ESTUDIO DE LA PROTECCIÓN CON EL ANTÍGENO Fh15 MÁS INMUNOMODULADORES EN OVINOS INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE CON Fasciola hepatica ASSESSMENT OF STUDY WITH Fh15 ANTIGEN AND IMMUNOMODULATORS IN SHEEP EXPERIMENTALLY INFECTED WITH Fasciola hepatica. MORRONDO, P.; ARIAS, M.S.; PEDREIRA, J.; DACAL, V.; VÁZQUEZ, L.; LÓPEZ, C.; DÍEZ-BAÑOS, P.; MARTÍNEZ, A.R.* Parasitología y Enfermedades Parasitarias. Dpto. Patología Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad de Santiago de Compostela. 27002 Lugo. * Dpto. Parasitología. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de Madrid. 28040 Madrid. ABSTRACT The protective efficacy of recombinant (rFh15) antigen from F. hepatica powered with immunomodulators was investigated. Among other parameters, the gain of alive weight and the reduction of flukes were determined. Lambs infected with 100 metacercariae/animal were employed, and divided into 3 groups. G-V (6 animals vaccinated and, subsequently, infected), G-I (lambs infected and non-vaccinated, infection controls) and G-C (3 control animals, non-infected and non-vaccinated). The vaccination was realized with ADAD, delayed delivery system of a water/oil emulsion containing immunomodulators as PAL (Polypodium leucotomos extract) y Qs (Quillaja saponaria extract), inside the water phase emulsified in Montanide 763A. This preparation was administered in two subcutaneous injections with 5 days of interval, in a sequence of 8 and 6 weeks pre-infection; the first application contained only immunomodulators, and the second, in addition, the recombinant (rFh15) antigen of F. hepatica. After infection, the daily gain of weight (grames) in G-I was low (27.33 g), while G-V was very higher (79.83 g) and similar to G-C (83.33 g). All animals were sacrificed 14 weeks post-infection and we verify that the reduction of flukes number in lambs of G-V was 43% than G-I. ADAD system with PAL and Qs immunomodulators and Fh15 antigen to adduce a good information for vaccination strategies against fasciolosis. INTRODUCCIÓN Fasciola hepatica es un trematodo parásito que afecta a la mayoría de los animales de renta (en especial, ovejas, vacas y cabras) y también al hombre, ocasionando importantes pérdidas económicas tanto directas (decomiso de hígados) como indirectas (descenso de la productividad). Aunque se disponen de fármacos eficaces para el tratamiento de la fasciolosis (especialmente el triclabendazol); sin embargo, ya se han señalado problemas de resistencias (Fairweather and Boray, 1999). En la actualidad, se están realizando diversos estudios tendentes a la obtención de vacunas (Ramajo et al., 2001; Almeida et al., 2003; Martínez et al., 2004) y se han propuesto diversos antígenos protectores potenciales frente al trematodo: ácidos grasos ligantes de proteínas (FABP), catepsinas L proteasas (CatL), glutathione S-transferases (GST), hemoglobina, leucinaminopeptidasa (LAP) y una proteína like-saposin (SAP-2) (Hillyer, 2005).

En este estudio, y basándonos fundamentalmente en la ganancia de peso vivo de los animales y en la reducción del número de ejemplares de F. hepatica, se valora la eficacia protectora de un antígeno recombinante (rFh15) de F. hepatica potenciado con inmunomoduladores. MATERIAL Y MÉTODOS Se emplearon 15 corderos de raza gallega, que se trasladaron a las dependencias de la Facultad de Veterinaria cuando tenían 7 semanas de edad y procedían de una granja libre de fasciolosis; además, mediante la realización de los correspondientes análisis coprológicos, se comprobó que los animales no estaban infectados de forma natural por helmintos. Durante toda la experiencia, los corderos se mantuvieron estabulados en el Hospital de la Facultad de Veterinaria de Lugo y se alimentaron con pienso, heno y agua ad libitum. La vacunación se realizó, según el protocolo descrito por Martínez-Fernández et al. (2004), con ADAD, sistema de cesión retardada de una emulsión de agua en aceite, conteniendo como inmunomoduladores PAL (extracto de Polypodium leucotomos) (Anapsos, ASAC Pharmaceutical internacional, Alicante, España) y una saponina Qs (extracto de Quillaja saponaria), en el interior de una fase acuosa emulsificada en un aceite no mineral (Montanide ISA763A, SEPPIC, París, Francia) Este preparado se administró mediante 2 inyecciones subcutáneas con 5 días de intervalo, en las semanas 8 y 6 previas a la infección; la primera aplicación contenía sólo inmunomoduladores y la segunda, además, un antígeno recombinante (rFh15) de F. hepatica. La dosis fue de 300mg de PAL, 150 µg de Qs y 150 µg de Fh15 en volumen final de inyección de 2 ml. La proteína recombinante de 15 kDa de F. hepatica (Fh15) empleada se aisló tras el cribado de una biblioteca lambda gt11 de ADNc de F. hepatica de adultos con suero policlonal monoespecífico anti-Fh12 de conejo (Rodríguez-Pérez et al., 1992). El ADNc se secuenció y la secuencia aminoacídica reveló un marco de lectura abierto que codificaba una proteína de 132 aminoácidos con un peso molecular previsto de 15 kDa, homóloga a una FABP de Schistosoma mansoni (Tendler et al., 1996). Las secuencias que codificaban la proteína Fh15 se amplificó mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y el ADN de rFh15 se clonó en el vector PGEX2TK. La proteína se expresó como una proteína de fusión glutathione S-transferase (GST) de S. japonicum y se purificó por afinidad usando glutathione agarose mediante elución por competición con glutathione reducido. La proteína recombinante Fh15 se obtuvo tras el corte con trombina de la proteína de fusión y finalmente se purificó usando una segunda columna agarosa glutathione (Hillyer, 1995). Los animales se dividieron en 3 grupos: G-V (6 animales vacunados y, posteriormente, infectados); G-I (6 corderos infectados y no vacunados, testigos de la infección) y G-C (3 animales control, no infectados ni vacunados). A cada uno de los corderos de los grupos vacunados (G-V) e infectados (G-I) se les administró por vía oral, utilizando cápsulas de gelatina, 100 metacercarias de F. hepatica que fueron obtenidas en el Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, Porto (Portugal) y se conservaron a 4ºC durante un mes hasta el momento de la infección. Los animales se sacrificaron a las 14 semanas post-infección mediante una inyección intravenosa de Tiobarbital y la necropsia se realizó de acuerdo con Ramajo et al. (2001) y Pérez et al. (2005). Las condiciones de alojamiento y cuidados de los animales se ajustaron a las recomendaciones de la Unión Europea sobre animales de experimentación.

Para calcular la ganancia de peso diaria, los corderos se pesaron al principio de la experiencia, antes de la infección y el día del sacrificio. Una vez realizada la necropsia, los ejemplares de F. hepatica se extrajeron del parénquima, de los conductos biliares principales y de la vesícula biliar según describe Ramajo et al. (2001) y Pérez et al. (2005). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Entre el pequeño número de antígenos nativos y recombinantes que presentan un potencial inmunoprofiláctico frente a la fasciolosis, las proteínas las FABP parecen ser unas de las más útiles (Hillyer, 2005). Éstas constituyen una familia de proteínas citoplasmáticas de bajo peso molecular que oscila entre 14 y 15 kDa y 127-133 kDa que representan el 2-5% de las proteínas citosólicas. En los platelmintos, la ausencia de rutas oxígeno-dependientes necesarias para la síntesis de esteroles y cadenas largas de ácidos grasos, provoca que tengan que obtener estas moléculas de su hospedador. Las FABP parasitarias desempeñan un papel importante en la alimentación celular y el transporte intracelular de los ácidos grasos desde el hospedador para la síntesis de membranas y captación de metabolitos (Esteves et al., 1997). Las FABP se han identificado y usado como vacunas frente a S. mansoni, S. japonicum, Fasciola hepatica, F. hepatica, Echinococcus granulosus y Clonorchis sinensis, (Esteves et al., 1997; Nambi et al., 2005; Lee et al., 2006). Tras el sacrificio de los animales, se comprobó que la reducción del número de fasciolas en los corderos del grupo vacunado fue del 43% respecto a los del grupo infectado; asimismo, se observó que la extensión e intensidad de las lesiones hepáticas era menor en los corderos vacunados que en los infectados. Estos resultados son mejores que los obtenidos por Martínez-Fernández et al. (2004) cuando emplearon el sistema ADAD con otra FABP denominada Fh12 nativa de F. hepatica, puesto que en este caso el porcentaje de reducción de fasciolas fue inferior (24,5%) y no apreciaron una reducción en las lesiones hepáticas. Por el contrario, en ratones infectados experimentalmente con el trematodo, la proteína recombinante Fh15 con adyuvante de Freund demostró un 76% de reducción de fasciolas recogidas (Muro et al., 2001; Casanueva et al., 2001). Por otro lado, experimentos con una FABP de 14 kDa de S. mansoni, con homología con Fh15 revelaron una reducción en el número de fasciolas y de los daños hepáticos en ovejas con fasciolosis (Almeida et al., 2003). En estudios previos, Rodríguez-Pérez et al. (1992) clonaron un gen de F. hepatica que codificaba una FABP y sugirió que podría ser una buena candidata frente a la fasciolosis, sin embargo, en ovejas infectadas por F. hepatica, Ramajo et al. (2001) comprobaron que cuando se usaba este antígeno Fh15 con adyuvante de Freund, no se producía reducción en el número de fasciolas y de las lesiones hepáticas en ovejas, pero había disminución del tamaño de las fasciolas maduras y en el recuento fecal de huevos indicando un efecto antifecundidad. Asimismo, usando cistein proteasas de F. hepatica con adyuvante de Freund se producía un efecto antifecundidad con reducción de la eliminación de huevos pero sin disminución de la carga parasitaria y daños hepáticos (Wijffels et al., 1994).

g/día a lo largo del experimento g/día post-infección

250

200

150

100

50

0 G-C

G-I

G-V

Figura 1.- Ganancia de peso vivo (gramos) en los corderos de los grupos control (GC), infectado (G-I) y vacunado (G-V). Como se observa en la Figura 1, la ganancia de peso (gramos) durante toda la experiencia y, en particular, tras la infección de los animales, fue netamente superior en los corderos del grupo vacunado que en los infectados; asimismo, se comprobó que la ganancia de peso en los corderos vacunados fue similar a la hallada en los controles. Aunque no hemos encontrado trabajos similares con los que poder comparar nuestros resultados, la ganancia de peso vivo en los corderos vacunados resultó similar a la obtenida por otros autores (Richards et al., 1987; Foreyt, 1988; Ramisz et al., 1997) tras la administración de un tratamiento antihelmíntico eficaz en ovinos infectados con F. hepatica. CONCLUSIONES 1ª.- El sistema ADAD con inmunomoduladores PAL + Qs y antígeno rFh15 aporta buena información para poder avanzar en las estrategias de vacunación frente a fasciolosis. 2ª.- La vacunación con antígeno recombinante Fh15 asociado a inmomoduladores reduce el número de ejemplares que se desarrollan a adultos y en los animales no se observa reducción de la ganancia de peso vivo, por lo que consideramos que produce una relativa protección frente a las infecciones por F. heptica. AGRADECIMIENTOS Al Ministerio de Ciencia y Tecnología de España por la concesión del Proyecto de Investigación (AGL-2000-0039), con el que se ha financiado este estudio.

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