INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

“ANÁLISIS QUÍMICO DE LOS VOLÁTILES DE LAS EMISIONES DE LOS MACHOS DURANTE EL LLAMADO SEXUAL Y MORFOLOGÍA GLANDULAR Y ANTENAL DE Toxotrypana curvicauda (DIPTERA: TEPHRITIDAE)”

TESIS Que para obtener el grado de: DOCTORADO EN CIENCIAS EN DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

PRESENTA

M. en C. NORMA REYNA ROBLEDO QUINTOS

Yautepec, Morelos

Septiembre, 2008

El presente trabajo de tesis se desarrolló en el Laboratorio de Ecología de Insectos del Departamento de Interacciones Planta- Insecto, del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos, bajo la dirección del Dr. Ángel René Arzuffi Barrera.

AGRADECIMIENTOS Al Instituto Politécnico Nacional por permitirme realizar mis estudios de doctorado y a COTEPABE por haberme dado mi licencia con goce de sueldo para lo mismo.

Al personal docente y no docente del CEPROBI que de una u otra manera me brindaron su apoyo para poder realizar estos estudios.

A los profesores de los comités tutorial y revisor de tesis: Dra. Gabriela Trejo Tapia, Dr. Ángel René Arzuffi Barrera, Dr. Julio Cesar Rojas León, Dr. Víctor López Martínez, Dr. Mario Rodríguez Monroy, Dr. Alfredo Jiménez Pérez, Dr. Federico Castrejón Ayala y al Dr. Víctor Rogelio Castrejón Gómez; por su participación, sus sugerencias y comentarios que enriquecieron éste trabajo.

Al Dr. Ángel René Arzuffi Barrera por darme esta oportunidad, por su enseñanza, su paciencia, su confianza y especialmente por su entusiasmo.

Al M. en C. Jorge Valdez Carrasco del Instituto de Fitosanidad, del Colegio de Posgraduados (Campus Montecillo), por su ayuda profesional y oportuna.

Al Dr. Jaime Escalante del Centro de Investigaciones Químicas de la UAEM, por su apoyo y asesoría química.

Al Dr. Julio Cesar Rojas León del laboratorio de Ecología Química de Insectos del ECOSUR, por su asesoría y por permitirnos trabajar en su laboratorio.

A mi hijo, mis padres y padrinos que estuvieron a mi lado con su incondicional apoyo.

A mis compañeros alumnos y trabajadores del CEPROBI.

Contenido Relación de cuadros

v

Relación de figuras

v

Resumen

vi

Abstract

vii

Capítulo 1. Introducción general

1

1. El mensaje. Feromonas sexuales de tefrítidos

4

2. El emisor. Glándulas productoras de feromona sexual en tefrítidos

7

3. El receptor. Estructuras receptoras de feromona sexual en tefrítidos

8

4. Modelo de estudio Toxotrypana curvicauda

10

5. Justificación y Objetivos

13

Capítulo 2. Composición química de emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2-metil-6-vinil pirazina

15

1. Introducción

16

2. Materiales y Métodos

18

2.1. Insectos

18

2.2. Extracción e identificación de compuestos volátiles

19

2.2.1. Colecta de volátiles con microextracción en fase sólida

19

2.2.2. Obtención de extractos con aeración dinámica (Súper Q)

19

2.2.3. Análisis químico e identificación de los compuestos volátiles

20

2.3. Síntesis de la 2-metil-6-vinil pirazina

21

2.4. Actividad biológica de las emisiones de los machos y de la 2,6 mvp sintética

22

2.4.1. Evaluación mediante electroantenografía

22 i

2.4.2. Evaluación de la 2,6 mvp en túnel de viento

23

2.3.4.3. Análisis estadístico

24

3. Resultados

24

3.1. Identificación de los compuestos volátiles

24

3.2. Identificación de la 2,6 mvp sintetizada

28

3.3. Respuestas electroantenográficas provocadas por el extracto de SQ y la 2,6 mvp sintética

29

3.4. Evaluación de la atracción de 2,6 mvp sintética en túnel de viento

31

4. Discusión

31

Capítulo 3. Efecto del fruto hospedero y coespecíficos sobre la liberación de la 2-metil-6-vinil pirazina en machos

35

1. Introducción

36

2. Materiales y Métodos

38

2.1. Insectos

38

2.2. Efecto de la edad

39

2.3. Tratamientos

39

2.4. Extracción e identificación de la 2-metil-6-vinil pirazina

40

2.5. Análisis estadístico

41

3. Resultados

41

3.1. Efecto de la edad

41

3.2. Efecto del fruto

41

3.3. Efecto de coespecíficos

43

3.4. Efecto de coespecíficos y fruto

44

4. Discusión

45

ii

Capítulo 4. Estudio químico y morfológico de las glándulas salivales y el epitelio pleural

48

1. Introducción

49

2. Materiales y Métodos

51

2.1. Insectos

51

2.2. Obtención de extractos de las glándulas salivales y el epitelio pleural

51

2.3. Análisis químico de extractos de las glándulas salivales y del epitelio pleural

52

2.4. Estudios morfológicos

52

3. Resultados

54

3.1. Estudios químicos

54

3.2. Estudios morfológicos

54

4. Discusión

57

Capitulo 5. Sénsulos antenales

59

1. Introducción

60

2. Materiales y Métodos

61

2.1. Insectos

61

2.2. Microscopía óptica

61

2.3. Microscopía electrónica de barrido

62

2.4. Número total de sénsulos funiculares

62

2.5. Características de los receptores funiculares

62

2.6. Análisis estadístico

63

5.3. Resultados

63

3.1. Morfología general de las antenas

63

iii

3.2. Número total de sénsulos funiculares

66

3.3. Características de los receptores olfatorios

66

5.4. Discusión

67

Capítulo 6. Discusión General y Conclusiones

72

6.1. Discusión General

73

6.2. Conclusiones

77

Bibliografía

79

Anexos

93

iv

Relación de cuadros 1.1. Compuestos identificados en feromonas sexuales de tefrítidos

6

5.1. Longitud antenal y ancho de antenas de machos y hembras

64

5.2. Longitud y ancho de los sénsulos olfatorios de ambos sexos.

66

Relación de figuras 1.1 Vía olfatoria

9

1.2. Macho en el “llamado sexual” en el campo

11

2.1. Cromatograma de las emisión del macho de 7 días de edad

25

2.2. Espectro de masas de la dimetil-2-pirazina

26

2.3. Cromatogramas sobrepuestos de la 2,6 mvp

26

2.4. A. Cromatograma y B. Espectro de masas del estándar

27

2.5. Espectro RMN y esquema de la 2,6 mvp

28

2.6. Despolarización en antenas de hembras (EAG)

30

2.7. Respuesta de atracción de hembras en túnel de viento

30

2.8. Aterrizaje de hembra en túnel de viento

31

3.1. Tratamientos

39

3.2. Promedio de 2,6 mvp liberada por machos los 13 días

42

3.3. Promedio de 2,6 mvp liberada por machos con y sin fruto

42

3.4. Promedio de 2,6 mvp liberada por machos con coespecíficos

43

3.5. Promedio de 2,6 mvp liberada por machos con coespecíficos y fruto

44

4.1. A. Esquema de glándulas salivales abdominales. B. Fotografía de macho con las pleuras hinchadas

52

4.2. Glándulas salivales abdominales de machos de 7 días de edad

53

4.3. A. Cromatograma y B. Espectro de masas de la 2,6 mvp

55

4.4. A. Corte transversal del segmento abdominal IV de un macho y B. Corte histológico de un tubo de la glándula salival abdominal

56

5.1. Antenas

64

5.2. Micrografías de los segmentos antenales y sénsulos funiculares

65

5.3. Micrografía de la parte interna del orificio olfatorio de la antena

67

v

Resumen En este estudio, las emisiones de machos llamando de la mosca de la fruta de la papaya, Toxotrypana curvicauda, fueron obtenidas con microextracción en fase sólida y fueron identificadas con cromatografía de gases/espectrometría de masas. Se sintetizó la 2-metil-6-vinilpirazina (2,6 mvp), componente principal de la feromona sexual. Se realizaron bioensayos de electroantenografía (EAG) y túnel de viento para probar la respuesta de atracción de las hembras a la 2,6 mvp sintética. Además, el efecto de la edad, fruto hospedero y coespecíficos sobre la liberación de la 2,6 mvp, se estudió durante 13 días de la etapa adulta. La estructura productora de la feromona sexual, fue localizada mediante estudios morfológicos e histológicos de la glándula salival abdominal y del epitelio pleural. La morfología antenal y los sénsulos funiculares de machos y hembras, fueron estudiados usando microscopía de luz y electrónica de barrido. Además de la 2,6 mvp se encontraron otros dos compuestos, la dimetil-2-pirazina y un terpeno. La 2,6 mvp fue sintetizada eficientemente y con ella se obtuvieron respuestas similares a aquellas provocadas por extractos hexánicos (SQ) de las emisiones de machos y machos llamando, en EAG y túnel de viento, respectivamente. La liberación de la 2,6 mvp, dependió de la edad de los machos (días) y fue modificada en forma importante por la presencia del fruto hospedero y machos. Las micrografías de la glándula salival abdominal, mostraron un tejido similar al encontrado en otros tefrítidos; en esta estructura se observaron organelos característicos de células secretoras y se encontró evidencia química de que ahí podría producirse la 2,6 mvp. Cuatro tipos de sénsulos funiculares (tricoideos, basicónicos, clavados y estilocónicos), característicos de otros tefrítidos fueron encontrados en antenas de machos y hembras, aunque no se encontró dimorfismo sexual en el número y tipo de ellos. Los sénsulos tricoideos y clavados fueron significativamente más largos en las hembras. Los datos obtenidos en este trabajo complementan la información que se tiene sobre la comunicación química sexual de estas moscas. Esta información eventualmente permitirá mejorar los sistemas de manejo que actualmente se emplean para T. curvicauda.

vi

Abstract Emissions of calling males of the papaya fruit fly, Toxotrypana curvicauda, were captured by solid phase microextraction and identified by gas chromatography/ mass spectrometry. The 2-methyl-6-vinyl pyrazine (2,6 mvp), the main compound of sexual pheromone, was synthesized and its biological activity as female attractive were tested on wind tunnel and by electroantenography (EAG). In addition to the 2.6 mvp, two other compounds, dimethyl-2-pyrazine and a terpene, were found in males´ emissions. The effect of age, host fruit and conspecifics on the release of 2,6 mvp was studied during 13 days. Structure-producing sex pheromone was located by morphological, histological and chemical studies of salivary glands and abdominal pleural tissue. Antennal morphology and funicular sensilla of male and female, were studied by light and scanning electronic microscopy. The 2,6 mvp was efficiently synthesized by a “one pot” reaction. Synthetic 2,6 mvp produced similar responses to those obtained with hexanic extracts of the males´ emissions and calling males, in EAG and wind tunnel, respectively. Release pattern of the 2.6 mvp depends on age of males (days) and it is modified by the presence of host fruit and other males. Micrographs of abdominal salivary glands showed similar tissue to that found in other tefritids; in this structure, cellular organelles of typical secretory cells were observed. The 2.6 mvp was the only compound found in this structure. Four types of funicular sensilla (trichoid, basiconic, clavate and styloconic) characteristic of tefritids, were identified in the antennae of male and females. Males and females did not differ in total number or type of sensilla found on the funiculus, however females’ trichoid and clavate sensilla were significantly larger. Information provided in this dissertation will be useful to understand and improve management systems currently used for T. curvicauda.

vii

Capítulo 1

Introducción general

Introducción General

La familia Tephritidae constituye el principal grupo de insectos dípteros fitófagos, los cuales causan un daño generalizado en frutales, algunos tallos y flores, ocasionando pérdidas importantes en todo el mundo (Howse et al., 1998; Landolt y Averill, 1999). Esta familia de insectos está constituida aproximadamente de 4200 especies pertenecientes a 500 géneros distribuidos principalmente en los frutales de las zonas tropicales y subtropicales (White y Elson-Harris, 1992; revisado por Hernández-Ortiz, 1996; Howse et al., 1998). Aunque la mayoría de las especies utiliza frutos como hospederos existen excepciones, como Eurosta solidaginis (Fitch) que oviposita alrededor de las proyecciones de los tallos de la planta conocida como vara de oro (Solidago canadensis, L. ó Solidago altissima L.) del este de Canadá y Estados Unidos (Vasey y Ritter, 1987). Los géneros de mayor importancia económica, ya que tienen una gran variedad de hospederos distribuidos en diferentes lugares del mundo, son: Ceratitis, Bactrocera (Dacus), Anastrepha, Rhagoletis y Toxotrypana (Enkerlin et al., 1989; HernándezOrtiz, 1996). Los adultos de estas especies dañan los frutos cuando ovipositan en ellos, causándoles manchas y decoloración en su superficie, lo cual es producto de los cambios fisiológicos y bioquímicos que ocurren en el sitio de la oviposición. Durante su desarrollo la larva consume el tejido interior de los frutos y forma canales por donde pueden ingresar patógenos, provocando la necrosis de los frutos y su pérdida total (White y Elson-Harris, 1992; Howse et al., 1998). Para combatir estas moscas tradicionalmente se han utilizado insecticidas sintéticos, aún con sus repercusiones económicas y ecológicas (Enkerlin et al., 1989). Por ello en la actualidad se buscan diferentes alternativas. Una de ellas consiste en la utilización de modificadores químicos del comportamiento, aprovechando sustancias 2

Introducción General

que normalmente participan en la comunicación química de los tefrítidos, permitiendo el desarrollo de estrategias más eficientes y de menor impacto ambiental, para lograr su detección, monitoreo y control (Jang y Light, 1996; Heath et al., 1996; Aluja et al., 1997b; Heath et al., 2000). Esto último ha propiciado el interés por investigar cómo son mediadas químicamente las relaciones intraespecíficas e interespecíficas de este grupo de insectos, en particular aquellas relativas a su comportamiento sexual (Chuman et al., 1987; Jang et al., 1989; Jones, 1989; Howse et al., 1998). Los compuestos que intervienen en estas relaciones son conocidos como semioquímicos, los cuales son usualmente mezclas de varios componentes (Howse et al., 1998) que modifican el comportamiento y la fisiología de los insectos que los reciben y pueden ser clasificados como feromonas y aleloquímicos (Dicke y Sabelis, 1988; Howse et al., 1998). El empleo exitoso de modificadores químicos del comportamiento para el manejo de poblaciones de insectos plaga requiere de estudios sobre su biología y en particular sobre los elementos que participan químicamente en sus relaciones (Jang y Light, 1996). El sistema de comunicación química sexual de los tefrítidos, de manera esquemática, está formado por tres elementos principales: 1) el mensaje (mezcla de compuestos químicos), que puede venir acompañado de otros compuestos en el medio ambiente (nivel de ruido) y es transportado por un vehículo (e.g. viento); 2) el emisor (glándulas del macho, en la mayoría de los tefrítidos), que dependiendo de su estado fisiológico es el encargado de la producción y liberación del mensaje y 3) el receptor (sénsulos antenales de la hembra), encargado de la recepción de la señal y de su envío al sistema

nervioso

para

su

procesamiento

y

generación

de

la

respuesta 3

Introducción General

correspondiente (Nation, 2002). 1. El mensaje. Feromonas sexuales de tefrítidos Las feromonas sexuales son señales químicas que median el comportamiento sexual de los insectos de una especie, tienen una composición y proporción de componentes característica. Estas feromonas pueden ser atractivas para ambos sexos, aunque su principal función parece ser la atracción de parejas potenciales (Landolt y Averill, 1999). Funcionan a la distancia e inducen la orientación y provocan respuestas de atracción, también pueden participar en el cortejo y eventualmente propiciar la copulación (Nordlund y Lewis, 1976; Dicke y Sabelis, 1988; Landolt y Averill, 1999). En los tefrítidos son los machos los que producen y liberan las feromonas sexuales, a excepción de Bactrocera oleae (Gmelin) (Jang y Light, 1996; Landolt y Averill, 1999). En la mayoría de estas moscas, las feromonas son mezclas complejas de compuestos químicos altamente específicos (Tumilson, 1989; Heath et al., 2000), por lo que se conoce sólo parte de ellas en algunas especies. Son relativamente pocas las especies de tefrítidos, comparativamente con otros grupos de insectos (e.g. lepidópteros), en las cuales se han aislado, identificado y verificado la actividad biológica de los químicos que constituyen sus feromonas sexuales (Heath et al., 2000). Una de las características químicas más importantes de las feromonas sexuales de tefrítidos, es su alta volatilidad. Esta propiedad les permite ser transportadas fácilmente en el aire. No existe un grupo químico en particular característico de esta familia, aunque estos compuestos son moléculas de bajo peso molecular (PM~200). Su naturaleza química es bastante variada, incluyen desde hidrocarburos 4

Introducción General

insaturados, aldehídos, cetonas, alcoholes, éteres, ésteres, ácidos carboxílicos, epóxidos, lactonas, terpenos, sesquiterpenos y compuestos heterocíclicos (Jacobson et al., 1973; Battiste et al., 1983; Haniotakis et al., 1986; Chuman et al., 1987; Jang et al., 1994; Raptopoulos et al., 1995; Heath et al., 2000; Nation, 2002; CastrejónGómez, 2006). Es posible que algunos compuestos sean característicos de varias especies de la misma familia, pero en cada caso se presenten en distintas proporciones (Nation, 2002). Las especies más estudiadas desde el punto de vista de la composición química de su feromona sexual, son Ceratitis capitata (Wiedemann), Bactrocera carambolae (Drew & Hancock), Bactrocera dorsalis (Hendel), B. oleae, Anastrepha fraterculus (Wiedemann), Anastrepha ludens (Loew), Anastrepha serpentina (Wiedemann), Anastrepha suspensa (Loew), Rhagoletis cerasi (L.) y Toxotrypana curvicauda (Gerstaecker). En el Cuadro 1.1 se presentan algunos ejemplos de compuestos detectados en las emisiones de machos de las especies mencionadas. Aunque este tipo de compuestos se han encontrado en las emisiones de los machos o en extractos glandulares, sólo para algunos se ha probado un efecto biológico en hembras. La mayoría de los bioensayos se han realizado con extractos glandulares e.g. Bactrocera tryoni (Froggatt) (Fletcher, 1969) y A. fraterculus (Lima et al., 2001). Para identificar los elementos activos en una mezcla de extractos de las emisiones de macho se han realizado estudios de electroantenografía acoplada a cromatografía de gases (EAG-CG). Mientras que para verificar el efecto biológico de compuestos individuales o mezclas se han realizado estudios de electroantenografía (EAG), túnel de viento y en campo. 5

Introducción General Cuadro 1.1. Compuestos identificados en feromonas sexuales de tefrítidos. Especie

B. dorsalis

 

Principales compuestos de la

Peso

feromona sexual

molecular

(E,E)-2-Etil-8-metil-1,7-dioxaspiro[5.5] undecano

           198.3 

Referencia

  Perkins et al., 1990

B. oleae

R-(1,7)-dioxaspiro [5.5] undecano

156.22

Haniotakis et al., 1986

B. carambolae

6-oxo-1-nonanol N-3-metilbutil acetamida

158.24 129.2

Wee y Tan, 2005

C. capitata

E-6-nonen-1-ol geranil acetato E-E-α farneseno etil (E)-3-octenoato 2,6-Dimetil-2,7-octadien-6-ol indol

142.24 196.29 204.35 170.25 154.25 117.14

Jacobson et al., 1973 Jang et al., 1994

A. ludens

(Z)-3-nonen-1-ol (Z,Z)-3,6-nonadien-1-ol

142.24 140 .22

Rocca et al., 1992

A. suspensa

hexahidro-4,7a-dimetil-4vinilbenzofuran- 2(3H)-ona

194.27

Battiste et al., 1983

A. serpentina

butirato de etilo 2,6 dimetil pirazina etil hexanoato 2,3,5-trimetil pirazina limoneno etil octanoato

116.16 108.14 144.21 122.16 136.24 172.26

Castrejón-Gómez, 2006

 

 

R. cerasi

ácido octadecanóico, ácido nonadecanóico, ácido eicosatetraenóico, ácido eicosapentaenóico, ácido eicosanóico, ácido docosanóico

284.48 298.50 304.47 302.45 312.53 340.58

Raptopoulos et al., 1995

T. curvicauda

2-metil-6-vinilpirazina

120.15

Chuman et al., 1987

 

Cossé et al., 1995

 

Como ejemplo pueden mencionarse los estudios de EAG-CG en C. capitata (Cossé et al., 1995) y A. serpentina (Castrejón-Goméz, 2006); bioensayos de EAG en C. capitata (Levinson et al., 1987; Jang et al., 1989) y R. cerasi (Raptopoulos et al., 1995); bioensayos en túnel de viento en B. carambolae (Light et al., 1999; Wee y Tan, 2005), C. capitata (Heath et al., 1991; Landolt et al.,1992a ; Flath et al., 1993; Jang et al., 1994) y T. curvicauda (Chuman et al., 1987) y captura en campo en C. 6

Introducción General

capitata (Baker et al., 1990; Heath et al., 1991), B. oleae (Mazomenos y Haniotakis, 1985) y T. curvicauda (Landolt et al., 1988; Heath et al., 1996). 2. El emisor. Glándulas productoras de feromona sexual en tefrítidos Las células de las glándulas productoras de feromonas en tefrítidos pueden ser especializadas y formar un epitelio secretor o bien grupos de células que integren un tejido glandular complejo (Nation, 2002). Estas células tienen membranas apical y basal

bien

diferenciadas;

en

ocasiones

presentan

también

membranas

intersegmentales y la epicutícula está perforada externamente para la difusión de las secreciones. Estas células tienen espacios extracelulares con morfología tubular o lamelar, con retículo endoplasmático liso (REL) bien desarrollado y retículo endoplasmático rugoso (RER) ubicado cerca del aparato de Golgi, donde se almacenan las substancias de secreción. La abundancia, el tamaño y la complejidad de las mitocondrias y las vesículas están relacionados con el tipo de secreción feromonal (Ma y Ramaswamy, 2003). Las glándulas de feromona sexual descritas en los tefrítidos son clase I (Ma y Ramaswamy, 2003), según el esquema de Noirot y Quennedey (1974), basado en la ruta que siguen las secreciones feromonales para cruzar la cutícula. En los tefrítidos, las glándulas productoras de feromona sexual se localizan en la parte

abdominal

y

son

tejidos

compuestos

de

células

epidermales

ultraestructuralmente modificadas (Nation, 2002). El desarrollo glandular está directamente relacionado con la madurez de las moscas, e.g. en A. suspensa el crecimiento de las glándulas pleurales, está correlacionado con el comienzo del comportamiento sexual y la liberación de feromona (Nation, 1989).

7

Introducción General

3. El receptor. Estructuras receptoras de feromona sexual en tefrítidos Las antenas son las estructuras más importantes involucradas en la recepción y procesamiento químico olfativo de los insectos. El comportamiento alimentario y reproductor de éstos, depende en forma importante de los estímulos químicos que reciban (e.g. volátiles de plantas y feromonas) (Rice, 1989). El sénsulo es la unidad estructural y funcional de los órganos sensoriales de los insectos (Frazer, 1985). Los sénsulos proporcionan información importante de su ambiente interno y externo, sus neuronas receptoras están localizadas muy cerca del sitio estimulado y están conectados a su sistema nervioso central (SNC) (Nation, 2002). Existen seis tipos de sénsulos externos en el cuerpo de los insectos, su designación incluye la forma de su cutícula, la presencia o ausencia de poros y el tipo de base (Zacharuk, 1980; Frazer, 1985; Keil, 1999). Los dos primeros son sin poros, uno tiene la base flexible con una célula sensorial de cuerpo tubular, la otra tiene una base fija y una célula sensorial con una dendrita lamelada. Los dos siguientes contienen un solo poro, uno tiene la base flexible con una célula sensorial de cuerpo tubular y una o más células con dendritas extendidas hacia la parte terminal del poro, la otra tiene una base fija con dos o más células sensoriales con dendritas no ramificadas. Los dos últimos contienen múltiples poros, uno tiene pared sencilla y múltiples células con dendritas ramificadas, la otra tiene doble pared múltiples células con dendritas no ramificadas (Frazer, 1985). Según la forma de su proyección cuticular, se han reportado 4 tipos de sénsulos en las antenas de tefrítidos: los tricoideos (cortos y largos), basicónicos (cuatro tipos),

8

Introducción General

clavados y estilocónicos (Rice, 1989). También se ha reportado un orificio funicular característico cerca de la base, que en su interior contiene sénsulos. Para comprender los mecanismos de procesamiento y el comportamiento asociado a ellos, es necesario conocer la morfología y los tipos de sénsulos que constituyen sus antenas (Rice, 1989). Los estudios realizados se han enfocado a la morfología antenal, topografía y ultraestructura de los sénsulos, en busca de dimorfismo sexual relacionado con la recepción de los compuestos feromonales emitidos. Sin embargo, si son encontradas diferencias, éstas no son suficientes para explicar la respuesta a los estímulos químicos, ya que la diferencia sexual también o únicamente puede estar a nivel neurofisiológico (Rice, 1989). El procesamiento de la información sensorial de las sustancias volátiles se lleva a cabo en la vía olfatoria (Figura 1.1).

Figura 1.1. Vía olfatoria. Estructuras involucradas en el procesamiento de información sensorial química (modificado de Anton y Homberg, 1999). Neuronas receptoras olfatorias (NROs).

Esta vía está formada por tres elementos básicos: la antena, el nervio antenal y el lóbulo antenal. En la antena los sénsulos tienen un complejo de neuronas receptoras 9

Introducción General

olfatorias (NROs) y células auxiliares, que reciben y transmiten las señales hacia el lóbulo antenal a través del nervio antenal, específicamente a los glomérulos olfatorios e interneuronas del lóbulo, las cuales integran información y la proyectan a otras partes del cerebro, para que se den las respuestas motoras correspondientes (Anton y Homberg, 1999; Keil, 1999).

4. Modelo de estudio Toxotrypana curvicauda El modelo de estudio revisado en esta tesis es T. curvicauda, conocida comúnmente como la mosca del fruto de la papaya (Carica papaya L.). Esta especie está distribuida en las zonas tropicales y subtropicales de América, incluyendo las islas del Caribe (Landolt, 2000). En México se ha reportado en los estados de Morelos, Oaxaca, Tamaulipas y Veracruz (Castrejón-Ayala, 1987; Aluja et al., 1997a; Norrbom, 2004). Además de los frutos de papaya, también se ha reportado que oviposita en algunos frutos silvestres como el cuaguayote (Jacaratia mexicana, Aubl) (Castrejón Ayala y Camino, 1991), el talayote (Gonolobus sorodius, Gray) (Castrejón Ayala y Camino, 1991) y tasi o doca (Morrenia odorata, Lindley) (Landolt, 1994). T. curvicauda se caracteriza por ser química y visualmente especialista, puede aparearse directamente sobre el sustrato de oviposición. Los machos llegan a la plantación y establecen territorios en los frutos hospederos (Landolt y Hendrichs, 1983). En los frutos muestran un comportamiento de llamado en el que liberan una feromona sexual para atraer a las hembras; en respuesta a ésta, las hembras arriban a los frutos y los machos las cortejan y eventualmente se presenta la copulación (Landolt et al., 1985; Sivinski y Burk, 1989). En el comportamiento de llamado (ver Figura 1.2), los machos se colocan con sus

10

Introducción General

patas extendidas en el fruto u otra parte de la planta hospedera y presentan un hinchamiento de la región pleural, elevan la región abdominal y mueven vigorosamente sus alas, lo que podría ayudar a la dispersión de los volátiles de sus emisiones y a la emisión de sonidos que formen parte del cortejo (Landolt y Hendrichs, 1983).

Figura 1.2. Macho de T. curvicauda en el “llamado sexual” en el campo.

Subsecuentes estudios en el laboratorio demostraron que las hembras eran atraídas por los volátiles que los machos emiten durante el llamado (Landolt et al., 1985). Posteriormente Chuman et al. (1987) identificaron a la 2 metil-6-vinil pirazina (2,6 mvp) como el único compuesto feromonal (mensaje). Después en varios estudios realizados para probar su efecto biológico en laboratorio (análisis con túnel de viento) (Landolt y Heath, 1988; Landolt et al., 1992b) y su efecto atrayente en campo (uso en trampas) (Landolt et al., 1988; Heath et al., 1996; Aluja et al., 1997b) se empleo el sintético de esta pirazina, obteniéndose atracción en el laboratorio, pero resultados poco consistentes con las capturas en campo (Heath et al., 1996).

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Introducción General

Landolt y Heath (1988) reportaron que las respuestas de atracción de las hembras a la 2,6 mvp, coincidían con la maduración de sus huevos. Ellos utilizaron un dispositivo liberador para la 2,6 mvp (estimulo químico) y trampas adhesivas en forma de esfera verdes (estímulo visual). Este sistema fue efectivo en la captura de hembras vírgenes y hembras que habían copulado en campo. Este mismo sistema se utilizó en Guatemala y Costa Rica (Landolt et al., 1991) obteniendo resultados similares. Sin embargo, el manejo de las trampas era problemático. Por lo que Heath et al. (1996) mejoraron el sistema de trampeo, en particular el sistema de liberación e hicieron trampas menos caras, más durables y manejables siempre empleando un sólo compuesto como atrayente. Esta pirazina no está disponible en el mercado, por lo que es necesario sintetizarla para realizar bioensayos. No obstante todos estos estudios, no se ha establecido si existen otros compuestos de la mezcla emitida por los machos que sean biológicamente activos, como sucede con otros tefrítidos. No se ha estudiado la respuesta antenal a la 2,6 mvp con estudios de EAG, ni se sabe si su liberación ocurre a una tasa constante desde que el macho inicialmente presenta el comportamiento de llamado, tampoco se ha establecido si la presencia de hembras sexualmente maduras, la de machos y el fruto hospedero, afecta la tasa de liberación de la misma. Con respecto a la estructura productora de la feromona sexual, Castrejón et al. (1997) reportaron que los machos de T. curvicauda tienen glándulas salivales sexualmente dimórficas y sugirieron la presencia de un epitelio de tipo pleural, pero no estudiaron su estructura fina y no establecieron si en esos tejidos se encuentra el componente principal de la feromona sexual.

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Introducción General

Para las antenas de T. curvicauda, se han reportado cuatro tipos de sénsulos, según la clasificación basada en la presencia de poros y tipo de pared (Rojas et al., 2001). Sin embargo, no se ha determinado el número y tipo de sénsulos funiculares y si existe dimorfismo sexual a este nivel.

5. Justificación y objetivos El desarrollo y la implementación de alternativas basadas en el empleo de feromonas y otros modificadores químicos del comportamiento de T. curvicauda, podrían permitir su detección, monitoreo y eventualmente su control (Jang y Light, 1996) por lo que es necesario conocer con detalle los procesos y estructuras que median químicamente su comportamiento sexual. Este trabajo aborda aspectos importantes de la comunicación química sexual de T. curvicauda: los constituyentes químicos de las emisiones de los machos (mensaje), la estructura productora en los machos (emisor/transmisor) y la estructura receptora de ella en las hembras (receptor). Además del estudio de algunos factores (fruto y coespecíficos) que podrían influenciar la tasa de liberación de esta feromona. El objetivo general de este trabajo es proporcionar información acerca del sistema de comunicación química sexual de T. curvicauda y de los elementos que participan en éste. Los objetivos particulares son los siguientes: 1) Analizar la composición química de las emisiones de machos de T. curvicauda, mediante microextracción en fase sólida (MEFS) y cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG/EM). 13

Introducción General

2) Realizar la síntesis de la 2,6 mvp y probar su actividad biológica mediante bioensayos con EAG y túnel de viento. 3) Conocer el efecto de la edad sobre la liberación de la 2,6 mvp los 13 días siguientes a la emergencia de los adultos. 4) Estudiar el efecto del fruto hospedero, hembras y machos en la liberación de la 2,6 mvp. 5) Estudiar la composición química de extractos de glándulas salivales abdominales y del epitelio pleural de machos de T. curvicauda. 6) Estudiar la morfología e histología de las glándulas salivales abdominales y el epitelio pleural de machos T. curvicauda. 7) Estudiar la morfología de las antenas y los sénsulos funiculares de hembras y machos de T. curvicauda.

Los objetivos 1 y 2 se abordan en el capítulo 2; el 3 y el 4 en el capítulo 3; los correspondientes al 5 y 6 en el capítulo 4 y el 7 en el capítulo 5.

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Capítulo 2

Composición química de las emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2-metil-6-vinil pirazina

Composición química de las emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2,6mvp

1. Introducción Las feromonas sexuales son señales químicas que median el comportamiento sexual de los insectos de una especie y que tienen una composición y proporción de componentes característica. Estas feromonas pueden funcionar a la distancia e inducir la orientación ó provocar respuestas de atracción en el sexo opuesto y participar en el cortejo (Landolt y Averill, 1999). La mayoría de las feromonas sexuales de los tefrítidos están constituidas por varios compuestos; en estudios realizados para verificar la actividad biológica, las moscas de algunas especies respondieron al componente principal o a parte de la mezcla feromonal y en otras sólo la mezcla completa con los compuestos en proporciones adecuadas, pudo atraer a la pareja potencial (Nation, 2002). Lo anterior ha dificultado el manejo de los compuestos feromonales en campo (Raptopoulos et al., 1995). Aunque existe bastante información sobre la composición química de los compuestos emitidos por los machos, poco se conoce acerca de su función como feromonas, debido a que muchos compuestos no se encuentran disponibles comercialmente. Existen reportes de los volátiles emitidos durante el comportamiento sexual de C. capitata, B. oleae, R. cerasi, A. suspensa, A. ludens, Anastrepha obliqua (Macquart), A. fraterculus, Anastrepha striata (Schiner), A. serpentina y T. curvicauda. En el caso de C. capitata, se han aislado e identificado un gran número de compuestos (más de 75) de extractos de machos o de los compuestos emitidos, como posibles componentes de su feromona sexual (Landolt y Averill, 1999; Heath, et al., 2000); sin embargo, en pocos de ellos se ha demostrado su capacidad atrayente. Entre los principales componentes identificados se encuentran terpenos (e.g. linalol), ácidos carboxílicos (e.g. E2-ácido hexanoíco), ésteres (e.g. etil-316

Composición química de las emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2,6mvp

octanoato), un compuesto imino cíclico (delta-pirrolino), una pirazina (2-etil- 3,5 dimetil-pirazina) y una furanona (dihidro-3-metilfuran-2(3,H)-ona) (revisado por Heath et al., 2000). Las mezclas feromonales de Bactrocera están constituidas por amidas, pirazinas y espiroacetales. Para las hembras de B. oleae el principal componente de la mezcla es el espiroacetal (R-(1,7)-dioxaspiro [5.5] undecano) conocido como R-olean, además de otros tres compuestos, un terpeno (α-pineno), un alcohol (nonanol) y un éster (etil-dodecanoato) (Haniotakis et al., 1986). La mezcla racémica (R y L) fue atractiva a los machos de B. oleae en estudios de laboratorio y campo (Haniotakis et al, 1991; Haniotakis y Pitarra, 1994). En R. cerasi, Raptopoulos et al. (1995) identificaron 75 compuestos en extractos de volátiles de machos con CG/EM, de los cuales 27 provocaron respuesta electrofisiológica, entre los compuestos identificados se encuentran los ácidos carboxílicos listados en el Cuadro 1.1. Las especies del género Anastrepha se caracterizan por compartir algunos compuestos químicos en distintas proporciones, como son los compuestos de tipo terpénico (e.g. ocimeno), alcoholes (e.g. nonenol), ésteres (e.g. etil octanoato) y lactonas (anastrefín y epianastrefín) (revisado por Heath, et al., 2000), además de algunas pirazinas (e.g. 2,3,5-trimetilpirazina y 2,6 dimetil pirazina) (Lima, et al., 2001; Castrejón-Gómez, 2006). Sin embargo, sólo para algunos compuestos se ha demostrado su actividad biológica. En estudios de electrofisiología y de comportamiento en el laboratorio con A. ludens, se observó que las hembras respondieron a una mezcla de cuatro enantiómeros de las lactonas y al combinarlos

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Composición química de las emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2,6mvp

con dos alcoholes, el (Z)-3- nonenol y el (Z-Z)-3,6-nonadienol (Robacker y Hart, 1985) se obtuvo un efecto aditivo (revisado por Nation, 1989). En estudios previos con T. curvicauda, Chuman et al. (1987) aislaron e identificaron una pirazina, la 2-metil-6-vinil pirazina (2,6 mvp), como el único componente de su feromona sexual y lo sintetizaron en tres pasos: 1) la producción de 2-metil-6dimetilaminoetilpirazina a partir de 2-6-dimetilpirazina (con reflujo); 2) Ioduro de 6metilpirazil trimetilamonio (la conversión de la sal) y 3) obtención de la 2-metil-6-vinil pirazina. Posteriormente se realizaron una serie de estudios en el laboratorio (Landolt y Heath, 1988; Landolt et al., 1992b) y en campo (Landolt et al., 1988; Heath et al., 1996) con los cuales probaron que esta pirazina fue parcialmente atractiva. En este trabajo se proponen formas de extracción y síntesis, basadas en tecnologías actuales, MEFS (que permite la captura de volátiles directamente de las emisiones) y “one pot” (procedimiento para hacer más eficientes las reacciones químicas de síntesis) (Escalante y Coutiño, 2008), respectivamente. Los objetivos de este trabajo fueron: 1) Analizar la composición química de las emisiones de machos de T. curvicauda, mediante MEFS y CG/EM. 2) Realizar una nueva síntesis de la 2,6 mvp y probar su actividad biológica mediante bioensayos con EAG y túnel de viento.

2. Materiales y Métodos 2.1. Insectos Se obtuvieron larvas de T. curvicauda de papayas parasitadas, provenientes de una pequeña plantación ubicada en Yautepec, Morelos, México (entre los 18°05’ de

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Composición química de las emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2,6mvp

latitud norte y los 99°03’ de longitud oeste; 1100 msnm). Las larvas se colocaron en tierra cernida y esterilizada, una vez que emergieron los adultos se mantuvieron en una cámara de cría (25°C de temperatura, 50-60% de humedad relativa y ciclo de luz-oscuridad 12-12 h). En todos los experimentos se emplearon hembras y machos recién emergidos, los cuales se mantuvieron separados por sexo al emerger y hasta completar el experimento, con suficiente agua y azúcar como alimento. También estuvieron aislados de los olores, en cámaras de cría diferentes, hasta iniciar cada experimento.

2.2. Extracción e identificación de compuestos volátiles 2.2.1. Colecta de volátiles con microextracción en fase sólida Machos de 3, 5 y 7 días de edad adulta (N=9, por edad) fueron colocados individualmente en viales de vidrio transparente de 40 ml con tapa de rosca y septa PTFE/silicón (27089-U, Supelco, EUA) y los compuestos volátiles que emitieron durante el “llamado” sexual fueron capturados mediante MEFS, con una fibra de 65 μm PDMS/DVB (57326-U, Supelco, EUA) durante tres horas a 25°C, de 12 - 15 h (periodo de mayor actividad en la plantación, de acuerdo a Castrejón,1987). Una vez capturados los compuestos, se realizó el análisis con CG/EM. Los resultados de estas muestras se utilizaron para la identificación de los volátiles emitidos por los machos. 2.2.2. Obtención de extractos con aeración dinámica (Súper Q) Se colocaron 10 machos de 5-7 días de edad (N=4), en un recipiente de vidrio para la colección de sus volátiles (Heath y Manukian, 1992). El sistema consistió de una cámara de vidrio (30 cm longitud y 4 cm de diámetro exterior) que en la entrada tiene

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Composición química de las emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2,6mvp

adaptado un filtro de carbón activado humedecido (limpieza de aire de entrada) y en la salida tiene un conector de vidrio, el cual tiene adaptado un filtro con 250 mg del material adsorbente Super Q (SQ) 80/100 (Alltech Assoc, Inc., EUA) 3). El sistema se conectó a una bomba de vacío (flujo 1l /min) y los compuestos capturados se eluyeron con 500 µl de hexano (HPLC, JT Baker, EUA). Posteriormente se realizó una reconcentración del extracto con corriente de nitrógeno hasta llegar a 100 µl. Este extracto fue usado para el análisis químico y para los bioensayos de EAG. La muestra se almacenó a 4°C hasta su utilización en los bioensayos. 2.2.3. Análisis químico e identificación de los compuestos volátiles El análisis químico de los compuestos volátiles adsorbidos por la fibra (MEFS), el extracto hexánico de SQ (volumen de inyección 1 µl) y la 2,6 mvp sintética (volumen de inyección 1 µl), se efectuó en un equipo de CG/EM (HP 6890/5972), con una columna no polar HP 5MS (30 m, diámetro interno de 250 µm y espesor de película de 0.25 µm) (Agilent, EUA). La temperatura inicial del horno fue de 60°C, posteriormente se incrementó 30°C/min hasta 200°C, en la cual se mantuvo durante 2 min. Se utilizó como gas acarreador helio a un flujo constante de 1 ml/min. La temperatura del inyector fue de 250°C y del auxiliar de 280°C, el inyector se trabajó en modo Splitless durante 0.30 min. El EM se trabajó en ionización electrónica (70 EV), en modo SCAN y en un intervalo de masas de 35 a 550 UMA, provisto de una biblioteca espectral (Wiley175, NIST). La identificación de los compuestos se llevó a cabo considerando sus tiempos de retención, la evaluación de sus espectros de masas, la comparación con la biblioteca espectral y con la inyección del estándar de referencia (compuesto sintetizado).

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Composición química de las emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2,6mvp

Para el análisis cuantitativo se utilizó el estándar de referencia, con el cual se elaboró una curva de calibración, a las siguientes concentraciones: 187, 375, 1126, 1500 y 3500 ng, empleando la ecuación: Y = a+bx; parámetros, a = 7.45667e+006, b = 2.0026e+007.

2.3. Síntesis de la 2-metil-6-vinil pirazina En un vial de 10 ml con agitación magnética, se colocaron 324 mg (3 mmol) de 2,6dimetilpirazina, 244 mg (3 mmol) del clorhidrato de la dimetilamina y 105 mg (1.16 mmol) de paraformaldehido. A esta mezcla se le adicionaron 2 ml de agua y la suspensión se colocó en un equipo de microondas presurizado bajo las siguientes condiciones de reacción: 100 oC y 100 Watts de potencia por un período de 2 h. Una vez transcurrido este tiempo, se le adicionaron 5 ml de agua al crudo de la reacción y esta mezcla se extrajo con éter etílico (10 ml X 5) y las fases etéreas resultantes se secaron con sulfato de magnesio; el material resultante se filtró y concentró en un rotavapor para producir 280 mg del crudo de la reacción. El producto se purificó por cromatografía en columna empleando éter como solvente de elusión. Se aislaron 140 mg de un aceite incoloro, posteriormente se realizó el análisis espectroscópico mediante

RMN

y

se

hizo

una

dilución

1µg/ml

para

el

análisis

cromatográfico/espectrométrico, descrito en la sección 2.3.3. Para confirmar que la sustancia sintetizada era la 2,6 mvp, se analizó con resonancia magnética nuclear (RMN), para lo cual se utilizaron 28 mg de estándar/0.6 ml de cloroformo deuterado (99.8%, Cambridge Isotope; Lab.Inc. EUA), con un equipo RMN-transformadas de Fourier, Inova Varian de 200 MHZ protón y 50 MHZ C13.

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Composición química de las emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2,6mvp

2.4. Actividad biológica de las emisiones de los machos y la 2,6 mvp sintética 2.4.1. Evaluación mediante electroantenografía. La cabeza de las hembras se cortó con unas tijeras de disección y se insertó en el extremo alargado de un capilar de vidrio, al cual se le colocó un alambre de plata en la parte posterior para que actuara como electrodo de referencia. La parte distal del funículo se insertó en otro capilar de vidrio, al cual también se le insertó alambre de plata para que funcionara como electrodo de registro. Ambos electrodos contenían solución salina (NaCl, 7.5 g; CaCl2, 0.21 g; KCl, 0.35 g; NaHCO3, 0.20 g y 1l de H2O). Los electrodos se conectaron a un equipo de registro y análisis de señales electroantenográficas Syntech (Holanda). Esta parte del trabajo se realizó en el Laboratorio de Ecología química del ECOSUR-Tapachula, con la asesoría del Dr. Julio Rojas. Sobre una pieza de papel filtro de 3 x 20 mm (Whatman No. 1) se aplicaron, por separado: 1) 2µl de hexano (HPLC, J.T. Baker, EUA), 2) 2µl del extracto hexánico de SQ (≈10 µg/µl de 2,6 mvp) y 3) 2µl de 2,6 mvp sintética (10 µg/µl). En cada caso, se dejaba evaporar el disolvente durante 20 s. Para la estimulación de la antena, una corriente de aire puro humidificado (0.7 l/min) se dirigió hacia ésta a través de un tubo de vidrio en forma de L (12 x 12 cm y de 1 cm d.i.) mediante una bomba de aire (CS-05, Syntech). La pipeta que contenía un papel filtro, impregnado con los compuestos a evaluar, se insertó en el orificio que se encontraba en uno de los extremos del tubo de vidrio en forma de L. El estímulo se aplicó mediante la activación de un flujo de aire de 0.5 l/min, que arrastraba los vapores de cada uno de los compuestos cargados en el papel filtro y los llevaba a la antena del insecto. La duración del estímulo fue de 1 s. Primero se estimuló con 22

Composición química de las emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2,6mvp

hexano como control, y luego con el extracto y la pirazina en forma alternada para cada antena. Para el análisis de datos se consideraron los valores de despolarización para cada compuesto, en total se utilizaron 6 antenas diferentes, provenientes de 6 moscas de 6-9 días de edad. 2.4.2. Evaluación en túnel de viento Los bioensayos se realizaron en un túnel de viento de plexiglás transparente (120 x 30 x 30 cm) similar al utilizado por Robacker (1999) para bioensayos con semioquímicos en otras moscas de la fruta. El túnel fue iluminado con cuatro lámparas fluorescentes (Phillips, México) colocadas en la parte superior del mismo, las cuales proporcionaron una iluminación de 1900 ± 13.97 luxes (promedio ± ESM) (N=17). El flujo de aire en el túnel fue de 0.4 m/s provisto por un extractor. Todas las pruebas se realizaron a una temperatura de 25 ± 2°C, y humedad relativa de 55 ± 5%. Se probaron tres estímulos: 1) hexano, como control, 2) 4 machos vivos llamando y 3) 2,6 mvp sintética (10 µg/µl, aproximadamente 2.5 µg equivalente macho). Cada estímulo por separado, se colocó en la entrada del flujo de aire, en un tubo de acrílico (φ=3 cm, h= 8 cm) con malla en ambos lados para permitir el flujo de aire hacia la parte final del túnel, en donde se colocaron individualmente los individuos a evaluar. En cada ensayo, una hembra virgen de 6-9 días de edad se colocó cerca de la salida del aire, a la misma altura que el tubo de estímulos. La hembra se depositó en un tubo de acrílico (φ=3 cm, h= 8 cm) con un lado abierto y una vez liberada se observó durante 5 min. En total se emplearon 7 hembras diferentes para cada serie de estímulos. Para evaluar la respuesta de atracción se empleo una escala ordinal

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Composición química de las emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2,6mvp

de tres puntos. Se asignó 1 punto si la mosca voló o caminó en dirección al estímulo y llegó al menos al 2º tercio del túnel; se asignaron 2 puntos si la mosca voló o caminó en dirección al estímulo y llegó al 3º tercio del túnel y 3 puntos si la mosca se posó en el tubo que contenía los estímulos. 2.5. Análisis estadístico Los datos de la despolarización provocada en la antena de hembras por hexano, extracto hexánico de Super Q y 2,6 mvp sintética, se analizaron por medio de un análisis de varianza simple para medidas repetidas y las diferencias entre grupos se probaron con una prueba de Tukey. Los datos de las respuestas de atracción de hembras en túnel de viento provocadas por hexano, machos llamando y 2,6 mvp sintética, se analizaron con una prueba de Friedman y las diferencias entre grupos se probaron con una prueba de Student-Newman-Keuls. Todas las pruebas se realizaron con el programa SigmaStat V. 3.5.

3. Resultados 3.1. Identificación de los compuestos volátiles En la mezcla de compuestos emitidos por los machos (Figuras 2.1 y 2.3), después de restar los blancos (sangrados de la fibra y columna), se encontraron tres compuestos: a) la pirazina reportada anteriormente por Chuman et al. (1987), 2,6 mvp con el TR 2.34 ± 0.05 min como el componente mayoritario de la mezcla; para los individuos de tres días de edad, el promedio (± ESM) de captura fue de 670 ±120 ng/macho-h, para los de cinco días fue de 720 ± 190 ng/macho-h y para los de siete días fue de 950 ±130 ng/macho-h; b) la dimetil-2-pirazina ó 2 etenil-3-5dimetilpirazina (C8H10N2, PM 134.18) no reportada anteriormente, con un TR de 2.65

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Composición química de las emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2,6mvp

± 0.05 min (Figuras 2.1 y 2.3), los datos espectrales fueron las masas (m/z): 39(17%), 42(24%), 65(8%), 133(100%), M*134(66%) (Figura 2.2), con 90% de calidad comparado con los espectros de la biblioteca Wiley175, NIST y representó el 16% del área del componente principal y c) un terpeno en el TR de 4.45, este compuesto se presenta en mucho menor concentración (3% del área de la 2,6 mvp) que las pirazinas, por lo que no fue posible identificarlo completamente (Figura 2.1). En los análisis espectrométricos se encontraron dos posibles compuestos: el Dgermacreno (C15H24; PM 204.19; CAS 23986-74-5) y el β cubebeno (C15H24; PM 204.19; CAS 13744-15-5).

Figura 2.1. Cromatograma de las emisión (MEFS) del macho de 7 días de edad.

En los extractos de hexano de SQ se pudieron localizar las dos pirazinas, en menor concentración que la capturada con MEFS (ver Figura 2.3), por lo que se reconcentró con corriente de nitrógeno hasta lograr una concentración aproximada de 10µg/µl,

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Composición química de las emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2,6mvp

con el propósito de usarla en los bioensayos de túnel de viento. En la Figura 2.3 se observa que la captura con MEFS fue mayor que con la aeración dinámica (SQ).

Figura 2.2. Espectro de masas de la dimetil-2-pirazina.

Figura 2.3. Cromatogramas sobrepuestos de los extractos MEFS, STD (estándar de referencia) y SQ (extracto hexánico utlizando aeración dinámica). P1 (2,6 mvp) y P2 (dimetil-2-pirazina).

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Composición química de las emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2,6mvp

A

B

Figura 2.4. Cromatograma (A) y espectro de masas del estándar de referencia de la 2,6 mvp (B).

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Composición química de las emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2,6mvp

3.2. Identificación de la 2,6 mvp sintetizada El análisis cromatográfico/espectrométrico indicó que la substancia sintetizada era la 2,6 mvp ó 2 etenil-6-metil pirazina, la cual se presentó en el tiempo de retención (TR) 2.36 ± 0.05 (C7H8N2; PM120.15; CAS 13925-09-2) (ver cromatograma en la Figura 2.4 A), una pureza del 90%. Los datos espectrales fueron las masas (m/z): 39(21%), 52(48%), 54(18%) 94(13%), 119(33%), 120(100%) (ver espectro en la Figura 2.4B). Este compuesto fue usado como estándar de referencia.

2.56

8.4 8.3

6.79

6.33

5.6

Figura 2.5. Espectro de la 2,6 mvp sintetizada, 200MHz-[1H] RMN y esquema de la molécula 2,6 mvp, para la interpretación de los datos espectroscópicos

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Composición química de las emisiones y extractos de machos y bioensayos con la 2,6mvp

Con el análisis de RMN se confirmó que el compuesto sintetizado era la 2,6 mvp (Figura 2.5), con los siguientes resultados: 1H (CDCl3, 200 MHz) δ 2.56 (s, 3H), 5.60 (dd, J = 1.2 y 11.0 Hz, 1H), 6.33 (dd, J = 1.2 y 17.4 Hz, 1H), 6.79 (dd, J = 17.4 y 11 Hz, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.40 (s, 1H) (Figura 2.5). En el análisis de RMN dio como resultado: 13C (CDCl3, 50 MHz) δ 21.7, 120.5, 133.7, 139.7, 141.3, 150.0, 153.3. Como se observa en la Figura 2.5 en la región de 8.3 y 8.4 aparecen los hidrógenos del sistema aromático de la pirazina. En 6.79 ppm se desplaza el hidrógeno que se indica como número (5) en la estructura química: como un sistema doble de dobles con unas constantes de acoplamiento de Jgem(H5-H4) de 17.4 Hz y Jtrans(H5-H3) de 11.0 Hz. En 6.33 ppm el hidrógeno número (4): como un sistema doble de dobles con unas constantes de acoplamiento de Jgem

(H4-H5)

de 17.4 Hz y Jcis

(H4-H3)

de 1.2 Hz.

En Figura 2.5 se muestran: 5.60 ppm se desplaza el hidrógeno número (3): como un sistema doble de dobles con unas constantes de acoplamiento de Jtrans 11.0 Hz y Jcis

(H3-H4)

(H3-H5)

de

de 1.2 Hz. Finalmente el metilo aparece como una señal simple

en 2.56 ppm. 3.3. Respuestas electroantenográficas provocadas por el extracto de SQ y la 2,6 mvp sintética Como puede observarse en la Figura 2.6 la 2,6 mvp sintética y los extractos henánicos de SQ, provocaron una despolarización significativamente mayor que el hexano (control) (F5/17=7.4, p