INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

“DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO” TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA PRESENTA:

Biól. JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

Diciembre del 2009, Reynosa (Tam.), México

El presente trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Industrial del Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección de la Dra. Claudia Patricia Larralde Corona.

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

ÍNDICE ABREVIATURAS _________________________________________________________ VI DEDICATORIA _________________________________________________________ VII AGRADECIMIENTOS ____________________________________________________ VIII RESUMEN _______________________________________________________________ IX ABSTRACT _______________________________________________________________ X 1. INTRODUCCIÓN ________________________________________________________ 1 2. ANTECEDENTES ________________________________________________________ 2 2.1. Bioquímica y biología del proceso de fermentación del vino ____________________ 2 2.2. Las sucesiones microbianas en el vino y sus técnicas de estudio _________________ 5 2.2.1. Electroforesis en gel de campos pulsados ________________________________ 7 2.2.2. Polimorfismo del ADN mitocondrial (ADNmt) ___________________________ 8 2.2.3. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción del ADN (RFLP) __ 8 2.2.4. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP) __________ 8 2.2.5. Hibridación fluorescente in situ (FISH) _________________________________ 9 2.3. El proceso de elaboración del mezcal y tequila ______________________________ 11 2.3.1. El jimado ________________________________________________________ 11 2.3.2. Cocción _________________________________________________________ 11 2.3.3. Molienda: obtención del mosto _______________________________________ 12 2.3.4. Fermentación _____________________________________________________ 13 2.3.5. Destilación _______________________________________________________ 13 3. JUSTIFICACIÓN ________________________________________________________ 15 4. HIPÓTESIS ____________________________________________________________ 16 5. OBJETIVO GENERAL ___________________________________________________ 16 6. OBJETIVOS ESPECÍFICOS _______________________________________________ 16 7. MATERIALES Y MÉTODOS______________________________________________ 17 7.1. Levaduras ___________________________________________________________ 17 7.1.1. Conservación de las levaduras en glicerol ______________________________ 17 7.2. Extracción de ADN de las levaduras ______________________________________ 18 7.2.1. Identificación molecular de las levaduras _______________________________ 18 7.2.2. Secuenciación de la región 26S e ITS1-5.8S-ITS2 del ADNg _______________ 20 7.3. Cálculo de los índices de diversidad de la fermentación del mezcal ______________ 21 7.4. Fermentaciones modelo en medio de mosto ________________________________ 22 _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

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7.4.1. Medios de cultivo _________________________________________________ 22 7.4.2. Preparación del medio de mosto de agave ______________________________ 22 7.4.3. Cuantificación de azucares reductores por DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico) ___ 23 7.4.4. Cuantificación de la biomasa por peso seco _____________________________ 24 7.5. Análisis estadístico ___________________________________________________ 25 7.6. Cuantificación de azúcares consumidos y etanol producido por HPLC ___________ 25 7.7. Determinación de la diversidad genética de las levaduras por rep-PCR ___________ 26 8. RESULTADOS _________________________________________________________ 28 8.1. Caracterización morfológica de los aislamientos ____________________________ 28 8.2. Identificación molecular de las levaduras __________________________________ 29 8.2.1. Diversidad de especies durante la fermentación del mezcal _________________ 34 8.3. Fermentaciones en medio de mosto de Agave _______________________________ 35 8.3.1. Consumo de azúcares reductores _____________________________________ 35 8.3.2. Crecimiento de las levaduras en mostos de Agave ________________________ 36 8.3.3. Análisis del consumo especifico de azúcares reductores ___________________ 36 8.4. Capacidad fermentativa de los aislamientos ________________________________ 39 8.5. Diversidad genética de levaduras por rep-PCR ______________________________ 42 8.5.1. Diversidad genética y productividad de etanol ___________________________ 46 9. DISCUSIÓN ____________________________________________________________ 48 9.1. Caracterización morfológica y molecular __________________________________ 48 9.2. Diversidad fenotípica __________________________________________________ 51 9.3. Diversidad genética y productividad ______________________________________ 51 10. CONCLUSIONES ______________________________________________________ 54 11. RECOMENDACIONES _________________________________________________ 55 12. BIBLIOGRAFÍA _______________________________________________________ 56 13. APÉNDICE ___________________________________________________________ 60 14. GLOSARIO __________________________________________________________ 101

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Lista de figuras Figura 1. Rutas metabólicas aerobias y anaerobias de la degradación de la glucosa y su excresión como etanol, glicerol y acetato en Saccharomyces cerevisiae. __________________________________________ 3 Figura 2. La figura muestra la recolección de las piñas y su posterior raspado o jimado de las partes que le dan un sabor desagradable al mezcal. _____________________________________________________ 11 Figura 3. Horno de cocción en el suelo de las piñas de agave _______________________________________ 12 Figura 4. Trapiche rústico con el cual se muelen las piñas de agave __________________________________ 13 Figura 5. Tanque de fermentación rústico en Tamaulipas __________________________________________ 13 Figura 6. Destilador rustico utilizado para destilar el mosto fermentado. ______________________________ 14 Figura 7. Ubicación geográfica del Ejido El Palmar lugar donde se colectaron las levaduras con la que se llevo a cabo este trabajo. _________________________________________________________________ 17 Figura 8. Esquema de la región ribosomal que involucra los genes 18S, 5.8S y 26S, además de las regiones no codificantes ITS1 e ITS2 y la localización de los oligonucleotidos utilizados en este trabajo. ______ 19 Figura 9. Amplificación por PCR de la región 26S M. marcador de peso molecular, muestras 1-16 levaduras con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo. ___________ 20 Figura 10. Productos de PCR de la región ITS1-5.8-ITS2 M. marcador de peso molecular, muestras 1-13 levaduras con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo. ___ 20 Figura 11. Curva de calibración para fructosa ___________________________________________________ 24 Figura 12. Curvas de calibracion para HPLC ____________________________________________________ 26 Figura 13. Microfotografías digitales de levaduras con su principal diferencia utilizada en este trabajo para clasificarlas morfológicamente. A) Saccharomyces cerevisiae (redonda) y B) Pichia kluyveri (ovalada). Objetivo 100X. __________________________________________________________ 29 Figura 14. Árbol de distancias obtenido de la región 26S de ADNr generado en el programa MEGA 4 utilizando el metodo Neighbor Joining. La distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum Composite Likelihood y un re-muestreo de 1000 replicas. Una cepa de Neurospora crassa tomada del GenBank fue utilizada como grupo de salida. ___________________________________________ 32 Figura 15. Árbol de distancias génicas generado de la región ITS1-5.8S-ITS2 con el método Neighbor Joining. La distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum Composite Likelihood y un remuestreo de 1000 replicas. Una cepa de Neurospora crassa tomada del GenBank fue utilizada como grupo de salida. ___________________________________________________________________ 33 Figura 16. Consumo de azucares reductores en el mosto después de 60 horas (A) Saccharomyces cerevisiae (S.c.), (B) Kluyveromyces marxianus (K.m.), (C) Torulaspora delbrueckii (T.d.), (D) Pichia kluyvery (P.k.), (E) Clavispora lusitaniae (C.l.), (F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m., P.g.). ___ 35 Figura 17. Biomasa producida por cada levadura en el mosto de agave. A) Saccharomyces cerevisiae (S.c.); B) Kluyveromyces marxianus (K.m.); C) Torulaspora delbrueckii (T.d.); D) Pichia kluyvery (P.k.); E) Clavispora lusitaniae (C.l.); F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m.) y (P.g.). __________ 37 _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

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Figura 18. Consumo especifico obtenida a las 60 horas por cada una de las levaduras. (A) Saccharomyces cerevisiae (S.c.), (B) Kluyveromyces marxianus (K.m.), (C) Torulaspora delbrueckii (T.d.), (D) Pichia kluyvery (P.k.), (E) Clavispora lusitaniae (C.l.), (F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m., P.g.). ___________________________________________________________________________ 38 Figura 19. Patrón obtenido utilizando la técnica rep-PCR para las levaduras del grupo S. cerevisiae _________ 42 Figura 20. Dendrograma obtenido de la matriz de ausencia presencia de bandas del rep-PCR de las levaduras Saccharomyces cerevisiae utilizando el programa Statistica y el método de distancias euclidianas. __ 43 Figura 21. Patrón obtenido utilizando la técnica rep-PCR para las levaduras del grupo K. marxianus y T. delbrueckii. ______________________________________________________________________ 44 Figura 22. Dendrograma obtenido de la matriz de ausencia presencia de bandas del rep-PCR de las levaduras Kluyveromyces marxianus y Torulaspora delbrueckii utilizando el programa Statistica y el método de distancias euclidianas. _____________________________________________________________ 45 Figura 23. Comparación de la diversidad genética y la producción específica de etanol de las levaduras probadas en este trabajo. S.c. (Saccharomyces cerevisiae)._________________________________________ 46 Figura 24. Comparación de la diversidad genética y la producción de etanol de las levaduras Kluyveromyces marxianus (K.m.) y Torulaspora delbrueckii (T.d.). ______________________________________ 47

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Lista de cuadros Cuadro 1. Levaduras y bacterias que han sido identificadas de mostos de Vitis vinifera y de Agave spp. _____ 10 Cuadro 2. Concentración de fructosa y curva de calibración obtenida para el método del DNS _____________ 23 Cuadro 3. Origen y características del mostos de mezcal (ejido “El Palmar” Tamaulipas) y de las levaduras aisladas en diferentes etapas del proceso. _______________________________________________ 28 Cuadro 4. Levaduras identificadas por secuenciación de las regiones ITS1-5.8S-ITS2 y 26S de los mostos de mezcal tamaulipeco utilizando el programa BLAST del NCBI. _____________________________ 30 Cuadro 5. Caracterización de la diversidad ecológica por etapas de la fermentación del mezcal de San Carlos (Tamaulipas) mediante su la riqueza de especies (S), el índice de diversidad de Shannon (H), y la diversidad (D) y dominancia (D´) de Simpson. __________________________________________ 34 Cuadro 6. ANOVA del consumo especifico de azúcar ____________________________________________ 39 Cuadro 7. Consumo de azucares y producción de etanol de cada uno de los aislamientos obtenidos por HPLC. 40

Lista del apéndice APÉNDICE 1. Aislamientos de levaduras con su clave de identificación y el número de carril en el que se encuentra en el gel de agarosa de la PCR. ______________________________________________ 61 APÉNDICE 2. Análisis de varianza del consumo específico de azúcares. _____________________________ 62 APÉNDICE 3. Imágenes de las levaduras utilizadas en este estudio divididas en dos grupos las que tienen células redondas y las de células ovaladas, objetivo 100 X _________________________________ 63 APÉNDICE 4. Secuencias obtenidas por secuenciación y secuencias de referencia utilizadas para la elaboración de los árboles de distancias génicas de las dos diferentes regiones. ___________________________ 72

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ABREVIATURAS g

Microgramos

L

Microlitro

M

Micromolar

A260

Absorbancia a 260 nm

A280

Absorbancia a 280 nm

ADNg

Ácido desoxiribonucléico genómico

AFLPs

Polimorfismos de la Longitud de los Fragmentos Amplificados.

dNTP

Deoxinucleótidotrifosfato

DO

Densidad óptica (nm)

EDTA

Ácido etilendiaminotetracético

mg

Miligramos

mL

Mililitro

mM

Milimolar

NH4OAc

Acetato de amonio

nm

Nanómetros

ºC

Grados centígrados

pb

Pares de bases

PCR

Reacción en cadena de la polimerasa

PDA

Agar papa dextrosa

rpm

Revoluciones por minuto

Taq

ADN polimerasa de Thermus aquaticus.

TGY

Medio de cultivo de Triptona-Glucosa-Extracto de levadura

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DEDICATORIA

A mis padres María Guadalupe Mireles Berlanga y Pedro Arratia Arratia que siempre han estado conmigo en las buenas y en las malas por darme la vida, su amor y sobre todo su apoyo incondicional ya que la mejor forma de agradecerles todo lo que me han dado es con mis logros profesionales. Y especialmente para la Dra. Paty quien creyó en mí y por estar siempre ayudándome en cada etapa de mi tesis por su apoyo y por no permitirme desistir en los momentos más difíciles Gracias.

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AGRADECIMIENTOS A la Dra. Claudia Patricia Larralde Corona por su asesoría para llevar a cabo este proyecto y por creer en mí. A mi comité revisor de tesis la M.C. María Antonia Cruz Hernández, el Dr. José Alberto Narváez Zapata, Dr. Netzahualcoyotl Mayek Pérez y el M.C. Víctor Moreno por sus críticas constructivas que hicieron en cada presentación de avances. A la M.C. Amanda Alejandra Oliva Hernández por su ayuda durante el desarrollo del trabajo de laboratorio. A todos mis compañeros de laboratorio Isabel, Erika, Paco, Salvador, Eliseo, Samantha, Amanda, Elizabeth y Leandro por su amistad y compañía que siempre tuve durante mi estancia en el laboratorio. A la generación 2007-2009 por su amistad y apoyo durante estos dos años y por compartir su compañerismo y amistad siempre. Al maestro Víctor e Israel del área de servicios por su apoyo en el uso del HPLC y por su ayuda durante la secuenciación de las muestras.

Y a todas las personas que de alguna manera directa o indirectamente contribuyeron al desarrollo de este trabajo.

Finalmente, se agradece el apoyo económico del CONACyT, por la Beca de Estudios otorgada, así como al Instituto Politécnico Nacional por la Beca Tesis otorgada, para la terminación del presente trabajo. Los insumos y la movilidad fueron apoyados por los proyectos CONACyT Básica2006-57576, y los proyectos SIP2008-0597 y SIP2009-0613, junto con el complemento de beca (PIFI) asociada a estos proyectos del Instituto Politécnico Nacional.

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RESUMEN El mezcal es una bebida artesanal de México con denominación de origen. A pesar de que esta bebida tiene una importancia económica para los estados donde se elabora, hace falta realizar más investigaciones acerca de la micoflora involucrada en la fermentación. Las levaduras son las responsables de la fermentación de los mostos de Agave, es decir gracias a ellas la fructosa, obtenida de la hidrólisis de la inulina al cocerse la piña de esta planta, es transformada en etanol y otros compuestos que le dan sabor, y si bien existen varios trabajos en la literatura que analizan la fermentación del mosto de Agave tequilana Weber var azul (para producir tequila), son muy pocos los resultados reportados para otras especies de Agave. En este trabajo se estudió la micoflora presente durante la fermentación de una mezcalera tamaulipeca, y se obtuvieron 51 aislamientos, pertenecientes a 9 especies diferentes de levaduras colectadas en diversas etapas de la fermentación, y se caracterizaron por su capacidad de consumo de azúcares y producción de etanol a 15 aislamientos de Saccharomyces cerevisiae, 12 de Kluyveromyces marxianus, 5 de Torulaspora delbrueckii, 6 de Pichia kluyveri, 4 de P. guillermondii, 2 de P. mexicana, 5 de Clavispora lusitaniae, 1 de Candida parasilopsis y 1 de Zygosaccharomyces bailii. De manera relevante, todos los aislamientos fueron capaces de producir etanol en concentraciones variables, no solamente S. cerevisiae, lo cual indica que todas contribuyen a la fermentación alcohólica. El análisis global genómico mediante la técnica rep-PCR permitió obtener patrones diferenciales de bandeo inter e intra especies, y si bien no fue posible determinar a priori las características productivas de un aislamiento basado en su perfil rep-PCR, sin embargo sí pueden ser utilizado como un sistema de identificación y etiquetamiento molecular de los aislamientos, que pudiera ser utilizado en el seguimiento de cada uno durante la fermentación, para verificar que la población deseada se encuentra presente en el proceso. Este trabajo constituye el primer reporte de caracterización global molecular y productiva de las levaduras involucradas en la producción del mezcal tamaulipeco.

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ABSTRACT Mezcal is a mexican artisan liquor with denomination of origin and very unique organoleptic characteristics. Despite the economic importance of this industry, there is a lack of of information concerning the micoflora involved in mezcal fermentation. The yeast are responsible for the fermentation of Agave must, converting the sugars obtained from the thermal hydrolysis of inulin present in the “piña” (Agave stalk) to ethanol and other compounds that confer the mezcal its unique flavor. There are several reports concerning the characterization of must of Agave tequilana Weber var Azul (to obtain tequila), but very few with other Agave species. In this work the fermentation of a tamaulipeca mezcalera was sampled, and 51 isolates were obtained, belonging to 9 different species from all stages of the fermentation, and they were molecularly identified and characterized in terms of consumption of sugars and ethanol production. Fifteen isolates were identified as Saccharomyces cerevisiae, 12 of Kluyveromyces marxianus, 5 of Torulaspora delbrueckii, 6 of Pichia kluyveri, 4 of P. guillermondii, 2 of P. mexicana, 5 of Clavispora lusitaniae, one of Candida parasilopsis and one of Zygosaccharomyces bailii. All isolates were able to produce ethanol in variable concentration, not only S. cerevisiae, which meant that all were contributing to the alcoholic fermentation. The global genomic analysis performed by rep-PCR allowed us to obtain differential patterns that were inter and intraspecific, although it was not possible to predict the productive behavior of the isolates by this analysis, nonetheless this technique can be used for fingerprinting of the isolates and to track their presence during the fermentation. This work is to our knowledge the first report of global molecular and productive characterization of all the yeast involved in the production of Tamaulipas´ mezcal.

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1. INTRODUCCIÓN Las bebidas elaboradas mediante la fermentación alcohólica han sido producidas por el hombre desde hace miles del años, acompañando el proceso de construcción de las civilizaciones. En la actualidad su consumo genera una importante fuente de divisas para los países que las producen. Entre las bebidas alcohólicas más importantes se tiene a la cerveza, el vino y las bebidas destiladas como el whisky, el ron y el tequila. La cerveza es elaborada a partir de la fermentación de cereales malteados, mientras que el vino, mezcal y tequila son producidos por la fermentación del jugo de frutas y agave, respectivamente. La destilación de bebidas malteadas producen el whiskey, el vino destilado produce el brandy, la destilación de melazas de caña de azúcar fermentadas producen el ron y la destilación del fermentado de cereales y bayas de enebro producen la ginebra. En cualquiera de los casos, la etapa más importante en la producción de estas bebidas es la fermentación, proceso en el cual los azucares son transformados en etanol por levaduras principalmente de la especie Saccharomyces cerevisiae. Esta se encuentra involucrada en todas las etapas de fermentación desde el inicio de esta hasta su terminación, siendo la más tolerante a altas concentraciones de etanol. El tequila y el mezcal se elaboran por fermentación alcohólica utilizando levaduras capaces de realizar la biotransformación de la glucosa a etanol y bióxido de carbono. En México existen diferentes especies de Agave con los cuales se elaboran bebidas alcohólicas , tales como el Agave tequilana con el cual se elabora el tequila, Agave salmiana y Agave angustifolia con los que se elabora el mezcal, el Agave maximiliana con el que se elabora el sotol, además de que existen otras especies como el Dacilirium con el cual se elabora la raicilla. El proceso de elaboración del mezcal es rudimentario y generalmente se realiza en cinco etapas: jimado, cocción, molienda, fermentación y destilación. A pesar de que México por denominación de origen es el único productor de mezcal y tequila, la mayoría de las investigaciones a cerca de las levaduras involucradas en la fermentación de estas bebidas son en el tequila aunque los dos son elaborados bajo los mismos principios, por lo que existe una escasa información de las levaduras que participan en la fermentación del mezcal de Tamaulipas, en especial de aquellas que le dan sus características organolépticas distintivas.

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2. ANTECEDENTES Dada la importancia que las bebidas fermentadas presentan tanto desde el punto de vista científico como económico, y debido al papel fundamental que juegan las levaduras y bacterias en éste proceso, a continuación se presentan los aspectos biológicos más importantes relacionados con la bebida alcohólica más estudiada: el vino, y la información existente del producto más emblemático de nuestro país: el tequila. Para ello en la presente revisión se analizan los siguientes aspectos: la bioquímica y la biología de la fermentación alcohólica del vino; las sucesiones microbianas durante la fermentación alcohólica y su metodología de estudio, y el proceso de elaboración del tequila y del mezcal. 2.1. Bioquímica y biología del proceso de fermentación del vino

La fermentación alcohólica por definición es el proceso bioquímico de extracción de energía en el cual compuestos orgánicos sirven tanto de donador (piruvato) como aceptor (NAD+) de electrones, teniendo como productos el etanol y bióxido de carbono.

C6H12O6

2 CH3CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP + ∆

El alcohol etílico (etanol, C2H5OH) es producido por microorganismos (levaduras y bacterias) durante un proceso que no requiere la participación del oxígeno (anaerobio). Este etanol es la base de la producción de bebidas alcohólicas complejas, sin embargo, también tiene usos como solvente industrial y como aditivo para la gasolina, entre otros. Dicha fermentación comienza con el transporte de azúcares a través de la membrana y su metabolización por la vía glucolítica (Embden-Meyerhof-Parnas principalmente). Las levaduras son principalmente los microorganismos involucrados en la producción de etanol, estos son anaerobios facultativos, lo que significa que pueden vivir sin oxigeno; cuando hay oxigeno lo utilizan para oxidar la glucosa completamente y de esa manera obtener ATP (respiración). En condiciones anaerobias ellas pueden transforman la glucosa en acido pirúvico siguiendo la secuencia de reacciones que conlleva la glucólisis, como se muestra en la figura 1. _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 2 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

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GLUCOSA

BIOMASA GLUCOSA 6-P

PENTOSA 5-P

FRUCTOSA 6-P BIOMASA

GLICEROL

DIHIDROXIACETONA-P

GLICERALDEHIDO 3-P

SERINA

GLICINA

3-P GLICERATO

BIOMASA

BIOMASA FOSFOENOLPIRUVATO ETANOL TREONINA

PIRUVATO

ACETALDEHIDO

ACETATO

ACETATO

OXALACETATO ALANINA

BIOMASA

ACETIL-CoA

PIRUVATO

ALANINA

BIOMASA BIOMASA ACETIL-CoA

OXALACETATO MALATO

MEDIO

SUCCINATO

α-KETOGLUTARATO

MITOCONDRIA CITOSOL

Figura 1. Rutas metabólicas aerobias y anaerobias de la degradación de la glucosa y su excresión como etanol, glicerol y acetato en Saccharomyces cerevisiae.

El segundo mayor producto derivado de la fermentación alcohólica producido por S. cerevisiae es el glicerol. Esta molécula es sintetizada a partir de la dihidroxiacetona fosfato, un intermediario de la glucólisis. Este compuesto es reducido por la enzima Gdp

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(dependiente de NAD-glicerol 3-fosfato deshidrogenasa) a glicerol 3-fosfato el cual es desfosforilado por la enzima Gpp (dependiente de NAD-glicerol 3-fosfato fosfatasa) a glicerol el cual puede ser usado por la levadura como fuente de carbono y energía, así como para proteger a la célula contra altas temperaturas, estrés oxidativo y estrés hiperosmotico acumulándose intracelularmente en células que son expuestas a decreciente actividad de agua extracelular. (Folch-Mallol et al., 2004).

Las bebidas alcohólicas son elaboradas por bioconversión o biotransformación de la glucosa en etanol (fermentación), proceso que es llevado a cabo mediante una serie de reacciones químicas realizadas por levaduras y bacterias específicas como parte de su metabolismo de producción de energía, cuyo rendimiento varía según el microorganismo involucrado y sus capacidades metabólicas específicas, como por ejemplo el trabajo realizado por Sánchez et al., (2005) quienes compararon la secuencia glucolítica de Debaryomyces hansenii y S. cerevisiae, observando que S. cerevisiae produjo aproximadamente cuatro veces mas etanol que D. hansenii. La relación entre el consumo de glucosa y la producción de etanol fue casi 3 veces más alta que en D. hansenii.

La fermentación del jugo de uva (mejor conocido como mosto) es realizada por una serie de interacciones entre microorganismos en los cuales están involucradas bacterias, levaduras, hongos e incluso virus, y éstas determinan el perfil ecológico de la producción y tiene influencias positivas o negativas en el sabor del vino. La producción de etanol durante la fermentación es principalmente llevada a cabo por la levadura Saccharomyces cerevisiae, la cual se encuentra de manera natural en los mostos de uva (Fleet et al., 1984), y juega un papel central debido a sus capacidades metabólicas en el proceso de fermentación de mostos (Zagorc et al., 2001).

Las levaduras generalmente se originan de la micoflora epifítica natural de las uvas, de la flora asociada con la superficie de los equipos de vinería y los cultivos iniciadores que son añadidos. Los hongos filamentosos se encuentran en la producción del vino en varias etapas durante la serie de operaciones, y su principal impacto más importante tiene lugar durante

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el cultivo, ya que pueden causar la pudrición de la cosecha, especialmente la provocada por Botrytis cinerea (Fleet, 2003).

Un importante fenómeno ocurre con algunas cepas de levaduras, las cuales secretan proteínas o glicoproteínas tóxicas que son letales para cepas sensibles de diferentes especies, por lo que se han denominado levaduras killer ó zimocidas (Zagorc et al., 2001). La actividad killer ha sido encontrada en los géneros Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, Willopsis y Zygosaccharomyces y han sido aisladas de muchos nichos ambientales como lagos, ríos, frutas y vegetales así como de la fermentación de varios alimentos y bebidas. El interés ecológico en este tipo de levaduras deriva debido a que cuando están presentes pueden dominar el proceso de fermentación, cuando poseen características enológicas positivas pueden ser usadas como inoculo inicial y producir una bebida de excelente calidad.

En un estudio del vino realizado por Versavaud et al. (1995) en cuanto a la diversidad genética de S. cerevisiae, los autores concluyen que la fermentación espontánea es iniciada por algunas especies tales como: Kloeckera apiculata, Candida famata, Rhodotorula sp., Metschnikowia pulcherrima y Saccharomyces cerevisise y que esta última se encuentra presente en todas las etapas de fermentación desde el inicio hasta el final de esta. Los autores detectaron 14 cepas killer de las cuales solamente 4 cepas fueron resistentes a la toxina K2, y 10 fueron sensibles, mientras que las cepas asociadas fueron neutrales. La cepa predominante fue S. cerevisiae y era del tipo killer 2 con la asociación de cepas que generalmente eran neutrales y algunas sensibles. 2.2. Las sucesiones microbianas en el vino y sus técnicas de estudio

La calidad final del vino es determinada por toda esta gama de microorganismos los cuales están presentes en diferentes cantidades en los mostos y que se desarrollan durante la fermentación, determinando en gran medida la cantidad y tipos de las muchas substancias que contribuyen en el olor, color y sabor característico de esta bebida (Fleet et al., 1984).

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Tradicionalmente la elaboración del vino es realizada de forma espontánea por las levaduras presentes en las uvas y en los tanques o quipo de vinería. Por lo general las especies de Hanseniaspora (y su anamorfo Kloeckera), Metschnikowia, Pichia y Candida crecen durante las etapas tempranas de fermentación, pero comienzan a perecer conforme progresa la fermentación y comienza a aparece en mayor proporción la especie S. cerevisiae. Esta levadura no es predominante en la micoflora epifitica de la uva, ya que generalmente se encuentra en concentraciones de 10 a 100 CFU/gr. Sin embargo, conforme la fermentación avanza, aparece en mayor proporción y se incrementa hasta llegar al final del proceso como prácticamente la única levadura presente en forma activa (Fleet, 2003).

Generalmente las cepas de Hanseniaspora (Kloeckera), Candida y Metschnikowia inician la fermentación y éstas se originan de las uvas. Algunas veces las especies Pichia, Issatchenkia y Kluyveromyces pueden tener crecimiento en estas etapas y llegan a alcanzar hasta 106 o 107 CFU/ml a la mitad de la fermentación, pero empiezan a declinar hasta morir, durante este tiempo S. cerevisiae se vuelve predominante (107-108 CFU/ml) y continua la fermentación hasta que esta termina (Fleet, 2003).

La producción de etanol por S. cerevisiae es considerado el factor que gobierna el crecimiento microbiano e influencia a las especies no-Saccharomycetaceas durante la fermentación. Por lo general las especies Hanseniaspora (Kloeckera), Candida, Metschnikowia, Pichia, Issatchenkia y Kluyveromyces se encuentran en el jugo y no son tolerantes al etanol cuando este supera 5 a 7 % , lo cual explica que declinen y mueran conforme avanza la fermentación, poco después de iniciada la etapa exponencial del proceso (Fleet, 2003).

Las levaduras nativas son requeridas para la producción del vino en específicos ambientes característicos de cada región (Araujo et al., 1998). Los autores concluyen que las especies de S. cerevisiae y S. rouxii son las especies que prevalecen durante la fermentación del vino en el estado de Zulia (Venezuela).

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Las presencia de bacterias también tienen influencias positivas (y negativas, dependiendo de las especies presentes) en la producción de bebidas alcohólicas. Estas contribuciones pueden ser moderadas por interacciones con levaduras. Los dos grupos principales de bacterias que son importantes en la microbiología del vino son las bacterias acidolácticas y las bacterias acidoacéticas (Fleet, 2003). Dentro de las bacterias acidolácticas los géneros Lactobacillus y Pediococcus son las más relevantes y junto con Oenococcus oeni conducen la fermentación maloláctica. Mientras que entre las bacterias acidoacéticas se encuentran Acetobacter aceti, Pasteurianus y Gluconobacter oxidans. Esta fermentación es siempre negativa dentro del proceso de producción de vino.

La fermentación maloláctica es la segunda fermentación más importante que ocurre en muchos vinos generalmente de 2 a 3 semanas después de la terminación de la fermentación alcohólica. La principal bacteria responsable de esta fermentación es O. oeni, durante esta fermentación funciona para incrementar la acidez del vino por transformación del acido málico en acido láctico aumentando el sabor y complejidad del vino (Fleet, 2003).

La mayoría de los estudios para identificar las especies de levaduras que aparecen en el proceso de fermentación generalmente están basados en la morfología comparativa, cultivos e identificación utilizando algunos criterios bioquímicos, la fisiología y la genética convencional de estas especies pero estas técnicas son tardadas y generalmente solo se puede identificar hasta el nivel de género. Es por eso que en algunos estudios se han utilizado técnicas basadas en el ADN.

Las principales técnicas empleadas para identificar levaduras de la fermentación se describen a continuación, haciendo énfasis en su utilización en vino y tequila. 2.2.1. Electroforesis en gel de campos pulsados La metodología de campos pulsados permite analizar el ADN genómico de levaduras para diferenciar en una misma especie, si los microorganismos analizados son iguales (clones) o no (policlonales). La técnica consiste en una variación de la electroforesis hecha en un gel de agarosa, en donde la orientación del campo eléctrico a través del gel se cambia _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 7 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

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periódicamente, en vez de mantenerse constante. Esto permite que fragmentos grandes de ADN se separen por tamaño, en forma efectiva. Esta técnica fue usada por Versavaud et al. (1995) para identificar la diversidad genética de cepas nativas de S. cerevisiae. 2.2.2. Polimorfismo del ADN mitocondrial (ADNmt) Esta técnica está basada en el contenido de G+C existente en el ADN nuclear (ADNn) en comparación con el del ADN mitocondrial, el ADNn tiene aproximadamente un 40% de contenido de G+C mientras que el ADNmt tiene solamente el 20 % por lo tanto, si se utilizan enzimas de corte específico para regiones ricas en G+C puede separarse debido a que el ADNn sería cortado en pequeños fragmentos no detectables en el gel de agarosa mientras que el ADNmt produciría fragmentos de mayor tamaño detectables en el gel de agarosa. En un estudio realizado por Sabate et al. (1998) se analizó la diversidad de cepas de S. cerevisiae en la fermentación de vino usando esta técnica, y encontraron una gran diversidad de cepas nativas de S. cerevisiae. Concluyen que S. cerevisiae es la predominante durante la fermentación sin embargo en algunos otros estudios tienden a confundirla y clasificarla incorrectamente como S. bayanus. 2.2.3. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción del ADN (RFLP) La técnica de RFLP se basa en el polimorfismo del ADN cuando es digerido con enzimas de restricción, lo cual visualizado en un gel de electroforesis, produce un patrón de bandas polimórficas de diferentes tamaños. Debido a que los cortes generados con estas enzimas difieren entre un organismo y otro por la distancia entre el sitio de corte, Zagorc et al. (2001), usaron esta técnica para identificar levaduras zimocidas (killer) de aislamientos de levaduras de vino. 2.2.4. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP) Esta técnica combina el uso de la PCR y los RFLP, y consiste en cortar el ADN con dos enzimas de restricción, una de corte frecuente, y otra de corte poco frecuente. A los fragmentos se les ligan oligonucleótidos de extremos compatibles con las enzimas usadas,

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se amplifica por PCR probando diferentes combinaciones de complementariedad del oligonucleótido con el sitio de restricción, con lo cual se puede disminuir o aumentar el número de bandas amplificadas y comparar su polimorfismo generado. Una ventaja especial de esta técnica es que es capaz de generar muchos marcadores moleculares en una sola reacción, por lo que deben visualizarse en un gel de poliacrilamida de alta resolución. Esta técnica fue usada para comparar las levaduras del genero Saccharomyces de mostos de agave (Flores-Berrios et al., 2005). Los autores encontraron cuatro diferentes especies de este género (S. cerevisiae, S. bayanus, S. pastorianus, y S. paradoxus) y el agrupamiento de los aislamientos de acuerdo al proceso de donde fueron aisladas. 2.2.5. Hibridación fluorescente in situ (FISH) Con esta técnica se pueden analizar células o tejidos completos, para la cual son primeramente fijados e hibridados con sondas específicas para los genes 18S o 28S del ADNr marcadas con algún fluorocromo. Posteriormente las células marcadas pueden verse a un microscopio óptico de fluorescencia. Con este método y gracias a que las células completas se hibridan se evitan artefactos generados por sesgos en la extracción de ADN, amplificación por PCR y clonación. Xufre et al. (2006) utilizaron esta técnica para analizar poblaciones dinámicas de levaduras en mostos de uva a nivel laboratorio. En su estudio muestran la identificación exacta mediante esta técnica de las especies presentes en la fermentación y concluyen que las especies Candida stellata, Torulaspora delbrueckii y Kluyveromyces spp. Deben también ser tomadas en cuentas como inóculos iniciales ya que tienen influencias positivas en el sabor del vino.

En el cuadro 1 se muestran a las principales levaduras y bacterias que han sido identificadas en los mostos de uva y de agave con las diferentes técnicas moleculares descritas anteriormente. En el se presentan las diferentes etapas de fermentación en el cual aparecen estas especies y como al transcurrir el tiempo y pasar las diferentes fases de fermentación la mayoría de las especies que se encuentran en los mostos desaparecen permaneciendo solamente las mas aptas a altas concentraciones de etanol.

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Cuadro 1. Levaduras y bacterias que han sido identificadas de mostos de Vitis vinifera y de Agave spp. Tipo de mosto Microorganismo

Etapa de fermentación Exponencial

Exponencial

temprana

tardía

Fermentación

Estacionaria

maloláctica

X X XXX

Ø Ø XXX

Ø Ø Ø

X X X X X X Ø X

XX XX XX XX Ø Ø Ø Ø

XX XX XX XX Ø Ø Ø Ø

Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø

X X X X X X X X X X X X X

Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø X X X X X

Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø XX XX XX XX XX

Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø XXX XXX XXX XXX XXX

Uva

Agave

Kloeckera Torulopsis stellata Saccharomyces cerevisiae

XXX XXX X

XXX X

XX XX XX

S. bayanus S. pastorianus S. paradoxus S. rouxii Hanseniaspora Metschnikowia Torulaspora Candida sp

Ø Ø Ø X XXX XXX XX XXX

X X X Ø Ø Ø X X

Rhodotorula Cryptococcus Pichia Willopsis Kluyveromyces Debaryomyces Zygosaccharomyces Issatchenkia Lactobacillus Pediococcus Oenococcus Acetobacter Gluconobacter

XX XX XXX XX XXX XXX XX XX X X X X X

X Ø X Ø X X Ø X Ø Ø Ø Ø Ø

Autor

1,3,7,11,13 1 1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11 ,12,13 8,9 9 9 4 3,6,10 3,7 10,12 3,6,7,10,11 ,13,12 7,12 6 3,6,10 6 3,6,10,12 6,12 6 3,12 3 3 3 3 3

Ø. Ausente, X. Escaso, XX. Moderado, XXX. Abundante. Tomado de: 1Fleet et al., (1984), 2Zagorc et al,. (2001), 3Fleet (2003), 4Araujo et al., (1998), 5Sánchez et al., (2005), 6Versavaud et al., (1995), 7Cronwright et al., (2002), 8Sabate et al., (1998), 9Flores-Berrios et al., (2005), 10Xufre et al., (2006), 11Arrizon et al., (2006), 12Jacques et al., (2006), 13Fiore et al., (2005).

Otra técnica rápida que ha sido usada recientemente es el polimorfismo en la conformación de cadena sencilla (SSCP) la cual ha mostrado ser una técnica muy poderosa logrando encontrar diferencias en especies las cuales tiene un cambio en un solo nucleótido. Esta técnica puede ser usada con fragmentos relativamente cortos de aproximadamente 200 pb (Qui-Ming et al., 2008), y permite encontrar diferencias en algunas especies de Saccharomyces y Candida debido a la migración de fragmentos amplificados de la región ITS1 e ITS2 en un gel de acrilamida.

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2.3. El proceso de elaboración del mezcal y tequila

El mezcal y el tequila son bebidas alcohólicas elaboradas en México por fermentación y destilación del jugo de algunas plantas de Agave tales como A. salmiana, A. angustifolia, A. tequilana y A. potatorum (Flores et al., 2005). El mezcal es una bebida alcohólica regional obtenida por destilación y fermentación de mostos preparados directa y originalmente con los azucares extraídos de las piñas maduras del Agave, las cuales son previamente cocidas para hidrolizar los azúcares, y son sometidas a fermentación alcohólica, con inóculos espontáneos o comerciales de levaduras. Generalmente el proceso es dividido en cinco diferentes fases: el jimado, el cocimiento de la piña, la extracción del mosto, la fermentación y la destilación. 2.3.1. El jimado En esta etapa es en la cual se cortan las pencas (Fig. 2) para dejar solo la piña, la cual después es rasurada para eliminar la raíz y todo lo que le pueda dar sabor desagradable al mezcal. Una vez obtenida la piña se lleva al horno de cocción.

Figura 2. La figura muestra la recolección de las piñas y su posterior raspado o jimado de las partes que le dan un sabor desagradable al mezcal.

2.3.2. Cocción La cocción se lleva a cabo para hidrolizar o transformar la inulina, el principal polisacárido presente en la piña de las plantas de agave. La inulina es convertida en azúcares libres, principalmente fructosa, para su posterior fermentación (Mancilla y Margalli 2002). A la _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 11 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

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reacción que ocurre durante el calentamiento de las piñas de agave se le denomina reacción de Maillard, y es un conjunto de reacciones químicas que se producen entre las proteínas y azúcares reductores cuando este se calienta aunque no sea a altas temperaturas. Los productos mayoritarios de estas reacciones son moléculas cíclicas y poli cíclicas, que aportan sabor y aroma al mezcal y tequila. La cocción se realiza en un horno construido a partir de un agujero cavado en la tierra (Fig. 3) y recubierto con piedras al rojo vivo después de haber colocado en su fondo las piñas, ó en autoclaves industriales.

Figura 3. Horno de cocción en el suelo de las piñas de agave

2.3.3. Molienda: obtención del mosto La molienda tiene como finalidad hacer que los monosacáridos obtenidos en la cocción estén más disponibles a la acción microbiana, así como a la captación de microorganismos del medio para favorecer la fermentación. La molienda se lleva a cabo generalmente utilizando un “trapiche” (Fig. 4). Este esta hecho de madera con 2 troncos unidos simulando los engranes, y dos troncos largos amarrados que son jalados por dos caballos. En versiones industrializadas, molinos de martillo o de tornillo sinfín realizan la extracción del mosto.

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Figura 4. Trapiche rústico con el cual se muelen las piñas de agave

2.3.4. Fermentación Es el proceso en el que las levaduras transforman los monosacáridos del Agave en etanol por medio de la fermentación alcohólica. Esta operación se lleva a cabo en tinas abiertas, de madera (Fig. 5) durante un tiempo aproximado de ocho a diez días, tomando en consideración la temperatura ambiente. Puede usarse como inóculo el remanente de la fermentación anterior que se deja en el fondo, o inocular con cepas de levaduras comerciales.

Figura 5. Tanque de fermentación rústico en Tamaulipas

2.3.5. Destilación En esta operación se efectúa la separación del alcohol del resto del mosto fermentado aprovechando para ello sus diferentes puntos de ebullición. El etanol, debido a su estructura _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 13 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

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molecular, tiene un punto de ebullición más bajo que el agua (78.5 o C a nivel del mar), por lo tanto, se separa de ésta al alcanzar esta temperatura. El dispositivo utilizado para la destilación tradicional es el alambique (Fig. 6) Este equipo está conformado por cuatro elementos fabricados en cobre debido a su alta conductividad térmica, de tal forma que facilita la transferencia de calor calentándose y enfriándose fácilmente alcanzando así la temperatura apropiada de separación. En versiones industriales, se puede utilizar una torre de platos. Durante la destilación también se separan otros compuestos volátiles tales como el acetaldehído, etil acetato, metanol, n-propanol, isobutanol, alcohol amílico y alcoholes superiores (Arrizon et al., 2006).

Figura 6. Destilador rustico utilizado para destilar el mosto fermentado.

Todas estas etapas determinarán la calidad final del producto a obtener, sin embargo, se sabe que las más importantes son la fermentación y la destilación.

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3. JUSTIFICACIÓN Las levaduras son las responsables de la fermentación de los mostos de Agave, es decir gracias a ellas la fructosa que se encuentra en la piña de esta planta es transformada en etanol y otros compuestos que le dan sabor al mezcal y al tequila, sin embargo las mayoría de las investigaciones que se han realizado acerca de las bebidas alcohólicas que se elaboran en México son sobre el tequila y esta información no puede ser extrapolada al mezcal ya que no utilizan las mismas plantas de Agave.

México por denominación de origen es el único productor de mezcal el cual tiene una importancia económica para los estados donde se elabora, además de ser una bebida típica artesanal del país por lo que hace falta realizar más investigaciones acerca de las levaduras que se encuentran involucradas en la fermentación del mezcal.

En Tamaulipas el mezcal se elabora en los municipios de San Carlos, Jiménez, Bustamante, Palmillas, Miquihuana, Méndez, San Nicolás, Jaumave y Cruillas este deja importantes ganancias económicas para los productores. Como en todos los productos de producción bebidas alcohólicas, la levadura S. cerevisiae es la mas importante durante el proceso de fermentación, de ahí la importancia de aislar levaduras con una alta productividad de etanol que podrían ser utilizadas como inoculo inicial para producir un mezcal con excelente calidad ayudando a los productores a competir mejor en el mercado. En este trabajo se propone realizar una caracterización genética de levaduras aisladas durante la fase exponencial de producción de mezcal, y determinar si existe una relación entre los niveles de productividad de etanol y el perfil genético determinado a nivel genómico.

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4. HIPÓTESIS La productividad de etanol de una población de levaduras está relacionada con su diversidad genética.

5. OBJETIVO GENERAL Caracterizar genética y productivamente a las levaduras involucradas en la fermentación del mezcal.

6. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Identificar genéticamente y caracterizar morfológicamente a las levaduras presentes en los mostos de mezcal tamaulipeco.

Caracterizar la productividad alcohólica de las levaduras.

Caracterizar la diversidad genética de las levaduras mediante una técnica de análisis global de su ADN.

Correlacionar la diversidad genética de las levaduras con su productividad.

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7. MATERIALES Y MÉTODOS 7.1. Levaduras

Las levaduras utilizadas en este trabajo pertenecen a la colección del Laboratorio de Biotecnología Industrial y fueron aisladas de fermentaciones de la vinata en el ejido “El Palmar” en el municipio de San Nicolás Tamaulipas donde se produce el mezcal. La imagen de satélite (Fig. 7) muestra la localización de dicha vinata.

Figura 7. Ubicación geográfica del Ejido El Palmar lugar donde se colectaron las levaduras con la que se llevo a cabo este trabajo.

Un total de 51 aislamientos fueron obtenidos los cuales fueron primeramente caracterizados de acuerdo a la forma de la célula separándolas de esta manera en dos grupos: morfología redonda u ovalada (Cuadro 2) y las cuales fueron aisladas de diferentes etapas de la fermentación, la cual fue caracterizada por la concentración de azúcares presentes en el momento del muestreo, con lo cual les fue asignada una clave.

7.1.1. Conservación de las levaduras en glicerol Todas los aislamientos fueron crecidos hasta la mitad de la fase exponencial en caldo YPF, y se diluyó con glicerol estéril hasta una concentración final de glicerol del 86%, y almacenadas a -70 °C. _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 17 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

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7.2. Extracción de ADN de las levaduras Las cepas se cultivaron en medio YPDA (Extracto de levadura 5 g L-1; peptona 3 g L-1; glucosa 20 g L-1; agar 20 g L-1) y se colocaron en el agitador orbital durante 18 horas a 30 °C y 250 rpm. Se utilizó el protocolo de extracción de ADN propuesto por Raeder y Broda (1985) con las siguientes modificaciones: Se colocaron de 40 a 50 mg de la muestra de levaduras en tubos eppendorf estériles y se sumergieron en nitrógeno líquido por 20 minutos, posteriormente se maceraron con un pistilo estéril. Se agregó 500 µl de solución amortiguadora de extracción (200 mM de Tris HCl pH 8.5, 250 mM NaCl, 25 mM de EDTA y 0.5% de SDS) y se incubó por 10 minutos, posteriormente se añadieron 500 µl de fenol-cloroformo mezclando en vortex por 5 minutos y se centrifugó a 13,000 rpm durante 30 minutos. La fase acuosa fue transferida a otro tubo adicionando 400 µl de cloroformo frío mezclando durante un minuto seguido de centrifugación a 13,000 rpm por 5 minutos y transfiriendo a un nuevo tubo, adicionando 8 µl de RNAsa e incubando a 37 °C, posteriormente se adicionan 500 µl de isopropanol frío mezclando por inversión ligera e incubando a -20 °C por 15 minutos y centrifugando por 5 minutos a 13,000 rpm, el sobrenadante fue desechado y se agregaron 500 µl de etanol al 70% mezclando por inversión y centrifugando, de igual manera el sobrenadante fue desechado y el tubo fue colocado boca abajo en papel secante para que se evaporara el etanol durante aproximadamente 30 minutos. La pastilla fue re suspendida en 50 µl de agua estéril. El ADN obtenido fue visualizado en un gel de agarosa al 1.0% teñido con SyberGold™ 10X. 7.2.1. Identificación molecular de las levaduras La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) fue utilizada para amplificar regiones utilizadas para identificar a nivel de especie a las levaduras utilizadas en este trabajo. En Saccharomyces cerevisiae como en todos los hongos existen cuatro regiones de ADNr (5S, 5.8S, 18S y 26S) y están agrupados en arreglos de cabeza a cola formando un grupo sencillo que se ubica en el cromosoma 12. Los genes 18S y 26S se encuentran separados por los espaciadores internos (ITS) (Fig. 8) los cuales no son secuencias codificantes excepto por los genes pequeños 5S y 5.8S (Montrocher et al. 1998).

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Figura 8. Esquema de la región ribosomal elaborado con la secuencia Saccharomyces cerevisiae (EU649672) que involucra las regiones 18S (SSrDNA), 5.8S y 26S (LSrDNA), además de las regiones no codificantes ITS1 e ITS2, la localización de los oligonucleótidos utilizados en este trabajo y el tamaño de los fragmentos esperados.

La amplificación por PCR de estas regiones mostró una similaridad en el tamaño de las bandas que para la región 26S las cuales fueron de aproximadamente 800 pb mientras que en el caso de la región ITS mostró más diferencias encontrando bandas que iban desde 500 hasta 800 pb (Fig. 9 y 10).

Se amplificó la región 26S y la ITS1-5.8S-ITS2 del ADNg utilizando los oligonucleótidos reportados por White et al., (1990): NL1 (5’ GCATTCAATAAGCGGAGGAAAAG 3’) y NL4 (5’ GGTCCGTGTTTCAAGACGG 3’) para la región 26S y los oligonucleótidos ITS1 (5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’) e ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’) para la región ITS1-5.8S-ITS2. La reacción se llevó a cabo en un termociclador (Perkin Elmer GeneAmp PCR system 9700, Applied Biosystems). Las reacciones se realizaron en un volumen final de 25 μl, utilizando 1 μl del ADN, 2.5 μl de Buffer 10X, 0.75 μl de cloruro de magnesio de 25 mM, 0.2 μl de dNTPs 10 mM, 1 μl de cada uno de iniciadores 5 μM y 0.2 μl de la enzima Taq DNA polimerasa 5 U/5μl y completando el volumen a 25 μl con agua milliQ estéril. El programa que se utilizó consistió de 1 ciclo de desnaturalización por 5 min a 94ºC y 35 ciclos de 30 seg a 94ºC, 30 seg a 59 ºC para ITS o 63 ºC para 26S y 1 min a 72ºC. Finalmente se dio un paso de extensión final a 10 min a 72ºC. Posteriormente los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 1% mezclando 5 μl del producto de PCR con 3 μl de SyberGold™ y depositándolos en el gel el cual se corrió en una cámara de electroforesis de la marca Bio-Rad a 100V por 30 min. De igual manera los productos de PCR fueron visualizado en un gel de agarosa al 1.0% teñido con SyberGold™ 10X, grabando la imagen del gel en el programa Kodak digital ScienceTM 1D (Figs. 8 y 9). Los productos de PCR fueron purificados con el Kit comercial Wizard SV and PCR clean up System de Promega para su posterior secuenciación. La imagen obtenida de cada una de _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 19 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

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las regiones amplificadas se muestra a continuación donde además se puede observar el tamaño del fragmento obtenido el cual para la región 26S fue de aproximadamente 800 pb, mientras que para la región ITS1-5.8S-ITS2 fue de entre 300 y 700 pb.

800pb

800pb

800pb Figura 9. Amplificación por PCR de la región 26S M. marcador de peso molecular, muestras 1-16 levaduras con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo.

700pb

700pb 300pb

700pb 300pb

Figura 10. Productos de PCR de la región ITS1-5.8-ITS2 M. marcador de peso molecular, muestras 1-13 levaduras con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo.

7.2.2. Secuenciación de la región 26S e ITS1-5.8S-ITS2 del ADNg Los fragmentos amplificados por PCR una vez que ya habían sido purificados se procedió a su secuenciación utilizando el secuenciador automático de capilar ABI Prism (Applied _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 20 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

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Biosystem

Modelo

3130)

con

los

siguientes

oligonucleótidos:

NL1

(5’GCATTCAATAAGCGGAGGAAAAG3’) forward para la región 26S, y el ITS1 (5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’) forward para la región ITS. Las reacciones de secuenciación se realizaron como sigue. Los productos de PCR purificados fueron nuevamente amplificados utilizando la siguiente reacción: 4 μl de Buffer big dye v 3.1 5X, 1 μl de iniciador, 4 μl de Big dye v 3.1 ready mix, 2 μl del producto de PCR, 9 μl de agua esteril milliq para un volumen final de 20 μl. Las condiciones de PCR fueron 1 ciclo de 96 °C por 1 minuto, seguido de 25 ciclos a 96 °C 10 segundos, 59 °C para los ITS o 63 °C para los 26S y 60 °C durante 4 min. Posteriormente la reacción de secuenciación fue purificada adicionando 2 μl de EDTA 125mM, 2 μl de NaOAC 3M pH 5.2 y 50 μl de etanol absoluto Merck mezclando suavemente e incubando a -20 °C durante 20 minutos y centrifugando a 14000 rpm por 15 minutos a 4 °C, se hizo un segundo lavado con 70 μl de etanol al 70% mezclando, incubando y centrifugando como en el paso anterior, secando la pastilla utilizando un termo-mixer (Eppendorf) durante aproximadamente 30 minutos, posteriormente fueron secuenciadas en el Área de Biotecnología del CBG.

Una vez obtenidas las secuencias, estas se alinearon en la base de datos BLAST del NCBI para su comparación e identificación, se seleccionaron las secuencias de referencia con las cuales tenían similitud, posteriormente se elaboraron los árboles de distancias génicas con las dos regiones usando el método Neighbor-Joining Saitou et al (1987) con un bootstrap de 1000 replicas, la distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum Composite Likelihood, también se estimo la divergencia evolutiva entre secuencias usando el método Maximum Composite Likelihood dato no mostrado, todo este análisis filogenético fue elaborado en el programa MEGA4 (Tamura et al., 2007). 7.3. Cálculo de los índices de diversidad de la fermentación del mezcal

Para conocer la diversidad de las especies y poblaciones involucradas en la fermentación del mezcal, se calcularon los índices de diversidad y dominancia de Simpson, así como el índice de Shannon, de acuerdo a las siguientes fórmulas:

Índice de dominancia de Simpson D´=

(n/N)2

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Índice de diversidad de Simpson D=

1/(n/N)2

Donde N= Número total de variedades presentes de todas las especies n = Número de variedades por especie

Índice de diversidad de Shannon H = - (pi) * ln (pi) Donde pi = Proporción de variedades de la especie i respecto al total de variedades presentes de todas las especies, es decir, la abundancia relativa de variedad ni/N, donde: ni = Número de variedades de la especie i N = Numero de todas las variedades de todas las especies 7.4. Fermentaciones modelo en medio de mosto 7.4.1. Medios de cultivo Los aislamientos se activaron en el medio de cultivo rico YPFA (extracto de levadura 5 g, peptona 3 g, fructosa 20 g y agar 20 g) aforando hasta un litro con agua destilada y se calento por aproximadamente 15 min. o hasta que se tornara translúcido, se esterilizó por 15 min a 121 oC, y se vació en cajas petri de 9 cm de diámetro. Cada aislamiento fue sembrado por duplicado en cajas petri. Para preparar el inóculo de los experimentos, se tomó una asada del aislamiento reactivado en YPFA, y se inoculó en 30 mL del medio YPF (sin agar) colocado en un matraz de 200 mL. 7.4.2. Preparación del medio de mosto de agave Con el fin de estudiar el sistema de fermentación del mezcal bajo condiciones de vinata, se preparó un medio de cultivo basado en mosto fresco de agave, el cual fue filtrado y centrifugado a 7000 pm por 15 minutos, y debido a que su concentración inicial de azúcares _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 22 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

reductores fue de 170 g L-1, fue diluido con agua estéril hasta alcanzar una concentración de 100 g L-1 de azúcar, se le agregó 1 g L-1 de sulfato de amonio (NH4)2 SO4 y se esterilizó para matar a los microorganismos presentes. Los experimentos se llevaron a cabo en tubos falcon de 50 ml y por duplicado añadiendo la cepa la cual fue crecida en el medio líquido midiendo la concentración con el uso de un espectrofotómetro a una D.O. de 0.05 y aforando hasta 30ml con mosto el cual contenía 1 g L-1 de (NH4)2SO4 como fuente de nitrógeno y colocándolas en una estufa a 30 °C durante 60 horas (tiempo de cosecha).Se cuantificó la concentración de azúcar residual en cada experimento utilizando el método del DNS, y la biomasa por peso seco. Se utilizo la prueba de ANOVA para escoger levaduras que representaran a cada uno de los grupos formados por la comparación de medias en el programa SAS. 7.4.3. Cuantificación dinitrosalicílico)

de

azucares

reductores

por

DNS

(ácido

3,5-

El método DNS se basa en la reducción del acido 3,5-dinitrosalisilico (el cual se encuentra de color amarillo naranja) por la glucosa y/o fructosa al acido 3-amino-5-nitrosalisilico (de color rojo obscuro) (Miller, 1959), cuya presencia puede detectarse por la lectura de la absorbancia. La solución DNS esta compuesta por 5 g de hidróxido sodio; 5 g de ácido 3,5dinitrosalicílico; 2.5 g de bisulfito de sodio y 1 g de fenol en cristales completando a 500 mL de agua y evitando su exposición a la luz; el reactivo puede ser utilizado después de 15 horas de su preparación. Posteriormente se realizó una curva patrón (Fig. 11) con diferentes concentraciones de fructosa que va desde 0 a 1.2 g L-1 como se muestra en el cuadro 2 a continuación:

Cuadro 2. Concentración de fructosa y curva de calibración obtenida para el método del DNS Concentración

Agua

Fructosa

de fructosa

(ml)

(mL)

0

0

0.500

0

1

0.2

0.475

0.025

2

0.4

0.450

0.050

3

0.6

0.425

0.075

4

0.8

0.400

0.100

5

1

0.375

0.125

6

1.2

0.350

0.150

No. De dilución

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 23 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

Absorbancia 570 nm

0.20

y = 0.1545x R² = 0.9954

0.15 0.10 0.05 0.00 0.00

0.50

1.00

Concentración de fructosa (g

1.50 L-1)

_________________________________________________________________________ Figura 11. Curva de calibración para fructosa

El análisis se efectúo en un tubo de ensayo conteniendo 0.5 ml de reactivo DNS y 0.5 ml de la muestra a analizar, previamente diluida a la concentración de la curva patrón, incubándose a 100 °C durante 10 minutos; enfriando por 10 minutos en hielo, agregando 5 ml de agua estéril y determinando la absorbancia a 570 nm (Miller, 1959). 7.4.4. Cuantificación de la biomasa por peso seco La concentración celular se determinó por el método de peso seco, esta técnica permite la estimación de la biomasa total de cada levadura. Para ello se pesaron tubos Falcon de 50 mL limpios y secos, y se les agregó 30 mL del medio YPF e inoculó con la levadura a probar, y se corrió la fermentación durante 60 h, después de lo cual se centrifugó a 2500 rpm por 15 min y se colectó el sobrenadante, y el tubo con la pastilla celular se secó a a 50 °C por 24 h, se colocó en un desecador por 12 h más, y se pesó el tubo con la muestra seca, restándole el peso del tubo limpio como se observa en la fórmula. Este método puede llevarse en paralelo con el de espectrometría, con el fin de obtener la correlación entre D.O. y concentración en biomasa por peso seco (Alfermann et al., 1997). La fórmula utilizada se muestra a continuación:

Donde: _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 24 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

Pf = peso final de la muestra en el tubo P0 = peso del tubo V = Volumen de la muestra PS = peso seco del mosto

7.5. Análisis estadístico

Se analizaron los resultados de biomasa y consumo de azúcares reductores utilizando una prueba ANOVA con un diseño experimental completamente al azar, y comparando las medias obtenidas por la prueba de la Diferencia Mínima Significativa (LSM por sus siglas en inglés) en el programa SAS y el programa Excel. De los resultados obtenidos por la prueba de LSM se escogieron las medias que fueran significativamente diferentes para analizar su productividad de manera fina por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC por sus siglas en inglés), y estos datos se utilizaron para realizar el cálculo de los parámetros de productividad y rendimiento de cada una de las levaduras analizadas en este estudio. 7.6. Cuantificación de azúcares consumidos y etanol producido por HPLC

Para la cuantificación tanto del consumo de azúcares del mosto (glucosa y fructosa) como para la del etanol producido, las muestras a las 60 h que fueron centrifugadas para remover cualquier resto celular o fibra del medio de mosto, se filtraron 3 mL utilizando una membrana de 0.20 μm, y se inyectaron 20 l de la muestra en un equipo de HPLC (Agilent 1100 seriesTM) equipado con una columna BioRadTM Aminex HPX (300 X 7.8 ml). La fase móvil se preparó con agua milliQ y ácido sulfúrico al 0.005 M con un flujo de 0.5 mL min-1 con un tiempo de analisis de 30 min, a una temperatura de 35ºC y se midió la absorbancia a 190 nm. Las curvas de calibración se prepararon con concentraciones de 1 a 15 g L-1, haciéndose la regresión lineal para la cual el cuadrado de coeficiente de correlación de Person (R2) no debió ser menor a 0.95 (Fig.12). A continuación se muestran las curvas de concentración del compuesto vs el área bajo la curva del cromatograma correspondiente:

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 25 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

Glucosa

Fructosa 20000

5000 Area

4000

Area

y = 307.67x R² = 0.9976

3000

15000

y = 1058.8x R² = 0.9949

10000

2000 5000

1000 0

0 0

10 20 Concentración de glucosa (g L-1)

0 10 20 Concentración de fructosa (g L-1)

Etanol 600

y = 35.501x R² = 0.9966

Area

500 400 300 200 100 0 0

10 20 Concentración de etanol (g L-1)

Figura 12. Curvas de calibracion para HPLC

7.7. Determinación de la diversidad genética de las levaduras por rep-PCR

Una de las técnicas reportadas para la caracterización de la diversidad genética de una población con varias especies es la rep-PCR, que se basa en la utilización de oligonucleótidos degenerados universales, los cuales amplifican regiones repetidas del genoma, y que visualizadas en un gel de agarosa produce un patrón de bandas característico de especie analizada. Para esto a partir del resultado de los árboles de distancias generados con el programa MEGA4 y el resultado obtenido del HPLC se escogieron los aislamientos que presentaron mayor producción de etanol, separándolos en 3 grupos por especie: el de las Saccharomyces cerevisise, el grupo de las Kluyveromyces marxianus y el grupo de las Torulaspora delbreckii, realizando esta técnica con cada grupo como se muestra a continuación. El ADNg de las levaduras fue sometido a esta técnica usando los oligonucleótidos

REPIR-1

(5’IIIICGICGICATCIGGC3’)

y

REP2-I

(5’ICGICTTATCIGGCCTAC3’) de acuerdo a Hierro et al., 2004. Las condiciones de _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 26 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

amplificación fueron 2.5 μl de buffer 10X, 1.5 μl de MgCl 25mM, 0.5 μl de dNTPs 10mM, 2.5 μl de cada oligonucleótido 5 μM, 0.5 μl de la enzima Taq polimerasa 5u/5 μl y 1 μl de ADN para un volumen final de 25 μl, las condiciones de amplificación fueron 1 ciclo de 94 °C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 47 °C por 1 min, 65 °C por 4 min, además de una extensión final a 72 °C por 7 minutos. Los productos de PCR fueron mezclados con SyberGold™10X y corridos en un gel de agarosa al 2% en una cámara de electroforesis de la marca Bio-Rad durante 4 horas a 90V y visualizados en un transiluminador, grabando la imagen del gel en el programa Kodak digital ScienceTM 1D y posteriormente vinculándolas con los árboles de distancias generados anteriormente.

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 27 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

8. RESULTADOS 8.1. Caracterización morfológica de los aislamientos

Los 51 aislamientos de levadura obtenidos fueron clasificados de acuerdo a su origen y etapa de fermentación (Cuadro 3). La caracterización preliminar de los mostos se realizó midiendo los grados Brix, y esto nos permitió caracterizar la etapa de fermentación en la que se encontraba el mosto, y por lo tanto de acumulación potencial de alcohol. Cuadro 3. Origen y características del mostos de mezcal (ejido “El Palmar” Tamaulipas) y de las levaduras aisladas en diferentes etapas del proceso.

Aislamiento

Etapa de fermentación

Azúcar o Brix

Morfología microscópica

Trapiche

20.8°

Ovaladas

Inicial

13.2°

Redonda

Final

10°

Redonda

ND

Ovaladas

C.l.4AN1, P.g.4AN2, C.l.4AN3, P.k.4AN5, C.l.4AN6,

P.g.4AN7,

K.m.4D2,

K.m.4D3,

K.m.4D4,

K.m.4D5,

P.k.4D6,

P.k.4D7,

K.m.4Y2, S.c.4Y3, C.l.4Y4, P.k.4Y6 T.d.1AN2, T.d.1AN1, P.m.1AN3, C.l.1AN4, T.d.1AN5, K.m.1AN6, T.d.1AN9, S.c.1D1, K.m.1D5,

C.p.1Y7,

P.g.1Y12,

P.g.1Y15,

P.k.1Y10,

K.m.1Y11,

P.k.1Y16,

K.m.1Y1,

K.m.1Y9, P.m.1Y14, T.d.1D2 S.c.D2,

S.c.D3,

S.c.D4,

S.c.D5,

S.c.D6,

Z.b.3Y1, S.c.3Y2, S.c.3Y3, S.c.3Y4, S.c.3Y5, S.c.3Y8

S.c.mosca3, S.c.mosca1, S.c.mosca6, K.m.mosca7, K.m.mosca5

Drosophila melanogaster (moscas)

Nota: las claves finales de los aislamientos fueron asignadas una vez conocida su identidad molecular, y se utilizan desde este cuadro para facilitar el análisis de resultados.

Los aislamientos que se encontraban en la etapa de trapiche tuvieron en general una morfologia ovalada, ademas de que en esta etapa y en la inicial fue donde se observó la mayor diversidad siendo K. marxianus la que aparece en mayor número de aislamientos, _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 28 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

mientras que S. cerevisiae se encuentra en baja frecuencia, ya que esta levadura generalmente se encuentra en los tanque de fermentacion o en las cubetas donde es colectado el mosto recien molido; sin embargo, ya que esta levadura es tolerante a altas concentraciones de etanol, aumenta su frecuencia, desplazando a las demas especies de levaduras al final del proceso, por lo que la diversidad disminuye conforme transcurre la fermentación.

En cuanto a la caracterización microscópica, se observaron dos morfologías (redonda y ovalada) principales, y las cuales sirvieron para realizar una clasificación preliminar de los aislamientos (fig. 13).

Figura 13. Microfotografías digitales de levaduras con su principal diferencia utilizada en este trabajo para clasificarlas morfológicamente. A) Saccharomyces cerevisiae (redonda) y B) Pichia kluyveri (ovalada). Objetivo 100X.

Dada la baja resolución de esta determinación cualitativa, se procedió a realizar la identificación molecular de los aislamientos, utilizando para ello la secuencia de fragmentos ribosomales, que es una técnica ampliamente utilizada y reportada. 8.2. Identificación molecular de las levaduras

Los 51 aislamientos fueron identificados por la secuencia de dos diferentes regiones ribosomales encontrando de esta manera nueve especies diferentes de levaduras y asignándoles entonces claves colocando las iniciales y el punto de aislamiento de cada levadura ya identificada (Cuadro 4), quedando de la siguiente manera: 15 Saccharomyces cerevisiae (S.c.), 12 Kluyveromyces marxianus (K.m.), 5 Torulaspora delbrueckii (T.d.), 6

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 29 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

Pichia kluyveri (P.k.), 4 P. guillermondii (P.g.), 2 P. mexicana (P.m.), 5 Clavispora lusitaniae (C.l.), 1 Candida parapsilosis (C.p.) y 1 Zygosaccharomyces bailii (Z.b.)

Cuadro 4. Levaduras identificadas por secuenciación de las regiones ITS1-5.8S-ITS2 y 26S de los mostos de mezcal tamaulipeco utilizando el programa BLAST del NCBI. Clave

Identificación con ITS

Valor E

Identidad %

Identificación con 26S

Valor E

Identidad %

Identificación

S.c.D2

S. cerevisiae ( EU145764)

0

98

S. cerevisiae ( EF192587)

0

99

S. cerevisiae

S.c.D3

S. cerevisiae ( EU145764)

0

88

S. cerevisiae ( EU884435)

0

100

S. cerevisiae

S.c.D4

S. cerevisiae ( EU649673)

0

96

S. cerevisiae ( EU884435)

0

100

S. cerevisiae

S.c.D5

S. cerevisiae ( EU145764)

0

87

S. cerevisiae ( EU884435)

0

99

S. cerevisiae

S.c.D6

--

--

--

S. cerevisiae ( EU884435)

0

99

S. cerevisiae

S.c.3Y3

S. cerevisiae ( EF457565)

0

98

S. cerevisiae ( EU556320)

0

99

S. cerevisiae

S.c.3Y5

S. cerevisiae ( EU145764)

0

97

S. cerevisiae ( EU884435)

0

99

S. cerevisiae

S.c.3Y4

S. cerevisiae ( EU145764)

0

98

S. cerevisiae ( EU884435)

0

99

S. cerevisiae

S.c.3Y8

S. cerevisiae ( EU145764)

0

98

S. cerevisiae ( EU884435)

0

100

S. cerevisiae

S.c.3Y2

S. cerevisiae ( EU151450)

0

98

S. cerevisiae ( EU884435)

0

99

S. cerevisiae

S.c.1D1

--

--

--

S. cerevisiae ( EU884435)

0

99

S. cerevisiae

S.c.4Y3

S. cerevisiae ( EU145764)

0

91

S. cerevisiae ( EU386759)

0

99

S. cerevisiae

S.c.mosca3

--

--

--

S. cerevisiae ( EU884435)

0

99

S. cerevisiae

S.c.mosca1

--

--

--

S. cerevisiae ( EU884435)

0

99

S. cerevisiae

S.c.mosca6

--

--

--

S. cerevisiae ( EU884435)

0

99

S. cerevisiae

K.m.1Y1

K.marxianus (AY939806)

0

97

K.marxianus ( EU019219)

0

98

K.marxianus

K.m.1Y9

--

--

--

K.marxianus ( GQ121696)

0

97

K.marxianus

K.m.1AN6

K.marxianus ( AF543841)

0

98

K.marxianus ( EU439449)

0

99

K.marxianus

K.m.1D5

K.marxianus ( AF543841)

0

99

K.marxianus ( EU439450)

0

99

K.marxianus

K.m.1Y11

K.marxianus ( AF543841)

0

98

K.marxianus ( EU439450)

0

98

K.marxianus

K.m.4D2

K.marxianus ( AF543841)

0

98

K.marxianus ( EU019219)

0

98

K.marxianus

K.m.4D3

K.marxianus ( AF543841)

0

98

K.marxianus ( EU439449)

0

99

K.marxianus

K.m.4D4

K.marxianus ( AF543841)

0

97

K.marxianus ( EU019219)

0

98

K.marxianus

K.m.4D5

K.marxianus ( AF543841)

0

97

K.marxianus ( EU439450)

0

98

K.marxianus

K.m.4Y2

K.marxianus ( AF543841)

0

98

K.marxianus ( EU019219)

0

98

K.marxianus

K.m.mosca7

K.marxianus ( AF543841)

0

97

K.marxianus ( EU019219)

0

99

K.marxianus

K.m.mosca5

K.marxianus ( AF543841)

0

98

K.marxianus ( EU019219)

0

97

K.marxianus

T.d.1AN2

T. delbrueckii ( D89589)

0

98

T. delbrueckii ( EU879962)

0

96

T. delbrueckii

T.d.1D2

T. delbrueckii (EF568083)

0

98

T. delbrueckii ( EU879961)

0

98

T. delbrueckii

T.d.1AN1

--

--

--

T. delbrueckii ( EU879961)

0

97

T. delbrueckii

T.d.1AN5

T. delbrueckii ( X80275)

0

100

T. delbrueckii ( EU879961)

0

99

T. delbrueckii

T.d.1AN9

T. delbrueckii ( X80675)

0

100

T. delbrueckii ( EU879961)

0

99

T. delbrueckii

Z.b.3Y1

Z. bailii (X84640)

1E-106

93

Z. bailii ( AJ966343)

0

99

Z. bailii

C.p.1Y7

C. parapsilopsis (EU564205)

0

99

C. parapsilopsis (EU605804)

0

99

C. parapsilopsis

P.m.1AN3

--

--

--

P. mexicana (AM397863)

0

99

P. mexicana

P.m.1Y14

P. mexicana (AB365477)

0

98

P .mexicana (EU809452)

0

98

P.mexicana

P.g.1Y12

P.guillermondii (EF15140)

0

98

P.guillermondii EU177574)

0

98

P.guillermondii

P.g.1Y15

P.guillermondii (AM160625)

0

98

P.guillermondii (EU177574)

0

98

P.guillermondii

P.g.4AN2

P.guillermondii (EF151440)

0

94

P.guillermondii (EU177574)

0

98

P.guillermondii

P.g.4AN7

P.guillermondii (EU568993)

0

98

P.guillermondii (EU177574)

0

99

P.guillermondii

C.l.1AN4

C. lusitaniae (AY321469)

0

96

--

--

--

C. lusitaniae

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 30 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

Cuadro 4. Continuación… Levaduras identificadas por secuenciación de las regiones ITS1-5.8S-ITS2 y 26S de los mostos de mezcal tamaulipeco utilizando el programa BLAST del NCBI. Clave

Identificación con ITS

Valor E

Identidad %

--

--

Valor E

Identidad %

C .lusitaniae (AY894825)

0

96

C .lusitaniae

Identificación con 26S

Identificación

C.l.4AN1

--

C.l.4AN3

C. lusitaniae ( AY321469)

1E-165

98

C. lusitaniae (AY894824)

0

98

C. lusitaniae

C.l.4Y4

C.lusitaniae ( AY149777)

4E-170

99

C.lusitaniae (EU669469)

0

98

C.lusitaniae

C.l.4AN6

C. lusitaniae ( EF136370)

2E-149

94

--

--

--

C.lusitaniae

P.k.1Y10

P. kluyveri (DQ104732)

0

97

P. kluyveri (EU268643)

0

99

P. kluyveri

P.k.1Y16

P. kluyveri ( DQ104732)

3E-140

90

P. kluyveri (EU373464)

0

93

P. kluyveri

P.k.4AN5

P.kluyveri ( DQ104732)

0

97

P.kluyveri ( EU268643)

0

98

P.kluyveri

P.k.4D6

P. kluyveri ( DQ104732)

0

97

P. kluyveri ( EF116919)

0

99

P. kluyveri

P.k.4D7

P. kluyveri ( DQ104732)

0

98

P. kluyveri ( EU373464)

0

99

P. kluyveri

P.k.4Y6

P. kluyveri ( DQ104732)

0

97

P. kluyveri ( EU268643)

0

98

P. kluyveri

Una vez obtenida la identidad de cada una de la levadura y con secuencias de referencia de la página del NCBI (GenBank) mediante el algoritmo blast, se elaboraron árboles de distancias génicas para cada una de las regiones secuenciadas, encontrando que, para la región 26S, todas las levaduras se agrupaban por especie, obteniéndose los nueve grupos (en números romanos) a los que pertenecía cada levadura (Fig. 14). El grupo I pertenece a la especie S. cerevisiae, el II son las pertenecientes a T. delbrueckii, el grupo III a Z. bailii, en el grupo IV se encuentra K. marxianus, en el V se encuentra C.parasilopsis, en el VI se agrupan las P. mexicana, en el grupo VII se encuentra P. guilliermondii, el grupo VIII muestra a C. luitaniae mientras que en el grupo IX se encuentran las levaduras P.kluyveri y se presentan de esta manera en los dos árboles de distancias mostrados a continuación.

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DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

65

100

52 65

100

41 99

100

65

100 97

65

100

100 88

65

100

79 100

100

100 98

36

0.14

0.12

0.10

0.08

0.06

0.04

0.02

S.c.mosca3 S.c.3Y2 S.c.mosca6 S.c.D3 S.c.D4 S.c.D5 S.c. D6 EU556339 Saccharomyces cerevisiae S.c.3Y5 S.c.D2 S.c.3Y3 S.c.3Y4 S.c.3Y8 S.c.1D1 S.c.4Y3 S.c.mosca1 T.d.1AN1 T.d.1AN2 T.d.1AN5 EU879961 Torulaspora delbrueckii T.d.1AN9 T.d.1D2 Z.b.3Y1 AJ966343 Zygosaccharomyces bailii EU439450 Kluyveromyces marxianus K.m.1AN6 K.m.mosca7 K.m.1Y1 K.m.4D2 K.m.4D5 K.m.4D3 K.m.4D4 K.m.4Y2 K.m.1D5 K.m.1Y11 K.m.mosca5 K.m.1Y9 C.p.1Y7 EU605804 Candida parapsilosis P.m.1AN3 EU809452 Pichia mexicana P.m.1Y14 EU177574 Pichia guilliermondii P.g.1Y15 P.g.4AN7 P.g.1Y12 P.g.4AN2 C.l.4AN1 AY894825 Clavispora lusitaniae C.l.4AN3 C.l.4Y4 AY305665 Pichia kluyveri P.k.1Y10 P.k.1Y16 P.k.4AN5 P.k.4D6 P.k.4D7 P.k.4Y6 FJ360521 Neurospora crassa

I

II III

IV

V VI VII

VIII

IX

0.00

Figura 14. Árbol de distancias obtenido de la región 26S de ADNr generado en el programa MEGA 4 utilizando el metodo Neighbor Joining. La distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum Composite Likelihood y un re-muestreo de 1000 replicas. Una cepa de Neurospora crassa tomada del GenBank fue utilizada como grupo de salida. _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 32 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

67

74

65

89

99

43

99 18

18 74 29

97

33 63 88

98 61 95

49 49

99

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

EU145764 Saccharomyces cerevisiae S.c.D3 S.c.4Y3 S.c.D5 S.c.3Y8 S.c.3Y2 S.c3Y3 S.c.3Y4 S.c.3Y5 S.c.D2 S.c.D4 T.d.1AN2 AB469378 Torulaspora delbrueckii T.d.1D2 K.m.1Y1 K.m.4D2 EF568057 Kluyveromyces marxianus K.m.4D3 T.d.1AN5 K.m.mosca5 K.m.1AN6 K.m.1D5 K.m.1Y11 K.m.4D5 K.m.4Y2 T.d.1AN9 K.m.mosca7 K.m.4D4 Z.b.3Y1 X84732 Zygosaccharomyces bailii K.m.1Y9 P.k.4AN5 P.k.4D6 P.k.4D7 DQ104732 Pichia kluyveri P.k.1Y10 P.k.4Y6 P.k.1Y16 P.m.1Y14 EF568069 Pichia mexicana P.g.4AN2 EF151440 Pichia guilliermondii P.g.4AN7 P.g.1Y12 P.g.1Y15 C.l.4Y4 AY321469 Clavispora lusitaniae C.l.4AN3 C.l.1AN4 C.l.4AN6 C.p.1Y7 FM172980 Candida parapsilosis FJ360521 Neurospora crassa

I

II

IV

III

IX

VI VII

VIII V

0.00

Figura 15. Árbol de distancias génicas generado de la región ITS1-5.8S-ITS2 con el método Neighbor Joining. La distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum Composite Likelihood y un remuestreo de 1000 replicas. Una cepa de Neurospora crassa tomada del GenBank fue utilizada como grupo de salida.

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DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

Para la región ITS1-5.8S-ITS2 (Fig. 15), aunque también se formaron los nueve grupos, algunas de las levaduras de los géneros Kluyveromyces y Torulaspora no se agruparon correctamente con su secuencia de referencia, como es el caso de los aislamientos T.d.1AN9 y T.d.1AN5 (Fig. 15) las cuales pertenecen al género Torulaspora y se agrupan con el género Kluyveromyces, además estas dos levaduras obtuvieron un 99% de identidad con su secuencia de referencia en el algoritmo blast. La levadura K.m.1Y9 también se salió del grupo de Kluyveromyces colocándose con Zygosaccharomyces en un grupo diferente, fuera de los 9 previamente identificados. 8.2.1. Diversidad de especies durante la fermentación del mezcal Para la caracterización de la diversidad ecológica del proceso de producción del mezcal, se consideraron todas las etapas de la fermentación, comenzando por el trapiche donde se aislaron 5 especies (16 variedades), en la etapa inicial 8 especies (24 variedades) y en la final 2 especies (5 variedades) (Cuadro 5). El índice de diversidad también indica que esta fue mayor en la etapa inicial. El hecho de que la mayor diversidad se encuentre en las primeras etapas de fermentación es debido probablemente a la alta concentración de azúcares y poco etanol en el mosto durante esas etapas (Cuadro 5).

Cuadro 5. Caracterización de la diversidad ecológica por etapas de la fermentación del mezcal de San Carlos (Tamaulipas) mediante su la riqueza de especies (S), el índice de diversidad de Shannon (H), y la diversidad (D) y dominancia (D´) de Simpson.

Variables

Etapas de la fermentación Trapiche

Inicial

Final

S

5

8

2

H

1.49

1.87

0.30

D

5.22

6.9

1.5

D’

0.19

0.15

0.67

Es claro por el índice de dominancia que, al final de la fermentación, un solo tipo de población (S. cerevisiae) predomina en esta etapa.

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8.3. Fermentaciones en medio de mosto de Agave 8.3.1. Consumo de azúcares reductores La cuantificación de los azúcares reductores en los mostos durante las fermentaciones demostró que, a las 60 horas, que fue el punto final muestreado para todos los aislamientos ya solo se encontraran pequeñas concentraciones de de azúcar en algunos casos.

B

A 120 100 80 60 40 20 0

g L-1

g L-1

120 100 80 60 40 20 0

C

D 120 100 80 60 40 20 0

g L-1

g L-1

120 100 80 60 40 20 0

E

F 120 100 80 60 40 20 0

g L-1

g L-1

120 100 80 60 40 20 0

Figura 16. Consumo de azucares reductores en el mosto después de 60 horas (A) Saccharomyces cerevisiae (S.c.), (B) Kluyveromyces marxianus (K.m.), (C) Torulaspora delbrueckii (T.d.), (D) Pichia kluyvery (P.k.), (E) Clavispora lusitaniae (C.l.), (F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m., P.g.).

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El consumo fue diferencial para cada aislamiento, y se puede destacar a la levadura S.c.D5, la cual utilizó el 88 % de los azucares, además de presentar un rápido crecimiento durante las primeras horas de inoculación (Fig. 16). En general, la mayoría de las S. cerevisiae tuvieron un buen consumo y crecimiento en el medio de mosto de Agave (Cuadro 6).

8.3.2. Crecimiento de las levaduras en mostos de Agave Los aislamientos que consumieron la mayor cantidad de azúcar demostraron ser también los que obtuvieron mayor peso seco por consiguiente fueron los que tuvieron el mayor crecimiento, siendo los aislamientos de S. cerevisiae los que alcanzaron hasta un peso seco de 4.8 g L-1, mientras que los aislamientos de Pichia spp no alcanzaron el 1 g L-1. Esto demuestra la gran variabilidad en su capacidad de consumir los azucares presentes en el mosto (Fig. 17).

8.3.3. Análisis del consumo especifico de azúcares reductores Se realizó el cálculo del consumo de azúcares reductores por unidad de biomasa, como un parámetro que indicara la capacidad específica de utilización de la fuente de carbono de cada uno de los aislamientos en el medio de mosto de agave, y como se puede apreciar en la Figura 18, al utilizar este parámetro, es posible observar diferencias en las capacidades de consumo de cada uno de los aislamientos en todas las especies aisladas, lo cual indica que existen diferencias metabólicas en cada población, que pudieran ser aprovechadas en el mejoramiento de la fermentación.

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DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

B

5

5

4

4

3

3

2

g L-1

g L-1

A

1

1

0

0

D

5

5

4

4

3

3

2

g L-1

g L-1

C

2

1

1

0

0

E

F

5

5

4

4

3

3

2 1 0

g L-1

g L-1

2

2 1 0

Figura 17. Biomasa producida por cada levadura en el mosto de agave. A) Saccharomyces cerevisiae (S.c.); B) Kluyveromyces marxianus (K.m.); C) Torulaspora delbrueckii (T.d.); D) Pichia kluyvery (P.k.); E) Clavispora lusitaniae (C.l.); F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m.) y (P.g.).

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DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

g-AZ/g-X

C

g-AZ/gX

B 80 70 60 50 40 30 20 10 0

80 70 60 50 40 30 20 10 0

D 80 70 60 50 40 30 20 10 0

g-AZ/g-X

g-AZ/g-X

A

F 80 70 60 50 40 30 20 10 0

g-AZ/g-X

g-AZ/g-X

E

80 70 60 50 40 30 20 10 0

80 70 60 50 40 30 20 10 0

Figura 18. Consumo especifico obtenida a las 60 horas por cada una de las levaduras. (A) Saccharomyces cerevisiae (S.c.), (B) Kluyveromyces marxianus (K.m.), (C) Torulaspora delbrueckii (T.d.), (D) Pichia kluyvery (P.k.), (E) Clavispora lusitaniae (C.l.), (F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m., P.g.).

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DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

Los datos de consumo específico de azúcares reductores fueron utilizados para realizar un análisis de varianza, el cual arrojó los siguientes resultados:

Cuadro 6. ANOVA del consumo especifico de azúcar

Fuente Modelo Error Total correcto Alfa Error de grados de libertad Error de cuadrado medio Valor crítico de t Diferencia menos significativa

GL 53 150 203

Suma de cuadrados 44549.06627 6020.04706 50569.11333

Cuadrado medio 840.54842 40.13365

F-Valor 20.94

Pr > F 10%) y que suelen encontrarse en ambientes vinícolas (Fleet, 2003). Con respecto al índice de dominancia de Simpson, se corroboró la observación de que es en la etapa final, de alta concentración etanólica, en donde se aislaron diez S. cerevisiae y una Z. bailii como se menciono anteriormente.

Haciendo una analogía con el sistema de fermentación vinícola, se ha observado que la concentración inicial de células usualmente es de 104-105 cfu mL-1 para las especies noSaccharomyces y de 102-103 cfu mL-1 para las Saccharomyces, sin embargo conforme transcurre la fermentación, las no-Saccharomyces desaparecen y las especies de Saccharomyces aumentan alcanzando alrededor de 107-108 cfu mL-1 al llegar a la etapa final del proceso (Xufre et al., 2006). Es razonable suponer que en el sistema de mosto de Agave spp deben presentarse cambios similares de poblaciones. Si bien en este trabajo la concentración celular no fue medida en los diferentes puntos de muestreo de la fermentación del mezcal tamaulipeco, sería importante, desde el punto de vista de proceso, hacer ésta cuantificación, y verificar si la concentración celular de una especie en particular tienen impacto en las características organolépticas del producto final.

En la fermentación espontánea de bebidas destiladas de Agave spp en general es en las primeras etapas donde se encuentra la mayor diversidad de especies de levaduras y es también donde se producen los primeros aromas de esta bebida lo cual es realizado por levaduras no-Saccharomyces, las cuales pueden producir altas concentraciones de algunos compuestos que determinan la calidad sensorial de las bebidas alcohólicas. Las especies de levaduras involucradas en la fermentación de mostos de agave son variables, y no hay dos tipos de mezcal que tengan el mismo perfil de poblaciones, Por ejemplo, en el caso de mostos de Agave salmiana (mezcal potosino), se identificaron 4 especies de levaduras involucradas en el proceso: C. lusitaniae, K. marxianus, P. fermentans y S. cerevisiae (De León Rodríguez et al., 2006).

En contraste, las poblaciones de levaduras que se encuentran presentes durante cada una de las etapas de fermentación en el caso del mezcal de Michoacán, se aislaron a Candida magnoliae, Hanseniospora vineae, H. uvarum, Issatchenkia occidentalis, Kluyveromyces lactis, y Saccharomyces cerevisiae en 13 diferentes destilerías (Gschaedler Mathis et al., 2004). En el caso del mezcal de Oaxaca, encontraron a Candida spp., Hanseniaspora spp. y _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 49 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

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S. cerevisiae (Andrade Meneses y Ruiz Teran (2004), citado en Lappe-Oliveras et al., 2008); en tanto que del mosto de A. fourcroydes de mezcal de Yucatán, se aislaron especies de Candida spp, C. parasilopsis, C. lusitaniae, Debaryomyces hansenii, Kluyvernomyces marxianus, Pichia caribbica, P. guilliermondii, Rhodotorula spp., T. delbrueckii y S. cerevisiae en una fermentación natural (Lappe-Oliveras et al., 2008). Es claro que existe una gran diversidad ecológica de levaduras que se encuentran presentes en la fermentación del mezcal de las diferentes regiones de México, y las cuales pueden influenciar la calidad de esta bebida artesanal, existen especies de levaduras comunes para todas las fermentaciones de mostos de Agave, es claro que la presencia de levaduras (y Agave spp) específicos para cada uno de los productos regionales, pueden conferirles propiedades organolépticas únicas.

La identificacion molecular la cual fue realizada por secuenciacion de las región ITS15.8S-ITS2 mostró consistencia, como era esperado, con la identificación arrojada con la región 26S ,y solo en pocos aislamientos el producto de PCR de esta región no pudo ser secuenciada (ver cuadro 4). También se observó que el porcentaje de identidad en general era más bajo al utilizar la secuencia de la región ITS1-5.8S-ITS2. Se ha reportado evidencia de que la región ITS1-5.8S-ITS2 contiene variaciones considerables en su secuencia; por ejemplo, Sujaya et al. (2004) en su trabajo realizado en el vino de arroz, identificaron 51 levaduras, sin embargo tuvieron el mismo problema al intentar secuenciar de forma directa las regiones ITS esto podría ser debido a la presencia de una heterocopia la cual se piensa pude ser por que algunas cepas son heterotálicas y contienen dos alelos en un mismo locus. Esto es una desventaja al utilizar la región ITS1-5.8S-ITS2 para clasificar levaduras. Es por ello que para los resultados que aquí se reportan, fue muy importante también secuenciar la región 26S, corroborando de esta manera nuestros resultados y logrando identificar molecularmente a los 51 aislamientos (cuadro 4).

El análisis filogenético con las dos diferentes regiones ribosomales analizadas en este trabajo reveló que dos de los aislamientos que fueron clasificados como Torulaspora delbrueckii con la región 26S, poseen una alta similitud con Kluyveromyces marxianus al ser identificados con la región ITS1-5.8S-ITS2, lo cual puede sugerir algunos errores en los reportes en la literatura de estas especies cuando solamente se utiliza esta región para su clasificación. Estos resultados indican que, en el caso de las levaduras, debieran _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 50 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

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secuenciarse al menos dos regiones, ribosomales o de algún gen constitutivo, para poder tener certeza de la identidad molecular de los aislamientos.

9.2. Diversidad fenotípica

En la caracterización productiva de las levaduras a las 60 h de cultivo, se pudieron observar diferencias fenotípicas en el consumo de azúcares, principalmente entre los aislamientos de las especies de S. cerevisiae, K. marxianus y T. delbrueckii, y todas las levaduras fueron capaces de producir etanol, no únicamente las pertenecientes a S. cerevisiae. En un estudio en vino realizado por Clemente- Jimenez et al. (2004), utilizando seis diferentes variedades de uva, midieron la cantidad de azucar residual en el mosto encontrando que las especies S. cerevisiae y Candida stellata fueron las que consumieron la mayor cantidad de azúcar, sin embargo al igual que en nuestro trabajo, todas las levaduras probadas produjeron etanol pero en cantidades variables. En nuestro caso no se encontró a C. stellata en los mostos de Agave spp utilizados en la elaboración del mezcal tamaulipeco.

Es conocido que las levaduras de la especie S. cerevisiae tienen actividad killer, es decir que producen compuestos toxicos para otras levaduras lo cual podria ser una explicación de que las demas levaduras presentes en las primeras etapas de fermentacion desaparecieran conforme transcurre este proceso, adicional al conocido efecto del etanol, en el cual la mayoría de especies, excepto las resistentes, son inhibidas cuando alcanza una concentración del 5 al 7% en el mosto (Fleet, 2003), y que en mostos de Agave spp puede llegar a alcanzar concentraciones del doble de ese valor (Díaz-Montaño et al., 2008). En nuestro caso los aislamientos de S. cerevisiae fueron los que presentan una variabilidad relativa de hasta un 70% en cuanto a su producción de biomasa, así como en su velocidad de consumo de azúcares y de producción de etanol, lo cual indica una alta especialización fenotípica a diferentes condiciones del mosto.

9.3. Diversidad genética y productividad

El uso de la técnica rep-PCR permitió obtener patrones diferenciales para cada una de las levaduras analizadas, sin embargo, en algunos casos, no fue posible obtener la _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 51 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

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amplificación, lo cual indica que probablemente estos aislamientos no tienen los sitios de hibridación para los oligonucleótidos utilizados. Las levaduras del grupo Saccharomyces presentan algunas diferencias en su patrón rep-PCR el cual se pudo observar principalmente en las levaduras S.c.mosca3, S.c.1D1, S.c.3Y4 y S.c. 3Y8, las cuales presentaron un patrón muy diferente entre sí y con las demas levaduras. Se observó variación en la identidad genética de los aislamientos incluidos en la mayoria de las especies involucradas en la fermentacion del mezcal tamaulipeco, pero especialmente en las especies S. cerevisiae, K. marxianus y T. delbrueckii. De manera relevante, todas las levaduras aisladas de los mostos de mezcal tamaulipeco producen etanol, aunque en concentraciones muy variables.

Estos resultados indican que esta técnica rep-PCR es capaz de diferenciar a las levaduras que se encuentran en los mostos de mezcal, separando a los aislamientos que incluso pertenecen a la misma especie. Por ejemplo, el aislamiento S.c.mosca3, que presentó la mayor producciónn de etanol, tuvo un patrón rep-PCR diferente a las demás S. cerevisiae.

Los aislamientos Td1AN5 y Td1AN9, identificadas molecularmente como pertenecientes a la especie Torulaspora , fueron clasificadas como Kluyveromyces tanto en el arbol de distancias elaborado con las secuencias de la region ITS1-5.8S-ITS2, como en el árbol elaborado con el patrón de bandas del rep-PCR, lo cual puede indicar que estos dos aislamientos no pertenece a Torulaspora como lo indica el arbol de distancias de la region 26S. La levadura K.m.1Y9 la cual se salió del grupo de las Kluyveromyces presenta un patrón rep-PCR diferente al resto de su grupo. Esto indica que un solo nivel de caracterización molecular no es suficiente para su identificación ó clasificación, por lo que el conjuntar estos datos con el fenotipo productivo sirvió para elegir a los aislamientos con mejores propiedades fermentativas.

Estos resultados indican que, si bien no es posible determinar a priori las características productivas de un aislamiento simplemente basado en su perfil rep-PCR, sin embargo sí pueden ser utilizado como un sistema de identificación y etiquetamiento molecular de los aislamientos, que pudiera ser utilizado en el seguimiento de cada uno durante la fermentación, para verificar que la población deseada se encuentra presente en el proceso.

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Durante los últimos años han aparecido técnicas novedosas para el estudio de los microorganismos utilizados en la industria de las fermentaciones, que han permitido identificar una gran diversidad de especies de interés económico e industrial. La técnica rep-PCR mostró un gran poder de resolución para los aislamientos probados en este estudio por lo que es recomendable utilizarla como una caracterización preliminar en las levaduras (y bacterias) presentes en los mostos para hacer una separación rápida de las diferentes especies que puedan estar presentes en los mostos de mezcal.

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10. CONCLUSIONES En este estudio se obtuvieron aislamientos pertenecientes a 9 especies diferentes de levaduras colectadas en la etapa inicial y final de la fermentación, y se caracterizaron molecular y fenotípicamente 15 aislamientos de S. cerevisiae, 12 de K. marxianus, 5 de T. delbrueckii, 6 de P. kluyveri, 5 de C. lusitaniae, 4 de P. guillerrmondii, 2 de P. mexicana, 1 de C. parapsilopsis y un aislamiento que fue tolerante a altas concentraciones de etanol, ya que fue colectada de la etapa final de fermentación, perteneciente a la especie Z. bailii.

Mediante el uso de la técnica rep-PCR se pudo analizar el genoma de las levaduras más productivas, encontrando una gran diversidad genética existente entre aislamientos de la misma especie, como fue en el caso de S. cerevisiae, mientras que en K. marxixnus y T.delbrueckii existen pocas diferencias aparentes para comparar con esta técnica los genoma de dichas especies. Sin embargo, el rep-PCR podría ser de gran ayuda para hacer una comparacion rápida de las levaduras que se encuentran en cada etapa de la fermentación.

Todas las levaduras produjeron etanol aunque en diferentes concentraciones, que variaron hasta en dos ordenes de magnitud, pero no hay que descartar la producción de otros metabolitos influyen considerablemente en el sabor del producto final. El aislamiento S.c.mosca3 fue el que tuvo la tasa de consumo de azúcares mas alta, y fue por consiguiente el que presentó la mayor producción de etanol, además de que esta levadura presentó un patrón en huella genética de rep-PCR diferente a las demás.

Los resultados presentados en este trabajo indican que existe una gran diversidad ecológica y genética de levaduras que se encuentran presente en las diferentes etapas de la fermentacion del mezcal que se produce en Tamaulipas, las cuales en su conjunto determinan las características organolépticas del producto final, y que aunque S. cerevisiae produce la mayor cantidad de etanol, es indudable que toda una gama de microorganismos están involucrados en menor o mayor grado en el sabor y olor del producto tamaulipeco.

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11. RECOMENDACIONES El mezcal, al ser una bebida artesanal, requiere más estudio acerca de las levaduras y otros microorganismos que se encuentran presentes durante cada una de las etapas de fermentación, ya que, si bien ya han sido identificadas y analizadas en cuanto a su productividad en este estudio, requiere corroborarse su implicación productiva en condiciones reales directamente en la mezcalera.

También se recomienda estudiar por HPLC y por CG otros metabolitos que se sabe están presentes en los mostos de mezcal, como ésteres y ácidos orgánicos, que son producidos por levaduras (y bacterias) tales como los ácidos acético, láctico, succínico, málico y cítrico; así como también es necesario estudiar los alcoholes superiores que podrían estar presentes en las diferentes etapas de fermentación, y que se sabe tienen un fuerte impacto en las características organolépticas del producto final.

Existen otras técnicas moleculares con las cuales se puede monitorear a las levaduras del mezcal tales como la hibridación in situ fluorescente (FISH) y de caracterización molecular global mediante el análisis de regiones ribosomales (ARISA), con las cuales se podría hacer el seguimiento de las especies y de la dinámica poblacional, así como implementar técnicas más rápidas de caracterización microbiológica de los mostos.

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13. APÉNDICE

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APÉNDICE 1. Aislamientos de levaduras con su clave de identificación y el número de carril en el que se encuentra en el gel de agarosa de la PCR. Clave S.c.D2 S.c.D3 S.c.D4 S.c.D5 S.c.D6 Z.b.3Y1 S.c.3Y2 S.c.3Y3 S.c.3Y4 S.c.3Y5 S.c.3Y8 T.d.1AN2 K.m.1Y1 K.m.1Y9 P.m.1Y14 T.d.1D2 C.l.1AN4 T.d.1AN1 P.m.1AN3 T.d.1AN5 K.m.1AN6 T.d.1AN9 S.c.1D1 K.m.1D5 C.p.1Y7 P.k.1Y10 K.m.1Y11 P.g.1Y12 P.g.1Y15 P.k..1Y16 C.l.4AN1 C.l.4AN6 P.g.4AN2 C.l.4AN3 P.k.4AN5 P.g.4AN7 K.m.4D2 K.m.4D3 K.m.4D4 K.m.4D5 P.k.4D6 P.k.4D7 K.m.4Y2 S.c.4Y3 C.l.4Y4 P.k.4Y6 S.c.mosca3 S.c.mosca1 S.c.mosca6 K.m.mosca7 K.m.mosca5

Número de carril 26S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Número de carril ITS1-5.8-ITS2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

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APÉNDICE 2. Análisis de varianza del consumo específico de azúcares. Agrupamiento "T"

Media

N

Levadura

A

77.55

4

P.m.1AN3

B

60.5

4

P.g.4AN2

B

59.6

4

K.m.4D2

C

B

56.575

4

C.l.1AN4

C

B

D

53.05

4

K.m.4D5

C

E

D

48.625

4

K.m.1Y11

C

E

D

48.475

4

K.m.4D3

E

D

46.5

4

T.d.1AN5

E

D

46.3

4

S.c.D5

E

D

46.25

4

T.d.1AN1

F

E

D

45.3

4

K.m.1D5

F

E

D

44.45

4

K.m.4D4

F

E

G

43.525

4

T.d.1D1

F

H

E

G

43.025

4

C.l.4AN3

F

H

E

G

43

4

K.m.1Y9

I

F

H

E

G

41.025

4

K.m.mosca5

I

F

H

G

J

39.825

4

K.m.4Y2

I

F

H

K

G

J

37

4

P.k.1Y10

I

F

H

K

G

J

36.675

4

K.m.1Y1

I

L

H

K

G

J

34.95

4

K.m.1AN6

I

L

H

K

J

34.325

4

T.d.1D2

I

L

K

M

J

32.375

4

P.k.1Y16

I

L

K

M

J

32.225

4

C.p.1Y7

L

K

M

J

32

4

S.c.3Y2

J

31.7

4

S.c.3Y5

L

N

K

M

L

N

K

M

30.375

4

C.l.4AN1

L

N

K

M

30.075

4

S.c.mosca6

L

N

K

M

30.05

4

T.d.1AN2

L

N

K

M

29.725

4

S.c.mosca3

L

N

K

M

28.7

4

S.c.3Y8

L

N

K

M

28.575

4

K.m.mosca7

L

N

M

27.8

4

S.c.4Y3

L

N

M

27.5

4

C.l.4AN6

L

N

O

M

27.05

4

Z.b.3Y1

P

N

O

M

25.325

4

T.d.1AN9

Q

P

N

O

M

24.6

4

S.c.3Y4

Q

P

N

O

23.125

4

S.c.D2

Q

P

R

18.45

4

P.g.1Y12

Q

P

R

17.725

4

S.c.mosca1

Q

P

R

17.375

4

P.k.4AN5

S

R

15.8

4

P.k.4Y6

S

R

14

4

P.m.1Y14

S

R

13.925

4

S.c.D4

O

Q

T

S

R

12.8

4

P.g.1Y15

T

U

S

R

11.75

4

S.c.3Y3

T

U

S

R

10.225

4

P.k.4D6

T

U

S

8.275

4

S.c.D6

T

U

S

8.2

4

P.k.4D7

T

U

S

8.1

4

S.c.D3

T

U

4.95

4

C.l.4Y4

U

3.575

4

P.g.4AN7

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APÉNDICE 3. Imágenes de las levaduras utilizadas en este estudio divididas en dos grupos las que tienen células redondas y las de células ovaladas, objetivo 100 X

Células Redondas

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Células Ovaladas

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DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

APÉNDICE 4. Secuencias obtenidas por secuenciación y secuencias de referencia utilizadas para la elaboración de los árboles de distancias génicas de las dos diferentes regiones. Región 26S de ADN ribosomal. >FJ360521_Neurospora_crassa TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATTTTTCTTACTTTCCTTCTACCTTTTTACTTTTGTAATGTCTT GCCCCCTTAGTAAGCTTCTTCCTTTCTTTTTCTTTTTATTCTTCTTTTCGTCCTCTTGTTCTACCTCCAAATCTTTATTAGGTA AGGGCGTTTATAAAGTAAATAAACACTTTTAGAGTAGTAGGAGCCGGATTATAACAAGGGTAGAGGTTTTTTTTATAAAT ATAGGAAGAAGAAGGTATTCGGAGGCGACTAAGTCGATCAACTAGAACCTATACGGTCTTGAATGAATTGTTAGGGAAGG GCAGGTAAATAATTGATAGTAGGAAAGAAGAAAAAGAAGAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAGAAATTTTGAAAGTAGTAG AAGAAGAAGGGTAGTAGAATTTAGGGGGTATAAATAGTTAGTAGAGTAGGTAGGGTGTTAGGTGGCTTTGGTTGTATGGG TAGGGAGGATATGTTGAGGTTAGTATATTAATAAAGAAGGTTGAATTGGTAAATGTAAAAAGAAAAAGATAAGAGTAAT ATGAATACTTTTGGTATAGTTATAAGATGTTGTAAATTATATTAGGGAAGATAAAAAGTAGTTAGCTTTTTACTTAGTGGA AACGTAGTTTGAGTGGACGCTGTAGGGTAGGCACGTCTGCTTTATATAAGAAAGGCGCGGCCGAGGTTGAAAAGGTGGAA GAGGGAAAGGCAGTGAAGGGTGGTACTTACCGAGTGCAGGGTAGGCAAGAACGACCGGGTAGGTAAGGAAGGCGCAAT CGACCTTTGGAAGCCGAAGTTTTGAAAAGGAAAATTGCGAGTAGGTAGCGCTTATTAAGTGTAGGGTAGGTAAGAACTAC AGGGTAGGTACGACGGGCCTGTATGAGAAAGGTAAGATCAAAGTTGAAAAGAAAAAAGTAGTAGGCGGGTAGTACCTAC CGAGTGCAGGGTAGGCAGGAATGACCGGGTAGGCAAGGAAGGCGCAACCAACTTGACGAGGAAGGCGTGGTCTTTGTGA ACTTGGAGCGAGATTCCTGAGAAGGTGCGACCCAGTTGGGTGGCTGGGTGGCCGTGAGTCGATTTTTAAAATTTCCCATAC TGGGGAATTTCGCGGGAGTTGAAAAGTCGCGGCTCAGACCGTCGGGCCGCACCGTCCCCAGACTCGAGGTCGAAGGGAAT ACAAGAAGGAGCGGCGGAGAGCAATGGGAAAGAGCGAGCGGTAAGACTGCTCGGTCGTCCCTGCCTCCGGCTCCCTCTTA CAGGTGTGGGCAAGGACGTACAGGGCCTGCTCCACCTGGAAGCCTTCTGCGGGAGGGCTGCTCTGGCCTGTGGCCTAGGC ACCTTCCCGCGGTAACCTGCAAAGGAAACCAAGTTCCAGTTCATGGAGCGTTGTTATCGCGTGGCTCCCTACGGTCTGCCG GGGAGTCAACGTTAACAGCGCGAGCCACCTCAGCACCGTTCCAGCAAGGGCTCTGCCTCTGCCGGGCGGCATCTGAGAAG ATCCTGCAGGCGCTAGGGAGTACCCCATAAGCGCCGAGGGGTGGGCTCTGTGGATGACTGGCCGCTGGCCAAACTTATCT ACAAGCCGCCGGGGGGTACCGGCCAGCTGGGGAAGCCTTCGGGCAGAACCTTCTGTGCTGGGCCTCCTCTTGGGGCGCAT AGGCGGTGTGCGAGAGGCGCTCTGCGCTCTCCCGTCCTCCTGCCGACCGCGCTCTGGGGAATTCAGGAGGGGAAAGCAGA TGCGTGTCTCGAGGCAAGTTCGGCCCTGCCGTACGAGCTTCGGACCGCCTACCTTCGTAACTTTGTGAACTCTTCCGCTCGC TTGCGAGCGGTTGGCCTTTCCAGGCGCACGATAGTTACCTGGTTGATTCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTA AGCCATGCATGTCTAAGTTTAAGCAATTAAACCGCGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATAGT ACCTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTA GATTAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTAACTGGTGATTCATAATAACTTCTCGAATCGCATGGCCTTGCGCTGGCGATGGT TCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGACGGCTGGGTCTTGGCCAGCCATGGTGACAACGGGTAACGGAGGGTTAGGG CTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGA CACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTT AACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTG AGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCTCGGCCCGTCGGTCCGCCTCACCGCGTGCACTGACTGGGTCGGGCCTTTT TTCCTGGAGAACCGCATGCCCTTCACTGGGTGTGTCGGGGAACCAGGACTTTTACCGTGAACAAATCAGATCGCTCAAAG AAGGCCTATGCTCGAATGTACTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGT AATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACT GCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGT CTTAACCATAAACTATGCCGATTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCCGTTCGGCACCTTACGATAAATCAAAATGT TTGGGCTCCTGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTG CGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACGATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGA TTTCGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAA CCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGG CAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACACAGCCAGCGAGTACTCCCTTGGC _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 72 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO CGGAAGGTCCGGGTAATCTTGTTAAACTGTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATCCC TAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATG GCTCAGTGAGGCTTCCGGACTGGCCCAGGGAGGTCGGCAACGACCACCCAGGGCCGGAAAGCTATCCAAACTCGGTCATT TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACAGAGTTGCAAAACTCCCACAA ACCATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGAAAGGCCTTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTC TCCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACTAAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAAT AAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATT GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCA TTTCAACCATCAAGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGTCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCA CACCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGTTGACCTC GGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAA CGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTTCGGCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGAAGCTTTTGGTGA GGCACCTTCTGAGTCCCCTGGAACGGGGCGCCATAGAGGGTGAGAGCCCCGTATAGTCGGATGCCGATCCAATGTAAAGC TCCTTCGACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCAAAATGGGAGGTAAATTTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAG ACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGGGTTAAATAGCACGTGAAATTGTTGA AAGGGAAGCGTTTGTGACCAGACTTGCGCCGTTCCGATCATCCGGTGTTCTCACCGGTGCACTCGGGACGGCTCAGGCCA GCATCGGTTTTGGCGGGGGGATAAAGGTCCGGGGAACGTAGCTCCTCCGGGAGTGTTATAGCCCCGGGCGTAATGCCCTC GCCGGGACCGAGGTTCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAACGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGA GTCAAGGTTTTGCGCGAGTGTTTGGGTGTAAAACCCGCACGCGTAATGAAAGTGAACGTAGGTGAGAGCTTCGGCGCATC ATCGACCGATCCTGATGTATTCGGATGGATTTGAGTAAGAGCGTTAAGCCTTGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTG GATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAATCTGAGCATG GGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTACCGCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCAGTGTTGTTCTTCAGTTT TATGAGGTAAAGCGAATGATTAGGGACTCGGGGGCGCTTTTTAGCCTTCATCCATTCTCAAACTTTAAATATGTAAGAAGC CCTTGTTACTTAATTGAACGTGGGCATTCGAATGTACCAACACTAGTGGGCCATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGATGCGG GATGAACCGAACGCGGGGTTAAGGTGCCGGAGTGGACGCTCATCAGACACCACAAAAGGCGTTAGTACATCTTGACAGC AGGACGGTGGCCATGGAAGTCGGAATCCGCTAAGGACTGTGTAACAACTCACCTGCCGAATGTACTAGCCCTGAAAATGG ATGGCGCTCAAGCGTCCCACCCATACCCCGCCCTCAGGGTAGAAACGATGCCCTGAGGAGTAGGCGGCCGTGGAGGTCAG TGACGAAGCCTAGGGCGTGAGCCCGGGTCGAACGGCCTCTAGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATACTTCAATGAGA ACTTGAAGGACCGAAGTGGGGAAAGGTTCCATGTGAACAGCGGTTGGACATGGGTTAGTCGATCCTAAGCCATAGGGAA GTTCCGTTTCAAAGGGGCACTTGTGCCCCGTGTGGCGAAAGGGAAGCCGGTTAACATTCCGGCACCTGGATGTGGGTTTTG CGCGGCAACGCAACTGAACGCGGAGACGACGGCGGGGGCCCCGGGCAGAGTTCTCTTTTCTTCTTAACGGTCTATCACCC TGAAAACAGTTTGTCTGGAGATAGGGTTTAATGGCCGGAAGAGCCCGACACTTCTGTCGGGTCCGGTGCGCTCTCGACGTC CCTTGAAAATCCGCGGGAGGGAATAATTCTCACGCCAGGTCGTACTCATAACCGCAGCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCT CTGGTTGATAGAACAATGTAGATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAACTTCGGGAAAAGGATTGGCTCTAAGGGTT GGGTACGTCGGGCTTTGGGCAGACGCCCTGGGAGCAGATCGCCACTAGCCGGGCAACCGGCCGGCGGCTTTCAGCATCCG GGTGCAGAAGCCCTTAGCAGACTTCGGTCGTCCGGCGTACGTTTAACAACCAACTTAGAACTGGTACGGACAGGGGGAAT CTGACTGTCTAATTAAAACATAGCATTGCGATGGCCAGAAAGTGGTGTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAA TGTCAAAGTGAAGAAATTCAACCAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCG TCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCCCTATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAG GGAACGGGCTTGGCAGAATCAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTTTGACATTGTGAAAAGACATAGG AGGTGTAGAATAGGTGGGAGCTTCGGCGCCGGTGAAATACCACTACTCCTATTGTTTTTTTACTTATTCAATTAAGCGGGG CTGGATTTTCGTCCAACTTCTGGTTTTAAGGTCCTTCGCGGGCCGACCCGGGTTGAAGACATTGTCAGGTGGGGAGTTTGG CTGGGGCGGCACATCTGTTAAACCATAACGCAGGTGTCCTAAGGGGGGCTCATGGAGAACAGAAATCTCCAGTAGAACAA AAGGGTAAAAGTCCCCTTGATTTTGATTTTCAGTGTGAATACAAACCATGAAAGTGTGGCCTATCGATCCTTTAGTCCCTC GAAATTTGAGGCTAGAGGTGCCAGAAAAGTTACCACAGGGATAACTGGCTTGTGGCGGCCAAGCGTTCATAGCGACGTCG CTTTTTGATCCTTCGATGTCGGCTCTTCCTATCATACCGAAGCAGAATTCGGTAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAATAGG GAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGACCTCATCGCAATGGTAATTGAGCTT AGTACGAGAGGAACCGCTCATTCAGATAATTGGTTTTTGCGGTTGTCCGACCGGGCAGTGCCGCGACGCTACCATCTGCTG GATAATGGCTGAACGCCTCTAAGTCAGAATCCATGCCAGAACGCGATGATACCTCCAGCACGTTGTAGACGTATAAGAAT _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 73 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO AGGCTCCGGCCTCGTATCTTAGCAGGCGATTCCTCCGTTGGCCTTGAAGTGGCCAGCGGTAATTCGCGTATTGTAATTTTA ACACGCGCTGGATCAAATCCTTTGCAGACGACTTAGATGTGCGAAAGGGTCCTGTAAGCAGTAGAGTAGCCTTGTTGTTAC GATCTGCTGAGGGTAAGCCCTCCTTCGCCTAGATTTCCCAGTGGAAGGGTCCGCCTAACAAGCGGGCATTTACTGGGGGGT CCCCCCGAGACTTGGTTGCCAGAGCCCGAGAGGGCGAAAGCGCCTTGCCGGAGGGAAAGTGCAGGGTAAGCAGGGACAG GAAGGGGACTTGGTCAAGTTCAGCATCTCCCGGGTTTGGACGACGTTGCCCTGGGGGCGCGGGCGGGCCGGGCATAAGGG GTCTGCCGTACCAGCAGCCAGCCTGCAGAAGGCTCGGTGGCTATGCATGGCACATGCCCGGGGAAGCGTCGACCGGCGCA GTGTACGCGGGCACGGCCGGGCCGGGCCTTTGCAAGTCTTGGTGGCTGCGGTAGGTAGGGTAGGCAAGAGCGACCGACCG AGCGGCGGCGGGGCAGGAGCGACCGGGTAGGCGAGCAATTTTTGGGCAAGCTTGCAGTTCTGGACAAGTGAATGCATTCG CGACCGGGTTGGGTGCGGCGCCGGGTAGGCAAGCGCGTTCGAATCGTACAAGGTGGCGTAGAGAAGAGAGGGTAGGCAA GTGCGTCCGGGCGGGTTAGGTGTGTAGGGTAGGCAGGCGCGTCTGGGCATGGAATTTTTGTGTAGATGGTGGCTGCATTG GGAAGGCAAGGGCGAGGGCCTGTGCAGGGTAGGTAAGAAGGACCGAGAGGCTTGGGGGGGCCAAGGGGTTGCTTTCCAG CTCCTACTGGGAGGGGCTTGTTGAAGGAAAGGGTAGGGTGATAGTAGGAGGGGGTAGGTAAGTAAAGAAGCTATGTGGT TGAGTAAAGGTATTTGTAGCCTTTTTATTAGAAGATGTAGTAGGGTAGGTAGGAAAAGGTTGTACGGGATTGTGTTTTTAC GTGAGGTAAAGGTATAAAGGGGGAGGCTATCTTTTTGATTTCTGGGTAGGCGAGGCGGTAGGTAGGCTACTTGGGCTGGG AATGGTTTAGTCTTTAGGGGGGGAGCGAAAATTTCTTTCTTCTTTTTCTTTTCCTTTTTTATTTATTTATTTTTTTTCTTTCTTC TTTTTCTCCTCCCTCTTTCTTCTTCCTACTTTTATCCTCTTTATTACTCTTCCTCCTCCCTTTCCTTTCCTCTCCGTCTTCCTTCG TTTTGGTCCTTTTTTTCTTTTCTCTTCCTTTTTCTTTTTTCTTTTTAGCTTTTAACCTCTTTTTAGGGCTTTCCTCTCTTAATATT TCTTTCCTTATACCTCCAAACCCCCCTCCGTTCCCTTCTTTTGTATTATATCTATACAAGGATAAAAAAGTAATATGATTAA TATGTAAATAAAATAAAGAAGGTTCTTATTCTTCTTTTCTTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

>K.m. 1D5 GGCATGCCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGATGTAATTTGAA GAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG ATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAA AGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAA AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAGTT TTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGGA CTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCA

>EU439450_Kluyveromyces_marxianus TGCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCCGAGTTGTAATTTGAAG AAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAT CCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAG CTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAA GTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAGTTTT AGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGGACT GAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACC

>T.d. 1AN1 GGGTATGCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAATCTGGTACCTTCGGTGTGGAGTGGTAATTTGTAGA AGGTAACTTTGGGGCTGGTCCTTGAAAATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAT CCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAG CTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAA GTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGGGGGAATT TCGCAGTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTGTTATATC CTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTC TTGAAACACGGACCA

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 74 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO >K.m. 1Y11 GGGTATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGAAGTAATTTGAAG AAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAT CCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAG CTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAA GTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAGTTTT AGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGGACT GAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCCC

>K.m. 4D2 CGGGGCTGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGATGTAATTTGAA GAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG ATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAA AGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAA AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAGTT TTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGGA CTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCAA

>K.m. 4D3 GGGCGATGCCCTTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGAGTAATTTGA AGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG GATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAG TTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGG ACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCA

>K.m. 4D4 CGGGGGTTTCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGAAGTAATTTGA AGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG GATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAG TTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGG ACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCAA

>K.m. 4D5 CGGGTGGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGATGTAATTTGAA GAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGCCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG ATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAA AGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAA AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAGTT TTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGGA CTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCA

>K.m. 4Y2 GGGGGATGCCTTAGTAACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGAAGTAATTTG AAGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA GGATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 75 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCA GTTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGG GACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAATCACGGACCA

>K.m. mosca7 CCGGTATGCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCCGAGTTGTAATTTGA AGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG GATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAG TTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGG ACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACC

>K.m. mosca5 CCCACGGGATGCCTAGTACGGCGATGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTAGAGAGGTAATTTGA AGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGACAATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG GATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAG TTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGG ACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAACCAACGGACC

>K.m 1Y1 AGGGAATGTCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAATCTGGCGTCTTCGACGTCCGAGTTGTAATTTGAA GAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG ATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAA AGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAA AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAGTT TTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGGA CTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAA

>K.m. 1Y9 AGGGAATGCCTTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAGCTCAAATTTGAAAATCTGGCGTCTTCGACGTAAGAGAAGTAATTT GAAGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTAGAAATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA GGATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCA GTTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGG GACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAACCACGGACCA

>T.d. 1AN5 GGGGGGATTGCCTTATACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT GTAGAAGGTAACTTTGGGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCG AGGATCCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC TAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGGG GGAATCTCGCAGCTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTG

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 76 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO TTATATCCTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCC GCCCGTCTTGA

>K.m. 1AN6 ATTTGGGGCTTTAGTTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCCGAGTTGTAATTTG AAGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA GGATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCA GTTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGG GACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAAACACGGACCA

>T.d. 1AN9 TCCCAGGGAAGCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGT AGAAGGTAACTTTGGGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG GATCCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGGGGG AATCTCGCAGCTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTGTTA TATCCTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC CGTCTTG

>T.d.1AN2 GGGGGTTTCCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCACATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCAGAGAGGTGATTTGT AGAAGGTAACTTTGGGGCTGGTCTTTGAAAATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG GATCCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGGGGG AATCTCGCAGCTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTGTTA TATCCTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC CGTCTTGAAAACACGGACCA

>EU879961_Torulaspora_delbrueckii CGGGATTGCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAAT TTGTAGAAGGTAACTTTGGGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGC GAGGATCCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCAT CTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGT GAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGG GGGAATCTCGCAGCTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGT GTTATATCCTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGC CGCCCGTCTTGAACCACCGGACCAAA

>T.d.1D2 CGGGAAAGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGT AGAAGGTAACTTTGGGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG GATCCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGGGGG AATCTCGCAGCTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTGTTA _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 77 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO TATCCTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC CGTCTTGAACCACCGGACCKAA

>S.c. 1D1 GGGTATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAG AGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGA GTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAA GCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAA AGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAAT CTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAG CCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGT CTTGA

>S.c. 4Y3 CGGGTCAAGCCTTATACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGATGTAATTTG GAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA GGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGG AATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTA TAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC CGTCTTGAAACCACGGACC

>S.c. mosca3 ACCGGGATGCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTG GAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA GGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGG AATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTA TAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC CGTCTTAAAACACGACCA

>EU556339_Saccharomyces_cerevisiae TGCGTGGATGCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT GGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCG AGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC TAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGG GAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATT ATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGC CCGTCTTGAACAACGGACCAAA

>S.c. mosca1 AGGGGGGATGCCTTCTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAATCTGGTACCTTCGGTGCAGAGAAGTAATTTG GAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTTTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA GGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGG _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 78 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO AATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTA TAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC CGTCTTCA

>S.c. mosca6 GGGTTATGCCCTTATACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGG AGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG GAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGA ATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTAT AGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCC GTCTTGAAMCMMSGGRACCATGAG

>S.c.3Y4 CGGGGATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCSAgTTGTAATTTGG AGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGtCTaTGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG AGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAA AGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAA AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAA TCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATA GCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCG TCTTGAA

>S.c. 3Y8 CgGGGGATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT GGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATgTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA GGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGG AATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTA TAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC CGTCTTGAACAaaCGGACCAA

>S.c. D2 CCGGGGTTGCCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATT TGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGC GAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCAT CTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGT GAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGG GGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTAT TATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCG CCCGTCTTGAACCMMSSRRMAMCA

>S.c. D3 GGGGCATGGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATT TGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGC GAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCAT CTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGT _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 79 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO GAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGG GGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTAT TATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCG CCCGTCTTGAAACCC

>S.c. D4 AGGGAATCCCTTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT GGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCG AGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC TAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGG GAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATT ATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGC CCGTCTTGAAACCGCGAACCA

>S.c. D5 CGGGGAATGCCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT GGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCG AGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC TAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGG GAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATT ATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGC CCGTCTTG

>S.c. D6 GGGGAAAAGCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT GGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCG AGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC TAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGG GAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATT ATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGC CCGTCTTGAACACACGGGACCA

>S.c.3Y2 CGGTATgCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCTAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAG AGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTcTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAG TGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAG CTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAA GTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATC TCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGC CTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTC TTGAAaaacccGGaACCAAA

>Z.b. 3Y1 CCCACGGATGCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAATCTGGTACCTTCGGTGCCGAGTTGTAATTTGTA GAAGGCGACTCTGGGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATGGAGGGTGAGAATCCCGTATGGCGAGG ATCCCAGTTCTTTGTAGAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAA _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 80 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO AGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAA AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCCTCGCCTCTCGTGGGTGGGGGA ATCTCGCAGTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCCCTGGGAATGTAGCTCTACCACTTCGTGGCGGA CGAACTTATAGTCCAGGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGAATGCGACTTTTAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTA TATGCCGCCCGTCTTGACCAAACGGACA

>AJ966343_Zygosaccharomyces_bailii TACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGTAGAAGGCGACTCTG GGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATGGAGGGTGAGAATCCCGTATGGCGAGGATCCCAGTTCTTTG TAGAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGC GAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATT GTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCCTCGCCTCTCGTGGGTGGGGGAATCTCGCAGTTCACT GGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCCCTGGGAATGTAGCTCTACCACTTCGTGGCGGACGAACTTATAGTCC AGGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGAATGCGACTTTTAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCT TG

>S.c. 3Y3 CAAAGGGAATGCTTATACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATT TGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGC GAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCAT CTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGT GAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGG GGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTAT TATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCG CCCGTCTTGAACCACGGACCAAAA

>Sc. 3Y5 ACAGGGGGATGCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT GGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCG AGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC TAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGG GAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATT ATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGC CCGTCTTG

>P.k. 1Y10 AGGGGCTTGCTCTGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGAAAATTGCAG GTTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATG TCGACACCTGTGAGGCCCTTTTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCT AAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGC ACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGG GTTTTTCCTGGGCCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGT AGATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGT CTTGAAACACGGACCCC

>AY305665_Pichia_kluyveri CAAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGTAAATTGCAGGTTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCCAG TCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAKCGTGCATGTCGACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCG _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 81 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO AGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAA GTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCCGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGG GCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGTGTGGGGTTTTCCCTCCGGGCCAGACCCCCGGTTTCCC GTTGCAGGACCTAAGGACAACCTAGTGTACCAGTAGTGCTCCCATCGAGTTCGCCCGCCATTATCGTACCCTTTTATGAAT GTCTGGTTGTGTCCGGGGTATTTGTCT

>P.k. 4AN5 AGGGCATGCCTCGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGAAAATTGCAGG TTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATGT CGACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTA AATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCA CGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACAKGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGG TTTTTCCTGGKYCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGTA GATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGTC TTGAACCACGGAC

>P.k. 4D6 GAATTGCCCTCAGTAGCGGGCGAGTGAAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTAGAAAATTGCA GGTTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCAT GTCGACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGC TAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAG CACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTG GGTTTTTCCTGGGCCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTT GTAGATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCC GTCTTGAAACACGGAC

>P.k. 4D7 CAGGATGCCTTCATAGCGGCGAGTGAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGAAAATTGCAGG TTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATGT CGACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTA AATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCA CGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGGT TTTTCCTGGGCCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGTA GATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGTC TTGAACACGGACCA

>P.k. 4Y6 AGGTCATGCCTCGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGAAAATTGCAGGT TGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATGTC GACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAA ATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCAC GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGGTT TTTCCTGGGCCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGTAG ATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGTCT TGAACCACGGACCA

>P.g.1Y12 CGCCTTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAGCGGCCAAGCTCAATTTGAATCTGGCGCCTTCGGTGTCGATAGTAATTTGAAGAT TGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGCC _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 82 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO CAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCT AAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGT ACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTTTGAGATCAGACTCGATATTTTGTGAGCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTGACCCGC ACTTTATCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGTAGGATAATGGCGTAGGAATGTGACTTTACTTCGGTGAAGTGTTATAGCCT GCGTTGATGCTGCCTGCCTAGACCGAGGACTGCGATTTTATCAAGGATGCTGGCATAATGATCCCAAACCGCCCGYCTTGA AACACGGACCCA

>EU177574_Pichia_guilliermondii GGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGCCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATTTG AAGATTGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAG ATGCCCAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTTTGAGATCAGACTCGATATTTTGTGAGCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTGA CCCGCAGCTTATCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGTAGGATAATGGCGTAGGAATGTGACTTTACTTCGGTGAAGTGTTAT AGCCTGCGTTGATGCTGCCTGCCTAGACCGAGGACTGCGATTTTATCAAGGATGCTGGCATAATGATCCCAAACCGCCCGT CTTGAAACACGGACC

>P.g.1Y15 AGGTGATGCTTATAGCGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGCCTTCGGTGTAGAGAGTAATTTGAA GATTGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGAT GCCCAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAA GCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAA AGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTTTGAGATCAGACTCGATATTTTGTGAGCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTGACCC GCAGCTTATCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGTAGGATAATGGCGTAGGAATGTGACTTTACTTCGGTGAAGTGTTATAGC CTGCGTTGATGCTGCCTGCCTAGACCGAGGACTGCGATTTTATCAAGGATGCTGGCATAATGATCCCAAACCGCCCGTCTT GAAACACGGACCAM

>P.g. 4AN2 AATGGGCCTTTTAGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAAAAAGCTCAATTTGAAATCTGGCGCCTTCGGTGTAGAGAGGATTTGA AGATTGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGACAATGTTTCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAG ATGCCCAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTTTGAGATCAGACTCGATATTTTGTGAGCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTGA CCCGCAGCTTATCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGTAGGATAATGGCGTAGGAATGTGACTTTACTTCGGTGAAGTGTTAT AGCCTGCGTTGATGCTGCCTGCCTAGACCGAGGACTGCGATTTTATCAAGGATGCTGGCATAATGATCCCAAACCGCCCGT CTTGAAACACGGACCAC

>P.g. 4AN7 CGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGCCTTCGGTGTCGAGATGTAATTT GAAGATTGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGA GATGCCCAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTTTGAGATCAGACTCGATATTTTGTGAGCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTG ACCCGCAGCTTATCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGTAGGATAATGGCGTAGGAATGTGACTTTACTTCGGTGAAGTGTTA TAGCCTGCGTTGATGCTGCCTGCCTAGACCGAGGACTGCGATTTTATCAAGGATGCTGGCATAATGATCCCAAACCGCCCG TCTTGAAACACGGACCA

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 83 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO >P.m. 1AN3 CGAGGATGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAATAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATTT GAAGAAGGTATCTTTGGTTTTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGA GATGCCCAATTCCATGTAAAGTTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGGTCAGACTTGGTTTTACCAGGCCAGCATCAGTTTGGATGGCAG GATAATAGCTTAGGAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTATAGCCTGGGTTGATACTGCCTGTCTAGACTGAGGACTGC GTCTTTGACTAGGATGCTGGCATAATGACCTTAAGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACC

>P.m.1Y14 TTCAAGGGATGCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAATAGCTCAATTTGAAATCTGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATTTG AAGAAGGTATCTTTGGTTTTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAG ATGCCCAATTCCATGTAAAGTTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGGTCAGACTTGGTTTTACCAGGCCAGCATCAGTTTGGATGGCAGG ATAATAGCTTAGGAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTATAGCCTGGGTTGATACTGCCTGTCTAGACTGAGGACTGCG TCTTTGACTAGGATGCTGGCATAATGACCTTAAGCCGCCCGTCTTAATCTCTTTAGGGAACGTWTTYGGCRACWYKCKCR MYWWSMSTMTGYSRCSRYYCCKRYSSYYKYRSSWYSYYAG

>EU809452 Pichia mexicana ATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAATAGCTCAAATTTGA AATCTGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTATCTTTGGTTTTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGG ACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGCCCAATTCCATGTAAAGTTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGG AATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAG GAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGGTCAGACTTG GTTTTACCAGGCCAGCATCAGTTTGGATGGCAGGATAATAGCTTAGGAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTATAGCCT GGGTTGATACTGCCTGTCTAGACTGAGGACTGCGTCTTTGACTAGGATGCTGGCATAATGACCTTAAGCCGCCCGTCTTGA AACACGG

>C.l.4AN1 AGGTCATGCCCAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAGCTCAATTTGAAATCCTGCGGGAATTGTAATTTGAAGGTTTCGTGGTCT GAGTCGGCCGCGCCCAAGTCCATTGGAACATGGCGCCTGGGAGGGTGAGAGCCCCGTCCGGCGCACGCCGACTCTTTGCA CCGCGGCTCCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCG AGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATTG TTGAAAGGGAAGGGCTTGCAAGCAGACACGGTTTTACCGGGCCAGCGTCAAATAGACGGGGGGAACAAGGGCTAAAGAA TGTGGCGCGCACCTTCGGGTGCGCGTGTTATAGCTCTCACTAACACCTCCATGTTTGTTTGAGGCCTGCGATTCTAGGACG CTGGCGTAATGGTTGCAAGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCA

>AY894825_Clavispora_lusitaniae GGATTGCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCTGCGGGAATTGTAATTTGAAGGTTTCGT GGTCTGAGTCGGCCGCGCCCAAGTCCATTGGAACATGGCGCCTGGGAGGGTGAGAGCCCCGTCCGGCGCACGCCGACTCT TTGCACCGCGGCTCCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATT GGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGA AATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGCAAGCAGACACGGTTTTACCGGGCCAGCGTCAAATAAACGGGGGGGATAAGGGGGA AAGAATGTGGCGCGTGCCTTCGGGTACGCGTGTTATAGCTTTCTCTAATACCCCCATGTTTGTTTGAGGCCTGCGATTCTAG GACGCTGGCGTAATGGTTGCAAGCCGCCCGTCTTGA

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 84 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO >C.l.4AN3 CGGTCATGCCCAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCCTGCGGGAATTGTAATTTGAAGGTTTCGTGGT CTGAGTCGGCCGCGCCCAAGTCCATTGGAACATGGCGCCTGGGAGGGTGAGAGCCCCGTCCGGCGCACGCCGACTCTTTG CACCGCGGCTCCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGC GAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATT GTTGAAAGGGAAGGGCTTGCAAGCAGACACGGTTTTACCGGGCCAGCGTCGAAAAGGGGGGAGGAACAAGAACTCGAGA ATGTGGCGCGCACCTTCGGGCGCGCGTGTTATAGCTCGTGTTGACGCCTCCATCCCTTTTCGAGGCCTGCGATTCTAGGAC GCTGGCGTAATGGTTGCAAGCCGCCCGTCTTGAAACCACGGACCA

>C.l. 4Y4 AGGGTATGCCCAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCTGCGGGAATTGTAATTTGAAGGTATCGTG GTCTGAGTCGGCCGCGCCCAAGTCCATTGGAACATGGCGCCTGGGAGGGTGAGAGCCCCGTCCGGCGCACGCCGACTCTT TGCACCGCGGCTCCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTG GCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAA ATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGCAAGCAGACACGGTTTTACCGGGCCAGCGTCGAAAAGGGGGGAGGAACAAGAACTCG AGAATGTGGYGYGYACCTTCGGGTGCGCGTGTTATAGCTCGTGTTGACGCCTCCATCCCTTTTCGAGGCCTGCGATTCTAG GACGCTGGCGTAATGGTTGCAAGCCGCCCGTCTTGAAAACACGGAC

>P.k. 1Y16 GATTATGCTCGTCAGTAAGCGGCGAGTGAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGAAGAGGGTGCA GGTTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATG TCGACACCTGTGAGGCCCTTCTCACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCT AAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGC ACGTGAAATTGTTTAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGG TTTTTTCTGGTTCAGCATCCGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGGGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGTA CATGCTGCGKATGGGGACCGAAGGCTGTGGCCGACTCCTTTCCTCTCGGGAGCTGGCCCCACGGCGCTTTATCGCCCCCCC TGAAACAAAYAACACACA

>C.p. 1Y7 TGTCTGTCCTTTATAAACGGCGATTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACTTTCAGTGTAGAGAAGTAATTT GAAGAAGGTATCTTTGGGTCTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGAACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGA GATGTCCCAGACCTATGTAAAGTTCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC TAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGTATGTTACTCTCTCGGGGGTGGCCT CTACAGTTTACCGGGCCAGCATCAGTTTGAGCGGTAGGATAAGTGCAAAGAAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTAT AGTCTTTGTCGATACTGCCAGCTTAGACTGAGGACTGCGGCTTCGGCCTAGGATGTTGGCATAATGATCTTAAGTCGCCCG TCTTGAAACACGGACCAC

>EU605804_Candida_parapsilosis AGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACTTTCAGTGTCCGAGTTGTAAT TTGAAGAAGGTATCTTTGGGTCTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGAACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGAT GAGATGTCCCAGACCTATGTAAAGTTCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCA TCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAG TGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGTATGTTACTCTCTCGGGGGTGGC CTCTACAGTTTACCGGGCCAGCATCAGTTTGAGCGGTAGGATAAGTGCAAAGAAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTA TAGTCTTTGTCGATACTGCCAGCTTAGACTGAGGACTGCGGCTTCGGCCTAGGATGTTGGCATAATGATCTTAAGTCGCCC GTCTTGAAACACGGACCA

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 85 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

Región ITS1-5.8S-ITS2 de ADN ribosomal >FJ360521_Neurospora_crassa TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATTTTTCTTACTTTCCTTCTACCTTTTTACTTTTGTAATGTCTT GCCCCCTTAGTAAGCTTCTTCCTTTCTTTTTCTTTTTATTCTTCTTTTCGTCCTCTTGTTCTACCTCCAAATCTTTATTAGGTA AGGGCGTTTATAAAGTAAATAAACACTTTTAGAGTAGTAGGAGCCGGATTATAACAAGGGTAGAGGTTTTTTTTATAAAT ATAGGAAGAAGAAGGTATTCGGAGGCGACTAAGTCGATCAACTAGAACCTATACGGTCTTGAATGAATTGTTAGGGAAGG GCAGGTAAATAATTGATAGTAGGAAAGAAGAAAAAGAAGAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAGAAATTTTGAAAGTAGTAG AAGAAGAAGGGTAGTAGAATTTAGGGGGTATAAATAGTTAGTAGAGTAGGTAGGGTGTTAGGTGGCTTTGGTTGTATGGG TAGGGAGGATATGTTGAGGTTAGTATATTAATAAAGAAGGTTGAATTGGTAAATGTAAAAAGAAAAAGATAAGAGTAAT ATGAATACTTTTGGTATAGTTATAAGATGTTGTAAATTATATTAGGGAAGATAAAAAGTAGTTAGCTTTTTACTTAGTGGA AACGTAGTTTGAGTGGACGCTGTAGGGTAGGCACGTCTGCTTTATATAAGAAAGGCGCGGCCGAGGTTGAAAAGGTGGAA GAGGGAAAGGCAGTGAAGGGTGGTACTTACCGAGTGCAGGGTAGGCAAGAACGACCGGGTAGGTAAGGAAGGCGCAAT CGACCTTTGGAAGCCGAAGTTTTGAAAAGGAAAATTGCGAGTAGGTAGCGCTTATTAAGTGTAGGGTAGGTAAGAACTAC AGGGTAGGTACGACGGGCCTGTATGAGAAAGGTAAGATCAAAGTTGAAAAGAAAAAAGTAGTAGGCGGGTAGTACCTAC CGAGTGCAGGGTAGGCAGGAATGACCGGGTAGGCAAGGAAGGCGCAACCAACTTGACGAGGAAGGCGTGGTCTTTGTGA ACTTGGAGCGAGATTCCTGAGAAGGTGCGACCCAGTTGGGTGGCTGGGTGGCCGTGAGTCGATTTTTAAAATTTCCCATAC TGGGGAATTTCGCGGGAGTTGAAAAGTCGCGGCTCAGACCGTCGGGCCGCACCGTCCCCAGACTCGAGGTCGAAGGGAAT ACAAGAAGGAGCGGCGGAGAGCAATGGGAAAGAGCGAGCGGTAAGACTGCTCGGTCGTCCCTGCCTCCGGCTCCCTCTTA CAGGTGTGGGCAAGGACGTACAGGGCCTGCTCCACCTGGAAGCCTTCTGCGGGAGGGCTGCTCTGGCCTGTGGCCTAGGC ACCTTCCCGCGGTAACCTGCAAAGGAAACCAAGTTCCAGTTCATGGAGCGTTGTTATCGCGTGGCTCCCTACGGTCTGCCG GGGAGTCAACGTTAACAGCGCGAGCCACCTCAGCACCGTTCCAGCAAGGGCTCTGCCTCTGCCGGGCGGCATCTGAGAAG ATCCTGCAGGCGCTAGGGAGTACCCCATAAGCGCCGAGGGGTGGGCTCTGTGGATGACTGGCCGCTGGCCAAACTTATCT ACAAGCCGCCGGGGGGTACCGGCCAGCTGGGGAAGCCTTCGGGCAGAACCTTCTGTGCTGGGCCTCCTCTTGGGGCGCAT AGGCGGTGTGCGAGAGGCGCTCTGCGCTCTCCCGTCCTCCTGCCGACCGCGCTCTGGGGAATTCAGGAGGGGAAAGCAGA TGCGTGTCTCGAGGCAAGTTCGGCCCTGCCGTACGAGCTTCGGACCGCCTACCTTCGTAACTTTGTGAACTCTTCCGCTCGC TTGCGAGCGGTTGGCCTTTCCAGGCGCACGATAGTTACCTGGTTGATTCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTA AGCCATGCATGTCTAAGTTTAAGCAATTAAACCGCGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATAGT ACCTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTA GATTAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTAACTGGTGATTCATAATAACTTCTCGAATCGCATGGCCTTGCGCTGGCGATGGT TCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGACGGCTGGGTCTTGGCCAGCCATGGTGACAACGGGTAACGGAGGGTTAGGG CTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGA CACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTT AACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTG AGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCTCGGCCCGTCGGTCCGCCTCACCGCGTGCACTGACTGGGTCGGGCCTTTT TTCCTGGAGAACCGCATGCCCTTCACTGGGTGTGTCGGGGAACCAGGACTTTTACCGTGAACAAATCAGATCGCTCAAAG AAGGCCTATGCTCGAATGTACTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGT AATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACT GCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGT CTTAACCATAAACTATGCCGATTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCCGTTCGGCACCTTACGATAAATCAAAATGT TTGGGCTCCTGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTG CGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACGATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGA TTTCGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAA CCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGG CAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACACAGCCAGCGAGTACTCCCTTGGC CGGAAGGTCCGGGTAATCTTGTTAAACTGTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATCCC TAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATG GCTCAGTGAGGCTTCCGGACTGGCCCAGGGAGGTCGGCAACGACCACCCAGGGCCGGAAAGCTATCCAAACTCGGTCATT TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACAGAGTTGCAAAACTCCCACAA _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 86 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO ACCATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGAAAGGCCTTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTC TCCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACTAAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAAT AAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATT GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCA TTTCAACCATCAAGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGTCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCA CACCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGTTGACCTC GGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAA CGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTTCGGCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGAAGCTTTTGGTGA GGCACCTTCTGAGTCCCCTGGAACGGGGCGCCATAGAGGGTGAGAGCCCCGTATAGTCGGATGCCGATCCAATGTAAAGC TCCTTCGACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCAAAATGGGAGGTAAATTTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAG ACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGGGTTAAATAGCACGTGAAATTGTTGA AAGGGAAGCGTTTGTGACCAGACTTGCGCCGTTCCGATCATCCGGTGTTCTCACCGGTGCACTCGGGACGGCTCAGGCCA GCATCGGTTTTGGCGGGGGGATAAAGGTCCGGGGAACGTAGCTCCTCCGGGAGTGTTATAGCCCCGGGCGTAATGCCCTC GCCGGGACCGAGGTTCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAACGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGA GTCAAGGTTTTGCGCGAGTGTTTGGGTGTAAAACCCGCACGCGTAATGAAAGTGAACGTAGGTGAGAGCTTCGGCGCATC ATCGACCGATCCTGATGTATTCGGATGGATTTGAGTAAGAGCGTTAAGCCTTGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTG GATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAATCTGAGCATG GGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTACCGCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCAGTGTTGTTCTTCAGTTT TATGAGGTAAAGCGAATGATTAGGGACTCGGGGGCGCTTTTTAGCCTTCATCCATTCTCAAACTTTAAATATGTAAGAAGC CCTTGTTACTTAATTGAACGTGGGCATTCGAATGTACCAACACTAGTGGGCCATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGATGCGG GATGAACCGAACGCGGGGTTAAGGTGCCGGAGTGGACGCTCATCAGACACCACAAAAGGCGTTAGTACATCTTGACAGC AGGACGGTGGCCATGGAAGTCGGAATCCGCTAAGGACTGTGTAACAACTCACCTGCCGAATGTACTAGCCCTGAAAATGG ATGGCGCTCAAGCGTCCCACCCATACCCCGCCCTCAGGGTAGAAACGATGCCCTGAGGAGTAGGCGGCCGTGGAGGTCAG TGACGAAGCCTAGGGCGTGAGCCCGGGTCGAACGGCCTCTAGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATACTTCAATGAGA ACTTGAAGGACCGAAGTGGGGAAAGGTTCCATGTGAACAGCGGTTGGACATGGGTTAGTCGATCCTAAGCCATAGGGAA GTTCCGTTTCAAAGGGGCACTTGTGCCCCGTGTGGCGAAAGGGAAGCCGGTTAACATTCCGGCACCTGGATGTGGGTTTTG CGCGGCAACGCAACTGAACGCGGAGACGACGGCGGGGGCCCCGGGCAGAGTTCTCTTTTCTTCTTAACGGTCTATCACCC TGAAAACAGTTTGTCTGGAGATAGGGTTTAATGGCCGGAAGAGCCCGACACTTCTGTCGGGTCCGGTGCGCTCTCGACGTC CCTTGAAAATCCGCGGGAGGGAATAATTCTCACGCCAGGTCGTACTCATAACCGCAGCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCT CTGGTTGATAGAACAATGTAGATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAACTTCGGGAAAAGGATTGGCTCTAAGGGTT GGGTACGTCGGGCTTTGGGCAGACGCCCTGGGAGCAGATCGCCACTAGCCGGGCAACCGGCCGGCGGCTTTCAGCATCCG GGTGCAGAAGCCCTTAGCAGACTTCGGTCGTCCGGCGTACGTTTAACAACCAACTTAGAACTGGTACGGACAGGGGGAAT CTGACTGTCTAATTAAAACATAGCATTGCGATGGCCAGAAAGTGGTGTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAA TGTCAAAGTGAAGAAATTCAACCAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCG TCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCCCTATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAG GGAACGGGCTTGGCAGAATCAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTTTGACATTGTGAAAAGACATAGG AGGTGTAGAATAGGTGGGAGCTTCGGCGCCGGTGAAATACCACTACTCCTATTGTTTTTTTACTTATTCAATTAAGCGGGG CTGGATTTTCGTCCAACTTCTGGTTTTAAGGTCCTTCGCGGGCCGACCCGGGTTGAAGACATTGTCAGGTGGGGAGTTTGG CTGGGGCGGCACATCTGTTAAACCATAACGCAGGTGTCCTAAGGGGGGCTCATGGAGAACAGAAATCTCCAGTAGAACAA AAGGGTAAAAGTCCCCTTGATTTTGATTTTCAGTGTGAATACAAACCATGAAAGTGTGGCCTATCGATCCTTTAGTCCCTC GAAATTTGAGGCTAGAGGTGCCAGAAAAGTTACCACAGGGATAACTGGCTTGTGGCGGCCAAGCGTTCATAGCGACGTCG CTTTTTGATCCTTCGATGTCGGCTCTTCCTATCATACCGAAGCAGAATTCGGTAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAATAGG GAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGACCTCATCGCAATGGTAATTGAGCTT AGTACGAGAGGAACCGCTCATTCAGATAATTGGTTTTTGCGGTTGTCCGACCGGGCAGTGCCGCGACGCTACCATCTGCTG GATAATGGCTGAACGCCTCTAAGTCAGAATCCATGCCAGAACGCGATGATACCTCCAGCACGTTGTAGACGTATAAGAAT AGGCTCCGGCCTCGTATCTTAGCAGGCGATTCCTCCGTTGGCCTTGAAGTGGCCAGCGGTAATTCGCGTATTGTAATTTTA ACACGCGCTGGATCAAATCCTTTGCAGACGACTTAGATGTGCGAAAGGGTCCTGTAAGCAGTAGAGTAGCCTTGTTGTTAC GATCTGCTGAGGGTAAGCCCTCCTTCGCCTAGATTTCCCAGTGGAAGGGTCCGCCTAACAAGCGGGCATTTACTGGGGGGT CCCCCCGAGACTTGGTTGCCAGAGCCCGAGAGGGCGAAAGCGCCTTGCCGGAGGGAAAGTGCAGGGTAAGCAGGGACAG _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 87 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO GAAGGGGACTTGGTCAAGTTCAGCATCTCCCGGGTTTGGACGACGTTGCCCTGGGGGCGCGGGCGGGCCGGGCATAAGGG GTCTGCCGTACCAGCAGCCAGCCTGCAGAAGGCTCGGTGGCTATGCATGGCACATGCCCGGGGAAGCGTCGACCGGCGCA GTGTACGCGGGCACGGCCGGGCCGGGCCTTTGCAAGTCTTGGTGGCTGCGGTAGGTAGGGTAGGCAAGAGCGACCGACCG AGCGGCGGCGGGGCAGGAGCGACCGGGTAGGCGAGCAATTTTTGGGCAAGCTTGCAGTTCTGGACAAGTGAATGCATTCG CGACCGGGTTGGGTGCGGCGCCGGGTAGGCAAGCGCGTTCGAATCGTACAAGGTGGCGTAGAGAAGAGAGGGTAGGCAA GTGCGTCCGGGCGGGTTAGGTGTGTAGGGTAGGCAGGCGCGTCTGGGCATGGAATTTTTGTGTAGATGGTGGCTGCATTG GGAAGGCAAGGGCGAGGGCCTGTGCAGGGTAGGTAAGAAGGACCGAGAGGCTTGGGGGGGCCAAGGGGTTGCTTTCCAG CTCCTACTGGGAGGGGCTTGTTGAAGGAAAGGGTAGGGTGATAGTAGGAGGGGGTAGGTAAGTAAAGAAGCTATGTGGT TGAGTAAAGGTATTTGTAGCCTTTTTATTAGAAGATGTAGTAGGGTAGGTAGGAAAAGGTTGTACGGGATTGTGTTTTTAC GTGAGGTAAAGGTATAAAGGGGGAGGCTATCTTTTTGATTTCTGGGTAGGCGAGGCGGTAGGTAGGCTACTTGGGCTGGG AATGGTTTAGTCTTTAGGGGGGGAGCGAAAATTTCTTTCTTCTTTTTCTTTTCCTTTTTTATTTATTTATTTTTTTTCTTTCTTC TTTTTCTCCTCCCTCTTTCTTCTTCCTACTTTTATCCTCTTTATTACTCTTCCTCCTCCCTTTCCTTTCCTCTCCGTCTTCCTTCG TTTTGGTCCTTTTTTTCTTTTCTCTTCCTTTTTCTTTTTTCTTTTTAGCTTTTAACCTCTTTTTAGGGCTTTCCTCTCTTAATATT TCTTTCCTTATACCTCCAAACCCCCCTCCGTTCCCTTCTTTTGTATTATATCTATACAAGGATAAAAAAGTAATATGATTAA TATGTAAATAAAATAAAGAAGGTTCTTATTCTTCTTTTCTTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

>EU145764_Saccharomyces_cerevisiae CATTAAAGAAATTTAATAATTTTGAAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACA AGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAAC GGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCA ACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCA AAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAA GAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTT GGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTT AACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTA CGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGT CTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAG GA

>K.m. 1Y9 CTATAGGGCGAATTGGGCCCGGCGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCGCGGGGAATTCGATTTCCTCCGCTTATTGA TATGCTTAAGTTCAGCGGGTACACCTACCTGATTTGAGGTCAAACTTCGAGAGTTTTGGTTAAAGCCGTATGCCTCAAGGA GACAAACACCAGCGAGTCTTTATAACACCTATGAGTCTCTATGACCCAAGCTTACCACGAATTGGCGCAAACCTAAGACG TAGATGTGCAAGAGTCGAGTCCATAGACTTGACACGCAGCCCTGCTCACGCAGATGGCAACGGCTAGCCACTTTCAAGTT AACCCGAGACGAGTATCACTCACTACCAAACCCAAAGGTTTGAGAGAGAAATGACGCTCAAAACAGGCATGCCCCCTGG AATACCAGAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTTGATGATTCACGAAAATCTGCAATTCACAATACATATCGCTACTTCGC TGCGTTCTTCATCGATGCGAGTAAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGAATATTAAATTTTATAGTATAATAGTTTCT CATAATACAAAATATTGTTTGTGTTTATGTCCACTGGAGAGACGAGCTCTCCAGGGAAGTAGTTCATAGAGAAAAAACTC CATTGTGTTTAGGATGAGAAATAGAAAACTGATAGCAGAGAATCAAGAACTGGCCGCGCAATTAAGCGCAGGCCTTGTTC AGACGATTCCCCCAGTAATCTATTCATTCA

>S.c.D2 ATATTTTGAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAG CCGGGCCTGCGCTTAAGTGGGGGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGC TTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATT CGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGT AACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC GATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCA TGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGG _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 88 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO CCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTT TACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTT CTTAAAGTTTGACCTCAAA

>S.c.D3 CAAATTTGATAATTTTGAAATGGATTTTTTTATTTTTGGGAATGGAGAGCGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGAGG GAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGCCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTGGGCATACAAAACGGGGAG AGTTTTCGGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAGCACTAGGGGGTATTTTCCTATCTTTTCAACTTTT TCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCAAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAAC AAGAATTTTCGTAACAGGAATTTTGAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAAAACA CATCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAAATTCCKGGAATCATCGAATCTTTGAACGCTAATTGTTCCCTTTGGTAT TCCTGGGGGCTTGGGTGTTGGAGCGAAATTACCTACCCAAAGATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGTAATAAATT TTAACTAAACGGCCTTTTCATTGAAATTTTTTTTTCTAAAAATTGGTTCCACGGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGT CTTTTTGGGTTTAACCACCTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAATAAGAAAGCGTCTAG GCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAAACGGGKAGGAAGACCCCCCTGAACTTAAGCTTCACTAAGAGCGGGGGAA GATAAA

>S.c3Y3 ATGATGATTCTTTTCGTTGGGCAAGAGCTGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGAAGGCGATGGAGAGTCGGCCGGGCCTGC GCTTAAGGGGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAG GACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGG GGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATT TTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGT GAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAG CGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGG ATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGG CTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAAGTTTG ACCT

>P.m.1Y14 ATTggGcCggCGGgGGAAAAAAAaCCCATAcACACAGtGTTTTTTGTTTATTAAAAAAActgttGCTTTGGCTTGGCGCAAGTCGG GCCAGAGGTAAaAAcGtAAACTTCAATTTTTAATTGAATTGTTATTTTAATACAGTTGTCAATTTGTTTGATTAAATTCAAAA ATAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATG AATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGC GTCATTTCTCTCTCAAACCCTTGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCA AGAGTGTACTAGATAGTACTACCTGTTATTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAACGACTGGGCGTAAGTTTCTGG TAATTGGCTCGGCCTTACAACAACAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAAGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA AgGCGGAGGAAGATCTTACAGTTATTACTTTCTACCAGCGCTTAATTGCGCGGTGGAAAATAACCCATACACACAGTGTTT TTTGTTTATTaAgAACTATTGCTTTGGCTTgGcGcAGTcGGGCAGAGGTTcTACGTAAcTTCAATTTTAATTGAATgTTATTTTA TccGttTCATTTtTTtAtTAATTaAAAaAATCcTCAAcTTTcACAcGActtTGGTTccCttttAAAaccCAAgCGATAaTAaaTtGAAtTGATTT

>EF568069 Pichia_mexicana GATCATTACAGTTATTACTTTCTACCAGCGCTTAATTGCGCGGTGGAAAATAACCCATACACACAGTGTTTTTTGTTTATTA CAAGAACTATTGCTTTGGCTTGGCGCAAGTCGGGCCAGAGGTTACTACGTAAACTTCAATTTTTAATTGAATTGTTATTTTA ATACAGTTGTCAATTTGTTTGATTAAATTCAAAAATAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGAT GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCC CTTTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCTTGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAG TCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCAAGAGTGTACTAGATAGTACTACCTGTTATTCAATGTATTAGGTTTATC

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 89 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO CAACTCGTTGAACGACTGGGCGTAAGTTTCTGGTAATTGGCTCGGCCTTACAACAACAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGG TAAGATTACCCGCTGAACTTAA

>S.c.D4 CAAAGATTATATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAAACAAGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGAGGG AGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAG ATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCAAATCTTTGCAACTTTTTC TTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAA GAATTTTCGTAACKGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCA GCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAAATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTC CAGGGGGCAKGCCTGTTTAAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTG AAATKGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCG TTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTTATACCGGAGCGTTTTGGAACGTTTTCGAAAAAAAAAAAGCGTCCTAG GCGAACAATTGTTTTAAAGTTTGACCCTCAAATCAGGTAGGAGKACCCCGCTGAACTAGCCTAAAAAGAGGGCGGGGGGA GAGAGTACAAAATTTTTATATTTTTGTAAAATGGAATTTTTTTTTTTTTTTTGGMMGRGAGCTTT

>S.c.3Y4 CAAAGAAAATTAATAATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAAAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGA GATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGGGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGT GAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACT TTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAA AACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGA ACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTG GTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTA ACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTAC GGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACCGAGCGTATTGGAACGTTATCGAAAAAAAAAGAGCGTC TAGGCGAACAAGGTTTTAAAAGTTTGCCTC

>S.c. 4Y3 CAAAATTTATAATTTTGAAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAAGCTTTTACCKGGCAAGAAAAAAAGAAAGG GAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTTTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGA GATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTT CTTTGGGCATTCAAGCAATCGGGCCCCAGAGGAAACAAACACAAAAATTTTTTTTTTTTCTTAAATTTTTTGTCAAAAACA AAATTTTTCKTAACGGGAATTTTTAAAATTTAAAAAATTTTCAACAACGGATCTCTGGGTTCCCCCATCGATAAAAACCCC ATCGAATTGCGATACGTAAGGTGAATTGCAAATTCCCGGGAATCATCAAAACTTTAACCCCCCTTGGCCCCCCTTGGTTTT CCAGGGGGCGGGCCTGTTTGAGCGTCTTTTCCTTCTCAAACTTTCTGTTGGGAAGGGAGGGATCCTCTTTGGAGTAAACTT GAAATTGCGGGCCTTTTCTTTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTC GTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGG CGAACAATGKTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCTTAACAAAAAGCGGGGGAGAA AA

>S.c. 3Y8 TAAATTTATAATTTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGAAAGAGAGGG AGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTTTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAG ATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCT TTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAG AATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAG CGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCC AGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAA _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 90 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO ATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTT TTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGA ACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAACGGGGGAAAAGAT CATTAAAGAAATTTAATAATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCMARGGCATGGAGAGCTTTT

>S.c.3Y2 CAGTAATAGTTTTGAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAAACAAGAGATGGAGA GTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAKTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTT CTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTG GGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAA TTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCG AAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTKGGTATTCCAG GGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAAT TGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTT AGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTA

>S.c.3Y5 TATGATGATTTTTTTCGTTGGGCAAGAGCGGAGGTTACGGAAAAAAAAGAAGGGAGAGCAGCGGGCTGCGTTAAGTGGG GGCTGGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGAAAATTAAAAC CGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTA ACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAA AAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAA TTCCKTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTT CTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCC AAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTA TACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAAAAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTT

>S.c.D5 CAAAATTTATAATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGCTAAGAACTGAAGACCTTTCTCTGGGTAAGAAGACAAAAAAGG GAGAGCCCAGCTGGGCCTGCGCTTAAGGGCGCGGCTTTGCTAGGTTTGCAAGTTTCTTGCTCGCTCTTCCAAACGGTGAAA TATTTCTGAGCTTTTGTTATAGGACACTTAAAGCCGTTTCATTACATCACGCTGTGGAGTTTTCACAGCTTAGCAACTTTTT CTTGGGGCTTTCAAGCAAGCGGGGCCCAGAGGTACCAAACACAAAAAATTTCATTTCTGCATTAATTTTTAGCCAAAAAC AAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAACATTAAAACCTTACAACAACGGATCACTTGTTTCTCGCATCGATTAACACCC CACCGAAATGCTAATCGTACTGTGAATTGCAAAATTCCGTGAATCATCGATTCTTTGAACACACATTGCGCCCCTKGGTAT TCCGGGGGGCAGGCCGGTTTTAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATCCTCTTAGTAGTTAACTT GAAATTGCCGGCCTTTACCTTGGAGGTTTTTTTTCCAAAAATAGTTTCCTCTGCTTGCTTGAGGCATAATGCAAGTACGGTC TTTTTAGGTTTAACCACCAGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCCAAAAAAAAAAAGCTTCTAGG CCAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAACCAGGGAGGAGTCCCCGCTGAACTTAACCATTCAAAAAAGCGGAGGAAAA AAAG

>K.m 1Y1 TATATTGAATGATAGATTACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTCTTGATTCCCTGCTA TCAGTTTTCTATTTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGG ACATAAACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATC TCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCT TTGAACGCACATTGCGCCMTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGT AGTGAGTGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGSTGCKTGTCAAGTCTA TGGACTCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAAGTGTTA

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 91 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO TAAAGACTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGACATACGGCTTTAACAAAAACTCTCAAAGTGTGAGCTCATATCAGGTAGGA GTATCCACTGAACTTAAGCATATCTATAAGCGGGGGGAAGA

>EF568057_Kluyveromyces_marxianus TGAATGAATAGATTACTGGGGGAATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTCTTGATTCTCTGCTATCA GTTTTCTATTTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACA TAAACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCT TGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTG AACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGT GAGTGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGG ACTCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAA AGACTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTA CCCGCTGAACTTAA

>K.m. 1AN6 CTAGATACTGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTTGATTCTCTGCTATCAGTTTTCTATTTCT CATCCTAAAAAAAGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAACAAT ATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGA TGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGCGCC CTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCGTCT CGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTGCAC ATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGTGTT TGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAG CATATCAATAAAGCGGGGGAAGG

>T.d. 1AN9 TATGATGATAGATACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATGGCGCGGCCAGTTTTGATTCTCTGCTATCAGTT TTCTATTTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAA ACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGG TTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAAC GCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAG TGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACT CGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGA CTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCC GCTGAACTTAAGCATATCAATAAAGCGGGAGAAAAG

>K.m. 1D5 AGAAGATGTGATGATAGATTACTGGGGGAATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTCTTGATTCTCTG CTATCAGTTTTCTATTTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGT GGACATAAACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGA TCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAAT CTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTG GTAGTGAGTGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTC TATGGACTCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGT TATAAAGACTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAG GAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAACGGGGGGAGAAGG

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 92 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO >K.m. 1Y11 ATGAATGATAGATTACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTTAGATTCTCTGCTATCAGT TTTCTATTTCTCATCCTAAACAAAAAGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATA AACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG GTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAA CGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGA GTGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGAC TCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAG ACTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACC CGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGGGAGAG

>AB469378 Torulaspora delbrueckii CTAAAGATCTATATGATGAGTTAGAGGACGTCTAAAGATACTGTAAGAGAGGATCTGGTTCAAGACCAGCGCTTAATTGC GCGGTTGCGGCTTGGTTCGCCTTTTGCGGAACATGTCTTTTCTCGTTGTTAACTCTACTTCAACTTCTACAACACTGTGGAG TTTTCTACACAACTTTTCTTCTTTGGGAAGATACGTCTTGTGCGTGCTTCCCAGAGGTGACAAACACAAACAACTTTTTATT ATTATAAACCAGTCAAAACCAATTTCGTTATGAAATTAAAAATATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCA TCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATT GCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACAATCATGTTTGGTAGTGAGTGATACT CTGTCAAGGGTTAACTTGAAATTGCTAGCCTGTTATTTGGTTGTGATTTTGCTGGCTTGGATGACTTTGTCCAGTCTAGCTA ATACCGAATTGTCGTATTAGGTTTTACCAACTTCGGCAGACTGTGTGTTGGCTCGGGCGCTTTAAAGACTTTGTCGTAAAC GATTTATCGTTTGTTTGAGCTTTTCGCATACGCAATCCGGCGAACAATACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAA TACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAACGGGAAGAGAAAGGGTCAT

>T.d. 1AN5 AGATACTGGGGGATCGTCTGACAGGCTGCGCTAATTGCGCGGCAGCGAGTCTCTGCTATCAGTTTTCTATTTCTCATCCTA AAAAAGGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAACAATATTTTGT ATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGA ACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGG TATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCGTCTCGGGTT AACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTGCACATCTAC GTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGTGTTTGTCTC CTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATC AATAAGCGGAAAAAG

>K.m. 4D2 ATGATGATAGATACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTTGATTCTCTGCTATCAGTTTT CTATTTCTCATCCTAAACACAAAGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAAC ACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC TCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCA CATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGA TACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGA CTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTC GCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCT GAACTTAAGCATATCATTAAAAGGGGA

>K.m. 4D3 ATGATAGATACTGGGTGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTCGATCTCTGCTATCAGTTTTCTATT TCTCATCCTAAAACAAGAGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAA ACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGC _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 93 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO ATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATT GCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACT CGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCT TGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTG GTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAAC TTAAGCATATCAATAAAAGGGGGAG

>K.m. 4D4 CGATAGATACTGGGGGATCGTCTGACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTGAGATCTCTGCTATCAGTTTTCTATTT CTCATCCTAAAACAAGGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAAC AATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGC GCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCG TCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTG CACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGT GTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTT AAGCATATCAATAAAGGGGAGAGAAGG

>K.m. mosca7 TGATAGATACTGGCGGATCGTCTGACAAGGCCTGCACTTAATTGCGCGGCCAGTCGAATCTCTGCTATCAGTTTTCTATTTC TCATCCTAAAACAAGAGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAAC AATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGC GCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCG TCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTG CACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGT GTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGGAGTACCCGCTGAACT TAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAA

>K.m. mosca5 ATATGATGATAGATTACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTTAGATTCTCTGCTATCAG TTTTCTATTTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACAT AAACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT GGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGA ACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTG AGTGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGA CTCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAA GACTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTAC CCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAACGGAGGAGAAAAGGA

>K.m. 4Y2 GATGATAGATACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTAGAGTCTCTGCTATCAGTTTTCT ATTTCTCATCCTAAAACAAGGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACAC AAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTC GCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACA TTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATA CTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACT CTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGC

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 94 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO TGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGA ACTTAAGCATATCAATAAGGCGGGAAGAAGGAT

>K.m. 4D5 TGATAGATACTGGGGGATCGTCTGACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCAGGCGAACCTCTGCTATCAGTTTTCTATTTC TCATCCTAAAAAAGGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAACAA TATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCG ATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGCGC CCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCGTC TCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTGCA CATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGTGT TTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAA GCATATCAATAAAGGGAGAAGAAGGAT

>T.d.1AN2 GAGATCTATATGATGAGTTAGAGGACGTCTAAAGATACTGTAAGAGAGGATCAGGTTCAAGACCAGCGTAAAAGGGGCG GTTGCGGCTTGGTTCGCCTTTTGCGGAACATGACTTTTCTCGTTGTTAACTCTACTTCAACTTCTACAACACTGTGGAGTTTT CTACACAACTTTTCTTCTTTGGGAAGATACGTCTTGTGCGTGCTTCCCAGAGGTGACAAACACAAACAACTTTTTATTATTA TAAACCAGTCAAAACCAATTTCGTTATGAAATTAAAAATATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGA TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC CCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACAATCATGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTGT CAAGGGTTAACTTGAAATTGCTAGCCTGTTATTTGGTTGTGATTTTGCTGGCTTGGATGACTTTGTCCAGTCTAGCTAATAC CGAATTGTCGTATTAGGTTTTACCAACTTCGGCAGACTGTGTGTTGGCTCGGGCGCTTTAAAGACTTTGTCGTAAACGATTT ATCGTTTGTTTGAGCTTTTCGCATACGCAATCCGGCGAACAATACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCC GCTGAACTTAAGCATATCA

>T.d. 1D2 ATCTTATGATGAGTTAGAGGACGTCTAAAGATACTGTAAGAGAGGATCAGGTTCAAGACCAGCGTAAAATGGGCGGTTGC GGCTTGGTTCGCCTTTTGCGGAATATGACTTTTCTCGTTGTTAACTCTACTTCAACTTCTACAACACTGTGGAGTTTTCTACA CAACTTTTCTTCTTTGGGAAGATACGTCTTGTGCGTGCTTCCCAGAGGTGACAAACACAAACAACTTTTTATTATTATAAAC CAGTCAAAACCAATTTCGTTATGAAATTAAAAATATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAG AACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTG GTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACAATCATGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTGTCAAGG GTTAACTTGAAATTGCTAGCCTGTTATTTGGTTGTGATTTTGCTGGCTTGGATGACTTTGTCCAGTCTAGCTAATACCGAAT TGTCGTATTAGGTTTTACCAACTTCGGCAGACTGTGTGTTGGCTCGGGCGCTTTAAAGACTTTGTCGTAAACGATTTATCGT TTGTTTGAGCTTTTCGCATACG

>EF151440_Pichia_guilliermondii GCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTT TAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGT TCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAAC GCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAG TGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTAGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATG TATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAG TTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGGGATCTTAAGTATTCTTTTGCCA GCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATAAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCTAGAGATGGTT GGGCGAGGTTTTACAAAACACATTTAATTATTTTT

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 95 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO >P.g.1Y12 TGCAGCGCTACTGCGCGGCGAGAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAATCTAGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAG GTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAAC AACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATC ATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCC GGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGCT GTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTAC AACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATAACGTACCGACGAAGGGATCTTA CAGTATTCTTTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGT TTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCAGAGGTTTACAAAACACAATTTAATTATTTT

>P.g.1Y15 GTGCGGAAGGTTCAAAGGTGTATTCTTTTGCGGCGCTTACTGCGCGGCGAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAG AACTAAGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTAAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCA AATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA GTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCT GTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAG TATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGG ATATTTCTGGTATTGTAGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTT ATGCATATCAATAAGCGGAGGAAAATCTAGTAGTCGTGTTTGCAGTACTTAGCTTCCGAGTGAAATCTCACCCACATAAA GTCTATATGATAAGTCTTGCTTTCGTTGGCTTGGGATAGAGATGCGGAGG

>P.g. 4AN2 AAGGGTTTTCTTTTTGCGGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTATAGCTTTG GGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTAAACAAGGCACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTA ATCTTCAAAACTTTCAACAACGGACTTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATT GCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCA TTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGG TAGTACTTGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGGGTGGCGGGATATTTCTGGTAT TGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAT AAGCGGAGGGGGGGATCTTACAGAAATCTGTTGCCAGCGATTAACGGCGCGGCGAAAAACCTCACCACAGTGTCTTTTTG ATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGAAAGGGTGGGGCAGAGGGTTTAAAACACATTTAAGTAT

>P.g. 4AN7 GGGTATTCTTTTGCCGCGCTTACTGCGCGGCGAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTG GCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTT CAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAG ATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCT CTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGT ACTGGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTT GGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTTGCATATCTATAACCG GAGGGAGATTTTAAGAAAATTGTTGTCAGCGATTAAGTGAGCGGCGAAAACCCTACACATTGTATCTTTTCTACAGACTCT TGCTTTGGTTGGGCTAGAGAAAGGGGGGGCAGAGGGTTAAAAACATAATTTAAGTATTTTACGGATCGCTC

>C.l.1AN4 CAAAATAATACTTTCCCTTTGTTTTTGCGAACAAAAAAAAATTTTTTTATTCGAATTTCTTAATATCAAAACTTTAAAAAGG TCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAAGCGATACGTAGTATGACTTGCAGACGTGAATCATCGAATCTTT GAACGCACATTGCGCCTCGAGGCATTCCTCCAGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGCATCCCCTCTAACCCCCGGTTAGGCGTT GCTCCGAAATATCAACCGCGCTGTCAAACACGTTTACAGCACGACATTTCGCCCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGA _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 96 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO ACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAGATGTTAATAATATACTTACACTTTGCTTGTGCGAACAAAAAAATAAATTTTT TTATTCGAATTTCTTAATATCAAAACTTTCAACATTTTAMTCTTTTTTTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGATTTTGGG ATACGTAGTATGACTTGCAGACGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTGGAGGCATTCCTCGAGGCAGGCT TTTTTGGGGCGTCCATCCCCTCTAACCCCCGGGTAGGCGTTAGCCCCTAAAATATCCACCCGCGCTTTCAAACCACGTTTTA CGGGGCGAACTTTTTCCCCCTCTAATTTGGGGGAAGAACTTACCCCCCTCAAATTTAAAAGGTTTCGCTTAAGGGGGGGGA AAAAA

>C.l.4AN3 GAAAAAAAATAAATTCACACTGTTTTTGCGAAAAAAAAAAAATTTTTTTATTCGAATTTCTTAATATCAAAATAACAACAA CGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATACGTAGTATGACTTGCAGACGTGAATCATCGAAT CTTTGAACGCACATTGCGCCTCGAGGCATTCCTCGAGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGCATCCCCTCTAACCCCCGGTTAGG CGTTGCTCCGAAATATCAACCGCGCTGTCAAACACGTTTACAGCACGACATTTCGCCCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGC TGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAGGATCATTAAAATACAAATTACACACTGTTTTTGCGAACAAAAAAATAA ATTTTTTTATTCGAATTTTTTAATATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAT TGCGATACGTAGTATGACTTGCAGACGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCTCGAGGGCATTCCTCGAGGCA TGCCTGTTTTGAGCGTCGCATCCCCCTCTAACCCCCGGGTTAGGCGTTTGCCCCTAAAATATCAACCCGCGCTTTCAAAAC ACATTTTACAGCACGGACAATTTTGCCCCCTCTAATTTAAGGKAAGAACTTACCCCCCTCAAAAATTTAAAAGGTTTCGCT TAAAGGGGGAGAGGAAAAAA

>AY321469_Clavispora_lusitaniae CGATCTTAAAATACTTACCATTGTTTTTGCGAACAAAAAAATAAATTTTTTTATTCGAATTTCTTAATATCAAAACTTTCAA CAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATACGTAGTATGACTTGCAGACGTGAATCATC GAATCTTTGAACGCACATTGCGCCTCGAGGCATTCCTCGAGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGCATCCCCTCTAACCCCCGGT TAGGCGTTGCTCCGAAATATCAACCGCGCTGTCAAACACGTTTACAGCACGACATTTCGCCCTCAAATCAGGTAGGACTAC CCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA

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>C.l. 4Y4 AAAAAAAAAAACTCACCCTGTTTTTGCGAAAAAAAAAAGAACATTACACTTCTAATATATTTTTATCAAAACTTTCAACAA CGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATACGTAGTATGACTTGCAGACGTGAATCATCGAAT CTTTGAACGCACATTGCGCCTCGAGGCATTCCTCGAGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGCATCCCCTCTAACCCCCGGTTAGG CGTTGCTCCGAAATATCAACCGCGCTGTCAAACACGTTTACAGCACGACATTTCGCCCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGC TGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGATAACTAAAAAATAATATACACACTGTTTTTGCGAACGAAAAAAAG AACATTACACTTCTTATTTCTTTTTATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGGTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGA ATTGCGATACGTAGTATGACTTGCAAACGTGAATCATCGACTCTTTGAACGCACATTGCGCCTCGAGGCAGTCCTCGAGGC ATGCATGTTTGAGCGTCGCAACCCCTCTAACCCCAGGTAAGGCGTTGGAACGAAATATCAACCGCGGTGTCAAACACATT TGCGTACGACAGTTCGCCCTCTATCTGGGAAGAGTACCCGCACAATTTAACCGACTCGCGTCGAGGAGGGAAAA

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DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO >P.k. 1Y10 AATTACATGAAATTATATCTTTCACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCAGTCACTAAGAATA ACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAA TTGCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTCTGAGCGTC GTTTCCTTCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACGTCTTGKACGAAGTGAACTAAACT ATTTGGAACGCTTTGGCCGCCGAACTTTTAACTAAKCTCGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATAT CGGTAAGCGGAGGGAAGCTCCCACTGTGATTTATATCTTTCAGGGGGCGTGAGGCACCCACCCTAAAATTGTAATATACC AGTCCTAAGTTTTACAAACCACTTTCCACAACGGATCTCTTGGTTCTGATCGATGAAGAGCGCAGCGAATGCAATACTAGT GTGAATTGGCCCTCGTGAATCATGACTTCTTGAACACATTGCGCCCCATGGTATTCATGGGGATGCCTGTTGAGCGTCTTTC CTTCTTCGCAAGCAAATTGAGAACAGGCATGCCTTTTTCGAAAGGCGCGTCGTAGAA

>P.k. 4D7 CTGATTTATCTTTCACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCAGTCACTAAGTATAACAAAACAA AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCAT CGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCTT GCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACGTCGTGGACGAAGTGAACTAAACTATTTGGAACG CTTTGGCCGCCGAACTTTTAACTAAGCTCGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGG AAATTAGATCATTACTGTGATTTATATCCTTCAACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCAGTC ACTAAGTTTTAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATA CTAGTGTGAATTCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCATGGGGCATGCCTGTC TGAGCGTCGTTTCTTCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAAATGGCACGTCGTGGACCAAGTG

>P.k. 4AN5 TCGGGTATTATTCTTTCACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCAGTCACTAAGAATAACAAAA CAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAG CCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCT TCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACGTCGTGGACGAAGTGAACTAAACTATTTGG AACGCTTTGGCCGCCGAACTTTTAACTAAGCTCGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA GCGGAGAGTAGATCATTACTGTGATTTATATCCTTCAACACGTGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACC TGTCACTAAGTTTTAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGC GATACATAGTGTGAATTGCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCATGGGGCATG CCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGCGCAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGCACGTCGTCGACAA AGT

>P.k. 4D6 TGTATTATTCTTTCACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCAGTCACTAAGAAATAACAAAACA AAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCA TCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCT TGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACGTCGTGGACGAAGTGAACTAAACTATTTGGAAC GCTTTGGCCGCCGAACTTTTAACTAAGCTCGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCG GAGAGTAGATCATTACTGTGATTTATATCCTTCAACACGTGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCTGT CACTAAGTTTTAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGAT ACATAGTGTGAATTCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCATGGGGCATGCCTG TCTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGATACAGGCTATGCCTTTTACGAAATGGCACGTCGTGGACC

>P.k. 4Y6 TAATTACTGTTATTTTTTTCTTTCACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCAGTCACTAAGTAAT AACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGA ATTGCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTCTGAGCGT _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 98 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO CGTTTCCTTCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACGTCGTGGACGAAGTGAACTAAAC TATTTGGAACGCTTTGGCCGCCGAACTTTTAACTAAGCTCGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATA TCAATAAGCGGAGGAAAGATCATTACTGTGATTTATATCCTTCAACACGTGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTA ATACTACCTGTCACTAAGTTTTAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGC GAAATGCGATACTAGTGTGAATTCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCATGGG GCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTYCTTCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTATTCGAAAAGGCACGTCG TCGACCAAGG

>P.k. 1Y16 CCGGGGATTTTTTTCTTTCACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTACCAGTCACTAAGTTTTAACA AAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGAAGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTG CAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATCGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCGTGCCTGTCTGAGCGTCGTT CCCTTCTTGCGAGCYAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCAAAATGGAACGTGTGGACGAATGGAACTAAACTTTGG GACCCTCWACGGCCGCAGGAGTTAGAAGCAACCTCGACCTCAGGGAGGTAGTAATACCGGTGAACATTAGTAGGTCAGT ACGCGTAGAAAATTATAACTCGTCTC

>DQ104732_Pichia_kluyveri AACCTGCGGAAGGATCATTACTGTGATTTATATCTTATACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTAAAATTGTAATACTAC CAGTCACTAAGTTTTAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATG CGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCA TGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGCGCAAGCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACGTCGTGGA CGAAGTGAACTAAACTATTAGCACGCTTTGGCCGCCGAACTTTTAACTAAGCTCGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCG CTGAACTTAA

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>Z.b. 3Y1 GATAGAAAATTTCTGATTGAACGAGTCTGGAGTAGTTGTGTTCTCTCTGTTTTTTCAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGACT AGAGCGGAGGGAGTTAAGCATAGTTACTCTGGCTTTCAATTTACACACAGTGGAGTTTCTACTTTTTTTATTCTTCTTTGGG AGGATGGGTTCGTCCCACTCCCATAGCTAAAACAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTATACCGGCCAAAACGAA AACTAAAAAAAAAAATTTTCAAATTTTTCACACACGGATTTTGTGTTTTCCCCCTCGAAAAAAACCCCAGCAAACCGCGCC TAATGGGAAATGGAAAATTCCGGGAAAACCCGAATTTTTAACCCCTTGCCCCCCCGGTTTTCCCCGGGGGGATGCCCGGTG GAGGGTCTTTTCTTCCTCCAAAAAGGGTTGGGGGGGGAGGGAAACCCTTTTTTTTGGGGGAAATAAAAACAACCCTTTTGG GGAACCCGTGGGGGGTAGTTTTTGGGGGGAAAATTTTGTTCCTCTCTTTCCAAAAAAAGGGTTTTACGGTTTTCCCCCCCC _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 99 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO CGACAGAGGGACAAGGAAAATGGGGAAGAAAAAAAAATATCGAGCTCGGCTTATTTTTTTTTTGGGGCGCCTGGGGAAA AAAAACCTGTCAAAGTTTSACCTCAATCAGGGAGAGAGTCCCCG

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14. GLOSARIO ADN. Molécula de gran peso molecular que está constituida por tres sustancias distintas: ácido fosfórico, un monosacárido aldehídico del tipo pentosa y una base nitrogenada cíclica que puede ser púrica (adenina o citosina) o pirimidínica (timina o guanina). ADNr. Se refiere a la región de ADN donde se encuentran los genes que codifican para la formación de los ribosomas, generalmente se encuentran en arreglos de cabeza a cola empezando con el mediano 18S, después el pequeño 5.8S y posteriormente el grande 26S, separados por los espaciadores internos ITS. ADN Taq polimerasa. Es una enzima que se extrae de la bacteria Thermus aquaticus para la replicación del ADN, la Taq ADN polimerasa, es ampliamente utilizada por sus propiedades de termorresistencia en las reacciones de PCR. Acido nucléico. Biomolécula formada por macropolímeros de nucleótidos, o polinucleótidos. Está presente en todas las células y constituye la base material de la herencia que se transmite de una a otra generación. Alambique. Del árabe al - ambiq, y este a su vez del griego ambicos = vaso), es el sistema de destilación más utilizado. El equipo consta de una caldera o pota de cobre, de capacidad variable, un capacete condensador prolongado en un cuello de cisne (o trompa de elefante), un condensador refrigerante cilíndrico (bidón) provisto en su interior de un serpentín de cobre, conectable al cuello de cisne y con salida para el destilado en su parte inferior y una base para el condensador refrigerante. Arbol filogenetico. Es un árbol que muestra las relaciones de evolución entre varias especies u otras entidades que se cree que tuvieron una descendencia común. Un árbol filogenético es una forma de cladograma. Bioedit. Es un programa bioinformatico editor de secuencias el cual permite la manipulación y análisis de múltiples secuencias y contiene aplicaciones que facilitan su alineamiento entre otras. BLAST. Es un programa informático que emplea un algoritmo heurístico lleva a cabo un alineamiento de secuencias de tipo local, ya sea de ADN o de proteínas. El programa es capaz de comparar una secuencia problema (también denominada en la literatura secuencia query) contra una gran cantidad de secuencias que se encuentren en una base de datos. Cepa. Es un grupo de aislamientos caracterizados de un microorganismo. Esencialmente esto se aplica a aislamientos del laboratorio, cultivos o selección, raza, variedad. Dendrograma. Tipo de representación gráfica o diagrama de datos en forma de árbol (Dendro=ramas) que organiza los datos en subcategorías que se van dividiendo en otros hasta llegar al nivel de detalle deseado (asemejándose a las ramas de un árbol que se van dividiendo en otras sucesivamente). Destilación. La destilación es el procedimiento más utilizado para la separación y purificación de líquidos, y es el que se utiliza siempre que se pretende separar un líquido de sus impurezas no volátiles. Diversidad. La variación entre las especies, es lo que les ha permitido a las poblaciones adaptarse a cambios climatológicos, así como a diferentes condiciones ambientales, la existencia de una amplia variedad de especies (diversidad de especies) de plantas, animales _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 101 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

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y microorganismos en su hábitat natural, o en comunidades con un particular medio ambiente (diversidad ecológica) o bien variaciones genéticas entre las especies (diversidad genética). Electroforesis. Migración de partículas a través de una matriz (usualmente polimérica) debido a un diferencial de campo eléctrico. Espectrofotómetro. Instrumento empleado para medir la cantidad de luz de una longitud de onda específica que es absorbida por una solución. Etanol. Es un alcohol que se presenta como un líquido incoloro e inflamable con un punto de ebullición de 78.5°C. Al mezclarse con agua en cualquier proporción, da una mezcla azeotrópica. Su fórmula química es CH3-CH2-OH, principal producto de las bebidas alcohólicas como el vino (un 15% aproximadamente), la cerveza (5%) o licores ( hasta un 50%). Fermentación. Conversión biológica anaeróbica (sin oxígeno) de las moléculas orgánicas, generalmente hidratos de carbono, en alcohol, ácido láctico y gases, mediante la acción de ciertos enzimas que actúan bien directamente o como componentes de ciertas bacterias y levaduras. Fermentación alcoholica. Es un proceso biologico de fermentación en ausencia de aire originado por la actividad de microorganismos que procesan los hidratos de carbono para obtener como productos finales el etanol dioxido de carbono en forma de gas y ATP. Fermentación maloláctica. Es el proceso por el cual el ácido málico presente en las frutas se transforma químicamente en ácido láctico; por medio de bacterias de origen láctico existentes de forma natural en el entorno, o en el interior de la fruta misma. Fructosa. Es una forma de azúcar encontrada en las frutas y en la miel. Es un monosacárido con la misma fórmula empírica que la glucosa pero con diferente estructura. Gen. Segemento de ADN que codifica una cadena polipeptidica o una molecula de ARN. Glucosa. Es un monosacárido con fórmula empírica C6H12O6, la misma que la fructosa pero con diferente posición relativa de los grupos -OH y O=. Es una hexosa, es decir, que contiene 6 átomos de carbono, y es una aldosa, esto es, el grupo carbonilo está en el extremo de la molécula. Es una forma de azúcar que se encuentra libre en las frutas y en la miel. HPLC. Cromatografía líquida de alta eficiencia emplea una fase móvil que es un líquido que fluye atravéz de una columna que contiene una fase líquida Índice de diversidad. Parámetro matemático para medir la biodiversidad de un ecosistema. Levadura. Hongos microscópicos unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la fermentación de hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias. Pares de bases. Dos nucleótidos opuestos y complementarios en las cadenas de ADN y ARN que están conectadas por puentes de hidrógeno. Mega 4. Es una herramienta bioinformatica para trabajar con alineamiento de secuencias manual y automaticamente para la realización de arboles filogeneticos empleando secuencias de las bases de datos, también estima rangos de evolución molecular y examinando las hipotesis evolutivas. _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 102 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

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Mezcal. Del náhualtl metl e izcalli que significa agave cocido al horno. Es una bebida alcoholica tradicional mexicana a base de agave. Mosto. Es el zumo de la uva sin fermentar. También nos podemos referir como las piñas del agave que son molidas y puestas a fermentar, o cualquier otro sustrato vegetal rico en azúcares fermentables. Oligonucleótido. Secuencia de ácido nucléico o de una molécula relacionada que sirve como punto de partida para la replicación del ADN. Polimorfismo. Diferencias en la secuencia de ADN entre individuos. Variaciones genéticas que ocurren en mas del 1% de la población pueden ser consideradas útiles para la identificación de individuos o para el análisis de genomas con alto porcentaje de similitud. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Técnica de análisis del genoma mediante la amplificación ilimitada de porciones específicas del ADN, aunque sean minúsculas. Es un método revolucionario de amplificación exponencial del ADN por la intervención de una enzima termoestable, la Taq polimerasa, inventado por el americano Kary Mullis en 1985 por lo que se le concedió en 1993 el premio Nobel. Es el proceso fundamental para la secuenciación del Proyecto Genoma Humano. Rep-PCR. Técnica molecular genómica donde se utilizan oligonucleótidos degenerados que por PCR y visualización en luz UV producen patrones de bandeo característico para cada especie. Secuencia de ADN. Orden de encadenamiento de las bases nitrogenadas de los nucleótidos que constituyen el ADN y que cifra toda la información genética. Cuando es codificante (exón), define el orden de los aminoácidos que forman la proteína correspondiente. SSCP. Es un proceso donde los productos de PCR son desnaturalizados en cadena simples de ADN, luego renaturalizados para favorecer los apareamientos intracatenarios y finalmente analizados en un gel de Poliacrilamida. La estructura de ADN adoptara una conformación y permitirá la diferenciación en el gel. Trapiche. Es un molino artesanal utilizado para extraer el jugo de determinados frutos como el agave.

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