Importancia de la Calidad Genetica en Animales de Laboratorio GENETIC SCIENCES & COMPLIANCE ANA V. PEREZ, Ph.D.

Objetivos de la Presentacion-1ra Parte • Quien es Taconic • Que es Calidad Genetica • Por que es importante la calidad Genetica en animales de laboratorio • Animales geneticamente modificados como modelo animal de enfermedades humanas • Ejemplos de generacion de modelos geneticamente modificados – Tecnicas Usadas

© TACONIC BIOSCIENCES

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Taconic Biosciences • Lider Mundial en roedores de laboratorio y servicios cientificos 60 years en 2012 • Proveedor Global de ratas y ratones de alta calidad con el mismo perfil genetico, fenotipico y de salud • Lider Mundial en generar ratones geneticamente modificados

• Lider Mundial en producir camadas de animales geneticamente modificados para estudios de investigacion 3

Historia-Taconic Biosciences • Fundada en 1952 • Primer Productor comercial de animales de laboratorio que obtuvo acreditacion AALAC1969 • Primer Productor Commercial que implemento la Barrera de aislamiento en 1981 para mantener los animales de laboratorio con los mas altos niveles de Bioseguridad • Proveedor de servicios de crianza a pedidos del cientifico investigador desde 1995 • Adquisicion de nuestra subsidiaria en Colonia, Alemania 2007– Lider en diseno y generacion de animales rodeores geneticamente modificados © TACONIC BIOSCIENCES

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Taconic Biosciences • Compania Privada – >600 empleados mundialmente – Produciion de mas de 200,000 cajas – AAALACi, ISO 9001+ ISO 14001 (TacBio-DK+ TacBio DE)

• Expertos Cientificos – Veterinarios certificados, Microbiologos, Biologos Moleculares, Embriologos, Genetistas, Patologo veterinario, Biologo Celular

• Clientes – Companias Framaceuticas, Companias de Biotecnologia, Universidades, y Organizaciones Gubernamentales 5

Presencia Global Albany, NY

Ejby, Denmark

Hudson, NY

Bomholt, Denmark

Germantown, NY

Borup, Denmark Laven, Denmark

Tokyo, Japan

Oxnard, CA

Cologne, Germany Chungbuk, South Korea Cambridge City, IN

Gyeonggi-do, South Korea Hyderabad, India Centros, Singapore

Taconic Biosciences

Distribuidores

Importancia de la Calidad Genetica Calidad Genetica

Pureza Validez

Reproducibilidad

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“Scientists go to tremendous lengths to ensure that reagents are pure and the glassware is clean. They should pay equal attention to the purity of the animals they use.” - Festing Lab Animal 1974

“In animal research validity and reproducibility are critically influenced by three important variables: genetic background, physical environment, microbial status…” - Lab An Sci 1998

“Do scientists, veterinarians, animal care personnel and facility managers know that the specific strains of research animals they develop, use, care for and house are genetically sound and truly representative of their assumed genotype or genetic background?” - Mam Genome 2013 (ICLAS)

Ratones y Ratas Consanguineos o Endogamicos • Apareamiento hermano x hermana por 20 generaciones • Todos los genes alelos son homozygotos • No hay segregacion de genes de manera que la siguiente generacion es equivalente a la anterior • Cada cepa es aproximadamente copia multiple de un solo individuo. Cada cepa tiene caracteristicas definidas

– C57BL/6, FVB, 129S6, etc

Colonias Heterogeneas – Apareamientos No consanguineos • Outbred Stocks • Maxima variedad genetica – Tamano deseables, pesos, fecundidad, etc. – A veces se desarrolla el fenotipo not observado en una cepa consanguinea – Permite el mantenimiento de mutaciones que produce un efecto severo en cepas consanguineas

•

Maxima heterogeneidad por alelo – Segregacion de alelos – Pequenas colonias de exogmicos se tienen que reemplazar frecuentemente – Derivaciones pueden ocacionar deriva genica – Monitoreo genetico consiste en chequear la frecuencia de alelos*

Inbred Genetic Background

C57BL/6NTac aaBBCCDDPP

DBA/2JBomTac aabbCCddPP

129S6/SvEvTac AwAwBBCCDDPP

A/a = Agouti locus (a; Chr 2) (banded black/yellow [A] vs. black [a] vs. white-bellied [Aw]) B/b = brown locus (Tyrp1; Chr 4) (black vs. brown pigment)

C/c = albino locus (Tyr; Chr 7) (pigment vs. no pigment) D/d = dilute locus (Myo5a; Chr 9) (intense pigment vs. diluted pigment) P/p = pinked-eyed dilution locus (p; Chr 7)

Cual es el Color de Fenotipo que estos genotipos representan

129S6/SvEvTac

C57BL/6NTac DBA/2JBomTac

Genotipo aaBBCCDDPP

Genotipo

Genotipo AwAwBBCCDDPP

aabbCCddPP

Fenotipo BLACK

Fenotipo DILUTE BROWN

Fenotipo AGOUTI

0

Taconic -G. Bothe et al. 2005

129P3/J 129S1/SvlmJ 129S6/SvEvTac 129T2/SvEmsJ 129X1/SvJ A/JCrTac B6129F1Tac BALB/cAnNTac C3H/HeNTac C57BL/6J C57BL/6NTac DBA/2NTac FVB/NTac NOD/MrKTac SJL/JCrNTac

Total Distance (cm)

Open Field Activity (first exposure) 3500

3000

2500

2000 F

1500 M

1000

500

Nomenclatura B6.SJL-Ptprca/BoyAiTac

Subcepa Inbred Partner

Linea Congenica

Donador Gen de Interes

Por que la Integridad Genetica es importante?

Impuridades geneticas o Deriva Genica pueden arruinar un estudio costando innecesario tiempo y dinero…..y tu ni te das cuenta

1 4

Que es Monitoreo Genetico? • Monitoreo Genetico es un programa de pruebas geneticas establecido como manera de verificar que la produccion de animales es de la cepa deseada y del genotipo correcto

Cual es el raton C3H?

• Monitoreo Genetico en Taconic es ejecutado de una de las siguientes maneras dependiendo del modelo animal – Verificacion del genotipo-verificar la presencia de la mutacion deseada – Verificacion de la Cepa – Observando o ensayando el fenotipo

Verificacion de Cepas – Tecnicas usadas • Pruebas Bioquimicas – Pruebas proteicas • ADN de Microsatelite

• Polimorfismo de Nucleotido – Single Nucleotide Polymorphisms or SNPs

Genetic Markers from Tissue Proteins“Biochemical Polymorphisms”

Jorde et al, 1995 “Medical Genetics”

Genetic Markers from Tissue Proteins“Biochemical Polymorphisms”

Electric field

+

-

Historically, RTI has tested 19 such proteins from blood and kidney for mic

Panel de Marcadores GeneticosBioquimicos E Car

Marker

Es 2

Acy1

s H6p d Es3

1

Hb

Idh b

d Gpi1

Pep 1 Ldr1

Mod1

Gg

Mpi

c Pgm1

Pn 1

c Gus-s

Sod p

Tr 1

Strain 129S6/SvEvTac

s

a

b

b

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c

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a

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A/JCrTac

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BALB/cAnNTac

s

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C57BL/6NTac

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C3H/HeNTac

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DBA/2NTac

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FVB/NTac

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NOD/MrkTac

s

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b

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NZM/AegTac

s

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b

b

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a

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SJL/JCrNTac

s

b

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a

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b

a

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b

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CBA/JBom

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DBA/1JBom

s

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a

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a

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b

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a

b

ADN y Cromosomas

…TGCTAGCTGTACGTACTGAC…..

Specific PCR primers based on known gene sequence

Encoded information for a specific function Jorde et al, 1995 “Medical Genetics”

PCR-Reaccion en Cadena de Polimerasa

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Microsatelite de ADN • ADN microsatelites – – – –

Segments cortos de DNA con una sequencis repetitiva La longitud de la sequencia repetitiva varia de cepa a cepa Es un poco inestable con una tasa de mutacion un poco alta Presenta problemas de ensayo cuando se amplifica, presenta problemas tecnicos – Es dificil de correr un ensayo con cientos de muestras

Marcadores Geneticos- Microsatelite de ADN

Polimorfismos de Nucleotidos • Single Nucleotide Polymorphisms or SNPs – Son variaciones en la secuencia del ADN que ocurre cuando un unico nucleotido es alterado (A,T,C,or G) en el genoma – Es mas estable que los microsatelites – Se pueden correr muestras en el orden de los miles AAGGCTAA ACGGCTAA

to

– Un Panel de SNPs nos permite diferenciar claramente las cepas

Caracterizacion del Fondo Genetico Name

Chr

129S6 C57BL/6NTac 1

Index1245

16

BB

BB

Index1246

16

AA

Index1247

16

Index1248

2

3

4

5

7

8

9

BB BB

BB

BB

BB

BB

BB

BB

BB

BB BB

BB

AB

BB

AB

BB

BB

AA

BB

BB BB

BB

BB

BB

BB

BB

BB

16

AA

BB

BB BB

BB

BB

BB

BB

BB

BB

Index1249

16

AA

BB

BB BB

BB

BB

BB

BB

BB

BB

Index1250

16

AA

BB

BB AB

BB

AB

BB

AB

BB

AB

Index1251

16

BB

AA

AA AB

AA

AB

AA

AB

AA

AB

Index1252

16

BB

BB

BB BB

BB

BB

BB

BB

BB

BB

Index1253

16

BB

AA

AA AA

AA

AA

AA

AA

AA

AA

Index1254

16

AA

BB

BB AB

BB

AB

BB

AB

BB

AB

Index1255

17

BB

AA

AA AA

AA

AA

AA

AA

AA

AA

Que es Deriva Genica? • Es un Proceso Natural que es el resultado de la replicacion de ADN • Es la acumulacion de mutaciones espontaneas en un organismo a lo largo del tiempo • Deriva Genica se puede fijar en una colonia de ratones/ratas inadvertidamente

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Como Evitar la Deriva Genica • Con Criopreservacion – Proteccion del ADN – Reduccion de riesgo – Extension de la vida Reproductiva de la colonia

• Con Recuperacion de cepas congeladas – Refresco de la colonia – Obtener nuevo Stock

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Objetivos de la Presentacion- 2da Parte • El rol de los animales geneticamente modificados • Importancia del origin del modelo – Como se genero?

• Ejemplos del uso de modelos animales • Modelos de raton humanizados

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Historia de Modelos Animals- Raton • Modelos animales como vehiculos de modelos de enfermedades humanas • Modelos animales para encontrar la medicinacuracion apropiada en humanos • Modelos Animales para entender el mecanismo biologico/metabolico de la enfermedad humana

• Modelos animales para usarlos como vehiculos de produccion de reactivos

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Modelo de Obesidad • En 1950 se publico el primer modelo animal de obesidad en raton – Mutacion genetica recesiva espontanea – No se sabe cual es el gen responsable de la mutacion – Los adultos obesos son esteriles

• En 1995 se publico la mutacion – La mutacion trunca la molecula de Leptina que regula el metabolismo de tejidos

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Modelo Lepob de obesidad • Secrecion y Accion de la Leptina

• Regulacion del metabolismo de tejidos perifericos y funcion de la leptina

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Cual es el origen del Modelo animal Geneticamente modificado que tiene?

• Inyecciones Pronucleares • Recombinacion Homologa • Modelos de gen editacion-CRISPR

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Biologia del Desarrollo

•

En 1950 se publico el primer modelo animal de obesidad en raton – – –

•

Mutacion genetica recesiva espontanea No se sabe cual es el gen responsable de la mutacion Los adultos obesos son esteriles

En 1995 se publico la mutacion –

La mutacion trunca la molecula de Leptina que regula el metabolismo de tejidos

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Origen de Modelos Animales Geneticamente Modificados • En los anos 1960s, Brinster desarrollo el sistema de cultivo in vitro de embriones de raton • En los 1970, Brinster empezo a injectar celulas de teratocarcinomas dentro del blastocisto y obtuvo ratones chimera • En los 1980 Brinster and Palmiter hicieron experimentos para introdujendo ADN en huevos fertilizados de raton y este AND se incorpora este en el genoma del raton • En 1985-Smithies, Bradley, Capecchi lograron generar mutaciones por recombinacion homologa

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Injecciones Pronucleares

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Characteristicas del Animal Transgenico • Insercion del ADN en el genoma es al azar • Integracion del ADN injectado es en el mismo sitio de integracion

• Utiliza para manipular reporteros genes, sobre-expresion, exprsesion de proteinas en tejidos especificos • Nomenclature is: Tg(Prom-YYY)#Zzz Tg(PB-Wnt1)1Hev B6.Cg -Tg(PB-Wnt1)1Hev

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Mutaciones Dirigidas de Recombinacion Homologa

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Caracteristicas del Raton de Mutacion Dirigida • La insercion del ADN en el genoma es por recombinacion homologa, hay homologia entre el ARN injectado y el gen que se quiere mutar y requiere de celulas madre embrionarias • Es un lugar unico de insercion en el genoma • El animal chimaera tiene 2 cepas de raton en un solo especimen (dos genomes)

• La nomenclatura es: YYYtm#Zzz Bmp1tm1Blh B6.Cg –Bmp1tm1Blh

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CRISPR-Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats sgRNA

DNA

SpCas9

DSB

Doble rotura de cadena de ADN

HDR

NHEJ **

Gene/PM

Knockout by frame shift

Knockin Point mutation

Microinjection

mutagenesis Wildtype © TACONIC BIOSCIENCES

Mutant 39

Caracteristicas del Metodo CRISPR • Insercion de la modificacion genetica ocurre por homologia de RNA y DNA- es inicialmente especifica • Ocurre por reparcion de alta fidelidad o recombinacion nohomologa del sistema de reparacion por excision

• Hay off-target integrations y variacion en la secuencia de AND en el lugar de integracion • Se puede utilizar un huevo fertilizado o celulas madre embrionarias

• La nomenclature es: YYYem#Zzz Bmp1em1Blh B6.Cg –Bmp1em1Blh

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CRISPR-Cas9

Haoyi Wang , Hui Yang , Chikdu S. Shivalila , Meelad M. Dawlaty , Albert W. Cheng , Feng Zhang , Rudolf Jaenisch One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering Cell, Volume 153, Issue 4, 2013, 910 - 918

http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2013.04.025

Tiempo de Generacion del Modelo

Como Mantener la Calidad Genetica Sistemas de apareamiento definidos

Mantenimiento de datos de la cepa o Stock

Monitoreo del Fondo Genetico

Verificacion del Genotipo

Evitar Deriva Genica Cuidadoso Diseno Experimental cuando se usa animales geneticamente modificados 4 3

Diseno Experimental cuando se usan animales geneticamente modificados C57BL/6NTac-Tyrtm1Arte

• Mutante de un sola base - G a C, base 369

• Mutante generada sacando un provirus del genoma

C57BL/6NTac-Atm1.1Arte

• Considerar

el fondo genetico

•Verificar que los animales controles del experimento son geneticamente equivalentes

•Verificar todos los alelos presentes 44

Importance del Fondo Genetico cuando se introduce una mutacion

C57BL/6NTac aaBBCCDDPP BLACK Tg(APPSWE)

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129S6/SvEvTac AwAwBBCCDDPP AGOUTI Tg(APPSWE)

Modelo APPSWE Transgenico •

Enfermedad de Alzheimer es un desorden cronico neurodegenerativo caracterizado: – Disminucion progresiva del conocimiento – Perdida de la memoria

•

Acumulacion de proteina beta amyloide cracteristica importante de la patologia

•

APPSWE (Apolipoproteina SWE) es el precursor de la proteina amiloide que contiene la mutacion Sueca (Swedish=SWE) que codifica una doble substitucion de aminoacidos asociada con la suceptibilidad al Alzheimer

•

Este modelo no recapitula completamente la enfermedad de Alzheimer pero se usa para investigar los procesos especificos intracelulares de la enfermedad

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…cont Origin of APPSWE Model • Taconic’s colony was established by transfer of embryos resulting from breeding a hemizygous transgenic male to a C57BL/6NTac female. The resultant male progeny were bred to SJL/JcrNTac females. The model 001349 colony is now maintained by breeding hemizygous transgenic male mice with female B6SJLF1/Tac mice.

• To generate model 002789, mice from Founder Line 2576 were backcrossed sixteen generations (N16) to 129S6. Taconic received stock in September 2003. • The mice were derived by embryo transfer and are maintained by backcrossing hemizygous male mice with 129S6/SvEvTac female mice.

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Caracteristicas del Modelo APPSWE Transgenico • Early and progressive accumulation of beta amyloid and development of plaques • Behavioral deficits that correlate with degree of amyloid deposition • Neuritic dystrophy and altered synaptic efficacy of plaque-associated neurons • No evidence of neuronal loss • Expression of inflammatory mediators by plaque-associated microglial cells and astrocytes • Gender differences in some aspects of physiology and behavior • Age-correlated elevation in brain levels of apoE and cholesterol • Deposition of amyloid in cerebral blood vessel walls

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Beta amyloid expression in APPSWE

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Learning Problems in APPSWE Model

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Diferencias Geneticas que dependen del Fondo Genetico • • • •

Modelo 1349 esta en un background mixto B6;SJL Modelo 2789 esta en la cepa 129S6 En la cepa C57BL/6 la mutacion is letal Pink eyed animals, associated with certain coat colors, and the Pde6brd1 retinal degeneration mutation can cause light sensitivity and/or blindness in some animals. This may impact the results of behavioral testing. • The mixed genetic background of model 001349 can result in pink eyed animals or homozygosity for the Pde6brd1 retinal degeneration mutation. • The 129S6 background of model 002789 does not carry the Pde6brd1 retinal degeneration mutation, and this strain has pigmented eyes.

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Inducible Knockouts via CreER

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Historia de Modelos de Immunodeficiencia • Hasta s.19 -cancer contagioso • 1950’s and 60’s, reconocio que el sistema imunologico tiene un rol en el cancer

• 1968 se descubre el raton desnudo– critico para transplantes de tumor • Raton Scid- Severe combined Immunodeficiencydescubierto en 1983 en Fox Chase Cancer Center

Composicion del Systema Immunologico • Adaptive - B cells produce antibodies. When you are sick once, your body ‘remembers’ the next time and produces more of the specific antibody • Innate - T cells (neutrophils and macrophages) do a lot of the clean up of foreign matter and are non-specific • Immunocompromised is the lack of one or both components of the immune system

Investigacion de Cancer-Oncologia • Xenoinjerto/transplante – Since they can not reject tissue implants, researchers can put human tumors in them

• Tumor Take Rates – High Tumor take rates increase speed of research while reducing number of animals needed

• Study of the infectious disease process – Scid mice

• Autoimmunity

Otros Modelos Immunodeficientes • Roedores Desnudos – carecen de pelo • Nude Mutation: Foxn1nu – Atrofia del crecimiento de pelo y del desarrollo del timo – El timo nunca es colonizado de celulas T progenitoras – Es una proteina de union de ADN que se expresa en piel y timo durante el desarrollo embrionario

• Varios Models – NCr nude, NMRI nude, NIH Swiss, BALB/c, Black 6 – NIH Nude Rat

Rata NIH desnuda • Lower T cell development compared to other vendors with better take rates (as presented by Pfizer researchers at AALAS 2008) • Better suited for imaging studies • Larger tumor endpoints • Longer life • Not always completely ‘nude’

Portafolio de Modelos de Immunodeficiencia • Ratones SCID –Deficientes en Celulas T y B algunos forman anticuerpos incipientes-leaky – Defective recombination of antigen receptor genes – Arrest in T and B lymphocyte development

• Several Genetic Backgrounds – C.B.-17 scid and ICR-scid – NOD scid-reduced NK cells – Scid-beige-NK cell deficient

Importancia del Fondo Genetico en el Modelo SCID • Mutacion SCID – Prkdcscid (Protein Kinase DNA activated catalytic polypeptide) • Endogamico – respuesta consistente • Exogamico – resistente, animal un poco mas grande puede tolerar tumores mas grandes • “Leakiness” de anticuerpos dependera del fondo genetico. Animales “Leaky” producen niveles bajos de anticuerpos noespecificos. De menos leaky a mas leaky: Rag2 ICR/SCID NODSC  CBSCBG CB17SC

Modelo Rag2 KO • Rag 2- Recombinant Activating Gene 2 – B and T lymphocytes present a highly variable region that allows them to recognize different antigens – This variable region is assembled by joining several genes together – This is done by two genes Rag1 and Rag 2

• Generated Rag2 KO model • Fail to generate mature B and T lymphocytes

Immune-Deficient Taconic Transgenic Models™ • Rag2 – Lacks T and B cells

• Pfp – Perforin deficient, impaired NK cell function

• Pfp/Rag2 – T, B and NK cell deficient

• Abb & β2M – MHC class I & II deficient

• CIEA NOG mouse® – Superimmunedeficient

• Jh – B cell deficient

• Stat1 – Immune response to alpha and gamma interferon deficient

• Fcer1g & Fcgr2b – FcγRIII, FcεrI, & FcγRIIβ deficient

CIEA NOG mouse® • Do you routinely have low take rates for certain cell lines or primary tumor types? • Use of a model with superior engraftment rates can result in more successful xenograft studies and reduce your overall animal usage, as well as labor costs

Modelos Humanizados • Modelo animal geneticamente modificado que expresa una proteina humana y/o injertado celulas humanas o combinacion de estas • Estos modelos se estan usando en varias aplicaciones: – – – – – – –

Candidatos de drogas Analysis de proteinas involucradas en metabolismo de drogas Sistema immunologico Hematopoiesis Enfermedades de infeccion Medicina regenerativa Cancer

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Modelos de raton immunodeficientes

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Sistema Immunologico Humanizado • •

Animales geneticamente modificados que sustituyen el gen de raton por humano Animales que poblan el sistema immunologico con celulas madre hematopoieticas o celulas mononucleares de la sangre periferica humana o tejidos fetales humanos

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Conclusiones • La Calidad Genetica es critica para los estudios cientificos y su reproducibilidad • Los Animales geneticamente modificados juegan un papel critico en la investigacion cientifica • La ciencia esta en constante avance y mejoramiento de modelos animales

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PREGUNTAS