INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

TÍTULO “CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE AISLAMIENTOS DEL VIRUS DE LA TRISTEZA DE LOS CÍTRICOS DEL NORESTE DE MÉXICO”

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

PRESENTA ING. CÉSAR GERMÁN SALAZAR VÁZQUEZ

Agosto 2002

Cd. Reynosa, Tamps. México.

El presente trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal I del Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección del Dr. Alberto Mendoza Herrera

DEDICATORIA

Esta tesis se la dedico a Dios nuestro Señor por dejarme vivir, a mi madre Sra. Teresa Vázquez Dueñas por darme la vida y por su apoyo incondicional. A mis hermanos que siempre me apoyaron y a todos mis amigos por su apoyo y sus consejos, especialmente a Nena, Susana, Elma, Alonso y Haydé que la quiero muchísimo y más que ser mi amiga es mi hermana.

IV

AGRADECIMIENTOS ¾ Al Dr. Alberto Mendoza Herrera y al Dr. Omar G. Alvarado Gómez por su apoyo y asesoría para llevar a cabo este proyecto y terminación del mismo. ¾ A la Dra. Ana María Sifuentes por su apoyo y consejos durante el desarrollo del trabajo. ¾ Al Centro de Biotecnología Genómica (CBG-IPN), por su apoyo para llevar a cabo mi maestría y el proyecto de investigación. ¾ Al Sistema de Investigación Alfonso Reyes (SIREYES), por su apoyo de Becas en el transcurso de mi maestría. ¾ Al Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI-IPN), por su apoyo de Becas en el transcurso de mi maestría. ¾ A la SAGARPA por su apoyo para realización del presente trabajo ¾ A todos mis amigos y compañeros que contribuyeron directa o indirectamente en mi formación académica, además de su comprensión y consejos.

V

CONTENIDO Página CONTENIDO............................................................................................................

I

DEDICATORIA........................................................................................................

IV

AGRADECIMIENTOS............................................................................................

V

LISTA DE CUADROS.............................................................................................

VI

LISTA DE FIGURAS...............................................................................................

VII

ABREVIATURAS.....................................................................................................

IX

RESUMEN.................................................................................................................

XI

1. INTRODUCCIÓN...............................................................................................

1

2. ANTECEDENTES..............................................................................................

3

2.1. Importancia económica de los cítricos..........................................................

3

2.2. Virus de la Tristeza de los Cítricos (VTC)....................................................

3

2.2.1. Sintomatología...................................................................................

4

2.2.2. Características del VTC.....................................................................

5

2.2.3. Diversidad genética............................................................................

6

2.2.4. Diseminación......................................................................................

8

2.2.5. Genoma viral: características del gen de la cápside (p25).................

9

2.2.6. Genoma viral: características de la región 5´ terminal (5´UTR)........

10

2.3. Técnicas basadas en PCR para la diferenciación de aislamientos de VTC..

11

2.3.1. Polimorfismos Conformacionales de Cadena Sencilla (SSCP).........

11

2.3.2. Polimorfismos en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP)...............................................................................................

12

3. JUSTIFICACIÓN...............................................................................................

14

4. OBJETIVOS........................................................................................................

15

I

5. MATERIALES Y MÉTODOS...........................................................................

16

5.1. Procedencia de los Reactivos........................................................................

16

5.2. Material Biológico........................................................................................

16

5.3. Extracción del RNA viral..............................................................................

17

5.3.1. Determinación de la calidad del RNA................................................

18

5.4. Diseño de Oligonucleótidos..........................................................................

18

5.5. Obtención de los productos del gen p25 y región 5´ terminal por RT-PCR

20

5.5.1. Retrotranscripción..............................................................................

20

5.5.2. Amplificación de los productos (PCR)..............................................

20

5.6. Electroforesis en geles de agarosa................................................................

20

5.7. Purificación de productos amplificados.......................................................

21

5.8. Análisis de Polimorfismos Conformacionales de Cadena Sencilla (SSCP)

21

5.8.1. Desnaturalización de fragmentos amplificados.................................

21

5.8.2. Tinción de geles de poliacrilamida con nitrato de plata.....................

22

5.9. Análisis de Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP)........................................................................................................

22

5.10. Clonación, transformación y secuenciación...............................................

23

5.10.1. Ligación...........................................................................................

23

5.10.2. Transformación...............................................................................

24

5.10.3. Selección de recombinantes............................................................

24

5.10.4. Extracción del DNA plasmídico.....................................................

25

5.10.5. Caracterización enzimática.............................................................

26

5.10.6. Secuenciación de las clonas...........................................................

26

5.11. Análisis Bioinformático..............................................................................

26

5.11.1. Análisis de las secuencias..............................................................

26

5.11.2. Alineamiento de secuencias...........................................................

27

6. RESULTADOS....................................................................................................

28

6.1. Extracción del RNA viral..............................................................................

28

6.1.1. Calidad del RNA.................................................................................

29

II

6.2. Amplificación del gen p25 que codifica para la cápside...............................

29

6.3. Amplificación de la región 5´ terminal (5´UTR)..........................................

30

6.4. Purificación de productos amplificados por la PCR.....................................

31

6.5. Análisis de Polimorfismos Conformacionales de Cadena Sencilla (SSCP).

32

6.6. Análisis de Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP)...........................................................................................................

33

6.6.1. Análisis con Alu I................................................................................

33

6.6.2. Análisis con otras endonucleasas de restricción.................................

35

6.6.2.1. Determinación del tipo de raza del VTC..........................................

35

6.6.2.2. Determinación de la sintomatología de las razas severas del VTC.

36

6.7. Clonación molecular de productos amplificados..........................................

39

6.7.1. Ligación...............................................................................................

39

6.7.2. Transformación...................................................................................

40

6.7.3. Selección de recombinantes................................................................

40

6.7.4. Extracción del DNA plasmídico.........................................................

41

6.7.5. Caracterización enzimática con Eco RI..............................................

41

6.8. Análisis de secuencias...................................................................................

42

6.8.1. Región no codificante 5’ terminal (5´UTR)........................................

42

6.8.2. Análisis de las secuencias del gen p25 (cápside)................................

45

7. DISCUSION...................................................................................................

50

8. CONCLUSIONES.........................................................................................

59

9. REFERENCIAS............................................................................................

60

10. GLOSARIO.................................................................................................

68

III

ABREVIATURAS

o

C

Grados centígrados

DNAc

Ácido desoxiribonucleico complementario

DNA

Ácido desoxiribonucleico

dNTP´s

Desoxirribonucleósidos trifosfatados

EDTA

Ácido- etilen-diamino- tetra-acético

Fig.

Figura

g

Gramos

h

Horas

IPTG

Isopropil-beta-D-thiogalactopiranósido

LB

Medio de cultivo Luria-Bertani

M

Marcador de peso molecular

M-MLV

Transcriptasa inversa obtenida del virus de la Leucemia Murina de Moloney

ml

Mililitro

min

Minutos

mM

Milimolar

ng

Nanogramo

PCR

Reacción en Cadena de la Polimerasa

IX

pb

Pares de bases

pH

Potencial de hidrógeno

RFLP

Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción

rpm

Revoluciones por minuto

RNA

Ácido ribonucleico

RT

Reverso transcripción

SDS

Dodecil sulfato de sodio

SSCP

Polimorfismos Conformacionales de Cadena Sencilla

Taq

DNA polimerasa de Thermus aquaticus

µg

Microgramo

µl

Microlitro

UV

Ultravioleta

VTC

Virus de la Tristeza de los Cítricos

X-gal

5-Bromo-4-cloro-3-indolil-beta-Dgalactopiranósido

X

LISTA DE CUADROS

Página Distribución de los aislamientos del VTC estudiados y del control positivo (+)....................................................................

17

Cuadro 2.

Descripción de oligonucleótidos utilizados en las PCRs..........

19

Cuadro 3.

Determinación de la concentración y calidad del RNA total....

29

Cuadro 4.

Amplificación de la región 5´(UTR) con los diferentes oliginucleótidos.........................................................................

31

Presencia de sitios de reconocimiento Hae III y Kpn I en aislamientos débiles del VTC....................................................

38

Presencia de sitios de reconocimiento Hae III y Kpn I en aislamientos severos del VTC...................................................

39

Cuadro 1.

Cuadro 5.

Cuadro 6.

Cuadro 7.

Comparación de la región 5´ terminal (5´UTR) de los aislamientos CBG-H33 y CBG-T2, con secuencias de razas débiles y severas........................................................................

Cuadro 8.

45

Comparación del gen p25 (cápside) de los aislamientos CBGNL1, CBG-NL2, CBG-V1, CBG-V2 y CBG-T2 con secuencias de razas débiles y severas........................................

49

VI

LISTA DE FIGURAS

Página Síntomas causados por aislamientos severos del virus de la tristeza de los cítricos en hospederos susceptibles..........................................

5

Figura 2.

Microfotografía electrónica del VTC.................................................

6

Figura 3.

Organización genómica del VTC.......................................................

6

Figura 4.

Áfido vector del VTC y distribución de la virosis en México............

9

Figura 5.

Representación esquemática del diseño de oligonucleótidos.............

19

Figura 6.

Extracción de RNA total a partir de tejido vegetal.............................

28

Figura 7.

Amplificación del gen p25 del VTC...................................................

30

Figura 8.

Amplificación de la región 5´ terminal (5ÚTR) del aislamiento T2

Figura 1.

del VTC utilizando diferentes oligonucleótidos.................................

31

Figura 9.

Purificación de productos DNAc amplificados por la PCR...............

32

Figura 10.

SSCP de los productos amplificados por la RT-PCR del gen p25 (cápside)..............................................................................................

32

Figura 11.

Perfil de RFLP del gen p25 con la enzima Alu I. ..............................

34

Figura 12.

Análisis por dendograma.................................................................... .

35

Figura 13.

Perfil de RFLP del gen p25 con la enzima Hae III............................

36

VII

Figura 14.

Perfil de RFLP del gen p25 con la enzima de restricción Kpn I........

Figura 15.

Tamizaje por PCR de la región 5´ terminal del aislamiento H33

37

(testigo positivo).................................................................................

40

Figura 16.

Extracción de DNA plasmídico del aislamiento V2...........................

41

Figura 17.

Digestión enzimática con la enzima de restricción Eco RI................

42

Figura 18.

Alineamiento múltiple de la región 5´ terminal (5´UTR) de los aislamientos CBG-H33 y CBG-T2 contra las razas de referencia del VTC..............................................................................................

Figura 19.

43

Dendograma mostrando la relación de diferentes aislamientos del VTC mediante un análisis computacional de las secuencias nucleotídicas de la región 5´ terminal (5´UTR)..................................

44

Alineamiento múltiple de secuencias aminoacídicas de 4 aislamientos de Nuevo León y Veracruz............................................

46

Figura 21.

Alineamiento múltiple de secuencias de aminoácidos del gen p25....

47

Figura 22.

Dendograma mostrando la relación de diferentes aislamientos del VTC mediante un análisis computacional de las secuencias aminoacídicas del gen que codifica para la cápside...........................

48

Figura 20.

VIII

RESUMEN

La tristeza de los cítricos, es la enfermedad viral más importante de los cítricos a nivel mundial. Esto queda demostrado por la pérdida de más de 40 millones de árboles entre los años 1930-1980 en América del Sur, California, Florida (E.U.), Israel y España. El agente causal (VTC), se transmite principalmente por el áfido Toxoptera citricida y por material vegetativo infectado (injertos). Uno de los efectos más visibles ocasionados por el VTC es un declinamiento rápido y muerte de árboles injertados en patrón de naranjo agrio (Citrus aurantium L.) o en limón macrofila (Citrus macrophylla Webster). Esta enfermedad ha sido reportada en 22 estados de la República Mexicana y el áfido T. citricida ha sido recientemente detectado en el sureste de nuestro país, principalmente en los estados de Yucatán y Quintana Roo. La presencia del virus y el áfido en el territorio mexicano es relevante, ya que la mayoría de las plantas comerciales (más del 90%) están injertadas sobre naranjo agrio que es susceptible al VTC, y juntos podrían ocasionar una epidemia. Los avances que se han logrado para detectar oportunamente el VTC han sido principalmente por métodos serológicos y últimamente moleculares. La caracterización molecular de diferentes razas, la cual incluye la secuenciación completa del genoma del VTC han abierto la puerta, para hacer diversos estudios en la generación de cítricos transgénicos resistentes a este virus. Por lo anteriormente expuesto, se llevó a cabo el presente trabajo de investigación con el objetivo de desarrollar un método integral para la diferenciación de razas del VTC, basado en la caracterización molecular del genoma viral. Para lograrlo nos propusimos amplificar la secuencia del gen de la cápside para posteriormente buscar polimorfismos con enzimas de restricción que permitieran diferenciar razas débiles de severas así como en este último caso discriminar o correlacionar los síntomas de la enfermedad (declinamiento y picado del tallo). Los resultados aquí obtenidos muestran que al realizar los RFLP utilizando la enzima Alu I, en los productos de PCR del gen p25 no fue posible relacionar los perfiles electroforéticos con las diferentes razas del VTC. Sin embargo, el uso de la enzima Hae III se logró separar las razas débiles (CBG-T2, CBG-V2) y severas ( CBG-NL1, CBG-NL2, CBG-V1, H33); en estas últimas la enzima Kpn I discriminó aquellas razas que ocasionan picado de tallo y declinamiento. El alineamiento múltiple de las secuencias de aminoácidos analizadas

XI

mostró un 79% de homología, además los dendogramas lograron separar las razas débiles de las severas. El análisis de la secuencia del gen p25 mostró dos posibles aminoácidos (glicina y treonina) en las posiciones 49 y 63, respectivamente, que podrían estar involucrados en la patogenicidad del VTC, ya que están conservados en las razas severas. Los porcentajes de identidad con las razas de referencia en todos los aislamientos fue superior al 90%, ya sea de aislamientos débiles o severos. El polimorfismo que presentó la región 5´ terminal fue muy elevado; al utilizar los oligonucleótidos diseñados para cada tipo de raza, designados como del tipo I, II y III. El aislamiento V2 pertenece al tipo I (raza severa, ocasiona declinamiento), mientras que NL6 al tipo II (raza severa, ocasiona picado de tallo) NL4 y NL7 al tipo III (raza débil) y NL5, H33 al tipo I y III. Finalmente, el aislamiento T2 presentó una mezcla de los tres tipos. Estos hallazgos nos hacen pensar en infecciones mezcladas en las muestras H33 y T2.

XII

Caracterización Molecular de Aislamientos del Virus de la Tristeza de los Cítricos del Noreste de México

1. INTRODUCCIÓN

El virus de la tristeza de los cítricos (VTC) es un patógeno de distribución mundial, que por su alta agresividad y ser uno de los cinco principales problemas sanitarios de los cítrcos en el mundo, es considerado de interés cuarentenario, aún cuando esté presente en diversos países (Villarreal-García, 2001). En 1981, el total de pérdidas a nivel mundial por esta enfermdad fue estimada en 50 millones de árboles (Bar-Joseph y cols., 1981).

En la actualidad el método de detección del VTC más utilizado es el ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima, el cual se basa en la unión específica de un anticuerpo con un antígeno. Los anticuerpos poliespecíficos 3DF1y el 3CA5 son capaces de detectar a la mayoría de los aislamientos conocidos de este virus (Vela y cols., 1986), sin embargo, otros anticuerpos como el MCA13 son específicos para razas severas (Permar y cols., 1990). La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite una detección rápida y precisa del VTC con suficiente sensibilidad aún en bajas concentraciones del virus, las cuales son frecuentes en épocas del año con altas temperaturas (Cepeda-Nieto y Barrera-Saldaña, 1997).

Técnicas de diagnóstico y caracterización molecular de los aislamientos como la hibridación con sondas de RNA o DNA (Francis, 2001), han sido utilizadas para detectar diferencias en alguna región del genoma de VTC (Albiach y cols., 1995).

Existen trabajos muy completos sobre la caracterización de las razas de VTC presentes en gran parte de México (Ayllón y cols., 2001). Sin embargo, se han utilizado pocos aislamientos de la región noreste. Lo anterior aunado con la necesidad de conocer no sólo la presencia de VTC, sino también del tipo de raza y su agresividad, es que nos hemos enfocado en realizar el presente estudio a nivel molecular, utilizando principalmente el gen codificante de la cubierta proteica. La mayoría de estos estudios han sido enfocados principalmente en este gen debido a que las variaciones nucleotídicas en esta región han sido relacionados con la virulencia del virus. Es posible que, como esta región es la de mayor variabilidad, se le pueda relacionar con alguna huella molecular específica para

1

Caracterización Molecular de Aislamientos del Virus de la Tristeza de los Cítricos del Noreste de México

variantes del VTC en cuanto a su virulencia (Ayllón y cols., 2001). En años anteriores, se ha intentado obtener un método que permita separar o reconocer una raza severa de alguna débil. Los análisis por SSCP, los cuales se basan en el principio de que la molécula de DNA (cadena sencilla) toma una estructura secundaria de la secuencia base bajo condiciones desnaturalizantes, las moléculas pueden diferir por la sustitución de una sola base y adquirir diferente conformación y migrar de diferente manera en un gel de poliacrilamida (Liu y cols., 2000). Por otro lado, también se ha empleado la técnica de RFLP, la cual da un perfil definido al ser digerido el gen en cuestión. Variaciones en los nucleótidos podrían reflejarse en diferentes patrones de los fragmentos generados por este método. En este trabajo se realizó la clonación y secuenciación de los productos de amplificación para conocer a nivel de nucleótidos las diferencias entre aislamientos y poder conocer los aminoácidos que pudieran estar involucrados en la virulencia del VTC.

En la actualidad los árboles que son infectados por el VTC son erradicados (incinerados) una vez que son localizados en el campo. Por consiguiente, es necesario desarrollar un método que nos permita la diferenciación de razas del VTC de una manera rápida. Las razas débiles encontradas se podrían considerar a futuro como una posibilidad para generar cítrcos transgénicos resistentes a dicha enfermedad.

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Caracterización Molecular de Aislamientos del Virus de la Tristeza de los Cítricos del Noreste de México

2.

ANTECEDENTES

2.1. Importancia económica de los cítricos Las especies de cítricos se encuentran ampliamente cultivadas en las regiones tropicales y subtropicales del mundo. La producción de cítricos a nivel mundial en el año 2001 se estimó en 14,1 81.045.263 toneladas, ocupando México el cuarto lugar con una producción de

6.170.000

toneladas.

Consulta

gov.co/citricos/citricos_descripcion2.htm).

en

línea

La

(FAO,

citricultura

http://www.agrocadenas. representa

una

actividad

importante para nuestro país; de acuerdo con las estadísticas de la Secretaría de Agricultura Ganadería Pesca y Alimentación (SAGARPA), en México la superficie cultivada es de 485,000 ha; que producen en promedio anual 5.6 millones de toneladas de fruta, con un valor estimado de 4, 659 millones de pesos. La naranja dulce ocupa el 69% de la superficie cultivada con cítricos, el limón mexicano el 21%, el limón persa el 3% y la mandarina, toronja, otros limones y pomelo ocupan el 7%. Asimismo, Veracruz con 176,000 ha ocupa el primer lugar en la producción de cítricos, le sigue San Luis Potosí con 44,000 ha, Tamaulipas con 38,000 ha, Michoacán con 35,000 ha, Nuevo León y Colima con 32,000 ha cada uno; en conjunto, estas entidades concentran el 83% de la superficie cultivada en el país (Villarreal-García, 2001). Además, México es el principal productor de limón mexicano en el mundo, con una producción cercana a las 128,981 ton, con más de 136,460 ha

plantadas

(SIEA,

SAGARPA,

2002;

http://www.

siea.

sagarpa.

gob

.mx/indexavnc2.html).

2.2. Virus de la Tristeza de los Cítricos (VTC) Una de las principales enfermedades de los cítricos es la virosis causada por el VTC, que afecta únicamente en forma natural a plantas de la familia Rutáceas y especies afines a ella (Garnsey y cols., 1987). El áfido Toxoptera citricida, principal vector de esta enfermedad tiene como hospederos varias especies de las familias Lauraceae, Passifloraceae, Malvaceae, etc. (Michand, 1998).

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Caracterización Molecular de Aislamientos del Virus de la Tristeza de los Cítricos del Noreste de México

2.2.1

Sintomatología

El VTC ocurre en la naturaleza en una diversidad de aislamientos o razas las cuales pueden variar en gran medida en la relación y sintomatología en diversos hospederos, así como en transmisibilidad por áfidos (Roistacher y Moreno, 1991). Existen aislamientos del VTC que causan declinamiento en plantas de naranja, toronja y mandarina injertadas en el patrón naranjo agrio. El efecto final es un declinamiento gradual o repentino que ocasiona la muerte del árbol. Como una consecuencia, puede aparecer una coloración café claro en la unión del injerto de algunos árboles afectados (Fig. 1A, D). Las plantas de limón mexicano son afectadas por este tipo de declinamiento independientemente del portainjerto utilizado o de haber crecido a pie franco. Existen algunos aislamientos que pueden inducir acanaladuras o picado del tallo o ramas en la variedad (copa) y/o en el portainjerto. En casos severos, se presenta un debilitamiento general del árbol con una subsecuente reducción en el tamaño del fruto y en el rendimiento (Fig. 1B, C). El potencial destructivo de los aislamientos que causan acanalado o picado del tallo se considera de gran importancia económica mayor, debido a que afectan a los cítricos independientemente del portainjerto utilizado (Lee y Rocha-Peña, 1992). Existen aislamientos poco patogénicos que no causan efectos visibles en los hospederos que infectan, aún en aquellos injertados en naranjo agrio (Lee y Rocha-Peña, 1992).

Aclaración de nervaduras y achaparramiento. Este síntoma es inducido generalmente por todas las cepas de VTC, excepto algunas extremadamente débiles, especialmente notable sobre lima Mexicana y lima del este de la India. Es por ello que el injerto sobre lima mexicana es uno de los procedimientos más empleados para llevar a cabo la caracterización biológica de cepas de VTC. Muchas veces el aclaramiento de las nervaduras y el achaparramiento van acompañados de hojas pequeñas y de apariencia acucharada.

Amarillamiento de plántulas. Se observa sobre plantas jóvenes de naranjo agrio, toronja o limón, produciendo además una clorosis y achaparramiento de las plantas. Las cepas débiles son aquellas que no causan síntomas notables sobre las variedades comerciales mientras que las severas causan declinamiento sobre el patrón naranjo agrio

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Caracterización Molecular de Aislamientos del Virus de la Tristeza de los Cítricos del Noreste de México

y/o picadura del tallo en variedades de importancia económica (Isidrón-Herrera y cols., 2001).

A

C

B

D

Fig. 1. Síntomas causados por aislamientos severos del virus de la tristeza de los cítricos en hospederos susceptibles. A: Declinamiento y Muerte; B: Acanaladuras en el tallo; C: Reducción en el tamaño del fruto; D: Línea de color café claro (necrosis) en el sitio del injerto.

2.2.2. Características del VTC El virus de la tristeza de los cítricos es un virión filamentoso (Fig. 2), con un tamaño de 11 x 2000 nm (Bar-Joseph y cols., 1989), envuelto por dos proteínas como cápside de 25 y 27 kDa, cubriendo el 95 y 5 % de la longitud de la partícula respectivamente (Febres y cols., 1996). Su genoma es de una sola cadena, la molécula de RNA es de sentido positivo (5´ a 3´) de 19,296 nucleótidos, organizados en 12 marcos de lectura abierta (ORFs) (Fig. 3), que codifican por lo menos para 17 productos proteicos y 2 regiones no traducibles (UTRs) de 5

Caracterización Molecular de Aislamientos del Virus de la Tristeza de los Cítricos del Noreste de México

aproximadamente 107 y 273 nucleótidos de la región 5´ y 3´ terminal, respectivamente (Karasev y cols., 1995; Karasev y Hilf, 1997; Pappu y cols., 1994).

Fig. 2. Microfotografía electrónica

Fig. 3. Organización genómica del VTC.

del VTC. Virión filamentoso muy

Genoma de RNA de cadena sencilla,

flexible, midiendo aproximadamente

mostrando los 12 ORFs.

11 x 2,000 nm.

2.2.3. Diversidad genética La mayoría de los aislamientos del VTC son poblaciones complejas integradas por mezclas de diferentes genotipos virales (Ayllón y cols., 1999). Esta mezcla incluye variantes genómicas, RNA defectivos (d-RNA) y de genotipos quiméricos, que se generan como consecuencia de posibles eventos de recombinación entre ellos.

La recombinación se considera como uno de los principales factores que determinan la evolución de los virus de RNA de cadena positiva (5´ a 3´) debido a que el único huésped natural o al menos reportado para el VTC son los cítricos. Se ha postulado que al menos cuatro especies de progenitores de cítricos originaron las variedades actuales que se usan en la agricultura y que los diferentes aislamientos evolucionaron en un principio en los portainjertos de cítricos nativos de Asia, dispersándose alrededor del mundo a través de yemas infectadas (Albiach-Martí y cols., 2000). Sus resultados demuestran que el aislamiento T30 considerado como débil, se encuentra ampliamente relacionado con aislamientos de origen asiático, así como otras secuencias de Taiwán (B252), Colombia (B272) y California (B354), divergiendo con el aislamiento T385 proveniente de España y

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Caracterización Molecular de Aislamientos del Virus de la Tristeza de los Cítricos del Noreste de México

también considerado débil. El análisis filogenético demostró que este aislamiento (T30) fue introducido a Florida hace más de 200 años y que los cambios de T30 con respecto a los aislamientos más relacionados son debidos al movimiento de los cítricos a través del mundo.

Vives y cols. (1999) secuenciaron el genoma completo de un aislamiento débil del VTC (T385) y lo compararon con otros genomas de aislamientos severos, T36 de Florida, VT de Israel y SY568 de California. El genoma T385 fue de 19,259 nucleótidos, 37 nucleótidos menos que el genoma T36, 33 y 10 nucleótidos menos que el VT y SY568, respectivamente, pero su organización fue idéntica. El T385 y SY568 tienen nucleótidos idénticos en un 90% al final de las regiones 5´ y 3´ terminal de sus genomas, mientras que en la región central tienen un 99 % de identidad. Estos datos sugieren que en la región central del genoma SY568 hay una recombinación del RNA entre los genomas de estos dos aislamientos, el cual fue casi idéntico al T385.

Kong y cols. (2000) compararon la estructura poblacional y la diversidad genética de aislamientos de VTC de California, estimando la distancia genética entre haplotipos por determinación y comparación de secuencias nucleotídicas. Las frecuencias de haplotipos (determinadas por los análisis de Polimorfismos Conformacionales de Cadena Sencilla, SSCP) y la distancia nucleotídica, fueron usadas para estimar la diversidad genética (promedio de distancia genética entre 2 haplotipos seleccionados al azar). La diversidad nucleotídica dentro de y entre aislamientos variaron para los diferentes aislamientos y regiones del genoma (Región A y F del gen de la replicasa, cápside y gen p20). La diversidad genética entre aislamientos constituyó de 75.4 a 94.3 % de la diversidad total observada. Algunos aislamientos mostraron una alta diversidad genética entre ellos; por ejemplo el aislamiento 65 para la región A del genoma, el cual fue originado de una infección mezclada en la misma planta por 2 aislamientos de VTC divergentes.

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2.2.4. Diseminación Este virus es diseminado en la naturaleza por varias especies de áfidos, como Toxoptera aurantii, Aphis gossypii, y Aphis spiraecola, pero el vector más eficiente es Toxoptera citricida, (Fig. 4A). T. aurantii es otro vector de importancia, pero su habilidad para la transmisión del virus es muy pobre. Sin embargo, es importante diferenciarlo de T. citricida, porque son similares en apariencia, pero sus implicaciones en el cultivo y su manejo son diametralmente opuestos. Los áfidos pueden adquirir el virus en pocos segundos y transmitirlo rápidamente. Este virus se transmite de manera semi-persistente por sus vectores, sin período latente y tienen una pérdida de efectividad, después de 48 horas de haberlo adquirido (Lee y cols., 1994; Rocha-Peña y cols., 1995).

Los primeros síntomas se manifiestan después de 7 a 8 meses de la inoculación, llegando su expresión más severa entre 1 a 2 años. El VTC también se transmite de árboles enfermos a árboles sanos por injerto (material vegetativo infectado). No se ha reportado transmisión a través de semilla (Lee y cols., 1994; Rocha-Peña y cols., 1995).

En México, en febrero del 2000 se detectó el pulgón café de los cítricos T. citricida, en las poblaciones de Chiquila y Kantunilkin, municipio de Lázaro Cárdenas, Quintana Roo y posteriormente se detectó en el Cuyo, Tizimín y Valladolid, Yucatán. (Consulta en línea: http://www.tapecosur.edu.mx/proyectos/entomo/broca/el_pulg%C3%B3n_caf%C3%A9_de _los_c%C3%ADtricos.htm). En México se realizan actividades de exploración y muestreo, que permiten detectar oportunamente brotes de VTC, emprendiendo acciones de erradicación para evitar su diseminación dentro y fuera de las entidades citrícolas. Así mismo, en el año de 1999 se inició el Programa Nacional de Certificación de material propagativo de cítricos libres de VTC. Se han protegido 464 mil hectáreas, equivalentes a 5.57 millones de toneladas, con un valor estimado de 4,659 millones de pesos.

Esta virosis tiene influencia en 22 estados de la República Mexicana a excepción de Chihuahua, Coahuila, Durango, Zacatecas, Nayarit, Aguascalientes, Guanajuato, Querétaro,

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Tlaxcala y el D.F. (Fig. 4B). Consulta en línea (http: //www. sagarpa. gob.mx/ Dgai/ condicionfito.htm#m1). A

B

Fig. 4. Áfido vector del VTC y distribución de la virosis en México. A) Pulgón café de los cítricos T. citricida y B) Mapa de la República Mexicana mostrando en color amarillo los estados con la enfermedad y en rojo donde ha sido detectado el vector.

2.2.5. Genoma viral: características del gen de la cápside (p25) La relación entre la severidad del VTC y el gen de la cápside, se analizó a partir de 7 aislamientos de Florida y 4 aislamientos de diferentes orígenes con sus propiedades biológicas. El tamaño del gen clonado fue aproximadamente de 670 pb, codificando para 223 aminoácidos. Los 11 aislamientos analizados presentaron una homología superior al 80 % entre las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas. Entre los aislamientos de Florida T36 (severo, causa declinamiento) y T30 (débil) se encontraron 8 diferencias en aminoácidos, 7 de ellas situadas en la región central del gen de la cápside. La mayoría de las diferencias aminoacídicas se encontraron como sustituciones conservadas funcionales (Pappu y cols., 1993).

Los 11 aislamientos fueron alineados y posteriormente se infirió un dendograma, en el cual los aislamientos severos de Florida que causan declinamiento quedaron dentro de un mismo grupo y los aislamientos débiles T4, T26, T30 y T55 formaron otro grupo. Los aislamientos de Colombia (B128) y Japón (B185) formaron un dominio, mientras el aislamiento de

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España (B53) que causa picado de tallo en toronja y plántulas amarillas formó un grupo con la T4 junto con el resto de aislamientos de Florida que causan declinamiento. La relación que pudiera existir entre los aminoácidos que variaron y la diversidad de los aislamientos del VTC se siguen explorando (Pappu y cols., 1993).

Manjunath y cols. (1993) secuenciaron y expresaron el gen que codifica para la cápside de 4 aislamientos (B165, B194, B220 y B227). Estos aislamientos procedían de la India, causan picado de tallo y moteado de nervaduras. El gen de la cápside fue amplificado por la PCR y clonado en el fagémido pUC118. Encontraron un 90% de similitud a nivel nucleotídico y un 95% a nivel aminoacídico entre los 4 aislamientos. Al comparar los aislamientos B194 y B227 que causan picado de tallo, con el aislamiento T36 de Florida (declinamiento), se encontró el mismo número de cambios de aminoácidos en 7 posiciones (19, 41, 49, 68, 79, 100 y 208). El gen de la cápside del aislamiento B227 fue expresado en E. coli y la identidad del producto de la expresión se confirmó usando Western blot con anticuerpos monoclonales y el policlonal MCA13. La expresión de la cápside se puede producir en grandes cantidades sirviendo como fuente de antígeno para producir anticuerpos y para control positivo de pruebas serológicas.

2.2.6. Genoma viral: características de la región 5´ terminal (5´UTR) López y cols. (1998) investigaron la variabilidad molecular de las regiones 5´ y 3´ terminal del RNA del VTC. Analizando 10 aislamientos de diferentes orígenes geográficos, encontraron mucha variabilidad en la región 5´ UTR y clasificaron las secuencias en tres grupos (I, II y III) representados por las secuencias T36 (declinamiento), VT (picado de tallo)

y la clona T317-8 (débil, en algunos patrones), respectivamente. La identidad

nucleotídica intragrupos fue mayor al 88% y la identidad intergrupos fue entre 44 y 63%. Algunos aislamientos pertenecen a más de un grupo, como la secuencia T388 de Japón que tiene los tres grupos. En contraste con la región 5´ terminal, la variabilidad encontrada en la región 3´ terminal de 984 nucleótidos fue mucho más restringida, con una identidad del 90%. Además, se encontró la presencia de un dominio conservado de un probable “dedo de zinc” (zinc-finger), adyacente a la región del gen p23, que codifica para el producto del

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ORF 11, sugiriendo que esta proteína podría actuar como un factor regulatorio durante la replicación del virus.

Ayllón y cols. (2001) estudiaron el polimorfismo de la región 5´ terminal de 57 aislamientos del VTC de diferentes orígenes y con diferentes grados de severidad. Al utilizar oligonucleótidos específicos para cada tipo, de los cuales los aislamientos que contienen el tipo I causan declinamiento; el tipo II causan picado de tallo en naranja dulce o toronja y finalmente el tipo III causan síntomas suaves a moderados en Lima mexicana, encontraron 19 aislamientos que contienen secuencias del tipo III. Sin embargo, se observó que varios aislamientos presentaban varios tipos de secuencias de los cuales 8 de ellos presentaban los tipo II y III, 11 del tipo I y III. Finalmente, que 19 aislamientos presentaron los 3 tipos, por lo que se postuló que estos provenían de infección mezclada por diferentes razas de virus.

2.3. Técnicas basadas en PCR para la diferenciación de aislamientos de VTC Los métodos previamente utilizados para diferenciar razas de VTC incluyen la reacción con distintos anticuerpos monoclonales, el análisis de mapas peptídicos de la proteína de la cápside, el análisis de RNAs bicatenarios (dsRNAs) en plantas infectadas, la hibridación molecular con sondas de DNA complementario (Moreno y cols., 1996); además de Polimorfismos Conformacionales de Cadena Sencilla (SSCP) y Polimorfismos en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP).

2.3.1. Polimorfismos Conformacionales de Cadena Sencilla (SSCP) Liu y cols. (2000) realizaron pruebas de movilidad de DNA de cadena sencilla en geles de poliacrilamida bajo condiciones no desnaturalizantes y observaron que éste es un método estándar para separar, identificar y purificar ácidos nucleicos. Los SSCP detectan cambios en una base, debido a que el DNA (cadena sencilla) adquiere una estructura diferente bajo condiciones no desnaturalizantes y los cambios en una base hacen que el DNA migre de manera diferente. El DNA de cadena sencilla, especialmente cuando es mayor de 400

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nucleótidos adopta muchas estados conformacionales. La concentración de buffer, el pH del buffer, la concentración del gel y la temperatura, tienen un efecto dramático en la movilidad del segmento de DNA; las interacciones azúcar-base y azúcar-azúcar juegan un papel importante en la estructura secundaria, determinando la asociación de la conformación con la movilidad. Lee y cols. (1996) al hacer una revisión de las diferentes metodologías que existen para diferenciar razas de VTC encuentran que la técnica de los SSCP, la utilizaron para diferenciar 8 aislamientos de razas débiles y agresivas y dentro de éstas últimas las que causan declinamiento y picado del tallo, generando diferentes patrones de migración de las bandas y separando los diferentes grupos de razas, en base al análisis del gen p27 que codifica para la parte complementaria de la cápside. Siguiendo la misma estrategia Gago-Zachet y cols. (1999), intentaron identificar si una región del gen p27 diferencia cepas severas de débiles, agrupando 6 aislamientos de VTC pertenecientes a diferentes biogrupos. El gen p27 fue amplificado por RT-PCR, obteniéndose 30 clonas de cada aislado, de cada clon se amplificaron dos fragmentos: uno de 459 pb y otro de 281 pb. La variación en las secuencias de los fragmentos fue analizada por SSCP. El análisis de los patrones de SSCP les permitió, formar los grupos II (razas débiles a moderadas), IV (razas severas, declinamiento) y III (razas severas, picado de tallo). Los resultados del trabajo generaron un procedimiento rápido para la búsqueda de heterogeneidad genética de los aislados virales presentando la ventaja de reducir considerablemente la fuente de ácidos nucleicos requeridos para análisis como secuenciación.

2.3.2. Polimorfismos en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP) Lozano y cols. (1997) utilizaron la técnica de los RFLP digiriendo los productos amplificados por la RT-PCR con la enzima de restricción Hinf I para caracterizar la familia de los arenavirus; concluyendo que estos análisis de restricción (RFLP) son eficientes para caracterizar rápidamente cDNAs de arenavirus de fragmentos amplificados y que podrían ser útiles para estudios epidemiológicos.

No obstante, Gillings y cols. (1993) mediante los RFLP realizaron un dendograma de diferentes aislamientos con su caracterización biológica; para predecir si éstos pertenecen a

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razas débiles o severas de declinamiento o picado del tallo. Analizando el gen p25 que codifica para la cápside, previamente digerido con la enzima de restricción Hinf 1, generó 7 patrones diferentes los cuales son asociados con sus características biológicas. Permitiendo una categorización de aislamientos de VTC sin tener que clonar y secuencias el gen de la cápside.

Con todos estos datos consideramos que hacer una comparación de ellos y buscar nuevas alternativas podría proporcionar métodos moleculares tal vez más sencillos, no solo para detectar al VTC, sino que además para poder diferenciar una raza débil de una severa.

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3.

JUSTIFICACIÓN

La citricultura mundial enfrenta numerosos riesgos debido a que presenta serios problemas de fitosanidad, destacándose entre ellos las enfermedades virales. La enfermedad viral de mayor importancia en la actualidad es la causada por el Virus de la Tristeza de los Cítricos (VTC), cuyo vector más eficiente es el áfido Toxoptera citricida (Kirkaldy). Esta enfermedad es más compleja, ya que el virus existe como poblaciones complejas integradas por mezclas de diferentes genotipos virales, presentando tres tipos de razas: débil, media y severa.

El VTC presenta una amenaza potencial para la citricultura nacional, principalmente por la predominancia del naranjo agrio (Citrus aurantium) como portainjerto, que aunque es tolerante a las diversas enfermedades, es extremadamente susceptible al VTC. Hasta hace poco tiempo, México era considerado una de las pocas áreas del mundo donde no existían problemas con Tristeza de los Cítricos. Sin embargo, los últimos datos publicados señalan que existen focos de infección en diversas zonas citrícolas. Aunado a esto, el áfido Toxoptera citricida ha sido detectado en el sureste del país procedente de América del Sur y del Caribe, indicando que de no controlarse la enfermedad podría considerarse como un problema serio en México. Actualmente el método más utilizado para la detección del virus es el ELISA. No obstante, las ventajas que pueda ofrecer los resultados obtenidos son únicamente cualitativos; sin embargo recientemente con la ayuda de la Biología molecular se han desarrollado técnicas más sensibles que pueden detectar la presencia de la enfermedad e incluso identificar el tipo de raza viral lo que las hace más confiables para su establecimiento como métodos de control y erradicación de la enfermedad e incluso pueden utilizarse métodos de detección más completos.

Aún cuando los SSCP y RFLP con Hinf I permiten la detección y diferenciación de las razas de VTC, a la fecha no existen reportes de su efectividad en aislamientos de VTC obtenidos en México, por tal razón en nuestro trabajo proponemos ponerlos a prueba y con los resultados generados buscar nuevas alternativas que permita no solo la diferenciación de la razas si no también correlacionarlo con la sintomatología.

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4.

OBJETIVOS

El presente trabajo persiguió los siguientes objetivos:

1.- Desarrollar un método integral para la diferenciación de razas del VTC, basado en la caracterización molecular del genoma viral. 2.- Caracterizar molecularmente aislamientos del VTC presentes en árboles localizados en el noreste de México.

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5.

5.1.

MATERIALES Y MÉTODOS

Procedencia de los Reactivos

Los reactivos que se utilizaron para llevar a cabo las reacciones de transcripción reversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR), fueron obtenidos de las siguientes casas comerciales: las enzimas M-MLV, Taq DNA polimerasa, desoxinucleósidos trifosfatados (dNTPs) y cloruro de magnesio (MgCl2) proceden de Promega Corporation (Madison, WI, EUA). Las enzimas de restricción y modificación utilizadas fueron adquiridas en New England Biolabs (Beverly, MA, USA) y Promega Corporation (Madison, Wi, EUA). Los oligonucleótidos (primers) fueron sintetizados en BioSynthesis, Inc. y Operón Technologies. Para la clonación de los productos de PCR, se utilizó el estuche “TA Cloning Kit” de la compañía Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). La secuenciación se llevó a cabo utilizando el estuche comercial Sequi Term Excell II DNA Sequencing (Lincoln, NE, USA y Canadá), y los reactivos más comunes fueron marca Sigma.

5.2.

Material Biológico

Se utilizó la corteza de varetas de naranjo dulce (Citrus sinensis L. Osb.) procedentes de los estados de Nuevo León, Tamaulipas y Veracruz, proporcionados por la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca (SAGARPA) y la Facultad de Agronomía de la UANL (Cuadro 1). El DNAc que se utilizó como control positivo fue proporcionado por el Citrus Center de Texas A & M University en Kingsville, Texas, E.U.A.

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Cuadro 1.

Distribución de los aislamientos del VTC estudiados y del control positivo (+)

ESTADO Nuevo León

Tamaulipas

Veracruz

Texas, E.U.A. (+)

5.3.

IDENTIFICACIÓN NO. MUESTRA NL

1

NL

2

NL

3

NL

4

NL

5

NL

6

NL

7

T

1

T

2

V

1

V

2

H33

1

Extracción del RNA viral

Con el fin de obtener el RNA viral en cantidades adecuadas para los análisis, a partir de tejidos de cítricos infectados con VTC, se utilizó el método de extracción de ácido ribonucleico total TRIzol Reagent (Gibco, BRL). El cual consistió de los siguientes pasos: Se mezcló 0.1 gramo de tejido con 1 ml de reactivo TRIzol y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. En seguida se adicionaron 0.2 ml de cloroformo, se agitó vigorosamente, se dejó reposar 2-3 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó a 12,000 rpm por 15 minutos a 4oC, recuperándose la fase acuosa en un tubo nuevo, al cual se le adicionó 0.5 ml de isopropanol y se incubó 10 minutos a temperatura ambiente para precipitar el RNA. Se volvió a centrifugar a 12,000 rpm por 10 minutos a 4ºC, se descartó y la pastilla resultante se lavó con 1 ml de etanol al 75%, mezclando por vortex y centrifugando a 9,600 rpm durante 5 minutos a 4oC. Luego se descartó el sobrenadante y

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eliminó cualquier remanente por inversión del tubo. Finalmente, después de secarse la pastilla, se resuspendió ésta en 30 µl de agua grado MQ estéril tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) y se incubó a 55oC durante 10 minutos en un termomixer (Eppendorf) para disolverla, colocándose luego a –20oC hasta su uso.

5.3.1. Determinación de la calidad del RNA Una vez que se extrajo el RNA, se procedió a visualizarlo en un gel de agarosa al 1%, siguiendo la técnica de Goda y cols. (1995), adicionando 0.2 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml) y 500 µl de tiocianato de guanidina 1M; se depositaron 4 µl de cada muestra en el gel y se corrió en una cámara de electroforesis horizontal (Mini-Sub Cell GT, BIO-RAD) a 100 volts por 50 minutos usando una fuente de poder EC105. La calidad del RNA extraído se determinó utilizando un Espectrofotómetro con luz UV DU 650 (Beckman Coulter, E.U.A.), leyendo las absorbancias a longitudes de onda de 260 y 280. Sólo se trabajó con muestras de RNA que tuvieran un valor mínimo de 1.5 obtenido por la relación de absorbancias A260/A280.

5.4.

Diseño de Oligonucleótidos

Los oligonucleótidos para la amplificación de la cápside, fueron amablemente proporcionados por el Dr. Omar Alvarado (Facultad de Agronomía, UANL). Para la amplificación del gen p25 que codifica para la cápside del VTC, se utilizaron los oligonucleótidos descritos por Lee et. al. que amplifican un fragmento de 688 pares de bases (pb) y cuyas secuencias se reportan en el Cuadro 2.

También se diseñaron un par de iniciadores que flanquean una secuencia cercana a la posición 5' terminal y que amplifican un producto de 736 pb. Estos iniciadores son complementarios a los nucleótidos que flanquean las posiciones 11 a 746 de la secuencia molde. El diseño de estos iniciadores se apoyó en el programa computacional OLIGO para Macintosh (Wojciech, 1992).

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En la figura 5, se muestra una simulación electrónica del diseño de oligonucleótidos en el programa Amplify (Engels, 1993).

Fig. 5. Representación esquemática del diseño de oligonucleótidos. Se muestra una amplificación virtual de los iniciadores. Para el diseño se utilizó como blanco la secuencia del VTC reportada en el GenBank (no. acceso CTU16304).

Cuadro 2.

Descripción de oligonucleótidos utilizados en las PCRs

Nombre

Secuencia

Sitio de unión

Producto de PCR (pb)

R731-7

5´-cgg aac gca aca gat caa cg- 3´

16,820-16,840

688

R731-6

5'-att atg gac gac gaa aca aa-3'

16,152-16,171

688

CBG-5' up

5´-att caa cct gtt cgc c- 3´

11-26

736

CBG-5' down

5´ -cga ggg atg agg att a- 3´

731-746

736

PM33

5´-ccc gta ccc tcc gga aat cac g-3´,

16-37

266

PM34

5´-tggtgt aaa tcc caa cca gac ggt tg-3´

57-82

229

PM35

5´-atc gcg cat ctg gcg caa ac-3´

170-189

115

RF130

5´ -cac tat gtc gaa act cag agg aa- 3´

204-284

181

RF137

5´ -ccg taa agg gac tat cgg c- 3´

266-284

-

Los oligonucleótidos PM33, PM34, PM35 y RF130 son de naturaleza sentido (5´ a 3´), mientras que el oligo RF-137 es antisentido.

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5.5.

Obtención de los productos del gen p25 y región 5´ terminal por RT-PCR

5.5.1. Retrotranscripción En todas las reacciones de reverso transcripción (RT) se utilizaron 3µl del extracto de RNA (2µg), 0.75 µl (0.5 µM) de los iniciadores antisentido (R731-7 y RF-137 cada uno en reacciones separadas), completando con agua MQ esteril a un volumen final de 15 µl. Esta mezcla se incubó a 70oC por 5 minutos y después se colocó en hielo. Posteriormente se adicionaron 5 µl de Buffer M-MLV (1X), 1.25 µl de dNTPs (0.5 mM), 0.625 µl de RNAsin (15.6 U) y 1 µl de la enzima M-MLV (200 U), llevándose a un volumen final de 25 µl. Finalmente se mezcló suavemente y después se incubó a 42oC durante 50 minutos.

5.5.2 Amplificación de los productos (PCR) Una vez obtenido el DNAc se procedió a amplificar en forma independiente el gen p25 que codifica para la cápside, y la región 5' terminal (5' UTR) por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 25 µl, utilizando 2.5 µl de DNAc procedente de la RT, 2.5 µl de Buffer 10X (concentración final a 1X), 1.5 µl de cloruro de magnesio 25 mM (final 1.5 mM), 0.5 µl de dNTP´s 10 µM (final 0.2mM), 1.25 µl de cada uno de los iniciadores 10 µM (final 0.5 µM) y 0.25 µl de la enzima Taq DNA polimerasa (1.25 U) y completando el volumen con agua MQ esteril. El programa que se utilizó consistió de 1 ciclo de 5 min a 94oC y 30 ciclos de 30 seg a 94oC, 30 seg a 50oC y 1 min a 72oC. Finalmente se dio un paso de extensión final a 7 min a 72oC. Las reacciones de RT-PCR se llevaron a cabo en un termociclador GeneAmp modelo 9700 de la compañía Perkin Elmer.

5.6.

Electroforesis en geles de agarosa

La visualización de los productos amplificados por la RT-PCR, se realizó en geles de agarosa al 1% para el caso del gen de la cápside, y al 2% para la región no codificante 5' terminal. Todos los geles fueron teñidos con 0.2 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml). Se utilizó la solución amortiguadora de TBE 0.5 X (45 mM Tris base, 45 mM ácido bórico y

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1.0 mM EDTA) a un pH 8.0 tanto para la preparación del gel como para el corrimiento el cual se realizó en una cámara de electroforesis horizontal (BioRad) a 100 volts por 50 minutos.

5.7.

Purificación de productos amplificados

Para purificar el fragmento de interés amplificado por PCR, se elaboró un gel de agarosa al 2% de bajo punto de fusión en solución amortiguadora TAE 1X (400 mM Tris acetato y 10 mM EDTA) pH 8.3, y se corrió en una cámara de electroforesis horizontal a 120 volts por 1.3 horas. Estos productos se visualizaron en un transiluminador UV y se cortaron las bandas de interés. Posteriormente se procedió a realizar una purificación directa utilizando el estuche comercial Wizard de la compañía Promega (No. cat. A7181). El protocolo se describe a continuación. A cada banda de interés previamente fundida a 70oC se agregó 1 ml de resina. Se agitó 3 veces en el vortex de 1 minuto cada uno, se preparó una columna para cada producto de PCR a purificar, y la mezcla se pasó a través de esta con la ayuda de una jeringa, agregando 2 ml de isopropanol al 80 % para lavar la columna. El exceso de isopropanol se eliminó al centrifugar (10,000 rpm por 20 segundos) la columna. Para eluir el DNA, se agregaron a la columna 50 µl de TE 1X pH 7.4, se incubó por 30 segundos a temperatura ambiente y finalmente se centrífugó a 10,000 rpm por 20 segundos. El DNA fue recuperado en un tubo Eppendorf.

5.8.

Análisis de Polimorfismos Conformacionales de Cadena Sencilla (SSCP)

5.8.1. Desnaturalización de fragmentos amplificados Los fragmentos amplificados por la RT-PCR se desnaturalizaron, tomando 1 µl del producto de la reacción, el cual se mezcló con la solución desnaturalizante (950 µl de formamida, 40 µl de EDTA 0.5 M, pH 8.0, 0.5 µg de azul de bromofenol y 0.5 µg de xilencianol) llevando a un volumen final de 10 µl. Posteriormente la mezcla se calentó a 100oC durante 10 minutos, y luego los tubos se colocaron en hielo por 3 minutos adicionales.

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Se depositaron 7 µl de cada uno de los fragmentos amplificados en geles de poliacrilamida al 12%, en solución amortiguadora de TBE 1X (90 mM Tris base, 88 mM de ácido bórico y 2.0 mM EDTA) a pH 8.0, se corrió en una cámara de electroforesis vertical a 150 volts durante 5 horas a 4oC para favorecer una mejor separación y migración de los fragmentos del DNAc.

5.8.2. Tinción de geles de poliacrilamida con nitrato de plata La tinción de los geles con nitrato de plata se llevó a cabo empleando el método descrito por Igloi (1983). Primeramente, el DNA fue fijado en el gel en una solución de etanol-ácido acético-agua (50:10:40) durante 60 minutos o toda la noche. El gel se pasó a una solución de etanol-ácido acético-agua (10:1:89) durante 1 hora. Se descartó la solución anterior y se agregó una solución de nitrato de plata 12 mM; se incubó por 60 minutos. Después el gel se lavó 2 a 3 veces con agua MQ, y se reveló con KOH 0.75 M (6.4 g KOH, 1.12 ml de formaldehído y 150 ml de agua) hasta que aparecieron las bandas e inmediatamente se detuvo la reacción con carbonato de sodio (Na2CO3) 0.07 M. Las bandas se visualizaron en una cámara de iluminación de luz blanca.

5.9.

Análisis de Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP)

El polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), de los productos de PCR amplificados, se determinó haciendo uso de la enzima de restricción Alu I que reconoce la secuencia AGCT (Han y New, 1998). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 10 µl, conteniendo 5 µl de DNA (20 ng), 1 µl de buffer (1X), 0.5 µl de enzima Alu I (5 U) completando con agua MQ estéril. Posteriormente las muestras se incubaron a 37oC por 2 horas y se inactivó la enzima a 65oC por 20 minutos.

Además de la enzima Alu I, también se utilizaron las enzimas de restricción Hae III y Kpn I, que reconocen las secuencias GG/CC y GGTAC/C, respectivamente, llevando las reacciones a un volumen final de 15 µl, utilizando 5 µl de DNA (20 ng), 1 µl de buffer 2

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(1X), 1 µl de las enzimas Hae III y Kpn I en reacciones separadas respectivamente completando con agua MQ estéril, incubando por 2 horas a 37oC.

Para visualizar los productos generados en las reacciones anteriores, se separaron 5 µl de producto en un gel de poliacrilamida al 12% utilizando TBE 1X (90 mM Tris base, 88 mM de ácido bórico y 2.0 mM EDTA) como solución amortiguadora a un pH 8.0 en una cámara de electroforesis vertical a 120 volts por 2 horas. El gel se tiñó en una solución de bromuro de etidio (0.5 ng) durante 30 segundos. Los fragmentos generados se visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta UV.

5.10.

Clonación, transformación y secuenciación

5.10.1 Ligación Los productos de PCR expuestos a bromuro de etidio y luz ultravioleta se les adicionó Taq DNA polimerasa, la cual tiene actividad de transferasa terminal, agregando extremos de desoxiadenosinatrifosfato (dATP) e incubando 10 minutos a 72oC. Para llevar a cabo la ligación se utilizó el estuche comercial (TA Cloning Kit) y se empleó la siguiente fórmula para determinar la cantidad de inserto y vector:

X ng producto de PCR (inserto) =

(Y producto de PCR) (X ng vector) tamaño de vector

La proporción óptima inserto – vector para la ligación es de 3:1 . La reacción de ligación se llevó a un volumen final de 10 µl con los siguientes componentes:

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Reactivo

Volumen (µl)

Inserto ≈ 15 ng

1

Vector (25 ng/µl)

1

Buffer de ligación (10 X)

1

Enzima ligasa T4 DNA

1

H2O

6

Los volúmenes en la ligación dependen de la concentración a la cual se tiene el inserto y al volumen final de la reacción. Las reacciones de ligación se incubaron a 14oC durante toda la noche.

5.10.2. Transformación Para llevar a cabo la transformación, 5 µl de cada producto de ligación, se mezclaron con una alícuota (50 µl) de células TOP10F´ ultracompetentes , mezclando suavemente con la punta de la pipeta e incubando en hielo durante 30 minutos. Después se dio un choque térmico a 42oC por 30 segundos e inmediatamente la muestra se colocó en hielo. Se adicionaron 250 µl de medio SOC a cada tubo con las células y se agitó a 700 rpm y 37oC por 1 hora. Para el análisis de las colonias recombinantes se plaquearon 100 y 150 µl en medio de selección sólido Luria Bertani (LB) más Amp60 y Kan50 , adicionando 50 µl X-gal (20 mg/ml) y 20 µl de IPTG (100 mM). Las cajas petri se incubaron a 37oC durante 18 horas.

5.10.3. Selección de recombinantes Las colonias recombinantes se seleccionaron por tamizaje por PCR, efectuado a partir de las colonias blancas las cuales de acuerdo a los marcadores de selección son potencialmente transformantes, cada colonia se resuspendió en 20 µl de agua MQ estéril. Se tomaron 10 µl de esta suspensión de células y se lisaron en un termociclador (MJ RESEARCH PTC-200) mediante un ciclo con las siguientes temperaturas: 96oC/5 min, 50oC/1.5 min, 96oC/1.5 min, 45oC/1.5 min, 96oC/1 min y 40oC/min. Posteriormente, los 10 µl de células lisadas se

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utilizaron como templado para amplificar por PCR y los resultados se visualizaron en un gel de agarosa al 1%.

5.10.4. Extracción del DNA plasmídico Las colonias que contenían el inserto de interés fueron multiplicadas en tubos de ensaye con 4 ml de medio LB líquido con Amp60 y Kan50 a 37oC en agitación constante (150 rpm) y durante toda la noche, para así aumentar la masa bacteriana. La extracción del DNA plasmídico se realizó modificando dos técnicas reportadas por Sambrook y cols. (1989).

A partir de un cultivo de las clonas transformadas con 10-12 horas en LB Amp60 y Kan50, 1.5 ml de células bacterianas (E. coli TOP10 F´) se centrifugaron a 5,000 rpm por 5 min y el sobrenadante se desechó. Las células se resuspendieron en 200 µl de solución I fría [50 mM de glucosa, 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) y 10mM EDTA (pH 8.0)] conteniendo 2mg/ml de lisozima. Después se adicionaron 200 µl de solución II (0.2 N NaOH y 1% SDS), preparada al momento; mezclando suavemente. Posteriormente se agregaron 200 µl de solución III fría pH 4.8 (acetato de potasio 5 M, ácido acético glacial concentrado y agua) y el tubo se incubó en hielo por 10 min. Se centrífugó a 14,000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante se recuperó en un tubo nuevo (≈ 500 µl), adicionando 1 µl de RNAsa (10 mg/ml) e incubando a 37oC por 15 min. A esta mezcla se le adicionó 1 volumen de solución cloroformo/octanol en proporción 24:1 (500 µl) se mezcló en un vortex por 30 seg y se centrifugó a 12,000 rpm por 5 min. La fase acuosa se transfirió a un tubo eppendorf nuevo (≈ 500 µl), adicionando 2 volumenes de etanol al 100% (1 ml) y se incubó 1 hora a –20oC. Después se centrifugó a 12,000 rpm durante 10 min, se eliminó el sobrenadante y la pastilla se lavó con 500 µl de etanol al 70%; posteriormente se dejó secar la pastilla y se resuspendió en 30 µl de TE 1X incubando a 37oC y 500 rpm. Se analizaron 4 µl de cada una de las muestras en un gel de agarosa al 1%.

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5.10.5. Caracterización enzimática Una vez que se obtuvo el DNA plasmídico se procedió a realizar la digestión enzimática con la endonucleasa de restricción Eco RI, la cual flanquea el insertó de interés en el plásmido pCR 2.1 (3.9 kb) para liberarlo del plásmido.

Las reacciones se llevaron cabo en un volumen final de 10 µl, tomando 5 µl de DNA (aprox. 5 µg), 1 µl de buffer 2 (1X), 1 µl enzima Eco RI (12 U/µl) completando con agua MQ estéril. Se incubó a 37oC durante toda la noche, después la enzima se inactivó a 65oC por 20 minutos. Posteriormente, 5 µl de la digestión enzimática se analizaron en un gel de agarosa al 1.5% a 100 volts por 1 hora. Una vez que se verificaron las colonias que tenían el inserto se interés, se enviaron para su secuenciación.

5.10.6. Secuenciación de las clonas Las clonas se secuenciaron en nuestro centro, usando un estuche comercial Sequi Therm Excel II DNA Sequencing en el secuenciador LI-COR.

5.11. Análisis Bioinformático 5.11.1. Análisis de las secuencias Una vez que se determinaron las secuencias de la clonas de cada uno de los aislamientos en estudio, se procedió a realizar una comparación de estas con las del banco de genes (GenBank,www.ncbi.nlm.nih.gov) mediante el programa computacional Blast (http:// www. ncbi .nlm.nih.gov/BLAST/), para verificar la similitud de las secuencias obtenidas con las previamente reportadas para el VTC. Una vez confirmada la identidad de las secuencias, estas fueron comparadas con secuencias previamente reportadas y que además fueron caracterizadas biológicamente esto con la intención de clasificar nuestros aislamientos con base en su agresividad, en razas débiles, moderadas ó severas.

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5.11.2. Alineamiento de secuencias Los alineamientos múltiples de las secuencias del VTC obtenidas, se realizaron mediante el programa Clustal X (Thompson y cols., 1997), con lo cual se procedió a realizar el dendograma de similitud, en el cual se empleó el programa SEQBOOT (BOOTSTRAP) del conjunto de programas Phylip (Felsenstein, 1993); por el método de Máxima Parsimonia.

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6. 6.1.

RESULTADOS

Extracción del RNA viral

Ha sido demostrado que el VTC se encuentra en mayores cantidades en tejidos ricos en floema, como son la corteza, el pecíolo y las nervaduras centrales de hojas en desarrollo. Además, las partículas virales del VTC generalmente tienden a perderse a medida que los tejidos maduran y endurecen, especialmente en condiciones de altas temperaturas (BarJoseph y cols., 1980). Por estas razones, el RNA viral fue extraído a partir de la corteza de varetas de naranjo, mediante el método del TRIzol. La extracción se hizo a partir de 0.1 gramos de tejido. El RNA total obtenido se resuspendió en 40 µl de agua MQ estéril. En la figura 6 se muestran los resultados de cada extracción. En esta figura se puede apreciar que a partir de las muestras T1 y V1 se obtuvo una mayor cantidad de RNA con respecto a las muestras de NL1 y NL2. Las extracciones de RNA viral efectuadas a partir de corteza de vareta se conservaron a –20oC, para su uso durante los análisis de RT-PCR.

NL1

T1

V1

NL2

NL3 T2 V2

NL4 NL5 NL6 NL7 H33

Fig. 6. Extracción de RNA total a partir de tejido vegetal. Separación del RNA en gel de agarosa al 1% a 80 volts por 60 minutos.

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6.1.1. Calidad del RNA Los resultados de la cuantificación de RNA se muestran en el Cuadro 3, estos fueron utilizados para determinar la cantidad y calidad (expresada en relación A260/280).

Cuadro 3.

Determinación de la concentración y calidad del RNA total

Identificación NL

Tamps. Ver.

No. Muestra 1 2 3 4 5 6 7 1 2 1 2

A260/280 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.1 2.1 2.0 1.7 2.2 2.0

Cantidad (µg µl-1) 6.3 4.3 5.3 3.4 3.5 3.3 3.2 4.6 5.1 3.1 4.5

Valores superiores a 1.7 se consideran de muy buena calidad e inferiores a 1.5 podrían indicar la presencia de proteínas o algunos compuestos fenólicos. Es importante resaltar que la calidad del RNA extraído se encuentra dentro de los valores recomendados por Sambrook y cols. (1989). Además, las concentraciones de RNA total fueron suficientes para llevar a cabo los análisis posteriores.

6.2. Amplificación del gen p25 que codifica para la cápside La amplificación del gen p25 a partir del DNAc de las 11 muestras, fue positiva sólo en 6 de ellas (Fig. 7). A pesar de que la amplificación de la cápside se intentó en varias ocasiones y bajo diferentes condiciones con las muestras que no habían amplificado, estas siempre resultaron ser negativas, lo que nos llevó a inferir que estos tejidos provenían de plantas no infectadas. En la figura 7, se muestran los fragmentos amplificados, los cuales dan un producto de 688 pb, correspondiente a la cápside. Como se puede observar en los carriles correspondientes a NL2, T2 y V2 hubo algunos fragmentos no específicos, por lo

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cual se decidió purificar los productos de la RT-PCR como fue señalado anteriormente (M. y M. 5.7). La muestra H33 (último carril) sirvió de referencia y comparación con los aislamientos mexicanos que se lograron amplificar.

1093pb 800pb 516pb

688pb

Fig. 7. Amplificación del gen p25 del VTC. Cada carril corresponde a una muestra de los aislamientos de Nuevo León, Tamaulipas y Veracruz. Los productos de PCR se analizaron en un gel de agarosa al 1%. El gen p25 corresponde al fragmento de 688 pb.

6.3.

Amplificación de la región 5´ terminal (5´UTR)

Una vez que se obtuvo el cDNA para esta región, se procedió a realizar la RT-PCR, en la que se logró amplificar un producto de 266 pb para los aislamientos de H33 (testigo positivo) y el aislamiento de T2 obteniendo bandas definidas como se muestra. En la figura 8 se muestran los resultados de la PCR para uno de los aislamientos.

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400pb 300pb 200pb

266pb

Fig. 8. Amplificación de la región 5´ terminal (5´UTR) del aislamiento T2 del VTC utilizando diferentes oligonucleótidos. Esta figura muestra la amplificación del aislamiento de T2. Carril: 1 Marcador λ/Pst I; 2: oligo PM33; 3: oligo PM34; 4: oligo PM35; 5: oligo RF130.

En el cuadro 4 se muestran los aislamientos, en los cuales fue amplificada la región 5´ (UTR).

Cuadro 4.

Amplificación de la región 5´(UTR) con los diferentes oliginucleótidos

SECUENCIA Oligonucleótidos TIPO

NL No. aislamiento 2 3 4 5 6 - - - + +/- - - + +

T

1 7 1 I PM35 - (Declinamiento) RF130 II (Picado de PM33 - tallo) III (Débil) PM34 - - - +/- +/- - + (+) = Amplificación intensa; (+/-) = Amplificó tenue; (-) = No amplificó.

V

H33 (+)

2 + + +

1 -

2 +

-

-

+ + +

+

-

-

-

6.4. Purificación de productos amplificados por la PCR Una vez que se logró amplificar el gen de la cápside a partir del cDNA por la PCR, se procedió a purificar los productos para eliminar las posibles interferencias con bandas inespecíficas y nucleótidos no incorporados. Este procedimiento permitió obtener fragmentos de mayor calidad, los cuales permitirían su mejor análisis (Fig. 9).

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1093pb 805pb 516pb

688pb

Fig. 9. Purificación de productos DNAc amplificados por la PCR. Gel de agarosa al 2%, indicando en el carril 1: Marcador λ/Pst I y en el resto los aislamientos indicados con sus respectivos productos purificados.

6.5. Análisis de Polimorfismos Conformacionales de Cadena Sencilla (SSCP) Una vez que se logró amplificar los DNAc por la RT-PCR, se procedió a desnaturalizar estos fragmentos con una solución desnaturalizante para posteriormente visualizarlos en un gel de poliacrilamida al 12%, tiñendo el DNA con nitrato de plata, con la finalidad de observar la separación y migración de las moléculas de DNA (cadena sencilla); esto es dependiendo de su conformación y los cambios en la secuencia nucleotídica

De acuerdo con el perfil electroforético observado (Fig. 10); se lograron distinguir dos grupos, el primero formado por los aislamientos de V1, NL2 y T2; mientras que el segundo grupo lo forman los aislamientos de NL1, V2 que presentaron un perfil electroforético muy semejante al aislamiento H33 de Texas (testigo positivo), el cual pertenece a una raza severa con características de declinamiento y picado de tallo. Pero aún consideramos que este método requiere de más cuidados para poder definir su utilidad en la diferenciación de razas débiles de severas.

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H33

NL1

V1

NL2

T2

V2

Fig. 10. SSCP de los productos amplificados por la RT-PCR del gen p25 (cápside). Gel de poliacrilamida al 12% con los aislamientos indicados en cada carril.

6.6. Análisis de Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP) 6.6.1. Análisis con Alu I Los RFLP de los productos amplificados correspondientes al gen de la cápside fueron digeridos con la enzima de restricción Alu I. Esta enzima fue seleccionada ya que ha sido ampliamente utilizada en diversos estudios relacionados con cambios a nivel nucleotídico en genes de diversos organismos (Han y New, 1998). Los perfiles generados con esta enzima se presentan en la figura 11; se puede observar que no existe un patrón definido que permita diferenciar entre aislamientos, donde se formaron patrones diferentes para cada aislamiento. Sin embargo, podemos destacar que los patrones formados por los aislamientos de Nuevo León y Veracruz (NL1, NL2 y V1) son muy similares entre ellos. Si bien es cierto que en algunos casos hay fragmentos que seguramente provienen de digestiones parciales, estas son fácilmente identificadas y no dificulte el análisis de sus patrones generados.

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339p 247p 210p 94pb

Fig. 11. Perfil de RFLP del gen p25 con la enzima Alu I. Carril 1: Marcador λ/Pst I; 2: Fragmento de PCR de NL1 sin digerir; 3: Fragmento de PCR de NL1 digerido; 4: Fragmento de PCR de V1 sin digerir; 5: Fragmento de PCR de V1 digerido; 6: Fragmento de PCR de NL2 sin digerir; 7: Fragmento de PCR de NL2 digerido; 8: Fragmento de PCR de T2 sin digerir; 9: Fragmento de PCR de T2 digerido;10: Fragmento de PCR de V2 sin digerir; 11: Fragmento de PCR de V2 digerido;12: Fragmento de PCR de H33 sin digerir; 13: Fragmento de PCR de H33 digerido.

Una vez realizados los RFLP con la enzima Alu I, se procedió a inferir un dendograma con un conjunto de programas computacionales (EMBOSS, Cross Checker y TreeView), para observar el agrupamiento de los aislamientos respecto al número de bandas generados por cada uno de ellos. Como se pude observar en la figura 12, se agruparon los aislamientos de NL1, NL2 y V1. Separando de éstos a los aislamientos de T2, V2 y el testigo positivo H33 el cual se conoce que es severo pues produce declinamiento y picado de tallo. Por lo tanto, no se logró agrupar los aislamientos de NL1, NL2 y V1 junto con H33.

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Fig. 12. Análisis por dendograma. Se muestra el dendograma generado a partir de los RFLP del gen p25 con la enzima Alu I de los aislamientos analizados en el presente estudio.

6.6.2. Análisis con otras endonucleasas de restricción El análisis de algunas secuencias del gen de la cápside, de las cuales su caracterización biológica está bien definida, permitió establecer que los sitios Hae III y Kpn I están siempre presentes en las razas severas del VTC, pero no en las razas débiles. En los cuadros 5 y 6 se muestra una comparación al respecto.

6.6.2.1. Determinación del tipo de raza del VTC El hallazgo anterior nos llevó a realizar los RFLP del gen de la cápside de nuestros aislamientos con las enzima de restricción Hae III, cuya secuencia de reconocimiento es GG/CC. Se logró distinguir claramente 2 grupos: el primero formado por los aislamientos de NL1, V1, NL2 y H33 (este último pertenece a una raza severa con características biológicas de declinamiento y picado de tallo, presentando solamente un sitio de corte Hae III). El segundo grupo formado por los aislamientos de T2 y V2, los cuales no presentaron sitio de corte por la enzima (Fig. 13).

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M

NL1 NL1

V1

V1

NL2 NL2

T2

T2

V2

V2

H33

H33

5166pb 154 pb

Fig. 13. Perfil de RFLP del gen p25 con la enzima Hae III. Carril 1: Marcador λ/Pst I; 2: Fragmento de PCR de NL1 sin digerir; 3: Fragmento de PCR de NL1 digerido; 4: Fragmento de PCR de V1 sin digerir; 5: Fragmento de PCR de V1 digerido; 6: Fragmento de PCR de NL2 sin digerir; 7: Fragmento de PCR de NL2 digerido; 8: Fragmento de PCR de T2 sin digerir; 9: Fragmento de PCR de T2 digerido; 10: Fragmento de PCR de V2 sin digerir; 11: Fragmento de PCR de V2 digerido; 12: Fragmento de PCR de H33 sin digerir; 13: Fragmento de PCR de H33 digerido.

6.6.2.2. Determinación de la sintomatología de las razas severas del VTC Los aislamientos que presentaron el sitio Hae III, se utilizaron para digerirlos con la enzima de restricción Kpn I, en los cuales se formó un solo grupo que son NL1, V1, NL2 y H33 con un solo corte, generando dos fragmentos. Además se utilizó el aislamiento de V2 para observar qué patrón se generaba con la enzima Kpn I, en el cual observamos que no hubo digestión enzimática (Fig. 14).

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M NL1 NL1 V1

V1 NL2 NL2 H33 H33

V2

V2

516pb

150pb

Fig. 14. Perfil de RFLP del gen p25 con la enzima de restricción Kpn I. Carril 1: Marcador λ/Pst I; 2: Fragmento de PCR de NL1 sin digerir; 3: Fragmento de PCR de NL1 digerido; 4: Fragmento de PCR de V1 sin digerir; 5: Fragmento de PCR de V1 digerido; 6: Fragmento de PCR de NL2 sin digerir; 7: Fragmento de PCR de NL2 digerido; 8: Fragmento de PCR de H33 sin digerir; 9: Fragmento de PCR de H33 digerido; 10: Fragmento de PCR de V2 sin digerir; 11: Fragmento de PCR de V2 digerido.

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En los Cuadros 5 y 6 se muestran aislamientos del VTC, algunos de ellos con su caracterización biológica y en letras negritas los reportados en este trabajo.

Cuadro 5. Presencia de sitios de reconocimiento Hae III y Kpn I en aislamientos débiles del VTC. Aislamiento Origen Patogenicidad Sitio Hae III T385 España Débil No T30 Florida Débil No B35 España Débil No VER2-2 Veracruz (México) No QR2753-1 Q. R. (México) No NL8 N. L. (México) No MichL9A11/9-1 Mich. (México) No H47 Texas No CPCu IJ-22 Cuba No CPCu IJ-12 Cuba No 25-20 Portugal No 2-93 Portugal No No CBG-T2 (parcial) Tamps. (México) Ver. (México) No CBG-V2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (-) = No tiene caracterización biológica.

Sitio Kpn I No No No No No No No No No No No No No No

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Cuadro 6. Presencia de sitios de reconocimiento Hae III y Kpn I en aislamientos severos del VTC. Sitio Hae III Si (508) Si (508) Si (423)

Sitio Kpn I No No Si (64)

Si (490) Si (508)

Si (131) Si (149)

Si (508)

Si (149)

19-21 Portugal Si (508) 28C Portugal Si (508) 2-98 Portugal Si (551) Corea del Sur Si (508) NUagA Japón Si (508) TAM11 Tamps. (México) Si (508) BC15-1 B. C. (México) No N. L. (México) Si (513) CBG-NL1 N. L. (México) Si (514) CBG-NL2 Ver. (México) Si (532) CBG-VER1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (-) = No tiene caracterización biológica.

Si (149) Si (149) Si (149) Si (149) Si (149) Si (149) Si (146) Si (156) Si (152) Si (152)

Aislamiento T36 13C H33 (parcial)

Origen Florida Portugal Texas

PB61 VT

Australia Israel

SY568

California

6.7.

Patogenicidad Severa (Declinamiento) Severa (P. de tallo y Declinamiento) Picado de tallo Severa (P. de tallo y Declinamiento) Severa (P. de tallo)

Clonación molecular de productos amplificados

Con el fin de conocer la secuencia nucleotídica de cada uno de los fragmentos provenientes del gen p25 se llevó a cabo la clonación molecular.

6.7.1. Ligación Las amplificaciones del gen de la cápside generados por la RT- PCR como un fragmento de 688 pb, de los aislamientos de NL1, V1, NL2, T2,V2, se ligaron en el plásmido pCR 2.1 (3.9 Kb). Dicho plásmido se seleccionó por ser eficiente en aceptar productos de PCR menores a 700 pb.

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6.7.2. Transformación Los cinco aislamientos ligados al plásmido pCR 2.1 se transformaron en células de E. coli TOP10F´ (ultracompetentes) para la multiplicación del plásmido. Las células transformadas se seleccionaron en medio sólido Luria Bertani (LB) adicionado de Amp60 y Kan50.

6.7.3. Selección de recombinantes Se analizaron entre 15 y 20 colonias blancas de cada aislamiento, potencialmente recombinantes para ser analizadas mediante tamizaje por PCR, utilizando los oligonucleótidos específicos para la cápside y la región 5´ terminal, respectivamente, (indicados en Materiales y Métodos, Cuadro 2).

Este método de selección es muy rápido, ya que las colonias que tienen el inserto de interés (gen p25 o región 5´ terminal) se pueden utilizar como templado para ser amplificadas por la PCR, y las colonias que no lo tienen, no amplifican y por lo tanto quedan descartadas. En la figura 15 se muestra un ejemplo de la selección de colonias de la región 5´ terminal para el aislamiento de H33 (testigo positivo), utilizando los oligonucleótidos RF130 y RF137. Aquí se aprecia que todas las 16 colonias que se analizaron amplificaron para esta región.

300pb 200pb

180pb

100pb

Fig. 15. Tamizaje por PCR de la región 5´ terminal del aislamiento H33 (testigo positivo). Carril 1: Marcador 100 pb; carriles 2 – 15 colonias analizadas.

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6.7.4.

Extracción del DNA plasmídico

Las colonias que fueron amplificadas en el tamizaje por PCR, fueron seleccionadas y el DNA plasmídico fue extraído mediante una lisis alcalina.

Al modificar las dos técnicas reportadas por Sambrook y cols. (1989), para la extracción del DNA plasmídico, se logró extraer DNA en mayor cantidad y mejor calidad como se puede observar en la figura 16, donde en cada carril se colocaron 4 µl del DNA plasmídico en un gel de agarosa al 1%. Las colonias con asterisco fueron seleccionadas para hacer la digestión enzimática con la enzima Eco RI.

* 1

2

3

4

5

6

7

8

*

*

*

*

9

10 11 12 13 14 15 16

Fig. 16. Extracción de DNA plasmídico del aislamiento V2. Carril 1: vector pCR 2.1; carriles 7, 9, 10, 12, 16 : colonias potencialmente recombinantes con el inserto de interés.

6.7.5. Caracterización enzimática con Eco RI Las colonias seleccionadas que potencialmente tenían el inserto de interés, se les hizo una digestión enzimática con la enzima de restricción Eco RI, ya que esta enzima flanquea la región del inserto de interés. Esto es con la finalidad de que la enzima libere el fragmento de PCR que fue ligado en el plásmido.

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En la figura 17 se puede observar la liberación del fragmento del gen p25 de la cápside de 688 pb en los carriles 3, 4, y 7 (clonas). Esto se realizó en un gel de agarosa al 1.5 %, en el cual se corrieron 5 µl de la muestra.

1093pb 805pb

688pb

516pb

Fig. 17. Digestión enzimática con la enzima de restricción Eco RI. Carril 1: Marcador de peso molecular λ/Pst I; 2-7: DNA plasmídico de las clonas indicadas. Las colonias que liberaron el inserto del gen p25 (cápside) y la región (5´UTR), se secuenciaron en nuestro Centro con ayuda de un secuenciador LI-COR.

6.8. Análisis de secuencias El nombre de las secuencias correspondientes a los aislamientos en este trabajo, se les antepuso el nombre de CBG.

6.8.1. Región no codificante 5’ terminal (5´UTR) En lo que corresponde a la región 5´ terminal se obtuvo la secuencia completa del aislamiento H33 de 273 pb y del CBG-T2 de 269 pb. Las secuencias obtenidas a partir del nucleótido 16 hasta antes del ATG

del primer ORF, del genoma del VTC, el cual

corresponde al gen de la replicasa, fueron alineadas y se compararon con la misma región

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de los genomas de referencia, que son T30 (Florida, raza débil); T385 (España, raza débil), SY568 (California, raza severa, causa picado de tallo) y T36 (Florida, raza severa, causa declinamiento). La longitud de los alineamientos tiene un tamaño de 94 pb, los cuales corresponden a la región no codificante, que es de 107 nucleótidos arriba del primer gen (Fig. 18).

T30 T385 SY568 CBG-H33 CBG-T2 T36

-CCCGTATC-TCCGGAGCTCG-ATCCGGACCCTGCGGGACTTGGTGTAAATCCCAACCAG -CCCGTACC-TCCGGAGCTCG-ATCCGGACCCTGCGGGACTTGGTGTAAATCCCAACCAG -CCCGTACCCTCCGGAAATCACGTCCGGACGCTGCGGGAATCGGTGTAAATCCCGGC-AA -CCCGTACCCTCCGGAAATCACGTCCGGACGCTGCGGGAATCGGTGTAAATCCCGGC-AA -CCCGTACCCTCCGGAAATCACGTCCGGACGCTGCGGGATTTGGTGTAGGTCCAGGCCAACCTGT-TCGCCCAGAAAATACGTCTGGCACAACAGGGATCCGGAATAGGTCC-AGCCTT ** ** * ** ** ** ** **** ** ** *** *

T30 T385 SY568 CBG-H33 CBG-T2 T36

ACGGTTGTTCTACGCCCATAATATCAATA-CAATATG ACGGTTGCTCTACGCCCATAATATCAATA-CAACATG ATTGCCCCACTACGGCCATACAAACAACAACAATATG ATTGCCCCACTACGGCCATACAAACAAATATATCATG ATTGCCCCACTACGCCCATACAAACAAACACAATATG TAAGCTCTAATATTCCCACAACAAAAATTACACTATG * ** *** * * ** *

Fig. 18. Alineamiento múltiple de la región 5´ terminal (5´UTR) de los aislamientos CBG-H33 y CBG-T2 contra las razas de referencia del VTC. Los asteriscos (*) indican aminoácidos idénticos; (:) indica grupos de aminoácidos fuertemente conservados; (.) indica grupos de aminoácidos débilmente conservados. Se indica con rojo el inicio de la transcripción del gen de la replicasa.

Una vez alineadas las secuencias, se procedió a realizar el dendograma de similitud, en el cual se empleó el programa SEQBOOT (BOOTSTRAP) del conjunto de programas Phylip (Felsenstein, 1993); por el método de Máxima Parsimonia. El dendograma formó dos grupos principales, el primero está formado por los aislamientos T385 y T30 (débiles) y dentro de este mismo al aislamiento T36 (severo); En el segundo grupo los aislamientos SY568 (severo, picado de tallo), CBG-H33 (severo, declinamiento y picado de tallo) y el aislamiento CBG-T2; lo cual indica que estos últimos podrían considerarse como potencialmente severos (Fig. 19).

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Fig. 19. Dendograma mostrando la relación de diferentes aislamientos del VTC mediante un análisis computacional de las secuencias nucleotídicas de la región 5´ terminal (5´UTR). Los aislamientos de referencia son el T36 (severo, declinamiento); SY568 (severo, picado de tallo); T30 (débil) y T385 (débil).

El Cuadro 7 muestra los porcentajes de identidad de la región 5´UTR de nuestras secuencias con respecto a las reportadas en el banco de genes (NCBI). Como puede observarse, el aislamiento CBG-H33 presenta una homología total con la raza severa SY568, mientras que el porcentaje más alto de identidad para el aislamiento CBG-T2 es también con la raza SY568. El porcentaje de identidad de la muestra CBG-H33 comparado con una raza débil T30 fue de solo 90%; asimismo, la muestra CBG-T2 comparado con la misma raza débil dio una identidad del 71%.

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Cuadro 7.

Comparación de la región 5´ terminal (5´UTR) de los aislamientos CBG-

H33 y CBG-T2, con secuencias de razas débiles y severas.

AISLAMIENTO

% IDENTIDAD

CBG-H33

100

SY568 (California, Picado de tallo)

90

T30 (Florida, débil)

CBG-T2

91 71

AISLAMIENTO RELACIONADO

SY568 (California, Picado de tallo T30 (Florida, débil)

6.8.2. Análisis de las secuencias del gen p25 (cápside) Para el gen p25 (cápside) se lograron obtener 4 secuencias completas de los aislamientos NL1, V1, NL2, V2 y una secuencia parcial del aislamiento CBG-T2. Estas secuencias se compararon en el banco de genes (NCBI) para asegurar que corresponden al gen p25 del VTC. Posteriormente, se procedió a traducir la secuencia de nucleótidos en aminoácidos mediante el programa ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). El siguiente paso fue realizar un alineamiento múltiple entre las secuencias estudiadas (CBG-NL1, CBG-NL2, CBG-V1 y CBG-V2), comparándose entre ellas para obtener su porcentaje de identidad. Al mismo tiempo, esto permitiría rastrear la posibilidad de que una misma raza del VTC estuviera presente en las regiones de donde procedían las muestras. Estos análisis mostraron que había diferencias entre sus secuencias y por lo tanto podríamos pensar que se trata de infecciones independientes o de razas diferentes. Pero sobre todo, hay que señalar un par de cambios interesantes. En la figura 20 se muestra el alineamiento múltiple de las secuencias, el aislamiento CBG-V2, el cual presenta una serina (S) en el residuo 49, mientras que los otros tres aislamientos poseen una glicina (G). Así mismo, en el residuo 63, el aislamiento CBG-V2 presenta una alanina (A) mientras que en los otros aislamientos conserva una treonina (T). Es importante señalar estos dos cambios, ya que más adelante se discutirá su posible implicación en la agresividad de los aislamientos del VTC.

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CBG-NL1 CBG-V2 CBG-V1 CBG-NL2

MDDETKKLKNKNKETKEGDNVVAAESSFGSVNLHIDPTLITMNDVRQLGTQQNAALNRDL MDDETKKLKNKNKETKEGDEVVAAESSFGSVNLHIDPTLITMNDVRQLSTQQNAALNRDL MDDETKKLKNKNKEAKEGDDVVAAESSFGSMNLHIDPTLITMNDVRQLGTQQNAALNRDL MDDETKKLKNKNKEAKEGDDVVSAESSFGSMNLHIDPTLITMNDVRQLGTQQNAALNRDL **************:****:**:*******:*****************.***********

CBG-NL1 CBG-V2 CBG-V1 CBG-NL2

FLTLKGKYPNLSDKDKDFHIAM-MLYRLVVKSSSLQSDDDTTGITYTREGVEVVLSDKLW FLALKGKYPNLPDKDKDFHIAM-MLYRLAVKSSSLQSDDDTTGITYTREGVEVDLSDKLW FLTLKGKYPNLPDKDKDFHIAM-MLYRLAVKSSSLQSDDDTTGITYTREGVEVDLPDKLW FLTLKGKYPNLPDKDKDFHIGYDVVIVIAVKSSSLQSDDDTTGITYTREGVEVDLPDKLW **:********.********. :: :.************************ *.****

CBG-NL1 CBG-V2 CBG-V1 CBG-NL2

TDVVFNSKGIGNRANALRVWGRTNDAL-------YLAFCRQNRNLSYGGRPLDAGIPAGY TDIVYNSKGIGNRTNALRVWGRTNDAL-------YLAFCRQNRNLSYGGRPLDAGIPAGY TDVVFNSKGIGNRTNALRVWGRTNDALSCFLCVTHLSYGGQYRNLSYGGRPLDAGIPAGY TTSCLTPRVMVTVLTPVEVWGRTNDAL-------YLAFCRQNRNLSYGGRPLDAGIPAGY * ..: : . ..:.********* :*:: * ******************

CBG-NL1 CBG-V2 CBG-V1 CBG-NL2

HYLCASFLTGAGLTDLEVCAVYIEAKGSNCCRSEGLIKSYYHVRQLGKFNTR HYLCADFLTGAGLTDLE-CAVYIQAKEQLLKKRGADEVVVTNVRQLGKFNTR HYLCADFLTGAGLTDLE-CAVYIQAKEQLFEEAR-SVNRVTNCQAAWEI--HYLCADFLTGAGLDWIE-CAVYNQAKEQLLRRRGADEVVVTNVRLKNNR--*****.******* :* **** :** . . : : :

Fig. 20. Alineamiento múltiple de secuencias aminoacídicas de 4 aislamientos de Nuevo León y Veracruz. Los asteriscos (*) indican aminoácidos idénticos; (:) indica grupos de aminoácidos fuertemente conservados; (.) indica grupos de aminoácidos débilmente conservados. Los residuos 49 y 63 están marcados en rojo.

A continuación se realizó un alineamiento múltiple de las secuencias antes mencionadas con las ya reportadas y tomadas como referencia (Fig. 21). Es importante resaltar que hubo cambios muy notorios; uno de ellos se presenta en el residuo 49 (señalado con letras rojas) donde el aislamiento CBG-V2, el cual se agrupó con las razas caracterizadas como débiles (T30 y T385) presenta el aminoácido serina (S), mientras que las otras secuencias tienen conservado el aminoácido glicina (G) en la misma posición, siendo estas razas caracterizadas como severas. El segundo cambio se encontró en el residuo 63 (señalado con letras rojas), donde los aislamientos o razas débiles presentaron el aminoácido alanina (A) y las razas severas treonina (T). Estos dos aminoácidos (glicina y treonina) parecerían distinguir a las razas débiles de las severas. Habría que estudiar posteriormente si estos residuos podrían jugar un papel importante en la patogenicidad del VTC. Al mismo tiempo, cabe señalar que los aislamientos CBG-V2 y CBG-T2 no presentan los sitios Hae III y Kpn I al igual que los reportados como razas débiles (Cuadro 5). Sin embargo, las razas severas que ocasionan declinamiento como la T36 presentan únicamente el sitio Hae III y las

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severas que ocasionan picado de tallo como SY568 presentan los sitios Hae III y Kpn I junto con CBG-NL1, CBG-NL2 y CBG-V1 (Cuadro 6). El cambio que se presenta en la secuencia de la cápside, a raíz de la presencia del sitio Kpn I es en la tercera posición del codón de treonina, por lo tanto el cambio es a nivel nucleotídico y no a nivel aminoacídico. Asimismo, la enzima Hae III también corta en la tercera posición de un codón de alanina y el cambio es también a nivel nucleotídico.

T30 CBG-V2 T385 SY568 T36 CBG-NL1 CBG-V1 CBG-NL2

MDDETKKLKNKNKETKEGDEVVAAESSFGSVNLHIDPTLITMNDVRQLSTQQNAALNRDL MDDETKKLKNKNKETKEGDEVVAAESSFGSVNLHIDPTLITMNDVRQLSTQQNAALNRDL MDDETKKLKNKNKEMKEGDDVVAAESSFGSVNLHIDPTLITMNDVRQLSTQQNAALNRDL MDDETKKLKNKNKETKEGDDVVAAESSFGSLNLHIDPTLIAMNDVRQLGTQQNAALNRDL MDDETKKLKNKNKETKEGDDVVAAESSFGSLNLHIDPTLIAMNDVRQLGTQQNAALNRDL MDDETKKLKNKNKETKEGDNVVAAESSFGSVNLHIDPTLITMNDVRQLGTQQNAALNRDL MDDETKKLKNKNKEAKEGDDVVAAESSFGSMNLHIDPTLITMNDVRQLGTQQNAALNRDL MDDETKKLKNKNKEAKEGDDVVSAESSFGSMNLHIDPTLITMNDVRQLGTQQNAALNRDL ************** ****:**:*******:*********:*******.***********

CBG-V2 T30 T385 SY568 T36 CBG-NL1 CBG-V1 CBG-NL2

FLALKGKYPNLPDKDKDFHIAM-MLYRLAVKSSSLQSDDDTTGITYTREGVEVDLSDKLW FLALKGKYPNLPDKDKDFHIAM-MLYRLAVKSSSLQSDDDTTGITYTREGVEVDLSDKLW FLALKGKYPNLPDKDKDFHIAM-MLYRLAVKSSSLQSDDDTTGITYTREGVEVDLSDKLW FLTLKGKYPNLSDKDKDFHIAM-MLYRLAVKSSSLQSDDDTTGITYTREGVEVDLSDKLW FLTLKGKYPNLSDKDKDFHIAM-MLYRLAVKSSSLQSDDDTTGITYTREGVEVDLSDKLW FLTLKGKYPNLSDKDKDFHIAM-MLYRLVVKSSSLQSDDDTTGITYTREGVEVVLSDKLW FLTLKGKYPNLPDKDKDFHIAM-MLYRLAVKSSSLQSDDDTTGITYTREGVEVDLPDKLW FLTLKGKYPNLPDKDKDFHIGYDVVIVIAVKSSSLQSDDDTTGITYTREGVEVDLPDKLW **:********.********. :: :.************************ *.****

CBG-V2 T30 T385 SY568 T36 CBG-NL1 CBG-V1 CBG-NL2

TDIVYNSKGIGNRTNALRVWGRTNDAL-------YLAFCRQNRNLSYGGRPLDAGIPAGY TDIVYNSKGIGNRTNALRVWGRTNDAL-------YLAFCRQNRNLSYGGRPLDAGIPAGY TDIVYNSKGIGNRTNALRVWGRTNDAL-------YLAFCRQNRNLSYGGRPLDAGIPAGY TDVVFNSKGIGNRTNALRVWGRSNDAL-------YLAFCRQNRNLSYGGRPLDAGIPAGY TDVVFNSKGIGNRTNALRVWGRSNDAL-------YLAFCRQNRNLSYGGRPLDAGIPAGY TDVVFNSKGIGNRANALRVWGRTNDAL-------YLAFCRQNRNLSYGGRPLDAGIPAGY TDVVFNSKGIGNRTNALRVWGRTNDALSCFLCVTHLSYGGQYRNLSYGGRPLDAGIPAGY TTSCLTPRVMVTVLTPVEVWGRTNDAL-------YLAFCRQNRNLSYGGRPLDAGIPAGY * ..: : . ..:.****:**** :*:: * ******************

CBG-V2 T30 T385 SY568 T36 CBG-NL1 CBG-V1 CBG-NL2

HYLCADFLTGAGLTDLE-CAVYIQAKEQLLKKRGADEVVVTNVRQLGKFNTR HYLCADFLTGAGLTDLE-CAVYIQAKEQLLKKRGADEVVVTNVRQLGKFNTR HYLCADFLTGAGLTDLE-CAVYIQAKEQLLKKRGADEVVVTNVRQLGKFNTR HYLCADFLTGAGLTDLE-CAVYIQAKEQLLKKRGADEVVVTNVRQLGKFNTR HYLCADFLTGAGLTDLE-CAVYIQAKEQLLKKRGADEVVVTNVRQLGKFNTR HYLCASFLTGAGLTDLEVCAVYIEAKGSNCCRSEGLIKSYYHVRQLGKFNTR HYLCADFLTGAGLTDLE-CAVYIQAKEQLFEEAR-SVNRVTNCQAAWEI--HYLCADFLTGAGLDWIE-CAVYNQAKEQLLRRRGADEVVVTNVRLKNNR--*****.******* :* **** :** . . : : :

Fig. 21. Alineamiento múltiple de secuencias de aminoácidos del gen p25. Los asteriscos (*) indican aminoácidos idénticos; (:) indica grupos de aminoácidos fuertemente conservados; (.) indica grupos de aminoácidos débilmente conservados. Los residuos

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distintivos 49 y 63 se muestran en color rojo. En azul residuos conservados en razas severas fenilalanina (F) y en razas débiles tirosina (Y).

Una vez que se hizo el alineamiento múltiple, se procedió a realizar el dendograma de similitud, utilizando el programa anteriormente descrito. Este análisis generó dos grupos o ramas principales; la primera de ellas agrupó a las razas severas de declinamiento y picado de tallo T36 y SY568 respectivamente, con los aislamientos CBG-NL1, CBG-NL2, CBGV2. El segundo grupo lo formaron los aislamientos T30 (débil) y CBG-V2 (Fig. 22).

Fig. 22. Dendograma mostrando la relación de diferentes aislamientos del VTC mediante un análisis computacional de las secuencias aminoacídicas del gen que codifica para la cápside. Los aislamientos de referencia son el T36 (severo, declinamiento); SY568 (severo, picado de tallo); T30 (débil) y T385 (débil).

Las secuencias de los aislamientos, a nivel de nucleótidos se compararon con el programa BLAST para determinar con que tipo de razas, en cuanto a severidad se refiere, principalmente comparten una alta identidad aminoacídica. Los porcentajes de identidad con las secuencias ya reportadas, se muestran en el cuadro 8.

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Cuadro 8.

Comparación del gen p25 (cápside) de los aislamientos CBG-NL1, CBG-

NL2, CBG-V1, CBG-V2 y CBG-T2 con secuencias de razas débiles y severas.

AISLAMIENTO

% IDENTIDAD

AISLAMIENTO RELACIONADO

CBG-NL1 CBG-NL2

96 94 94

H33 (P. Tallo y Declin.) SY568 (California, P. Tallo) PB61 (Australia. P. Tallo)

CBG-V1

96

PB61 (Australia. P. Tallo)

CBG-V2

99

T30 (Florida, débil)

CBG-T2 (parcial)

94

T30 (Florida, débil)

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7.

DISCUSION

Previamente ha sido reportado que la detección del VTC, a nivel mundial como en México, se hace por reacción inmunológica, usando anticuerpos generados con la capa proteica (cápside) de este virus (Vela y cols., 1986; Permar y cols., 1990). Sin embargo, la técnica de inmunoimpresión y la PCR últimamente han tomado mucho popularidad, sobre todo esta última. De ahí que una de nuestras primeras metas fue amplificar el gen de la cápside a partir de las muestras de trabajo.

En este proyecto se realizó una caracterización molecular de aislamientos del virus de la tristeza de los cítricos presentes en huertos citrícolas comerciales del noreste de México.

Como fue mencionado anteriormente, solo en 6 muestras de las 11 en total se amplificó el gen de la cápside, en una de ellas la amplificación fue muy leve, a pesar de haber intentado incrementar la concentración del RNA total extraído de los tejidos, y modificar varias condiciones de reacción, como la temperatura de alineamiento, concentración de cDNA y cloruro de magnesio con el fin de darle el máximo de probabilidad de amplificación siempre y cuando el VTC estuviera presente. De acuerdo con nuestros resultados, consideramos que cinco de las muestras provenían de árboles que no se encontraban infectados por el virus o al menos, habían sido catalogadas como positivas de acuerdo al análisis serológico, por lo tanto creemos que resultaron ser falsos positivos. Aquella muestra, en la que solo se logró obtener una amplificación muy leve, probablemente se debió a que la concentración del virus en tejido era muy baja y sobre todo a que el tejido estaba muy deteriorado y por consecuencia el RNA. Bar-Joseph y cols. (1980) aseguran que las bajas concentraciones del RNA viral, provocan una amplificación deficiente.

No obstante que los SSCP detectan cambios en una base nucleotídica, debido a que el DNA de cadena sencilla adquiere una estructura diferente bajo condiciones no desnaturalizantes y los cambios en una base hacen que el DNA migre de manera diferente. Esta técnica presenta varias desventajas, ya que la concentración y el pH del buffer, la concentración del gel y la temperatura, tienen un efecto dramático en la movilidad del fragmento de DNA; las 50

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interacciones azúcar-base y azúcar-azúcar juegan un papel importante en la estructura secundaria, determinando la conformación y por lo tanto la movilidad (Liu y cols., 2000). Aunado a ésto, se tiene que considerar que para lleva a cabo la tinción de los geles de poliacrilamida con nitrato de plata, es más tardado y minucioso que teñir con bromuro de etidio. Si bien es cierto que el nitrato de plata es más sensible en la detección de DNA, también es muy dependiente de las condiciones de revelado, porque si se pasa el tiempo requerido el gel se torna amarillento y el perfil de bandeo se obscurece demasiado, dificultando su definición. Si no se cuidan todos estos aspectos técnicos antes mencionados, los datos generados por los SSCP no son confiables para la separación y migración de la cadenas de DNA.

Los DNAc del gen p25, al ser analizados por el método de SSCP pudieron formar dos grupos, el primero integrado por los aislamientos de V1, NL2 y T2, los cuales presentaron un perfil electroforético diferente al segundo grupo, el cual estuvo formado por los aislamientos de NL1, V2 que presentaron un mismo perfil semejante al aislamiento H33 del cual sabemos pertenece a una raza severa. Sin embargo, dadas las dificultades técnicas que este tipo representa, estos análisis dieron resultados poco confiables para poder separar las razas débiles y severas, ya que para hacer un diagnóstico más preciso y profundo se requieren de un número considerable de aislamientos positivos con su caracterización biológica y así poder comparar los perfiles electroforéticos que presentan éstos, con los perfiles que presentan otros aislamientos. Pero sobre todo resultó ser un método difícil de reproducir y sobre todo muy laborioso, y como ya se mencionó hemos detectado un método potencialmente confiable y sencillo a aplicar y sobre todo fácilmente reproducible. Claro está que siempre se requerirá de contar con un número mayor de muestras para darle mayor peso al mismo. Sin embargo, habrá que hacer mención que Lee y cols. (1996) analizaron el gen p27 que codifica para la parte complementaria de la cápside, con este mismo tipo de método y ellos lograron diferenciar 8 aislamientos de razas débiles y agresivas y dentro de éstas últimas las que causan declinamiento y picado del tallo, generando diferentes patrones de migración de las bandas y separando los diferentes grupos de razas. Cabe señalar que de los aislamientos utilizados, se sabía el tipo de raza al que pertenecía por su caracterización biológica y mediante esta técnica de SSCP les dio una relación muy confiable, debido a que

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los perfiles generados por estos análisis eran idénticos a las características que presentaban biológicamente.

Los oligonucleótidos utilizados para amplificar la región 5´ terminal descritos por Ayllón y cols. (2001) (Cuadro 2) fueron diseñados con base en la secuencia de tres diferentes razas del virus. Dos de ellas provocan síntomas severos como son el declinamiento y picado de tallo y la otra solo ocasiona síntomas muy débiles. El diseño de estos oligonucleótidos se hizo con el fin de buscar polimorfismos entre las diferentes razas del VTC. Estos investigadores diseñaron cuatro oligonucleótidos PM33, PM34, PM35 y RF130, tres de estos se unen al molde en forma sentido y uno (RF137) en antisentido. Para las razas que provocan declinamiento se diseñaron los oligonucleótidos PM35 y RF130, los cuales clasificaron como secuencias del tipo I; para las razas que provocan picado de tallo se diseñó el oligonucleótido PM33 quedando clasificado como secuencias del tipo II y para las razas débiles se diseñó el oligonucleótido PM34, secuencia del tipo III. Se utilizó como único oligonucleótido antisentido el RF137 para todos los aislamientos. Sus resultados mostraron que 19 aislamientos pertenecían al tipo III. Además, se encontró que 8 de ellos compartían dos tipos de secuencias; presentaban los tipos II y III, 11 del tipo I y III, finalmente 19 aislamientos presentaron los 3 tipos. Sin embargo, se concluyó que la aparente asociación entre la expresión de los síntomas en el hospedero y la predominancia de secuencias del tipo II en la región 5’ terminal, no necesariamente significa que esta región del RNA genómico está directamente involucrada en la patogénesis del VTC (Ayllon y cols., 2001).

En este trabajo, utilizando los mismos oligonucleótidos descritos anteriormente, encontramos que de las 11 muestras utilizadas (Cuadro 1) los aislamientos de NL1, NL2, NL3, T1 y V1 no generaron amplificación alguno con ninguna de las combinaciones de los oligonucleótidos descritos. Con referencia a las muestras NL1 y T1, estos resultados no nos sorprenden, ya que cuando se intentó amplificar el gen de la cápside a partir de estas muestras, su amplificación también resultó negativa. Lo anterior en realidad nos confirma que estas muestras provenían de árboles sanos. Por el contrario, los resultados de las muestras de NL2, NL3 y V1 nos hacen pensar en un deterioro de los tejidos utilizados, y

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por lo tanto del RNA obtenido. Estas observaciones nos llevan a sugerir que una optimización de las condiciones para la PCR bajo situaciones de este tipo requieren ser estudiadas en mayor detalle para evitar posibles falsos negativos. Probablemente, el uso de la técnica de PCR anidada pudiera ser de utilidad, presuponiendo un bajo título viral. Del total de muestras amplificadas, una de ellas V1, amplificó con los oligonucleótidos para secuencias del tipo I; otro aislamiento NL6, amplificó para secuencias del tipo II; dos aislamientos NL4 y NL7 coincidieron con secuencias del tipo III. Sin embargo, dos aislamientos NL5 y H33 concordaron con secuencias del tipo I y III; y finalmente, el aislamiento T2 presentó los tres tipos. Esto nos llevaría a pensar en que estas muestras podrían estar infectadas por más de una variante del VTC, como ya se ha propuesto anteriormente (Ayllón y cols., 1999). Solamente los aislamientos de T2 y H33 generaron bandas intensas, lo que puede ser debido a que tenían mayor cantidad de partículas virales, tomando como base que el VTC se caracteriza por estar en mayores cantidades en tejidos ricos en floema, como son la corteza, pecíolo y nervadura central de hojas tiernas en desarrollo, pues las partículas de VTC generalmente tienden a decrecer a medida que, los tejidos maduran y endurecen, especialmente en condiciones de altas temperaturas (BarJoseph y cols., 1980); el tiempo de inoculación del virus en la planta, ya sea por el áfido Toxoptera citricida o por material vegetativo infectado (injerto), porque una vez que el virus entra en contacto con la planta, aparece una necrosis en la zona del injerto alrededor de 7 u 8 meses posterior a la inoculación y los principales síntomas se manifiestan al cabo de los 10 a 23 meses después (Agrios, 1995).

Cabe señalar que los aislamientos que amplificamos para esta región, no los tenemos caracterizados biológicamente, excepto el H33, que es un aislamiento que presenta síntomas severos como declinamiento y picado de tallo, y en nuestro caso fue amplificado con los oligonucleótidos PM35/RF130 que fueron diseñados para razas que producen declinamiento, y el oligonucleótido PM33/RF130 para razas que producen picado de tallo. El propósito de encontrar posibles diferencias en los RFLP del gen de la cápside amplificado por PCR, entre las razas severas y débiles, una vez digeridos con la enzima de restricción Alu I, no fue exitoso. Si bien es cierto que la enzima Alu I no había sido reportada para diferenciar razas de VTC, esta enzima ha sido utilizada ampliamente en 53

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diversos estudios relacionados a nivel nucleotídico en genes de diversos organismos y por su alto número de sitios de corte (Han y New, 1998). Con los patrones que se formaron al hacer las digestiones enzimáticas del gen se generó un dendograma de similitudes utilizando un conjunto de programas computacionales (EMBOSS, Cross Checker y TreeView). Al analizar este dendograma (Fig, 12) nos confirma lo que ya habíamos visualizado en el gel. Si bien es cierto que por una lado agrupa aislamientos de una misma región, NL2 y NL1 y muy cercanos a los aislamientos V1 y T2, lo cual nos indica que estos aislamientos forman patrones muy similares entre ellos. Coincidentemente los hemos catalogado como razas débiles. Sin embargo, habría que señalar que el aislamiento H33, del cual sabemos pertenece a una raza severa, esta agrupado con el aislamiento V2, el cual lo tenemos catalogado como una raza débil. Si bien, es cierto que un número mayor de aislamientos del VTC serían necesarios para darle más solidez a estas observaciones, si podríamos mencionar que los perfiles generados con esta enzima Alu I, no permitirían una separación confiable entre las razas débiles de las severas.

Por otro lado, el haber utilizado las enzimas de restricción Hae III y Kpn I para caracterizar las razas del VTC, fue muy conveniente en nuestro caso, ya que nos permitió separar las razas severas y débiles a partir del gen p25 que codifica para cápside. Como se muestra en los cuadros 5 y 6, el análisis se realizó primeramente a partir de 25 secuencias reportadas donde en ocho de ellas se menciona su caracterización biológica, aunque en el resto de ellas, solo mostraban su secuencia nucleotídica. Con este conjunto de secuencias se hizo un mapa de restricción para cada una de ellas, lo cual arrojó que las razas de VTC pertenecientes a razas débiles no presentaron los sitios de restricción de Hae III y Kpn I (Cuadro 5). Por otro lado, las razas severas que producen declinamiento tienen conservado solo el sitio Hae III, pero no el sitio Kpn I. Algo muy interesante es que las razas de virus que producen picado de tallo presentan tanto los sitios Hae III como Kpn I, a excepción de un sola secuencia que solo presentó el sitió Kpn I, aunque habría que aclarar que de este aislamiento en su secuencia no se menciona su caracterización biológica (Cuadro 6).

Los resultados obtenidos a partir de los aislamientos NL1, V1 y NL2 los cuales forman un mismo grupo junto con el testigo positivo (H33) de Texas, presentaron únicamente el sitio

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de corte Hae III en los nucleótidos 164 y 516 respectivamente. Mientras que los aislamientos T2 y V2 formaron otro grupo al no presentar el sitio de corte por esta enzima. Posteriormente, a los aislamientos que presentaron el sitio Hae III se les realizó una segunda digestión con la enzima de restricción Kpn I, la cual está presente en las razas que provocan tanto declinamiento como picado de tallo, y en los cuales hubo un solo grupo junto con el testigo positivo.

Todo nos indica que estas enzimas discriminan entre razas débiles y severas, y dentro de estas últimas, las razas que producen declinamiento y picado de tallo. Estas enzimas solo presentan un sitio único de restricción en las secuencias de las razas severas.

Gillings y cols. (1993) encontraron que mediante los RFLP y utilizando la enzima de restricción Hinf I para digerir el gen p25 (cápside), se generaron siete patrones diferentes los cuales están asociados con sus características biológicas, permitiendo una categorización de aislamientos de VTC sin necesidad de clonar y secuenciar el gen.

Por consiguiente, la enzima Hae III que nosotros utilizamos, discrimina fácilmente las razas débiles de las severas, ya que genera un solo patrón y fácilmente se pueden distinguir unas de otras. Además, la enzima Kpn I, separa dentro de las razas severas las que producen declinamiento y picado de tallo, formando un solo patrón y lográndose diferenciar fácilmente unas de otras. Consideramos que el protocolo desarrollado en este trabajo, supera a otros reportados, porque genera únicamente un patrón para discriminar entre las razas débiles de las severas y dentro de estas últimas a las que producen declinamiento y picado de tallo; es decir, que solo presentan un único sitio de corte, en los cuales si están presentes los sitios Hae III y Kpn I, que reconocen las secuencias GG/CC y GGTAC/C, respectivamente, va a cortar la enzima. Por ejemplo, dos métodos para diferenciar o separar las razas débiles de las severas han sido publicados (ELISA e hibridación con sondas) uno de ellos se basa en la utilización de anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de partículas virales de razas débiles y/o severas. Asimismo, existe otro método que esta basado primeramente en la amplificación por PCR de una región del gen de la cápside, ya sea de una raza débil o severa para posteriormente ser utilizado este fragmento como sonda

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en hibridaciones tipo southern. Consideramos que un método técnicamente más sencillo y menos costoso podría tener una repercusión probablemente más aceptada que el tener que realizar algunas de las técnicas antes mencionadas, por ejemplo hibridaciones que son más costosas y consumen más tiempo.

En cuanto al análisis de las secuencias, se lograron obtener dos secuencias de la región 5´ terminal, correspondientes a los aislamientos CBG-H33 y CBG-T2, los cuales comparándolos con razas severas como T36 (Florida, declinamiento), SY568 (California, picado de tallo); y razas débiles como T30 (Florida, débil) y T385 (España, débil), se encontraron 36 nucleótidos idénticos en el alineamiento múltiple que representan el 38.29% del total observado. López y cols. (1998) analizaron la variabilidad molecular de las regiones 5´ y 3´ terminal del RNA de 10 aislamientos del VTC, y encontraron un 88% de identidad intragrupos y entre 44 y 63% intergrupos. En este trabajo al comparar por separado las secuencias del aislamiento CBG-H33 y CBG-T2, se encontró que tienen un 100% y 91% de identidad, respectivamente, con la raza severa SY568 que produce picado de tallo. Esto se corroboró con el dendograma generado por este alineamiento, donde agrupó a los aislamientos de CBG-H33 y CBG-T2 con la raza SY568, separando de éstos a las razas débiles.

Las secuencias obtenidas a partir del gen p25 (cápside) de los aislamientos CBG-NL1, CBG-NL2, CBG-V1, CBG-V2 y CBG-T2 (parcial) correspondieron a un fragmento de 688 pb; al realizar el alineamiento entre estas secuencias se encontró arriba del 79% de homología a nivel de aminoácidos. No obstante, en los estudios realizados por Pappu y cols., en 1993 para ver la relación entre la severidad del VTC y el gen de la cápside, encontraron arriba del 80% de similitud entre las secuencias de aminoácidos de 11 aislamientos que analizaron. Cabe señalar que en las secuencias reportadas en este trabajo se encontraron dos cambios muy importantes; en los residuos 49 y 63 los cuales corresponden a una glicina y una treonina. Pappu y cols., en 1993 agruparon 7 aislamientos de Florida y 4 aislamientos con sus propiedades biológicas, entre estos el T30 (débil) y el T36 que causa declinamiento, ambos de la Florida y posteriormente infirieron un dendograma de similitudes; donde los aislamientos severos quedaron dentro de un mismo

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grupo y los débiles formaron otro grupo. Al hacer un alineamiento múltiple de nuestras secuencias junto con las reportadas, en las cuales se conoce su caracterización biológica que son T36 (Florida, causa declinamiento), SY568 (California, causa picado de tallo), T30 (Florida, débil) y T385 (España, débil), encontramos que los aislamientos CBG-NL1, CBGNL2 y CBG-V1 formaron un mismo grupo junto con las razas severas T36 y SY568 (todas estas presentando los sitios Hae III y Kpn I) y el aislamiento CBG-V2 formó otro grupo con la raza débil T30. Hay dos puntos muy importantes que resaltar, el primero es que los cambios que se presentaron en las posiciones 49 y 63 de nuestras secuencias, los cuales son los mismos que se presentan al comparar estas secuencias con las reportadas y tomadas como referencia, donde una glicina (posición 49) está en las razas severas al igual que nuestros aislamientos, cambiado por una serina en las débiles, y en la posición 63 una treonina en las severas y una alanina en las débiles. Estos residuos podrían jugar un papel muy importante en la patogenicidad del VTC. El segundo punto es el cambio que se da en la posición 49 donde cambian los aminoácidos, se encuentra el sitio de corte de la enzima Kpn I que está presente en las razas severas que ocasionan picado de tallo. Asimismo, Pappu y cols., en 1993 además reportan que las razas severas tienen conservado el aminoácido fenilalanina (F), mientras que las razas débiles tienen conservado el aminoácido tirosina (Y) en la misma posición (letras color azul, fig. 21), siendo este un cambio distintivo entre las razas severas y débiles. Ahora bien, al analizar nuestros aislamientos del VTC correlacionan completamente con la presencia de los sitios Hae III y Kpn I con las razas consideradas como severas y la presencia del aminoácido fenilalanina como señala estos autores. Considerando ambos hechos podríamos pensar que además del aminoácido fenilalanina los sitios de restricción Hae III y Kpn I también están conservados en las razas severas pero no en las débiles. Por lo tanto, estas características pueden ser utilizadas como referencia si se pretende hacer una diferencia entre las razas de VTC. Con base en lo anterior anterior, consideramos que la técnica de los RFLP con las enzimas de restricción Hae III y Kpn I del gen de la cápside, tienen mucha potencialidad para poder diferenciar las razas débiles de las severas, dado que siempre es más sencillo y práctico realizar una digestión enzimática del DNA que realizar hibridaciones. Por lo tanto, esta técnica sería potencialmente más rápida y confiable para poder discriminar los tipos de

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razas de VTC, siempre y cuando se aumente el número de secuencias analizadas y que se cuente con su caracterización biológica.

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8.

CONCLUSIONES

1.- El dendograma de similitud generado por los RFLP del gen de la cápside mediante la digestión con la enzima Alu I, no permitió agrupar y/o diferenciar los aislamientos del VTC de acuerdo con su perfil electroforético comparado con una raza severa. De igual forma sucedió con los patrones generados por el análisis tipo SSCP.

2.- El análisis de las secuencias del gen de la cápside mostró que las razas severas tienen conservado el sitio Hae III, y dentro de éstas, utilizando la enzima Kpn I se logró separar las que causan picado de tallo de aquellas que causan declinamiento. Mientras que las razas débiles no poseen ninguno de estos sitios. Las muestras CBG-T2 y CBG-V2 no mostraron estos sitios de corte, por lo tanto son potencialmente débiles. Sin embargo los aislamientos CBG-NL1, CBG-NL2 y CBG-V1 si lo presentaron, por lo tanto podrían considerase como severas, al igual que el testigo positivo H33.

3.- Los dendogramas de similitud generados a partir de las secuencias de aminoácidos del gen de la cápside permitió separar las razas severas de las débiles. Del total de muestras analizadas los aislamientos CBG-NL1, CBG-NL2 y CBG-V1 podrían ser considerados como razas severas y los dos restantes, CBG-T2 y CBG-V2, como posibles razas débiles.

4.- Se encontraron dos aminoácidos conservados, el residuo 49 (glicina) y el residuo 63 (treonina) que pudieran estar involucrados en la patogenicidad del VTC.

5.- En las amplificaciones de la región 5´ terminal se observó que el aislamiento V2 pertenece al tipo I, mientras que NL6 al tipo II, NL4 y NL7 al tipo III y NL5, H33 al tipo I y III Finalmente, T2 presentó una mezcla de los tres tipos, lo cual nos hace pensar en infecciones mezcladas en las muestras H33 y T2.

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9.

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10.

GLOSARIO

Ácidos nucleicos. Polímeros compuestos de nucleótidos que en los organismos vivos se basan en uno de dos azúcares y reciben los nombres de ácido ácido ribonucleico (RNA) y ácido desoxirrinonucleico (DNA).

Aminoácidos. Unidades monoméricas de las proteínas, cada una compuesta por tres grupos funcionales unidos a un carbón alfa central: un grupo amino R característico y un grupo carboxilo.

Cápside. Cubierta proteica de un virión o de una partícula viral.

Cebador, iniciador, oligonucleótido, primer. Secuencia corta de nucleótidos con un 3´OH reactivo que puede iniciar la síntesis de DNA a lo largo de un molde o plantilla.

Clonación del DNA. Técnica de uso muy extendido para producir grandes cantidades de un segmento específico de DNA.

Código genético. Sistema mediante el cual la secuencia de nucleótidos de DNA codifica la información para elaborar proteínas.

Codones. Secuencias de nucleótidos (tripletes de nucleótidos) que especifican aminoácidos.

Digestión enzimática. Acción de cortar un fragmento de DNA de doble cadena por una enzima de restricción.

DNA ligasa. Enzima encargada de unir los fragmentos de Okazaki en una cadena continua.

DNA polimerasa. Enzimas encargadas de construir nuevas cadenas de DNA.

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Electroforesis. Migración de partículas suspendidas en un campo eléctrico.

Enzima. Proteína vitalmente importante que cataliza las reacciones celulares.

Espectrofotómetro. Instrumento empleado para medir la cantidad de luz de una longitud de onda específica absorbida por una solución. Si se conoce la absorbancia característica de un tipo particular de moléculas, entonces la cantidad de luz de longitud de onda apropiada absorbida por una solución de dicha molécula suministra una medida sensible de su concentración.

Filogenia. Historia evolucionista de poblaciones de organismos con parentesco.

Genes. Segmentos de DNA que contienen la información para una sola molécula de polipéptido o de RNA, incluyendo regiones transcritas pero no codificadas.

Genoma. Complemento de la información genética única para cada especie de organismo.

Inserto. Fragmento de DNA de doble cadena preparado para si introducción en un vector.

IPTG. Induce la síntesis de la beta-D-galactosidasa, una enzima que promueve la utilización de la lactosa. Se utiliza para inducir la expresión del gen del lacZ en experimentos de la reproducción.

Ligación. Enzima que une los extremos de dos cadenas de ácido nucleico.

Mapa de restricción. Tipo de mapa físico de los cromosomas basado en la identificación del ordenamiento de conjuntos de fragmentos generados por las enzimas de restricción.

Marcador de masas. Permite la determinación del tamaño de manera fácil y exacta de ADN lineal de doble cadena.

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Nucleótido. Monómero de ácidos nucleicos, cada uno con tres partes: un azúcar (ribosa o desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada; el fosfato está unido al azúcar y al carbono 5´ y a la base del carbono 1´.

Proteínas. Grupo diverso estructural y funcionalmente de polímeros construidos a base de monómeros de aminoácidos.

RFLP (Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción). Diferencia genética entre individuos que se detecta comparando fragmentos de DNA liberados mediante digestión con una o más enzimas de restricción.

Tamizaje. Evaluación de clonas individuales para detectar ciertas propiedades o características.

Transformación. Alteración genética de bacterias ocasionada por la incorporación de DNA extraño en las células bacterianas.

Vector DNA. Vehículo para transportar DNA extraño en la célula huésped adecuada, como la bacteria E. coli. El vector contiene secuencias que le permiten duplicarse dentro de la célula huésped. Más a menudo, el vector es un plásmido o el virus bacteriano lambda (λ). Una vez que el DNA se encuentra en el interior de la bacteria se duplica y reparte entre las células hijas.

Virus. Patógeno intracelular obligatorio pequeño que no se considera vivo debido a que no puede dividirse directamente, el cual es necesario para la teoría celular de la vida.

X-gal. Se utiliza conjuntamente con IPTG para detectar actividad de la beta-galactosidasa.

70

M

2

2

2

2

Carriles: NL4 = 6-9 NL5 = 10-13

M PM33 PM34 PM35 RF130

NL6

PM33 PM34 PM35 RF130 PM33

PM34 PM35 RF130

M PM33 PM34 PM35 RF130 PM33 PM34 PM35 RF130

NL3

M PM33 PM3 PM35 RF13 PM33PM34 PM35RF130

Carriles: NL1 = 2-5 NL2 = 6-9 H33 = 10-13

M PM33 PM35 RF130 PM34

Carriles: NL7 = 2-5 NL3 = 6-9 V1 = 10-13 M

T2

PM33 PM34 PM35 RF130 PM33 PM34 PM35 RF130 PM33 PM34 PM35 RF130