. Es decir, el centro activo de la enzima queda abierto, y queda en la posición de poder fosforilar al sustrato. Vemos la forma activa, y vemos que hay un cambio de conformación, y una apertura de la zona donde pueden entrar sustratos.

ACTIVACION DE LA PROTEINA QUINASA A: La proteína quinasa A esta formada por 4 subunidades, dos reguladoras y dos catalíticas. Las reguladoras pueden tomar dos moléculas de AMP c por subunidad, y cuando se une el AMP c a las subunidades reguladoras se separan de las subunidades catalíticas que quedan activadas. Esto esta de forma activa, hasta que las concentraciones de AMP c en la célula son lo suficientemente grandes como para unirse a las subunidades reguladoras.

Esto se debe a que entre las subunidades reguladoras y catalíticas, existe lo que se denomina la secuencia pseudosustrato, es una secuencia que esta en la subunidad reguladora. Es una secuencia consenso, que tiene los mismos aminoácidos, que la subunidad catalítica va ha reconocer en otra proteína y va a fosforilar, pero en lugar de tener a la molécula que va a fosforilar, una proteína quinasa A que sería serina o treonina, tiene una alanina. Por tanto, cada una de las subunidades catalíticas reconocen la secuencia pseudosustrato y se unen a ellas, pero no son capaces de fosforilarlas porque no tienen el aminoácido necesario, para poder fosforilar. Es como un engaño, ya que reconocen la secuencia pero luego no pueden fosforilar. Cuando hay grandes cantidades de AMP c, en el citoplasma, este AMP c se une a sus puntos correspondientes de las subunidades reguladoras y cambia la conformación. Al cambiar la conformación es cuando se separan, entonces quedan como libres para poder encontrar una proteína que tenga la secuencia sustrato adecuada. Posee una alanina en lugar de tener una serina o una treonina.

En esta imagen podemos ver la estructura de la proteína quinasa C, con sus diferentes isoformas, con la secuencia pseudosustrato. Vemos unos dominios de control que tiene esta proteína, el dominio de control 1 se repite en a y b, y el dominio de control 2 que esta situado en diferentes puntos. En este caso la activación se debe a un segundo mensajero que es el diacilglicerol, (DA).

Al final siempre el extremo C-terminal va ha tener el dominio quinasa. Todo esto sucede también a través de una secuencia pseudosustrato. Esta secuencia en este caso esta en el extremo N-terminal, y se sitúa en el sitio activo del dominio quinasa, de su propia proteína, de su propia molécula. Estas zonas de control 1 se van a unir al diacilglicerol, y este segundo mensajero queda unido a la membrana. Este DA se formará a partir de fosfolípidos de membrana, que va a ser un sustrato de cualquier fosfolipasa, por ejemplo, y va a dar lugar a diacilglicerol y al ion calcio. En este caso, la proteína se situá bajo la membrana, y el centro de control 2 va a tomar iones calcio, que en ese momento están en exceso en la célula. Así cambia la conformación y la PK C queda con el sitio activo expuesto y capaz de unirse a su ligando y fosforilar. FAMILIAS DE FOSFATASAS:

Para cada quinasa existe una fosfatasa, ya que todo lo que se fosforila debe poder desfosforilarse. Algunas de ellas son más específicas, y otras menos. Las tirosin fosfatasas van a revertir la actividad de las tirosin quinasas. Las serin treonin fosfatasas van a revertir el efecto de las serin treonin quinasas, (PK a y PK c). Además hay familias de fosfatasas que tienen una actividad dual, es decir, pueden valer lo mismo para algunas proteínas que son tirosin y serin quinasas al mismo tiempo, como sucede por ejemplo con la proteína MeK (proteína intracelular). Cualquier fosforilación, debe desacerse al cabo de un tiempo, para no crear un problema a la célula.

Esquema en relación con las proteínas quinasas y fosfatas solubles. Vemos la estructura de las quinasas y de las fosfatasas. Tienen además una forma de saber donde están dentro de la célula. Algunas tienen dominios transmembranas. Hay una gran cantidad de moléculas implicadas, las intracelulares la mayoría tienen un dominio fosfatasa que prácticamente lo ocupa todo y luego hay otras con dominios distintos como pueden ser de asociación a la membrana, o de localización nuclear.

Se sabe cual puede ser la distribución celular de la fosfotirosin fosfatasa. Se sabe que tiene unas zonas en las cuales son capaces de reconocer restos de fosfotirosina, para colocarse en esa zona. Además, algunas tienen unas zonas que pueden unirse a las membranas de las mitocondrias, (se ha representado como una especie de tornillo en el dibujo), dependiendo de donde tengan que hacer su función. Incluso dentro del núcleo se pueden encontrar unas cuantas fosfatasas capaces de unirse.

Los tornillos intentan representar que son capaces de atravesar determinadas membranas (en este caso membranas del RE). Lo importante es que tienen una estructura capaz de hacer ver donde tienen que situarse dentro de la célula. Podemos observar en la imagen la zona catalítica y la zona capaz de decir cual es la situación dentro de la célula. Parece ser que la zona amino terminal es catalítica.