Casa abierta al tiempo

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UNIVERSIDAD AUTóNOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICASY DE LA SALUD Departamento de Biotecnología

Micropropagación in vitrode Hylucereus undatus (Cactaceae)

Tesis que presentael alumno:

Juan Manuel Loeza Corte 95336137 Para la obtencih del grado de:

Licenciado en Biología Asesores:

Dr. Francisco Cruz Sosa M. en B. E. José Angel Lechuga Corchado Mayo de 2002

Micropropagación in vitrode Hylocereus undatus (Cactaceae) Loeza Corte Juan Manuel RESUMEN LoscactuscomoplantasornamentaleshanadquiridoimportanciaenMéxico,además los h t o s de Hylocereus undatus se comercializan ampliamente en Yucatán. En el presente trabajo se cultivaron esquejes obtenidos de semilla de H. undatus en medio básico MS SIGMA (M-5519) complementado con diferentes concentraciones deANA y BAP, lográndose establecer cultivos asépticos, así como la producción de nuevos brotes. INTRODUCCI~N Hylocereusundatus (Haworth)Britton & Rose (cactaceae), se distribuye comúnmente a lo largo de los trópicos y subtrópicos. Dos formas de esta especie son comunes en Yucatán. Una es llamada chacoub,confloresblancasaexcepcióndelos segmentos del perianto que tienen el borde y los extremos púrpura, el h t o es globular y púrpura enrojecido. La otra forma llamada zacoub tiene las flores blancas y oblongadas y, el fruto es blanco cremoso (Britton& Rose, 1963). En general, los cactus han llegado ser a importantes como plantas hogareñas, esto por su facilidad de cultivoysuhabilidadpararesistir estos ambientes internos, además de la belleza de crecimiento suvegetativo simétrico y ocasionalmentelapresenciadehermosasflores (Jonson & Emino, 1979b). Adicionalmente a esto, el h t o de H.Undatus delaformazacoubes considerado entre los más deseables en Yucatán y esencontradoen los mercadosparasuventa (Britton & Rose, 1963). Loscactustradicionalmentesonpropagadospor semilla (sexualmente) o esquejes (asexualmente), lo que puede plantear serias dificultades (Ault & Blackmon,1987;Smith et al, 1991),ademásde quelassemillaspuedenserdificiles de obtener debido que a en las plantas raramente se encuentran(Mauseth,1977y1979;Smith et al, 199l), aunque y se tengan, estos métodos convencionales son inadecuados porque las semillaslleganaestarenlatencia o tenerbaja germinación, por otra parte su crecimiento es lento y como su fase juvenil es larga, requieren muchos años para madurar (Clayton et al., 1990; Escobar et al., 1986;Mauseth,1977y1979;Vyskot & Jára, 1984; Wakhlu& Bhay 2000). A pesar de su crecimiento extremadamente lento, suresistencia a temperaturasextremasyala

continua sequía, se ha hecho del cactus un material favoritoparaestudiosfisiológicos(Minocha & Mehra, 1974). Las técnicas de cultivo de tejidos in vitro, proporcionan grandes posibilidades para una rápida masiva y propagación plantas, de superando los métodos convencionales de multiplicación de cactus para diferentes propósitos (Ault & Blackmon,1987;Clayton et al., 1990; Kolár et al. 1976; Lazarte et al., 1982; MartinezVázquez & Rubluo, 1989; Mauseth, 1977 y 1979; Steinhart, 1962; Wakhlu& Bhay 2000). Investigaciones previas han mostrado que el efecto con concentraciones altas de citocininas y concentraciones bajas de auxinas produce un rápido crecimiento de los tejidos, mientras que en concentraciones las auxinas altas dey concentraciones bajas de citocininas se estimula la proliferaciónrápidadenuevosápicesaxilaresa nivel de raíz, de igual manera los mecanismos de regulación básica para la organogénesis in vitro en varias especies están en el balance de auxinas y citocininas(Ault & Blackmon, 1987 y 1985; Clayton et al., 1990; Escobaret al., 1986; Johnson & Emino, 1979a; Kolár et al. 1976; Lazarte et al., 1982; Martinez-Vázquez & Rubluo, 1989; Mauseth,1976y1977;Mauseth & Halperin, 1975;Minocha & Mehra,1974;Smith etal., 1989; Smith et al, 1991; Starling, 1985; Steinhart, 1962;Vyskot & Jára,1984;Wakhlu & Bhau, 2000). Paraestetrabajono se encontraronreportes de propagación in vitro de H. Undatus. Elobjetivo de estetrabajo fue establecer los in vitro para la requerimientos de cultivo formacióndebrotesen Hylocereus undatus, y evaluar los efectosdela6-bencilaminopurina (BAP)endiferentesconcentracionesconácido naftalacético (ANA) .

MATERIALES Y MÉTODOS Se trabajoconsemillasprovenientesdefrutos obtenidos comercialmente. Las semillas se retiraron del fruto y se lavaron. Posteriormente se desinfestaronmediante un lavadocondetergente comercial y agua corriente. Seguido de un lavado conalcoholal 70% durante 10 min, y finalmente con cloro comercial al 10% durante 10 min, seguidosdevariosenjuaguesde agua destilada estéril.Lassemillassesembraronencondiciones de asepsia, utilizándose como recipiente de cultivo frascos tipo gerber conteniendo medio básico MS SIGMA (M-55 19). Plantasde 4 meses en condicionesasépticasse obtener esquejes utilizaron depara aproximadamente 1 cm de longitud. Los esquejessesembraron en condiciones de medio utilizado, antes elasepsia, en complementadoconácidonicotínico 0.5 m@, tiaminaHC1 0.1 m&, piridoxinaHC1 0.5 mg/L, 30 g/L, fitagel 2 mio-inositol 100 m@,sacarosa g/Ly diferentes concentraciones deANA y BAP (Tabla l), el pH fue ajustado a 5.8 con NaOH (1N) o HC1 (1N) después se esterilizó en la autoclave a una presión de 1 .O5 KgJcm’ durante 15 m i n .

O

0.01

0.1

1.o

O

A

B

C

D

0.01

E

F

G

H

E

0.1

I

J

K

L

%

1.0

M

N

O

P

10.0

Q

R

S

T

v

Tabla I . Diferentesconcentracionesde para los cultivos.

ANA y BAP utilizadas

Cada fiasco de cultivo contenía aproximadamente 10 mL de medio de cultivo y tres esquejes de H. undatus. Posteriormente los cultivos se mantuvieron a una temperatura aproximada de 25 f 3 OC con un fotoperiodo de 12/12hrs de iluminación-oscuridad. Cadatratamientoconsistiódedosrepeticiones (cinco fiascos). La variable evaluar a fue la formacióndebrotes. Se realizóelanálisis de varianza (ANDEVA) conel fin decorroborarsi existia diferencia significativa entre los tratamientosde BAP manteniendoconstante las

concentraciones de ANA. Las pruebas de Tukey y Duncan serealizaronparaencontrardiferencias significativasentre los tratamientos(seutilizóel paqueteestadístico SPSS paraWindowsversión 9.0).

RESULTADOS Y DISCUSI~N El ANDEVA se realizó con un a = 0.001, presentando diferencias significativas en cada una de las columnas de ANA(Tabla 2).

O

0.01

0.1

1.0

O

3

0.01

W

0.1

2m

1.o

1

10.0 10.6

3.6a

9.8 b 11.2 b

1 4 . 6 ~ 15.0 b

b

18.5 b

3.5 a

9.2 b 11.44 b 8.0 b

5.9 a

Taba1 2. Efecto del BAP y ANA en la formacióndebrotesde undatus, despu6s de 10 semanas.

H.

Con las pruebas Tukey de y Duncan se diferenciaron tres grupos en la columna ausente de ANA, donde las mayor cantidad de brotes producidos se observó en el tratamiento M (Tablas 1 y 2 y gráfico 1). Para las demás columnas sólo se diferenciaron grupos dos donde las concentracionesde 0.1, 1.0 y 10.0 m& de BAP presentaron la mayorproduccióndebrotes,con excepción de la columnacon 1.0 mg/LdeANA, donde la mayor cantidad de brotes sólo se obtuvo en la concentración de 1.0 mg/L de BAP (Tabla 2 y gráfíco 1). Lazarte (1982) reporta la mayorobtenciónde brotes de Epiphyllum chrisocardium (cactaceae) a concentraciones de O. 1 mg/LdeANA y 1.O mg/L de BAP. Martinez-Vázquez & Rubluo (1989), analizando el efecto de los reguladores del crecimiento en Mammillaria respuestas morfogenéticas de en haageana (cacataceae)sóloobtuvieronbrotes Concentraciones de 1.0 y 2.0 mg/L de BAP. Vyskot & Jára (1984), en cultivos de Mammillaria carmenae (cactaceae) la estimulaciónóptimade brotes axilares h e enconcentracionesde 1 mg/L deANA y 2 m&de BAP y en M. prolfera

(cacataceae) presentó formación una más frecuente de brotes en concentraciones de 0.5 a 1 mgL de ANA y de 0.5 a1 mgL de BAP. Por otra parte Escobar et al. (1986) reportan una producción óptima de brotes para Opuntia amyclaea (cactaceae) unaBAP acon concentracióndeM(0.0313m@).

M ANA 0.01

subcultivos de éstos brotes para determinar o no la presencia de vitrificación. Sesugierequeareservadelapresenciade vitrificación en los tratamientos con concentraciones de 1.O y 10.0 mgL de BAP en las diferentes concentraciones deANA, se utilicen los tratamientos yJ K quepresentandiferencias significativas (tablas 1 y 2) para continuar con la multiplicación brotes, deenraizamiento y establecimiento de planta la en condiciones naturales (aclimatación, invernadero y campo).

LITERATURA CITADA

O ANA 0.1 O

O

I

O.1

0.01

BAP (mgm

Gráfico 1. Efecto del undaius.

BAP en

ANA 1.0

"A

la formación de brotesde

H.

En los tratamientos M, N y R donde se obtuvo el mayor número brotes, de éstos presentan ensanchamiento del tallo y un color verde oscuro, pudiendo ser esto un desorden fisiológico llamado vitrificación,elcualsedebeacondicionesde hiperhidircidadpredominanteenlaatmósferade cultivo que afecta a plantas herbáceas y leñosas durantesupropagación invitro. Lavitrificación aparece como resultado del estrés presentado en el interior de los frascos de cultivo, donde factores como la presencia de citocininas (BAP), el tamaño, tipo y cierre (tapa y parafilm) del frasco de cultivo,humedadrelativa,etc.,puedenactuar sinergicamenteen unordensecuencial (Mew, 1997).

CONCLUSIONES En todos los tratamientos se observó formación de brotes, cual cumple loobjetivo el del establecimiento de cultivos vitro in para la formación de brotes. Enlostratamientosseobservaqueamayor concentración de BAP se obtiene un mayor número de brotesaunaconcentraciónde0.01 mg/L de ANA, para las otras concentraciones de ANA elefectodelaBAPtieneunamayor respuesta en las concentraciones de O. 1 y 1.0 mg/L de la BAP(gráfko 1). En los tratamientos M, N y R quesuponenla presencia vitrificación, de sugiere se hacer

Adelberg, J. W., Desamero, N. V., Hale, S. A. & R. E. Young.1997.Long-termnutrientand waterutilizationduringmicropropagationof Cattleya on a liquidmembrane system. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 48: 1-7. Ault,J. R. & W. J. Blackmon.1987.Invitro propagation of Ferocactus acanthodes (Cactaceae). HortScience. 22: 126-127. Ault,J. R. & W. J. Blackmon.1985. In vitro propagationofselectednativecactispecies. HortScience. 20: 54 l. Bindy R. C., & M. Vivekanandan. 1998. Hormonal activities of 5-aminolevulinic acid in callus induction and micropropagation. Plant Growth Regulation. 26: 15-18. Briton, N. L. & J. N. Rose. 1963. The Cactaceae, descriptionandillustrationofplantsofthe cactus family. Dover Publications, Inc. 241 p. Clayton, P. W., Hubstenberger, J. F., Phillips, G. C. & S. A. Butler-Nance. 1990. Micropropagation members of of the cactaceaesubtribecactinae. J. h e r . Soc. Hort. Sci. 115: 337-343. Escobar, H. A., Villalobos, V. M. & A. Villegas. 1986. Opuntia micropropagationbyaxillary proliferation.PlantCell,TissueandOrgan Culture. 7: 269-277. Johnson, J. L. & E. R. Emino.1979a.Invitro propagation of Mammillaria elongata. HortScience. 14: 605-606. Johnson, J. L. & E.R.Emino.1979b.Tissue culture propagation in the cactaceae. Cactus & Succulent Journal(U. S.). 5 1: 275-277. Kolár, Z., Bártek, J. & B. Vyskot. 1976. Vegetative propagation cactus the of Mammillaria woodsii Craig through tissue cultures. Experientia. 32: 668-669.

Lazarte, J. E., Gaiser, M. S. & O. R. Brown. 1982. In vitro propagation of Epiphyllurn chlysocardium. HortScience. 17: 84. Martinez-Vázquez, O. & A. Rubluo.1989. Invitromasspropagation of thenear-extinct Mammillaria san-angelensis SánchezMejorada.JournalofHorticulturalScience. 64: 99-105. Mauseth,J.D. 1979. A newmethod forthe propagation of c a c t i : sterile culture of axillary buds. Cactus & Succulent Journal (U. S.). 5 1: 186- 187. Mauseth, J. D.1977.Cactustissueculture:a potentialmethod of propagation.Cactus & Succulent Journal (U. S.). 49: 80-81. Mauseth, J. D. 1976.Cytokinin-andgibberellic acid-induced effects on the structure and metabolism of shoot apical meristems in Opuntiapolyacantha (Cactaceae).Amer. J. Bot. 63: 1295-1301. Mauseth,J.D. & W. Halperin.1975.Hormonal control organogenesis of in Opuntia polyacantha (Cactaceae). h e r .J. Bot. 62: 869-877. Mer= Vázquez, S. 1997. Estudio preliminar sobre propagación in vitro de ajenjo (artemisia absinthium Asteraceae). L. Tesis de licenciatura. U N A M . 43-44 pp. Minocha, S. C. & P. N. Mehra. 1974. Nutritional andmorphogeneticinvestigationsoncallus cultures of Neomammillaria proJlera Miller (Cactaceae). Amer. J. Bot. 61: 168-173. Murashige T. 1974.Plantpropagationthrough tissuecultures. Ann. Rev.PlantPhysiol.25: 135-166. Murashige T. & F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco cultures. tissue Physiologia Plant-. 15: 473-497. Smith,M.A.L., A r t . L.,Meyer,M. J. & M . T . McClelland. 1989. Non-invasive image analysisevaluation of growth duringplant micropropagation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 19: 91-102. Smith, R. H., Burdick, P. J., Anthony, J. & A. A. Reilley. 1991. In vitro propagation of Coryphanthamacromeris. HortScience.26: 315. Starling, 1985. R. In vitro propagation of Leuchtenbergia principis. Cactus & Succulent Journal (U. S.). 57: 114-1 15. Steinhart, C. E. 1962. Tissue cultures of a cactus. Science. 137: 545-546.

Vyskot, B.& Z. Jára. 1984. Clonal propagation of cacti through axillary buds in vitro. Journalof Horticultural Science. 59: 449-452. Wakhlu, A. K. & B. S. Bhau.2000.Callus formation and plant regeneration from tubercles of Colyphantha elephantidens (LEM.) LEM. In Vitro Cell. Dev. Bio1.-Plant. 36: 21 1-214.