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III.10. RMN BIDIMENSIONAL.

III.10.1 Introducción. A través de sus métodos multidimensionales la RMN se ha convertido en la técnica más importante para resolución de estructuras, estudios de dinámica y reacciones de los biopolímeros en disolución. Aunque los espectrómetros comerciales actualmente disponibles incluyen automatizaciones avanzadas que facilitan el uso de un amplio conjunto de diferentes experimentos y mejoran rápidamente, no es trivial seleccionar el experimento mas adecuado al problema que queremos resolver y establecer los valores óptimos de los numerosos parámetros experimentales y de procesamiento de datos. Por otro lado tampoco es trivial la interpretación rigurosa de los espectros. Por ello es ineludible comprender en suficiente profundidad los fundamentos de la moderna FT-RMN para usarla con la necesaria fiabilidad. La descripción de los experimentos de RMN bidimensional mediante un modelo vectorial es bastante engorrosa y limitada, no pudiéndose explicar todos los aspectos de estos métodos. Afortunadamente el formalismo de los operadores producto con un diseño preciso de las rutas de transferencia de coherencia, hoy plenamente desarrollado, proporciona un marco teórico de gran exactitud, simple y con la rigurosidad de la Mecánica Cuántica. No obstante, la explicación de este formalismo basado en el concepto de matriz densidad desborda los límites de lo que se pretende en esta asignatura; por ello nos limitaremos a plantear conceptos generales y describir fenomenológicamente algunos experimentos básicos. El concepto de espectroscopia de RMN bidimensional fue propuesta por primera vez por Jean Jeener en una “Ampere International Summer School” que tuvo lugar en Basko Polje (antigua Yugoslavia) en 1971. Curiosamente la comunicación de Jeener nunca fue publicada e incluso su propuesta no fue comprobada experimentalmente hasta 1975. Los primeros experimentos fueron publicados por Aue, et al. (1976). Andrew E. Derome en su ampliamente difundido libro “Modern NMR Techniques for Chemistry Research” introduce la RMN bidimensional describiendo lo que el autor califica como “remarkably silly experiment” pero idóneo para ilustrar cualitativamente los conceptos básicos y facilitar la iniciación a la RMN multidimensional. Adoptamos aquí el mismo criterio considerando el espectro de 1H de una muestra con una simple línea

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espectral, como podría ser una disolución de cloroformo en disolvente deuterado, con una diferencia respecto a la frecuencia del sistema de referencia de ejes rotatorios,  (Ver Apéndice del tema). El experimento, esquematizado en la Figura III.10.1 en la que solo se destaca la magnetización transversal, consiste en dos pulsos de radio frecuencia de 90º separados por un intervalo de tiempo t1. El primer pulso pone la magnetización en el plano XY y se crea coherencia de forma que una componente transversal neta de la magnetización precesiona a la frecuencia angular  . Transcurrido un tiempo t1 después del pulso esta componente transversal habrá barrido un ángulo 2 t1 radianes y la magnetización transversal puede descomponerse en las componentes especificadas en la Figura III.10.1. El segundo pulso rota la componente transversal al plano XZ de forma que la componente cosenoidal o componente sobre el eje y aparece sobre el eje z en dirección – z, mientras que la componente senoidal se conserva. Después de este segundo pulso comienza la adquisición de los datos que describen la atenuación libre de la inducción magnética (FID) como una función de la variable temporal t2. Si realizamos una serie de experimentos en los que se repite la adquisición de la FID durante el tiempo t2, para valores discretos del tiempo t1 distribuidos a intervalos regulares desde cero hasta un cierto valor para el cual prácticamente desaparece toda coherencia creada con el primer pulso, tendremos un conjunto de datos que corresponderían a una cierta función de dos variables temporales independientes, S(t1, t2); es decir, una superficie cuyas intersecciones con planos perpendiculares al plano t1-t2 y paralelos al eje t2 serían las FIDs de amplitud modulada, y paralelos al eje t1 serían oscilaciones periódicas exponencialmente atenuadas, llamadas interferogramas, completamente análogas a las FIDs, Figura III.10.2-A. La transformación de Fourier (T.F.) del juego completo de datos para pasar del dominio de la variable t2 al dominio de la frecuencia F2, da lugar a un conjunto de espectros con un pico simple a la frecuencia relativa  ; pero cuya amplitud estará modulada por la función periódica Msen( 2 t1 ) , que a su vez se atenúa exponencialmente con el tiempo de relajación T2, S(t1, F2) en la Figura III.10.2-B. Una segunda T.F. para pasar del dominio de la variable t1 al dominio de la frecuencia F1 produce un pico bidimensional centrado en (  ,  ), Figura III.10.2-C.

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z

z

M0 y

y      2 X

x

x

t1

z

z

y

y -x

x

     2 X

x

M cos(2 t1 )

-y

y

M sen (2  t 1 )

2  t 1

M  M 0 e

t2

t  1 T2

x

Figura III.10.1: Evolución de la magnetización transversal correspondiente a una muestra con una simple línea espectral durante una secuencia de pulsos:     ------ t1------   ----- t2 (adquisición)--- 2 x  2 x

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S(t1, t2)

A

t2 t2

t1

t1

FFT sobre la dimensión t2

B

Interferograma Msen ( 2  t1 )

S(t1, f2)

t1

t1

f2 FFT sobre la dimensión t1

C S(f1, f2)

f1



f1

f2

f2 

Figura III.10.2: A: Conjunto de datos S(t1,t2) obtenidos al digitalizar las FIDs en el dominio de la variable t2 para valores discretos regularmente separados de la variable t1. B: S(t1,F2), espectros obtenidos por FFT en el dominio t2 cuyas amplitudes están moduladas en el dominio t1. C: S(F1,F2), espectro bidimensional obtenido por doble FFT de S(t1,t2) y mapa de contornos del espectro bidimensional. 182

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La representación usualmente adoptada para el análisis de los espectros bidimensionales es la de un mapa de contornos en el que los picos están representados por curvas de nivel, y el significado de los ejes ortogonales del plano dependen del tipo de espectro, como veremos posteriormente. En la Figura III.10.2-D se muestran los elementos esenciales del caso considerado; el eje horizontal representa la frecuencia F2 (la escala normalmente va de derecha a izquierda), el eje vertical la frecuencia F1 (la escala normalmente va de arriba abajo), con lo cual existe una diagonal (valores de frecuencia idénticos de cada eje) desde el vértice superior derecho al inferior izquierdo sobre la que se proyecta el espectro monodimensional; en este caso las curvas de contorno del pico están centradas sobre la diagonal en (  ,  ). El experimento que acabamos de describir no representa

ninguna

aportación

relevante

en

relación

con

un

buen

espectro

monodimensional; la causa de su poca utilidad radica en que la frecuencia de precesión de la magnetización y la frecuencia de modulación de la FID es la misma; la utilidad de la RMN-2D se pone claramente de manifiesto cuando los picos se corresponden con diferentes frecuencias en cada eje, es decir cuando aparecen fuera de la diagonal.

III.10.2. Esquemas experimentales para las técnicas de RMN-2D.

El término RMN-2D abarca un amplio conjunto de técnicas que tienen en común el uso de secuencias específicas de pulsos de radiofrecuencia para manipular la evolución de la magnetización de una muestra, modificando el Hamiltoniano del sistema en cada periodo delimitado por los pulsos de la secuencia. El esquema general para un experimento de RMN-2D puede considerarse formado por cuatro periodos de tiempo o bloques a los que llamamos preparación, evolución, mezcla y detección, figura III.10.3. El periodo de preparación, tp, es un tiempo de retardo cuyo propósito es asegurar que la magnetización de equilibrio se ha restablecido antes de repetir la secuencia de pulsos en el proceso acumulativo que usualmente se realiza para mejorar la relación señal/ruido. Este periodo termina con la aplicación de uno o más pulsos para crear coherencia. El periodo de evolución, t1, que sigue al de preparación corresponde a la 2ª dimensión de los espectros bidimensionales; durante este periodo la coherencia evoluciona hasta alcanzar un estado que depende del valor t1.

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Preparación

tp Hp

Evolución

Mezcla

t1

tm

t2

He

Hm

Hd

90º

90º

t1

Detección

90º

tm

NOESY

Figura III.10.3: Esquema experimental general para los experimentos de RMN2D. Ejemplo del NOESY.

El periodo de mezcla, tm, incluye uno o varios pulsos de radiofrecuencia y tiempos de retardo; este periodo se diseña con el propósito de transferir coherencia entre espines. Durante el periodo de detección, t2, el sistema evoluciona y se registra la FID cuya T.F. generará la dimensión F2 del espectro bidimensional. En un experimento completo los tiempos de preparación, mezcla y detección son fijos en cada medida, mientras que el tiempo de evolución se incrementa a intervalos regulares entre medidas. En los espectros bidimensionales obtenidos por doble T.F. del juego de datos S(t1, t2), las frecuencias de precesión durante t1 y t2 determinan las coordenadas de los picos. El espectro de RMN-2D es por consiguiente una representación de los procesos de transferencia de coherencia, donde cada uno de los picos aparece a las frecuencias características de las coherencias interconectadas, la intensidad de los picos está determinada por la eficacia del proceso de transferencia que, a su vez, depende de factores estructurales y dinámicos de las moléculas bajo estudio. Con diferentes configuraciones de los cuatro periodos descritos se diseña un amplio conjunto de espectros 2D, cada uno optimizado para obtener un determinado tipo de información y resolver diferentes tipos de problemas. La diversidad de experimentos de RMN-2D es consecuencia de la variedad de procesos de transferencia de coherencia. Los experimentos más ampliamente usados responden a procesos de correlación que, de forma

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genérica, podemos clasificar en tres tipos: 1) correlación a través de acoplamientos homonucleares, 2) correlación a través de acoplamientos heteronucleares y 3) correlación a través del Efecto Nuclear Overhauser. A continuación describimos algunos de los experimentos básicos de la espectroscopia que se utilizan con mas frecuencia y que solo representan un reducido número de las muchas secuencias de pulsos que resultan en experimentos útiles. Otro importante concepto en RMN, tanto 1D como 2D, es el Ciclado de fases. En un ciclado de fases una secuencia de pulsos se repite, variando de forma sistemática las fases de los pulsos de excitación y la fase del detector, mientras que el resto de parámetros permanece invariable; para cada incremento de t1 se suman todos los FIDs. El propósito de este proceso es eliminar señales artefactuales no deseadas que provienen de imperfecciones instrumentales, de transferencia de magnetización longitudinal a transversal como consecuencia de los múltiples pulsos (picos axiales), etc. Estos ciclados de fase solamente son útiles cuando los artefactos se cancelan mientras que las señales deseadas se acumulan.

III.10.3 Los experimentos bidimensionales de correlación escalar: COSY (COrrelated SpectroscopY) y TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY).

COSY: Fue el primer experimento de RMN-2D propuesto por el físico belga Jean Jeener en el año 1971. Es uno de los más simples y útiles experimentos bidimensionales. El esquema de la secuencia de pulsos se muestra en la Figura III.10.4; un primer pulso no selectivo de radiofrecuencia de 90º crea magnetización transversal, después del tiempo de evolución variable t1, un segundo pulso mezcla los estados de los espines transfiriendo magnetización entre espines acoplados; el periodo de detección comienza inmediatamente a continuación del segundo pulso; coincide por consiguiente con el experimento que hemos descrito para introducir la RMN-2D. Es uno de los experimentos mas cortos, en un espectrómetro convencional necesita un mínimo de 4 pasos para el ciclado de fases pero en un espectrómetro dotado de gradientes se reduce a un solo paso; un experimento COSY puede realizarse así en pocos minutos (5-10 min.) El espectro COSY presenta, además de los picos sobre la diagonal, picos fuera de la diagonal y distribuidos simétricamente respecto a ésta, conocidos como picos de cruce, que son consecuencia de la transferencia de coherencia entre espines acoplados escalarmente.

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90º

COSY

90º

te t2

Figura III.10.4: Esquema de pulsos de un experimento tipo COSY. En los espectros monodimensionales, bajo circunstancias normales, todos los picos tienen la misma fase y podemos ajustarla para que todos aparezcan en modo de pura absorción; sin embargo mediante el formalismo de los operadores producto puede demostrarse fácilmente que las fases de los picos de la diagonal y de los picos de cruce del COSY deben siempre diferir en 90º. La consecuencia inmediata es que ambos picos tienen formas distintas y disponemos de dos opciones, ajustar la fase para que los picos de cruce aparezcan en modo absorción y los picos de la diagonal en dispersión, o viceversa. Dado que los picos de cruce son los más informativos lo usual es optar por la primera opción. Así la forma que presentan los dos tipos de picos se muestra en la Figura III.10.5 en una representación pseudo 3D y como mapa de contornos. En sus comienzos y para experimentos de rutina los espectros COSY se representan en modo de valor absoluto suprimiendo la información asociada a los signos deliberadamente; para un análisis detallado del espectro es aconsejable preservar esta información y cuando así se hace se usa el término COSY sensible a la fase. Para ilustrar estas características consideremos el esquema del espectro COSY sensible a la fase para un sistema de dos espines, débilmente acoplados; que se muestra en la Figura III.10.6. Transiciones dentro del mismo multiplete, a las que llamaremos paralelas, no producen desplazamiento de fase; las transiciones entre multipletes, a las que llamaremos conectadas, producen desplazamientos de fase de  90º . Una vez ajustada la

fase, los picos de cruce, que provienen de las transiciones conectadas, forman dos pares de picos de signo contrario en los vértices de un cuadrado que llamamos multiplete en antifase. Los picos sobre o cerca de la diagonal, que provienen de magnetización no

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transferida o de transiciones paralelas, tienen la forma dispersiva indicada en la Figura III.10.5-B.

A

B

Figura III.10.5: A: Pico en modo absorción; perspectiva 3D a la izquierda y mapa de contorno a la derecha. B: Pico en modo dispersión; perspectiva 3D a la izquierda y mapa de contorno a la derecha donde las líneas de trazo discontinuo corresponden a valores negativos.

El propósito que generalmente se persigue con un COSY sensible a la fase es medir las constantes de acoplamiento directamente de los picos de cruce. En moléculas muy complejas donde se solapan fuertemente los picos, esta tarea no es fácil; especialmente en aquellos picos de cruce que están cerca de la diagonal, pues dado el carácter dispersivo de los picos en la diagonal sus extendidas colas hacen muy difícil observar tales picos. Otro problema importante es la cancelación mutua de picos cuando su anchura es del mismo orden de magnitud que las constantes de acoplamiento; esto ocurre tanto en señales en fase como en señales antifase, aunque es mucho más marcada en el segundo caso. Si la anchura de línea es suficientemente grande la cancelación incrementa aparentemente la separación entre líneas espectrales y puede disminuir la amplitud de los picos de cruce hasta confundirlos con el ruido. En general hay una gran diferencia de intensidades entre las señales de la diagonal y de los picos de cruce.

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A

B

C

Figura III.10.6: A: Esquema de un espectro COSY sensible a la fase de un sistema de dos espines IS acoplados, con los picos de la diagonal en modo dispersión y los picos de cruce en modo absorción. Los cíirculos rellenos y huecos representan picos positivos y negativos, respectivamente. Los dobletes en modo dispersión de los picos de la diagonal estan representados por los triangulos rellenos y huecos. B: Esquema de una sección transversal, paralela al eje F2 mostrando un doblete sobre la diagonal (Izquierda) en modo dispersión y un doblete de un pico de cruce en modo absorción(derecha).C: Estructuras multiplete de los picos de cruce de los sistemas de espín de 1H AX, AMX, A3X, y A3MX. Los círculos rellenos representan señales positivas y los círculos huecos señales negativas. El área de los círculos es proporcional a la intensidad de los picos. Los acoplamientos se 188indican con corchetes (Figura extraida del libro “NMR of Proteins and Nucleic Acids” de Kart Wüthrich. Ed. John Wiley & Sons).

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Figura III.10.6_2. Espectro 1H COSY de una disolución en D2O del inhibidor K de proteasa, a una concentración 0.01M, pD = 3.4 y 25 ºC. Representación de espectros apilados (Figura extraida del libro “NMR of Proteins and Nucleic Acids” de Kart Wüthrich. Ed. John Wiley & Sons).

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COSY con filtro de doble cuanto o DQF-COSY: Es una variante del COSY que

se caracteriza por presentar tanto los picos de cruce como los de la diagonal en forma de absorción en antifase, eliminando de esta forma el inconveniente derivado de las “colas” dispersivas y disminuyendo la diferencia de intensidad entre los dos tipos de señales. La secuencia de pulsos para el DQF-COSY está esquematizada en la Figura III.10.7, donde apreciamos que un tercer pulso sigue inmediatamente a la secuencia convencional después de un pequeño (pocos s ) retardo.

90º

DQF-COSY

90º 90º

t1



Figura III.10.7: Secuencia de pulsos para COSY con filtro de doble cuanto (DQF-COSY).

El DQF-COSY es una técnica sensible a la fase. La secuencia de pulsos crea momentáneamente coherencia de doble cuanto y la transforma en coherencia observable de simple cuanto con el último pulso. Un ciclado de fases de 8 pasos cancela la magnetización que no sigue la ruta adecuada, no obstante si el espectrómetro dispone de gradientes solo será necesaria una etapa.

TOCSY: Es la abreviatura de “TOtal Correlation SpectroscopY”. El TOCSY con

bloqueo anisotrópico de espines se llamó inicialmente experimento HOHAHA, abreviatura de “HOmonuclear HArtmann HAhn”; hoy TOCSY y HOHAHA se usan como sinónimos (Braunschweiter & Ernst, 1983; Bax & Davies, 1985). La principal aplicación del TOCSY, como la del COSY y sus variantes, es la asignación de protones en moléculas orgánicas y/o biopolímeros; sin embargo los mecanismos de transferencia de coherencia en uno y otro caso son completamente

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diferentes y el primero presenta ventajas respecto al segundo, especialmente porque consigue la transferencia de coherencia homonuclear en fase de todo un sistema de espines, facilitando notablemente la asignación de señales que provienen de un mismo sistema de espines. La secuencia de pulsos comienza, como en otros experimentos bidimensionales, con un pulso de 90º para crear magnetización transversal que evoluciona durante el tiempo variable t1. Como en los otros experimentos entre el periodo de evolución y el periodo de detección hay un periodo de mezcla para transferir coherencia, pero en este caso consiste en un tren de pulsos formando una serie repetitiva de pulsos de elevada potencia con determinadas longitudes y fases (MLEV-17,WALTZ16, DIPSI-2), ver Figura III.10.8.

TOCSY/HOHAHA 90º

t1

Secuencia de bloqueo de espines

t2

Figura III.10.8: Secuencia de pulsos para TOCSY/HOHAHA con un tren de pulsos.

El objetivo principal de este tren de pulsos es convertir un sistema de espines débilmente acoplados en un sistema de espines fuertemente acoplados, situación que se conoce por bloqueo de espines. Bajo estas condiciones las diferencias en los desplazamientos químicos se hacen

insignificantes, el acoplamiento escalar domina el proceso y la coherencia de un espín está “en resonancia” con la de los otros espines del sistema (incluso con aquellos que no están directamente acoplados) y la magnetización se comporta como la de un sistema de espines fuertemente acoplados que evoluciona como un “espín colectivo”. Hay dos tipos de bloqueo de espín, isotropico y anisotropico. El bloqueo de espín isotropico (WALTZ o MLEV16) permite transferir todos los componentes de la magnetización, así para un sistema de dos espines 1 y 2 las transferencias posibles son: I1X  I 2 X ; I1Y  I 2 Y ; I1Z  I 2 Z . Ernst y Braunschweiter

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demostraron que es posible conseguir que toda la magnetización de un espín se convierta periódicamente en magnetización de un segundo espín, si ambos están escalarmente acoplados y bajo condiciones de mezcla isotropica, de ahí el nombre que recibe este experimento; en sistemas reales con más de dos espines acoplados la transferencia completa no es posible y la magnetización se distribuye por todo el sistema de espines. Como al final del periodo de evolución hay componentes de la magnetización en modo de absorción y en modo dispersión, esta modalidad de bloqueo de espines incluye importantes contribuciones dispersivas. Como consecuencia, actualmente sólo se utilizan secuencias de bloqueo anisotropicas (MLEV-17, DIPSI) que sólo transfieren una componente transversal y la componente Z, así para un sistema de dos espines, por ejemplo: I1X  I 2 X ; I1Z  I 2 Z . Los picos de cruzamiento presentan una alta proporción del modo absorción aunque con una contribución pequeña del modo dispersión. III.10.4 Los experimentos bidimensionales de correlación dipolar: NOESY (“Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY”) y ROESY (“Rotating frame Overhauser Effect SpectroscopY”). Espectroscopía de efecto nuclear Overhauser, NOESY:

Como su propio nombre indica esta técnica de RMN está basada en el efecto NOE anteriormente explicado, es decir, se fundamenta en procesos de relajación a través de interacción dipolar directa de los espines nucleares (Macura & Ernst, 1980). Juega un papel muy importante en la determinación de estructuras tridimensionales por RMN porque en este tipo de experimentos se obtiene información acerca de las distancias entre protones próximos en el espacio (Neuhaus & Wilianson, 1989). La secuencia de pulsos básica consiste en tres pulsos de 90º y está incluida en la Figura III.10.3. El proceso puede describirse cualitativamente mediante un sencillo modelo vectorial, esquematizado en la Figura III.10.9 para un sistema con tres espines I, J y K con diferentes desplazamientos químicos y con acoplamiento dipolar directo (a través del espacio). El primer pulso de 90º convierte la magnetización longitudinal de equilibrio M0 en magnetización transversal sobre el eje Y. Durante el tiempo de evolución cada espín precesiona a su frecuencia de Larmor (su “offset” en el sistema de coordenadas giratorio), así el segundo pulso de 90º, al final del periodo de evolución, generará magnetización longitudinal diferente para cada espín, en proporción a la correspondiente componente sobre el eje Y en el instante de aplicar el pulso. La población de estados justo después del pulso será diferente de la

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distribución de Boltzmann de equilibrio, así, durante el periodo de mezcla el sistema sufrirá un doble proceso de relajación por interacción con el entorno y por interacción dipolar directa con otros núcleos cercanos; este último, que es el fundamento del NOE, recibe el nombre de relajación cruzada. El tiempo de mezcla concluye con el tercer pulso de 90º que convierte la magnetización longitudinal existente en el momento de aplicar este último pulso en magnetización transversal observable.

z

z

z x

J

M0 y

y x

     2 X

K

I

t1

x      2 X

z

z

Relajación cruzada

z K

M y x

     2 X

y

J

y tm

x

x

y I

Figura III.10.9: Representación vectorial del comportamiento de un sistema de tres espines I, J y K con interacción dipolar mutua en el sistema de coordenadas giratorio. En el esquema superior-derecha, por simplicidad, solamente se han dibujado las proyecciones sobre el plano XY de los vectores magnetización individuales y en el esquema inferior-derecha solamente se han dibujado las componentes longitudinales que aparecen al girar 90º sobre el eje X las proyecciones de los vectores magnetización individuales sobre el eje Y.

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La intensidad de la señal asociada a un núcleo I que experimenta un proceso de relajación cruzada con otro núcleo S estará modulada por los cambios en la magnetización longitudinal de este último. Por consiguiente, la intensidad del pico a la frecuencia

I (dominio temporal t2) en función del tiempo de evolución t1 presentará una amplitud modulada a la frecuencia S , y existirá un pico de cruzamiento a las frecuencias ( I , S ) en el espectro bidimensional. El volumen de este pico proporciona información cuantitativa sobre la velocidad del proceso de relajación cruzada de la que se puede deducir información sobre la distancia que separa ambos núcleos. La secuencia de pulsos en NOESY produce coherencias que no están relacionadas directamente con el efecto NOE y la discriminación ha de realizarse con un ciclado de fases adecuado. Desafortunadamente la transición de cuanto cero en COSY comparte la misma ruta de coherencia y no es posible cancelarla con ciclos de fase; no obstante, obteniendo el espectro sensible a la fase la contribución del COSY a la integración de los picos de cruzamiento debe idealmente anularse debido a su naturaleza antifase. El experimento ROESY (Rotating frame Overhauser Effect SpectroscopY) (Bax

& Davies, 1985b) El ROESY es un experimento diseñado para obtener, como el NOESY, información sobre distancias entre núcleos. Está basada en el ROE que consiste en NOE en los ejes de referencia rotatorios. La secuencia de pulsos es casi idéntica a la del TOCSY, así para evitar los artefactos TOCSY se reduce la potencia usada para lograr el bloqueo de los espines y se aumenta el periodo de mezcla. En el experimento ROESY la relajación de los espines no ocurre en el campo estático B0 a lo largo del eje z, sino en el campo transversal generado por la secuencia de pulsos de radiofrecuencia que producen el bloqueo de los espines; es decir, en el proceso de relajación la magnetización transversal de un espín se convierte en magnetización transversal de espines vecinos por relajación cruzada mientras están bajo el campo de bloqueo de espines. Las características del ROESY en comparación con el NOESY pueden resumirse en los siguientes puntos: -

Mientras que los NOEs dependen fuertemente del tiempo de correlación, anulándose para 0  C  1 , los ROEs presentan una débil dependencia.

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-

Los picos de cruzamiento NOESY tienen el mismo signo u opuesto a los picos de la diagonal, para NOEs negativos y positivos, respectivamente; sin embargo los ROEs son siempre positivos y como consecuencia lo picos de cruzamiento y los de la diagonal son siempre de signo contrario.

-

En NOESY los picos que provienen del intercambio químico tienen el mismo signo que la diagonal y como consecuencia son indistinguibles de los NOEs negativos. En ROESY los picos del intercambio químico tienen el mismo signo que la diagonal y se distinguen fácilmente de los ROEs positivos.

-

Mientras que no hay efectos de “offset” (desplazamiento de la línea base sobre cero) en NOESY en ROESY el “offset” siempre tiene que corregirse para integrar picos.

-

No hay contribución ROESY en NOESY pero si aparecen interferencias NOE en ROE (excepto cuando se cumple 0  C  1 )

-

La integración de los picos NOESY no está afectada por contribuciones TOCSY de los acoplamientos escalares, sin embargo no podemos decir lo mismo de los picos ROESY con el resultado de posibles errores en las distancias.

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Apéndice: El sistema de coordenadas rotatorio.

Las ecuaciones de Bloch, y por consiguiente la visualización del movimiento de precesión de la magnetización en torno a un campo magnético que rota y cambia su inclinación a su vez, se simplifican adoptando como sistema de referencia un sistema de ejes ortogonales (x´, y´, z), con el eje z común, que rota respecto al sistema de coordenadas ortogonales que hemos utilizado anteriormente (x, y, z) (al que llamaremos ejes del  laboratorio) a la misma frecuencia angular con que rota la componente B1 ( ) de

radiofrecuencia, frecuencia a la en los sucesivo llamaremos  rf . En este sistema de referencia rotatorio el campo de radiofrecuencia parece estático, pero la magnetización M, que en el sistema de referencia del laboratorio precesiona en torno al eje z a la frecuencia angular  0    B0 , precesiona ahora con una frecuencia angular:    0   rf . Este movimiento correspondería a la precesión de la magnetización con un campo magnético aparente: Bap 







 0   rf  rf  B0   

En el sistema de referencia rotatorio el campo efectivo Bef , en torno al cual precesiona la magnetización, es la suma vectorial de Bap y B1 : B0

B(t)

Bap

Beff

B1

B1

En el Sistema de referencia del laboratorio

En el Sistema de referencia rotatorio

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