Manual de Laboratorio de Microbiología Ambiental

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA

MANUAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

ELABORADO POR: Q.B.P. MIRIAM JUÁREZ JUÁREZ M. EN C. GLORIA LÓPEZ JIMÉNEZ. ING. VERONICA GABRIELA LUNA FONTAINE Q.F.B. MARÍA DE LOURDES MORENO RIVERA

Julio 2011

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Manual de Laboratorio de Microbiología Ambiental

ÍNDICE

NO. DE LA PRÁCTICA i

TITULO DE LA PRACTICA

PÁGINA

PRESENTACIÓN

1

ii

INSTRUCCIONES GENERALES

3

1

OBSERVACIÓN DE ORGANISMOS PROCARIOTES

5

2

TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS: TINCIÓNES

9

2

TECNICAS MICROBIOLÒGICAS: ESTERILIZACIÓN

15

2

TECNICAS MICROBIOLÒGICAS: CULTIVO

20

2

TÈCNICAS MICROBIOLÒGICAS: AISLAMIENTO

25

3

RUTAS METABÓLICAS: RESPIRACIÓN Y FERMENTACIÓN

31

4

CICLOS BIOGEOQUÍMICOS: CICLO DEL NITRÓGENO

39

5a

CRECIMIENTO MICROBIANO

43

5b

FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

49

6

MUESTREO, RECUENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DEL AGUA: INDICADORES SANITARIOS, BACTERIAS PATÓGENAS

55

7

MUESTREO, RECUENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DEL SUELO: 63 ACTINOMICETOS, CELULOLÌTICOS, AMILOLÌTICOS

8

MUESTREO, RECUENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DEL AIRE : 65 AUTÒTROFAS, HETERÓTROFAS, PATÒGENAS MEDIOS DE CULTIVO, COLORANTES Y REACTIVOS 68

APÉNDICE

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INSTRUCCIONES GENERALES DEL LABORATORIO 1.DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS DENTRO DEL LABORATORIO Se impartirán dos sesiones por semana de 1.5 horas cada sesión principiará y terminará a la hora indicada. Solo se tendrán 5 minutos de tolerancia después de esta no se puede entrar al laboratorio. Se tomara lista al inicio de la práctica. Se anotarán las faltas y asistencias com todo rigor y por ningun motivo se pondrán retardos Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la práctica y sin el consentimiento del profesor se considerara que no asistió a la práctica Las faltas en el laboratorio se calificarán con cero La asistencia al laboratorio es obligatoria, ya que uno de los objetivos del trabajo práctico es que El alumno adquiera habilidades y destrezas mediante estas experiencias . En caso de llegar tarde no se permitira la entrada a menos que sea discusión con su correspondiente falta. El reporte se entregará una semana después de realizada la discusión. El alumno utilizará el instructivo de laboratorio en cada sesión. Los datos obtenidos en la práctica se anotarán en la sección de reporte de datos de su manual. 2. NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO  El alumno asistirá al laboratorio con bata blanca debidamente abrochada.  No se permitirá utilizar pipetas sin su tapón de algodón.  En la zona de trabajo del laboratório no se permitirá comer, beber, fumar, jugar, guardar alimentos.  No se podrán utilizar celulares, audifonos, ipods, ni aplicar cosméticos.  Durante el desarrollo de la práctica queda prohibida la entrada a personas ajenas al grupo.  El laboratorio deberà mantenerse ordenado y limpio, retirando del mismo, cualquier material que no tenga relación con el trabajo.  Las superfícies de trabajo se descontaminarán al iniciar y terminar el trabajo de siembra.  Los alumnos se lavarán las manos antes y después de haber concluído el trabajo en el laboratorio.  Todo el material contaminado se descontaminarán o se esterilizaràn antes de ser eliminados o de volver a utilizarlos.  Sólo se permitirá el paso a la zona de trabajo del laboratorio a los alumnos inscritos. Durante el trabajo se mantendrán cerradas las puertas del laboratorio  Todos los accidentes y exposiciones a material infeccioso se notificarán inmediatamente al profesor responsable del grupo. Se realizara un protocolo por escrito de estos eventos.  Se prohíbe llevarse objetos o sustancias a la boca durante la pràctica.  Los artículos personales como bolsas, mochilas deberán colocarse en los lugares asignados.  Las personas con el cabello largo deberán traerlo amarrado o en su defecto utilizar una cofia.  Los hombres deben evitar la barba o bien usarla muy corta.  Todos los recipientes para almacenar sustancias deben estar etiquetados, los frascos sin etiqueta, cajas petri, matraces, tubos etc. que no tengan etiqueta serán automáticamente desechados.  Se proporcionarán recipientes adecuados para el material de desecho y el material de vidrio roto se colocará en un recipiente especial para ello,  Revisar que las llaves de agua y gas estén siempre bien cerradas al final de cada práctica.  Los medios de cultivo deberán estar tapados perfectamente para evitar su hidratación.  Utilizar un vidrio de reloj, papel aluminio o charolitas especiales para pesar, tomando las muestras con espátulas limpias. Después de utilizar la balanza, limpiar el platillo, con un pincel.  Si no se sabe utilizar algún equipo, solicitar apoyo al profesor antes de iniciar el experimento.

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3. EVALUACIÓN DE LABORATORIO. El laboratorio se evalúa de la siguiente manera: Trabajo práctico 4 puntos Cumplimiento de tareas 1 punto Reporte de la práctica 2.5 puntos Discusión 2.5 puntos Nota: Solo se promediará el laboratorio si aprueba la teoría. El reporte se evalúa en los siguientes aspectos: Objetivos y bibliografía 0.5 puntos Resultados y cuestionario 0.5 puntos Discusión y análisis de resultados 1.0 punto Conclusiones 0.5 puntos.  Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones prácticas, aprobar el 80% de las prácticas efectuadas y obtener un promedio mínimo de 6.  Al inicio de cada práctica, el alumno entregará un diagrama de bloques del trabajo que se desarrollará en el laboratorio, esta actividad se evaluará en lo que corresponde a cumplimiento de tareas.  La calificación del trabajo práctico se obtendrá promediando las sesiones de las que conste la práctica. Si el alumno no cumple en alguna de las 3 etapas, se le calificará con cero en la sesión correspondiente.  La calificación final del laboratorio será el promedio de las calificaciones de todas las prácticas.  Se subirán al SAES las calificaciones de las prácticas de laboratorio correspondientes a cada periodo de evaluación, para que se promedie con la calificación de teoría.  Si el alumno no asiste a una sesión tendrá cero en trabajo práctico, si la justifica se mantiene esa calificación pero no se contará la falta para el cómputo final de asistencias.  Se elegirá un reporte al azar de cada equipo, revisando que todos los miembros del equipo hayan elaborado el reporte. El alumno que no entregue reporte tendrá una calificación de cero.  A cada equipo le corresponderá esterilizar y lavar material utilizado en alguna de las prácticas, no deberá dejar el material rezagado en su gaveta ya que el material se utiliza constantemente. Si el material no es lavado por el equipo correspondiente tendrán una calificación de cero.

    

2. ORGANIZACIÓN CON LOS ALUMNOS 2.1 Para poder entrar al laboratorio el alumno deberá traer: Bata de algodón de manga larga con todos los botones, blanca, limpia, sin pintas. Manual de laboratorio engargolado Asa bacteriológica Una foto tamaño infantil. Marcador Indeleble

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2.2 Por equipo deberán traer: Un rollo de masking-tape ancho una caja de porta objetos Un frasco de barniz de uñas transparente Un metro de franela Encendedor Tijeras de punta recta

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Jabón para manos liquido Colores Rollo de papel sanitario Regla graduada Pinza de punta roma Ligas, 3 botes de lámina

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PRACTICA 1: OBSERVACIÒN DE ORGANISMOS PROCARIOTES 1.INTRODUCCIÓN La Microbiología es la ciencia que estudia los organismos que no se pueden distinguir a simple vista y para lo cual se necesita la ayuda de un microscopio. Entre los organismos microscópicos que estudia la Microbiología, se encuentran las bacterias, los mohos, las levaduras, los protozoarios y las algas. Los últimos cuatro grupos microbianos se estudiaron en el curso de Biología de Eucariotes. Cuando el estudio se enfoca a los organismos procariotes, se refiere particularmente a las bacterias. Las bacterias de acuerdo a la clasificación de los cinco reinos de Whittaker (1969), pertenecen al Reino Monera; según la clasificación de Margulis (1988) pertenecen al Dominio Prokarya y al Reino Bacteria. Para la observación de los organismos procariotes, se requiere un microscopio, debido al tamaño tan pequeño de ellos y para optimizar su observación se aplican algunos métodos para alinear los haces de luz que atraviesan las diferentes lentes de éstos microscopios. El método más utilizado es el de Khöler, y se aplica en microscopios de alta calidad para iluminar uniformemente y sólo la superficie necesaria de una preparación. De esta forma, no se utiliza iluminación innecesaria. Además, con este tipo de iluminación se evitan, en la medida de lo posible, reflejos de luz molestos, como los procedentes de las paredes interiores del tubo del microscopio. Las preparaciones perfectamente iluminadas son un requisito imprescindible para conseguir imágenes impecables. 2.OBJETIVO GENERAL Ajustar la iluminación de un microscopio compuesto por el método de Khöler, observar la morfología microscópica de organismos procariotes y comparar con la morfología microscópica de organismos eucariotes. 2.1 OBJETIVOS PARTICULARES: 1.- Ajustar la iluminación de la preparación de acuerdo al método de Köhler. 2.-Observar en el microscopio compuesto, las preparaciones fijas de bacterias teñidas con tinción simple y preparaciones frescas. 3.- Determinar la forma, agrupación y movilidad de los organismos procariotes 4.- Observar protozoarios y algas en diferentes muestras de agua. 3.MATERIAL Y REACTIVOS POR EQUIPO: Microscopio compuesto Aceite de inmersión Papel seda Portaobjetos Cubreobjetos Gotero con bulbo Pizetas con alcohol al 70% Preparaciones fijas de procariotes:  Escherichia coli  Bacillus subtilis  Desulfovibrio sp.  Staphylococcus sp.  Streptococcus sp. Material que deberá traer el equipo de alumnos  Agua de un lago  Agua de pecera  Agua de un charco

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4. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 4.1.- Cuidado y limpieza del microscopio 1.1 Limpiar las partículas de polvo, con un bulbo inyector de aire o un pincel. 1.2 Limpiar el ocular y el objetivo con papel seda humedecido con una mezcla de etanol al 40 %, éter al 20 %. 4.2.- Iluminación por el método de Köhler. El microscopio compuesto posee dos diafragmas: un diafragma de campo, situado a nivel de la lámpara y un diafragma de abertura, situado debajo del condensador. La técnica de Köhler, ajusta la apertura de ambos diafragmas para redireccionar los haces luminosos y optimizar la cantidad de luz en la muestra, por lo que se incrementa el contraste y la resolución de la muestra.  Luz amarilla (bajo voltaje)  Ajustar la distancia interpupilar  Ajustar las dioptrías  Abrir el diafragma de campo e iris  Subir completamente el condensador con la lente frontal introducida



Enfocar la preparación con el objetivo 4X ó 10X, ajustar la imagen con los tornillos macro y micrométrico



Observar y cerrar el diafragma dispuesto en el pie del microscopio



Bajar el condensador, hasta obtener la máxima nitidez de la imagen del diafragma (hexágono definido)



Centrar el diafragma de campo luminoso en el campo visual con los tornillos del condensador

Abrir el diafragma de campo luminoso casi hasta el borde del campo visual, centrando con la mayor precisión y abrirlo hasta que desaparezca detrás del borde del campo visual

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Regular el contraste de la imagen con ayuda del diafragma del condensador.

 Insertar el filtro azul, regular la intensidad de la luz con el control del voltaje Al cambiar de objetivo: enfocar con el micrométrico y regular la cantidad de luz con el diafragma del condensador.

4.3 OBSERVACIÓN DE PREPARACIONES FIJAS Enfocar las preparaciones fijas de células procariotes con el objetivo de 10X y 40X; una vez ubicado el frotis, colocar una pequeña gota de aceite de inmersión sobre el frotis y enfocar la preparación con el objetivo de 100X, cuidando de no tocar con el aceite los objetivos 10X y 40X. Realizar los dibujos en relación a la forma, agrupación, tamaño y movilidad de las células. 4.4 OBSERVACIÓN DE PREPARACIONES EN FRESCO Observación en fresco de bacterias 4.2.1 Colocar una gota de la suspensión de bacteria, con una pipeta Pasteur sobre un portaobjetos, colocando encima un cubreobjetos y observar con los objetivos 10X y 40X, dibujando lo observado. Observación en fresco del agua de lago, pecera, charco. 4.2.2 Colocar una gota del agua con una pipeta Pasteur sobre un portaobjetos colocando encima un cubreobjetos y observar con los objetivos 10X y 40X, dibujando lo observado. Nota: Realizar los dibujos en relación a la forma, agrupación y movilidad de las células. 5.- RESULTADOS Microorganismo Escherichia coli Bacillus subtilis Desulfovibrio sp Staphylococcus sp. Streptococcus sp

Microorganismo 1. 2. 3. 4.

Tabla 1 preparaciones fijas. Forma Agrupación

Tabla 2 preparaciones en fresco. Forma Agrupación

Movilidad

Movilidad

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Con base a lo observado discuta los siguientes aspectos: a) Uso del microscopio b) Ajuste de la iluminación con la técnica Khöler

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c) Observación de la movilidad de los microorganismos d) Del cuidado del microscopio, en su uso y transporte 7.- CUESTIONARIO 1. En relación al tamaño, la forma y la agrupación, describe las diferencias que observaste entre las bacterias, compara con las células de eucariotes que hayas encontrado en las referencias bibliográficas y con lo que observaste en la práctica. 2. Describe brevemente las observaciones de las preparaciones en fresco ¿es posible observar forma, tamaño, movilidad? ¿Para qué sirve una preparación fija y una en fresco? 3. ¿Existen otras técnicas para la optimización de la iluminación en los microscopios compuestos?, compara con la técnica de Köhler. 4. En forma de conclusión, compara los resultados en relación con los objetivos particulares de la práctica y lo publicado en las referencias bibliográficas. 8.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS DE LA PRÁCTICA Cebulla W. (1990). Qualitative microscopy en Handbook of incident light microscopy by Carl Zeiss, West Germany. 68 Págs. Madigan, Martinko, Parker (2005). Brock Biology of the microorganisms. 10th edition, Prentice Hall,. 892 Págs. 9.-ENLISTA LAS REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS QUE CONSULTASTE, DE ACUERDO AL SIGUIENTE FORMATO. Autor (es) iniciando con los apellidos e inicial del nombre, año de publicación, Título del capítulo del libro, título del libro, edición, país, páginas.

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PRACTICA No. 2a TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS: TINCIONES 1. INTRODUCCIÓN El estudio de las células procariotas se inicia con el análisis de la morfología de las células aisladas o grupos de células, que se observan por medio de un microscopio. La observación microscópica constituye la primera etapa en el estudio de las bacterias con fines taxonómicos y permite conocer algunas de sus características como: tamaño, forma y modo de agrupación. Estos caracteres constituyen la Morfología microscópica de la célula, asimismo, permite la observación de ciertas estructuras celulares como: pared celular, cápsulas, esporas y flagelos. La morfología microscópica de las células procariotas puede ser examinada de dos formas: a) observando al microorganismo vivo y sin teñir, y b) observando las células muertas fijadas a un portaobjeto y teñidas con colorantes. Las bacterias vivas son generalmente incoloras y ofrecen por lo general un contraste insuficiente con el medio acuoso en el cual están suspendidas, como para ser claramente visibles en el microscopio. Al realizarse una tinción, este contraste se incrementa notablemente. Forma.- La mayoría de las células bacterianas tienen formas celulares características que se mantienen más o menos constantes en cultivos jóvenes que crecen activamente en buenas condiciones. Sin embargo, puede darse que en cultivos viejos, donde la estructura celular se está desintegrando, aparezcan formas degenerativas o formas de involución. (Figura 1) Cocos - La forma esférica de una bacteria recibe el nombre de coco. Bacilos - Las células con forma cilíndrica o de bastones reciben el nombre de bacilos. Espirilos - El tercer grupo morfológico principal de bacterias está formado por las formas espirales, que en el caso de espirales largas adquieren forma de hélice. Vibrios .- Las células tienen forma de coma, se encuentran aisladas. Otros - Bacterias cuadradas con lados y esquinas rectos, aislados de ambientes extremadamente salados Agrupaciones.- Al dividirse una célula, las células hijas pueden o no separarse inmediatamente. La combinación de los diferentes planos de división y la probabilidad de separación célula hija de la célula madre, conducen a agrupaciones características de las bacterias (Figura 1).

Estrellas

Cuadrada

Figura 1 Formas y agrupaciones de procariotes Cocos Los subtipos morfológicos de los cocos se distinguen según la disposición de las células unas con otras. La división en un plano da lugar a pares de organismos, diplococos. Cuando la tendencia a quedar unidos es más

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intensa, el resultado es una cadena de células, estreptococos consistentes en 4 a 10 o con más de 20 células (cadenas largas) que muchas veces tienen aspectos de diplococos unidos en serie, ejemplo de este tipo es Streptococcus epidermidis. La división regular en dos planos, uno respecto al otro a 90 º, resulta en tétradas y la división regular en tres planos da lugar a paquetes cúbicos de ocho células, como los que se dan en el género Sarcina. La división irregular en dos o tres planos, lleva a acúmulos irregulares en forma de racimos de uva denominado estafilococos, cuyo ejemplo característico es Staphylococcus aureus Bacilos : Algunas de las formas bacilares adoptan agrupaciones características, consecuencia de movimientos después de la división celular. En algunos tipos de bacilos hay tendencia a formar cadenas, el tipo morfológico denominado estreptobacilo En el caso de las cadenas formadas por bacilos, éstas pueden ser cortas o largas. Definición de términos: Frotis.- El material que se va a observar debe ser “fijado” o pegado sobre el portaobjeto, de manera que durante la tinción, la solución de colorante no arrastre o “lave” la capa de células colocada sobre el portaobjeto. Tinciones.- Al agregar algunos colorantes, las células o las estructuras se observan con nitidez, por lo cual se obtienen las siguientes ventajas: Al teñir los microorganismos se incrementa el contraste con sus alrededores y por tanto son mucho más visibles. Ciertas tinciones pueden ayudar a identificar estructuras de las células que de otra manera no podrían ser vistas (cápsulas, esporas) Se puede utilizar un objetivo con aceite de inmersión para obtener una amplificación mayor de la imagen Pueden ser utilizadas con fines taxonómicos, ya que no todos los microorganismos presentan la misma afinidad por los distintos colorantes. Colorantes Los colorantes reaccionan químicamente con la célula bacteriana pero no con sus alrededores, permitiendo así distinguirlas. Por lo que, la mayor ventaja de la tinción es proveer un contraste entre el microorganismo y sus alrededores, permitiendo de esta forma una diferenciación entre distintos tipos de morfología, y permitiendo el estudio de estructuras como la pared celular, cápsulas y esporas. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Los colorantes básicos o colorantes catiónicos, cargados positivamente, se combinan fuertemente con los constituyentes celulares ácidos cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos. La célula bacteriana, que en medio de pH cercano a la neutralidad, está cargada negativamente, se combina con los colorantes básicos, cargados positivamente, con lo cual queda teñida. Como ejemplo de colorantes básicos tenemos, el Cristal violeta, la safranina y el azul de metileno. Los colorantes ácidos o aniónicos, cargados negativamente, son moléculas que se combinan con constituyentes celulares cargados positivamente, como pueden ser muchas proteínas. Ejemplos de estos colorantes son la eosina, fucsina ácida, rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles, que se combinan con los lípidos de la célula, revelando la ubicación de los depósitos de grasa en la misma. Un ejemplo de este grupo es el Sudán negro. Tipos de tinciones Las técnicas de tinción se pueden clasificar en primera instancia como: 1. Tinción positiva, Implica el uso de colorantes para teñir las células y aumentar su contraste de manera que se pueda observar más fácilmente una muestra al microscopio. 2. Tinción negativa.- Se utilizan colorantes que no tiñen al microorganismo, sino que colorean al medio que los rodea; por lo tanto, lo que se ve es el perfil de las células. Las sustancias utilizadas son materiales opacos que no tienen afinidad por los constituyentes celulares. Un ejemplo de este tipo de colorante es la tinta china (suspensión de partículas de carbono coloidal) y la nigrosina. Tambien se clasifican como: 3. Tinciones simples Se denomina así, porque solo se utiliza un colorante, generalmente básico. Con este tipo de coloración no se pretende diferenciar microorganismos o estructuras celulares. Las técnicas de coloración simple pueden ser positivas cuando el colorante es fijado por las células apareciendo los microorganismos de color oscuro

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o coloreado sobre un fondo luminoso o claro, y son negativas cuando los microorganismos no fijan el colorante, en cuyo caso el fondo es el que se tiñe y los microorganismos aparecen brillantes sobre fondo oscuro. 4. Tinciones diferenciales son técnicas en donde se somete la muestra a más de una solución colorante de forma que no se tiñen de la misma manera todos los componentes celulares, por ejemplo: Tinción de Gram, Tinción de Ziehl Nielsen 4.1 Tinción de Gram. El método fue descubierto por Christian Gram (Danés), en 1884, quien observó que en cortes histológicos que contenían bacterias coloreadas con violeta de genciana y tratadas con solución acuosa de yodo, este colorante podría ser removido del corte histológico con el empleo de alcohol, pero no de las bacterias. Posteriormente descubrió que no todas las bacterias retenían al violeta de genciana sino que algunas eran decoloradas por acción de una mezcla alcohol-acetona. Esta técnica permite diferenciar a dos grandes grupos de procariotas en función de la composición de la pared celular. Las procariotas que contienen un alto contenido de péptidoglucanas (aproximadamente el 90%) y un bajo contenido de lípidos (aproximadamente 10%), dan reacción de Gram positiva y los procariotes que contienen un bajo contenido de péptidoglucanas (aproximadamente el 10%) y un alto contenido de lípidos (aproximadamente 90%), dan la Reacción de Gram negativa 5. Tinciones estructurales o específicas: estas técnicas se emplean para el reconocimiento de estructuras celulares (cápsulas, esporas, flagelos, etc.), ejemplo: Tinción de Shaeffer y Fulton (para endosporas), Tinción con Tinta china( cápsula). Existen diversos tipos de esporas microbianas, pero la espora bacteriana tiene especial importancia ya que son organelos de gran resistencia que se producen en el interior de la célula, por lo que reciben el nombre de endosporas. La endospora es una estructura compuesta, de dipicolinato de calcio en eL centro, dentro de su compleja cubierta que consta de siete capas que contienen mureína. Pocos géneros de bacterias son capaces de formar endosporas, siendo los principales: Bacillus y Clostridium. La función de las endosporas no es la reproducción, ya que de un bacilo que forma una espora solo surge una bacteria por germinación.Tanto el tamaño, como la forma y posición de la espora en la célula bacteriana son caracteres relativamente constantes de cada especie, ya que poseen cierto valor para distinguir entre sí los diferentes tipos de bacterias esporuladas. La posición de la espora en la célula puede ser central, sub-terminal o terminal y de forma redonda u ovalada. La espora puede también ser más grande que el diámetro de la bacteria o menor que éste. Las endosporas bacterianas son muy resistentes y refractarias a la desecación, a los agentes químicos y sobre todo a temperaturas elevadas, ya que pueden sobrevivir expuestas a altas temperaturas durante largos períodos a diferencia de las bacterias vegetativas normales que mueren con breves exposiciones. 2. OBJETIVO GENERAL Desarrollar la habilidad para la preparación de frotis y diferentes tinciones, así como la descripción de la morfología microscópica de células procariotes. 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Realizar frotis (preparaciones fijas)  Realizar tinciones simples, diferenciales y específicas  Observar forma y tipo de agrupación de los microorganismos  Observar cápsulas y esporas  Observar movilidad bacteriana 3. MATERIAL Y CEPAS MICROBIANAS Por equipo: 1 kit para tinción de Gram 1 Kit para tinción de Shaeffer y Fulton Tinta china o Nigrosina

6 portaobjetos Gradilla Asa bacteriológica

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Lámpara de alcohol Hisopos Encendedor Microscopio Puente de tinción Aceite de inmersión Mechero Bunsen Papel absorbente Microorganismos: Cultivo de Escherichia coli en medio sólido. Cultivo de Bacillus subtilis en medio líquido Cultivo de Klebsiella pneumoniae en medio sólido Cultivo de Staphylococcus epidermidis en medio líquido 4. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA Frotis Se deberán emplear portaobjetos limpios, desengrasados y sin raspaduras para evitar interferencias en la observación. Realizar por triplicado el procedimiento siguiente: 1. Con un asa bacteriológica previa esterilización por incineración al rojo y fría, se toma la muestra de Bacillus subtilis, para lo cual se retira el tapón de algodón del tubo de ensayo que contiene el cultivo, sosteniéndolo entre el dedo meñique y la palma de la mano y se flamea la boca del tubo en la llama del mechero; se toma la muestra con el asa y antes de tapar se flamea nuevamente la boca del tubo. Se deposita el material extraído con el asa sobre el portaobjeto y se extiende en forma de elipse en 1 cm2, formando una capa fina. Dejar secar al aire 2. Colocar una gota de agua en un extremo del portaobjetos, y con el asa bacteriológica estéril, tomar una pequeña cantidad de cultivo de Escherichia coli, emulsionar y extender uniformemente en una superficie aproximada de 1 cm2, dejar secar al aire. 3. Identificar adecuadamente cada frotis 4. Fijación: Una vez que la preparación esté seca, se pasa el portaobjeto (con la preparación seca hacia arriba) tres veces por la llama del mechero, en forma rápida como lo indica el profesor y con el calor suficiente que se tolere en el dorso de la mano. El calor, tiene por objeto matar los microorganismos y coagular el protoplasma celular para adherir las células al portaobjeto. El fijador ideal preserva las estructuras celulares sin modificaciones. Además del calor, se pueden utilizar otros agentes tales como: alcohol, ácido crómico, fenol. 5. Los frotis deben ser delgados y uniformes para permitir el paso de la luz a través de ellos y facilitar su observación B. Tinción Simple. 1. Colocar una gota del colorante (azul de metileno o safranina) sobre el frotis y dejarlo actuar 1 minuto. 2. Lavar con agua corriente hasta eliminar exceso de colorante. 3. Dejar secar al aire. 4. Observar a 10X y 40X en el microscopio compuesto. 5. Colocar una gota de aceite de inmersión y observar con el objetivo de inmersión. 5. Dibujar lo observado. C. Tinción de Gram (Figura 2) 1. Cubrir un frotis con cristal violeta y dejar actuar durante un minuto. 2. Lavar con agua corriente, cuidando que no se arrastre la muestra y sacudir para eliminar el exceso de agua. 3. Cubrir el frotis con solución de lugol y dejar actuar por un minuto. 4. Lavar con agua corriente. 5. Decolorar la primera etapa con la mezcla alcohol-acetona, aproximadamente 10 segundos 6. Lavar con agua corriente. 7. Cubrir el frotis con Safranina y dejar actuar por 1 minuto.

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8. Lavar con agua corriente. 9. dejar secar al aire. 10. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación y observar al microscopio con objetivo de inmersión. Interpretación: Las bacterias Gram positivas retienen el complejo cristal violeta - lugol y se tiñen de color violeta o azul violáceo Las bacterias Gram negativas se tiñen en rojo ó rosa. Dibujar, destacando la forma y el color de cada frotis.

Figura 2 Tinción de Gram D. Tinción de esporas por el método de Schaeffer y Fulton 1. Colocar un frotis sobre un soporte y agregar suficiente solución de verde de malaquita al 5%. 2. Flamear la preparación pasando por debajo de ésta la lámpara de alcohol hasta observar una ligera emisión de vapores por espacio de minuto y medio, evitando que se evapore totalmente el colorante, agregar más si es necesario de lo contrario corres el riesgo de que se quede pegado el colorante y calcinar a tu microorganismo. 3. Lavar al chorro del agua, hasta eliminar exceso de colorante. 4. Cubrir la preparación con solución de contraste, Safranina al 5%, y dejar actuar el colorante durante un minuto y medio. 5. Lavar al chorro del agua hasta eliminar el exceso de colorante. 6. Secar al aire 7. Observar al microscopio con objetivo de inmersión en aceite. 8. Dibujar, destacando la forma y el color de cada frotis. Interpretación: Las esporas deberán estar teñidas de color verde y los cuerpos bacilares en rojo. E. Tinción negativa de cápsula 1. Colocar una pequeña asada del cultivo de Klebsiella pneumoniae sobre el portaobjetos 2. Agregar una gota de Nigrosina o tinta china y mezclar suavemente 3. con la ayuda de otro portaobjetos limpio se extiende la mezcla para formar una película delgada. 4. Dejar secar al aire, sin fijar

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5. Observar a inmersión Interpretación: Observar halos transparentes, sin teñir, alrededor de las células F. Determinación de movilidad en gota pendiente 1. Colocar una gota de cada cultivo de bacteria sobre un cubreobjetos, si el cultivo es en medio sólido, suspender la asada en una gotita de agua 2. colocar un portaobjetos excavado, invertir cuidadosamente de forma que se mantenga la gota suspendida y observar a seco fuerte (40 X) 3. Dibujar lo observado, indicando si hubo movilidad o no de las células analizadas 5. RESULTADOS Describir con esquemas cada una de las tinciones realizadas en la práctica, colorear de acuerdo a la tinción trabajada. Informar los resultados obtenidos en la siguiente tabla Forma Agrupación Gram Movilidad

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN Analiza tus resultados y compáralos con lo descrito en la bibliografía consultada. Enfatiza en el fundamento de las tinciones. Revisa porqué se mueven los microorganismos y determina si tu observaste la movilidad como se describe en los libros. 7. CUESTIONARIO 1. Consultar la estructura química de 2 colorantes ácidos y 2 básicos. Que significa grupo cromóforo y grupo auxocromo en los colorantes 2. ¿Cuál el índice de refracción del aceite de inmersión y porqué se utiliza para observar a las bacterias? 3. ¿Cuál es el fundamento de la Tinción Diferencial de Gram y de la Tinción diferencial de Ziehl Nielsen? 4. ¿Cuál es la función que desempeña el Lugol en esta coloración? 5. Escribir el nombre científico (Género y especie), de 5 bacterias Gram positivas y 5 Gram negativas. 6. ¿Por qué algunos microorganismos Gram positivos en un cultivo joven se vuelven Gram negativos cuando envejecen? 7. Indicar 5 géneros de bacterias esporuladas 8. ¿A qué se debe la movilidad de las bacterias? ¿En qué consiste el movimiento Browniano? 9. Menciona 5 géneros de bacterias móviles 8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS DE LA PRÁCTICA 1. Brock, T.D. Biología de los Microorganismos. Ed. Prentice-Hall. 1996. 2. Stanier, R.Y.M. Microbiología. Ed. Prentice-Hall. 1997. 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CONSULTADAS Autor (es) iniciando con los apellidos e inicial del nombre, año de publicación, Título del capítulo del libro, título del libro, edición, país, páginas.

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PRACTICA No. 2b TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS: ESTERILIZACIÓN 1. INTRODUCCIÓN La esterilización es el proceso por el cual se eliminan o destruyen los microorganismos. Se dice que es un proceso porque durante su desarrollo depende de varios factores como son la temperatura, dosis de radiación, o concentración del agente letal, tiempo de la exposición, presión, entre otros. Los procesos de esterilización pueden ser físicos o químicos. Entre los procesos físicos se encuentran el calor, la microfiltración y la radiación. El calor que se aplica durante el proceso puede ser por vapor de agua (calor húmedo) o bien en un horno de alta temperatura conocido como calor seco. La muerte de las bacterias por el calor húmedo es consecuencia de la desnaturalización de sus proteínas. El calor, se puede aplicar a numerosos instrumentos, materiales y substancias, con el propósito de matar a las bacterias que ellos contengan. Existen numerosos factores que condicionan la efectividad del proceso: Cantidad de agua, temperatura, presión, tiempo de contacto, superficie de esterilización, pH, la presencia o no de esporas, composición del medio de suspensión, etc. Las células vegetativas y las endosporas bacterianas de un mismo organismo varían considerablemente en cuanto a su resistencia al calor. La muerte de los microorganismos es más rápida a pH ácido. Las concentraciones elevadas de azúcares, proteínas o grasas disminuyen la penetración del calor y habitualmente aumentan la resistencia de los organismos al calor, mientras que las elevadas concentraciones de sal pueden incrementar o bien reducir la resistencia al calor, dependiendo del organismo. Calor seco.-Este tipo de esterilización incluye al flameo, incineración y los hornos de aire caliente. La esterilización celular se produce principalmente por la oxidación de las proteínas vitales, a las esporas de Geobacillus sthearothermophilus o de Aspergillus niger que se destruyen a 160 °C en una hora y son los bioindicadores de este proceso. Calor húmedo. Es un proceso rápido y es efectuado con vapor a presión. La muerte microbiana se produce por la desnaturalización de las proteínas, en un sistema cerrado libre de aire, se requiere de 121 °C, 1.05 atmósferas de presión (15 libras) por 15 minutos y se aplica a materiales que no se afectan por la humedad y la temperatura, las esporas de Geobacillus sthearothermophilus, son los bioindicadores utilizados. Microfiltración o filtración a través de membranas, se aplica principalmente para soluciones termolábiles, es decir que son susceptibles de degradación por el calor. Se utilizan membranas o cartuchos de porosidad de 0.22 ó 0.45 micrones La filtración puede usarse para esterilizar líquidos termosensibles o gases. Un filtro es un dispositivo con poros demasiado pequeños para que pasen los microorganismos, pero suficientemente grandes para permitir el paso de un líquido o un gas. Algunas de las células bacterianas de mayor tamaño miden más de 10 μm de diámetro, mientras que las más pequeñas en la escala de tamaños tienen un diámetro menor a 0.3 μm. Los filtros de profundidad están constituidos por una lámina fibrosa o tapete hecho de matrices dispuestas al azar de fibras de papel, asbesto o vidrio que se solapan, este filtro atrapa las partículas en la imbricada trama y urbidumbre que se crea a través del espesor de la estructura, son porosos y se usan como prefiltros para eliminar las partículas de gran tamaño que pudieran interferir en la microfiltración tanto para soluciones como para aire. El filtro de membrana (Fig. 1) se compone de polímeros con una elevada resistencia, como el acetato de celulosa, nitrato de celulosa o polisulfonas

a

b

Fig. 1 a) Porta membrana y b) membrana para microfiltración

El tercer tipo de filtro para uso común es el filtro de nucleación (Nucleopore). Estos filtros se han obtenido tratando películas muy finas de policarbonatos (10 μm de grosor) con radiación nuclear y fracturando la película con un producto químico. El microorganismo que se ha utilizado como testigo de esterilización por este proceso es Pseudomonas diminuta que tiene un diámetro aproximado de 0.50 micrones.

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Limpieza del material. El material de vidrio e instrumental que se utiliza en la realización de estudios microbiológicos debe estar limpio, seco y libre de residuos de detergentes u otros contaminantes como germicidas, desinfectantes, vitaminas, aminoácidos, etc. que interfieran en el desarrollo de los microorganismos. Además de la limpieza y el secado previo del material, es importante la envoltura del material que se va a someter a esterilización, para la conservación de la esterilidad posterior al proceso. Los materiales que se van a esterilizar por calor húmedo, requieren ser envueltos en materiales con superficies porosas, para que el vapor penetre libremente por todo el interior de los materiales a esterilizar. Para esterilizar por calor seco el material no requiere ser poroso, solo se necesita que transfiera fácilmente el calor por contacto. 2. OBJETIVO GENERAL  Adquirir el conocimiento y los cuidados necesarios para esterilizar por los métodos con calor. 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Desarrollar la habilidad para preparar material para su esterilización  Esterilizar por los métodos de calor seco y calor húmedo 3.0 MATERIAL Y REACTIVOS Papel aluminio Papel Kraft Algodón 3 tubos de ensaye de 16 X 150 mm 3 tubos de ensaye de 13 X 100 mm 3 cajas Petri de vidrio1 matraz de 125 mL 1 matraz de 500 mL 3 pipetas de diferentes volúmenes Termómetro 2 Mecheros Encendedor Masking tape Asa bacteriológica

1 pinza de disección 1 tijera 1 gradilla 1 canastilla 1 cilindro pipetero 1 cilindro para cajas de Petri 1 vaso de precipitados ligas botes de metal Swinnex de 13 mm de diámetro Membranas de 0.45 um de 13 mm de diámetro Autoclave a 116°C y 121 °C Horno de calor seco a 160 °C. Incubadora a 37 °C

4. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA A) Lavado de material de vidrio e instrumental. 1. Si existe material que ha estado en contacto con cultivo de microorganismos, éste debe ser esterilizado en autoclave a 121 °C, 1.05 atm de presión durante 15 minutos. 2. Recolectar los desechos del material esterilizado en bolsas de plástico biodegradables. 3. Enjuagar con agua de la llave. 4. Frotar con una solución detergente, utilizando escobillones para las pipetas, los tubos y los matraces y una fibra suave para las cajas Petri, el material plano y el instrumental metálico. 5. Enjuagar suficientemente con agua de la llave. 6. Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente. B) Preparación del material para esterilización por calor húmedo. 1. Tubos de ensayo. 1.1 Tapar 3 tubos de ensayo con tapones de algodón siguiendo las indicaciones del profesor. 1.2 Colocar los tubos en un bote con orificios en la base y taparlos con papel Kraft, asegurarlos con una liga, anotar fecha, equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.

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2. Cajas de Petri. 2.1 Envolver 3 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel, la cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, laboratorio y grupo. 3. Pipetas. 3.1 Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy compacto utilizando para ello una aguja de disección. 3.2 Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodón. 3.3 Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo con maskingtape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el número de equipo de laboratorio. Con una flecha indicar el sentido de la punta de la pipeta. 4. Matraces. 4.1 Colocar en la boca de cada matraz un tapón compacto de algodón, envuelto con gasa y elaborado siguiendo las instrucciones del profesor. 4.2 Con papel Kraft, confeccionar un gorro ligeramente más grande que el tapón de algodón. 4.2 En una tira de masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo; adherir el masking-tape al matraz. No anotar los datos sobre la capucha de papel. 5. Pinzas y tijeras. 5.1 Envolver con papel Kraft una pinza o una tijera señalando con una flecha la punta y colocarlos en un bote de metal con orificios. 5.2 Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo. Manejo de Autoclave. 1. Asegurarse de que haya un buen nivel de agua en el autoclave. Si no hay suficiente, agregarla hasta que casi llegue a la parrilla inferior. 2. Introducir el material que se va a esterilizar procurando que quede bien colocado para evitar algún problema y cerrar la puerta ajustándola bien. Debe de quedar herméticamente cerrado. 3. Abrir la válvula de salida de vapor y encender la fuente de calor de la autoclave. 4. A medida que suba la temperatura del agua (ver el termómetro), empezará a salir una mezcla de vapor-aire por la válvula de salida de vapor, dejar que escape esta mezcla hasta que solo salga un flujo continuo de vapor y el aire haya sido eliminado; a esto se le llama purgar el autoclave. 5. Una vez purgado el autoclave, cerrar la válvula de salida de vapor y dejar que la presión suba hasta 15 libras por pulgada cuadrada (vigilar el manómetro), lo que proporciona una temperatura de 121 °C. 6. En ese momento empezar a contar el tiempo. 7. Transcurridos 15 minutos a 15 libras de presión, apagar la fuente de calor y dejar que el autoclave se enfríe sólo (no abrir la válvula de salida de vapor), hasta que la presión haya bajado a cero libras. 8. Abrir la autoclave y sacar el material con precaución. C. Preparación del material para esterilización por calor seco. 1. Tubos de ensaye. 1.1 Colocar en 3 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en un bote de metal. 1.2 Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape indicador. 2. Cajas de Petri. 2.1 Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri algunas cajas en posición invertida perfectamente secas (POR ESTE MÉTODO NUNCA SE ESTERILIZA MATERIAL CONTAMINADO). 2.2 Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el número de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la fecha. Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.

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3. Pipetas. 3.1 Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy compactado. 3.2 Flamear las boquillas en la flama del mechero a fin de eliminar el exceso de algodón. 3.3 Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas. 3.4 Anotar en una tira de papel kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la tira entre la tapa del cilindro pipetero. 4. Matraces. 4.1 Colocar en la boca de un matraz de 125 mL una tapa de papel aluminio. 4.2 En una tira de papel kraft anotar feche, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetándolo con maskingtape indicador. 5. Pinzas y Tijeras. 5.1 Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera. 5.2 En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura. Manejo del Horno. 1. Para efectos de esta práctica, encender el horno eléctrico y mediante el termostato, elevar la temperatura hasta que llegue a 160 °C y mantener esta temperatura constante. 2. Introducir el material a esterilizar y cerrar la puerta. Esperar a que la temperatura del horno alcance los 160°C. 3. Empezar a contar 60 minutos de exposición a esa temperatura. 4. Después de este período, apagar el horno, abrir la puerta y sacar el material. Si aún está caliente, usar un guante de asbesto. D. Esterilización por calor húmedo. 1. Preparar 3 tubos de ensaye de 16x150 mm con 5 mL de caldo nutritivo sin esterilizar y etiquetar tubos 1, 2, 3. 2. Mantener el tubo número 1 sin esterilizar. 3. En el segundo tubo de ensaye sin esterilizar y que contiene caldo nutritivo, colocar una tira de esporas de Geobacillus sthearothermophilus, tapar el tubo con un tapón de algodón y someterlo a una temperatura de 116 °C durante 15 minutos y una presión de 10 lb/pulg. 4. En el tercer tubo de ensaye sin esterilizar y que contiene el caldo nutritivo, colocar una tira de esporas de Geobacillus sthearothermophilus, tapar el tubo con un tapón de algodón. Esterilizarlo a 121 °C durante 15 minutos. Tener cuidado de eliminar todo el aire del sistema, iniciar la cuenta del tiempo cuando la presión sea de 15 lb/pulg. 5. Incubar los tres tubos a 35 °C + 2 °C durante 48 a 72 horas. No olvidar etiquetar los tubos con los datos del equipo. 6. Observar diariamente los tubos incubados durante 3 días. Anotar cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez. E. Esterilización por calor seco. 1. Colocar el material preparado para esterilizar por calor seco en el horno, revisar que la temperatura ascienda a 160 °C, y empezar a tomar el tiempo, durante una hora. 2. En un tubo de ensaye sin esterilizar, colocar una tira de papel filtro que contenga esporas de Bacillus subtilis var níger, cubrir la boca del tubo con papel aluminio. Esterilizar a 160 °C durante 1 hora. En caso de que no se te proporcione la tira impregnada con esporas introduce una ampolleta que ya contenga el papel filtro impregnada con esporas. 3. Después de transcurrido el tiempo de esterilización, apagar el horno y esperar a que el termómetro indique la temperatura ambiente. Abrir y retirar con mucho cuidado el material con guantes de asbesto. 4. Con ayuda de la pinza estéril y bajo condiciones asépticas, colocar la tira de papel filtro conteniendo las esporas del microorganismo indicador a un tubo de ensaye que contenga 10 mL de caldo nutritivo estéril. Incubar a 35 + 2 °C de 48 a 72 horas.

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5. Incubar una tira reactiva con las esporas sin esterilizar para que sea el testigo positivo. 6. Observar diariamente y anotar cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez. Interpretación de resultados Tubos con turbidez: Proceso incorrecto de esterilización, material contaminado. Tubos sin turbidez: Condiciones correctas de esterilización, material estéril. Testigo positivo: Deberá presentar turbidez (desarrollo microbiano) Testigo con esporas esterilizado: Sin turbidez, c ondiciones correctas de esterilización, 5. RESULTADOS En una tabla, anota los resultados de cada material, solución o medio de cultivo que hayas esterilizado, en la misma tabla, correlaciona el tipo de envoltura que utilizaste con el proceso de esterilización al que fue sometido el material. 6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Compara tus resultados, con lo descrito en la bibliografía: 6.1 Parámetros de cada proceso de esterilización, 6.2 Limpieza del material 6.3 Preparación del material para esterilizar 6.4 Puntos críticos durante la preparación y los procesos de esterilización 7. CUESTIONARIO 1. Dibujar y describir un Autoclave y un Horno de calor seco. 2. ¿Qué tipo de material se puede esterilizar en el Horno de calor seco y en el Autoclave? Dar ejemplos. 3. ¿Cuál es la temperatura y el tiempo que se requieren para lograr la esterilización en el Horno de calor seco? 4. ¿Por qué es necesario ajustar el tiempo y la temperatura para lograr la esterilización? 5. Describe a la filtración como un método para esterilizar líquidos que no pueden esterilizarse por calor. Explica sus ventajas y menciona dos ejemplos. 6. Describe la radiación ultravioleta como un método para esterilizar material e instrumental. Explica sus ventajas sobre los otros métodos de esterilización y menciona dos ejemplos. 8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS DE LA PRÁCTICA Denyer S.P., Hodges N. A., Gorman S.P. Pharmaceutical Microbiology, Ed. Blackwell, 7a Edición, pag. 346 9.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS CONSULTADAS

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PRACTICA No. 2c TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS: CULTIVO 1. INTRODUCCIÓN MEDIOS DE CULTIVO Como resultado del pequeño tamaño de los microorganismos, la única manera de obtener información sobre ellos es estudiando sus poblaciones. Tales poblaciones se obtienen al hacer crecer los microorganismos bajo condiciones más o menos bien definidas, como cultivos. El cultivo es el crecimiento de las poblaciones microbianas en ambientes artificiales bajo condiciones de laboratorio. Al confeccionar un medio de cultivo, la meta principal consiste en proporcionar una mezcla equilibrada de los nutrientes requeridos a concentraciones que permitan el crecimiento del microorganismo. Estas concentraciones deben ser las adecuadas ya que muchos nutrientes se hacen inhibidores del crecimiento o resultan tóxicos al elevar su concentración, además aun cuando el crecimiento pueda tener lugar en un medio concentrado, las actividades metabólicas de la población microbiana en crecimiento en un momento determinado llegará a cambiar la naturaleza el medio ambiente hasta el punto de hacerse altamente desfavorable, con lo cual la población se hace fisiológicamente anormal o bien muere. Esto puede ocurrir debido a un cambio drástico en el pH, por acumulación de metabolitos orgánicos tóxicos, o en caso de los aerobios estrictos, por agotamiento del oxígeno. El punto de arranque racional para la preparación de medios es componer una base mineral que proporcione todos los nutrientes que pueden suministrarse a cualquier organismo en forma inorgánica. Este medio base puede suplementarse si es necesario, con una fuente de carbono, una fuente de energía una fuente de nitrógeno y algún factor de crecimiento requerido. Estos suplementos varían de acuerdo con las propiedades nutricionales del organismo en particular que se desea cultivar. Medios simples. Con base a el número de componentes los medios se denominan simples consisten en una mezcla bien balanceada de nutrientes en agua, con salinidad y pH controlados, sin componentes especialmente complejos ni agentes inhibidores. Se utilizan para aislar, contar y conservar microorganismos de fácil desarrollo. A este grupo pertenecen: el caldo nutritivo, Agar Nutritivo, Agar cuenta estándar. Medios enriquecidos. Los medios enriquecidos se obtienen agregando a un medio simple base, componentes ricos en nutrientes orgánicos tales como sangre, huevo, leche, extractos de vísceras o vegetales. Su aplicación es para microorganismos especialmente exigentes en sus demandas nutricionales: gelosa sangre para el Streptococcus pyogenes, medio de Lowenstein para Mycobacterium tuberculosis o gelosa triptosa para Brucella Medios sintéticos. Son medios de cultivo químicamente definidos. Un medio de cultivo sintético es el medio ELG para Escherichia coli (tabla 1). Esta especie puede sintetizar sus constituyentes celulares a partir de la glucosa y de algunas sales minerales a partir de la glucosa y de algunas sales inorgánicas. La glucosa puede servir como fuente de energía y fuente de carbono. Tabla 1. Medio ELG

Ingredientes

G/L

Glucosa K2HPO4 KH2PO4 MgSO4 (NH4)2SO4 Agua

5 7 2 0.08 1 1000 ml

Medios complejos. Contienen ingredientes de composición química desconocida. Como ejemplo, de medio complejo es la Gelosa sangre (Tabla 2), que aunque tiene pocos componentes, se desconoce la composición química de la infusión de carne y de la sangre que se le agrega.

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Tabla 2. Gelosa sangre

Ingredientes Infusión de carne Triptosa

G/L 1000 ml 10 g

Cloruro de Sodio Agar

5g 15g

Medios selectivos. Con base en su selectividad los medios se clasifican como selectivos y diferenciales. En un medio inoculado con una variedad de organismos, solo aquellos que puedan crecer en él se reproducirán y todos los demás organismos serán inhibidos. Con frecuencia se añade penicilina, estreptomicina, actidiona, azida de sodio y otros antibióticos adecuados con el fin de evitar el desarrollo de gérmenes indeseables, mientras crecen en el medio las especies de interés, así también se les pueden agregar sales como taurocolato, desoxicolato, tioglicolato y telurito de potasio entre otros. En algunos casos también se agregan colorantes en concentraciones elevadas tales como cristal violeta, fucsina. Por ejemplo, el medio de Baird-Parker se utiliza para el aislamiento selectivo y enumeración de estafilococos coagulasa-positivos (Tabla 3). Tabla 3 Base de Agar Baird Parker Ingredientes Peptona de caseína Extracto de carne Extracto de levadura Cloruro de Litio Agar Glicina Piruvato de Sodio pH final 6.8 +- 0.2

g/L 10.0 5.0 1.0 5.0 17.0 12.0 10.0

Usos. A este medio se le agregan telurito de potasio y emulsión de yema de huevo. Las colonias típicas de Staphylococcus aureus son negras, brillantes, convexas y rodeadas por colonias claras de 2 a 5 mm de diámetro aproximadamente. Otros microorganismos que pueden desarrollarse ocasionalmente son del género Micrococcus que forman colonias oscuras o negras; las levaduras que forman colonias de color castaño oscuro mate. Medios de cultivo diferenciales. La adición de ciertos reactivos o sustancias químicas a los medios de cultivo trae como resultado un determinado tipo de crecimiento bacteriano o de cambios después de la siembra e incubación del medio, lo cual permite diferenciar distintos tipos de bacterias. Los medios diferenciales contienen un indicador que les permite el reconocimiento de organismos con una actividad metabólica particular. Como ejemplo de medios diferenciales se encuentra el Agar de Eosina y Azul de Metileno (EMB), por su contenido en lactosa y sacarosa permite diferenciar a Salmonella y Shigella que no asimilan lactosa y sacarosa de otras enterobacterias que no asimilan lactosa pero son sacarosa positivas, tales como Proteus vulgaris, Citrobacter y Aeromonas. La microflora Gram positiva es inhibida por los colorantes de la formula (Tabla 4). Es un medio adecuado para cultivar Escherichia coli, ya que sus colonias presentan características particulares como el brillo metálico. Tabla 4. Agar EMB Ingredientes g/L Peptona de gelatina 10.000 Lactosa 5.000 Sacarosa 5.000 Fosfato dipotásico 2.000 Eiosina 0.400 Azul de Metileno 0.065 Agar 13.500 PH final 7.2 +- 0.2

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Medios indicadores. Están constituidos por un medio base adicionando una sustancia específica que permite poner de manifiesto una determinada reacción metabólica como la fermentación de un carbohidrato (caldo lactosa), o la producción de un ácido orgánico, la actividad enzimática del microorganismo (producción de ureasa) o la asimilación de algún sustrato. Como ejemplo de estos medios indicadores se encuentran algunos que se mencionan en la tabla 5. Tabla 5. Ejemplos de medios de cultivo indicadores: Medio Microorganismo Indicador

Caldo de cultivo y rojo de fenol Fermentación de carbohidratos Agar con hierro y triple azúcar (TSI) Organismos fermentadores de dextrosa, lactosa, sacarosa. Medio de movilidad con indol y Cepas móviles, productoras de H2S sulfuro Rojo de metilo y Voges proskauer Organismos fermentadores de lactosa (MR-VP) Tubos con agar y urea Miembros del grupo Proteus Agar con fenilalanina Grupo Proteus Caldo para descarboxilación Diferenciación de enterobacteriaceae Leche tornasol Clostridium Caldo con nitrato Reductores de nitrato a nitritos

Rojo fenol rojo a amarillo rojo de fenol, sulfato ferroso Tiosulfato sódico Rojo de metilo Rojo de fenol Cloruro férrico Rojo de cresol Tornasol Nitrato de potasio

En la formulación de un medio de cultivo deben considerarse, no solo el tipo de microorganismo, sino también el tipo de muestra que se va a analizar, y el objetivo final que se persiga: aislamiento, recuento o identificación. 2. OBJETIVO GENERAL Preparar medios de cultivo de uso específico. 2.1 OBJETIVOS PARTICULARES Preparar medios sintéticos, simples, diferenciales e indicadores para el cultivo de microorganismos. 3. MATERIALES Y MÉTODOS Por equipo Agar nutritivo agar EMB glucosa SIM NaCl g.r. 1 varilla de vidrio acodada Fosfato monobásico de potasio Sulfato de amonio cucharas desechables 8 cajas Petri estériles

Asa bacteriológica Mechero Encendedor. Gradilla 4 Matraz Erlenmeyer.de 250 mL Fosfato dibásico de potasio Sulfato de magnesio 1 Matraz Erlenmeyer.de 500 mL 5 tubos de 16 X 150

4. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 4.1.- Recomendaciones generales para la preparación de los medios de cultivo Preparar solo los volúmenes de cada medio que se va a utilizar. Utilizar agua destilada y material de vidrio libre detergentes. Para los medios deshidratados, guardar en su frasco y en lugares frescos, secos y protegidos de la luz,

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Emplear recipientes con una capacidad 2 veces mayor al volumen que se va a preparar para evitar la proyección en el momento de la ebullición Añadir un la mitad del volumen de agua para permitir la disolución completa y después completar el volumen total En general los medios se disuelven hasta disolución completa para aclararse, pero debe evitarse que se derramen. Usar soporte universal con rejilla de tela de asbesto. NO deben calentarse a la flama directa del mechero El pH de los medios debe ajustarse antes de la esterilización y con el medio a una temperatura de 25 oC. Si el medio contiene agar debe lavarse perfectamente el electrodo del potenciómetro después de usarlo. Es conveniente evitar el sobrecalentamiento durante la esterilización por calor para evitar la pérdida de materiales nutritivos y cambiar la consistencia del medio. Antes de inocular un medio debe comprobarse la esterilidad de cada lote, incubando un 3-4% del total de placas durante 2 días a 37oC. Los medios de cultivo ya preparados y esterilizados deben mantenerse en refrigeración (4oC) y protegidos de la luz. Antes de emplearlos verificar que no exista contaminación, precipitación, cambio de color o de consistencia etc. Un medio contenido en un matraz puede ser esterilizado una segunda ocasión. 4.2 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO EN TUBOS DE ENSAYE Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad necesaria del medio. Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua destilada. Calentar suavemente hasta disolverlo completamente Vaciar 3 mL de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 X 100 mm limpios, taparlos con un tapón de algodón-gasa. Etiquetar los tubos y colocarlos en un bote y tapar con papel Kraft. Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (121 oC durante 15 minutos y 15 libras de presión). Dejar enfriar la autoclave. Colocar los tubos en una superficie inclinada y dejar que solidifiquen. Los tubos con medio semisólido SIM. No se inclinan. Incubar dos tubos con el medio de cultivo preparado a 37°C por 48 h, como testigo negativo de contaminación durante el proceso de preparación de los medios de cultivo, identificados con el nombre del medio de cultivo, fecha y equipo 4.3 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO EN CAJAS PETRI Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad que indique el profesor. Colocar el medio en un matraz con el doble del volumen y adicionarle el agua necesaria. Calentar suavemente hasta disolución completa Tapar el matraz con un tapón de algodón – gasa y gorro de papel Kraft Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (121 oC durante 15 min y 15 libras de presión). Dejar enfriar la autoclave y enfriar los matraces a 45°C. En condiciones asépticas transferir de 15 a 20 mL de cada medio en cajas de Petri estériles y dejar que solidifiquen a la temperatura ambiente. Incubar una caja de Petri con el medio de cultivo preparado equipo a 37°C por 48 h, en posición invertida, como testigo negativo de contaminación durante el proceso de preparación de los medios de cultivo, identificada con el nombre del medio de cultivo, fecha y equipo. 4.4 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO EN MATRACES Pesar cuidadosamente la cantidad que se indica en la etiqueta del envase para preparar la cantidad que indique el profesor. Colocar el medio en un matraz y adicionarle el agua necesaria. Ajustar el pH Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.

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Tapar el matraz con tapón de algodón y papel Kraft Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (121°C durante 15 minutos y 15 libras de presión). Dejar enfriar la autoclave. 4.5 PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO A PARTIR DE INGREDIENTES Pesar cuidadosamente la cantidad de cada uno de los ingredientes que se indica en la formulación del medio ELG, para preparar la cantidad que indique el profesor. Colocar un ingrediente en un matraz y adicionarle el agua necesaria hasta disolver, agregar uno a uno hasta disolución, ajustar el pH si lo indica la formulación, completar con agua destilada hasta el volumen final requerido. Tapar el matraz con tapón de algodón y papel Kraft Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (121°C durante 15 minutos y 15 libras de presión). Dejar enfriar la autoclave. 5. RESULTADOS 5.1 En una tabla, presentar los diferentes medios de cultivo preparados, indicando si fueron colocados en tubo, cajas de petri o matraz. 5.2 En un cuadro sinóptico, indicar la fórmula del medio de cultivo preparado y el uso para el cual se destina. Anotar el resultado del testigo de contaminación. 5.3 Clasificar los medios de cultivo preparados de acuerdo a los criterios establecidos en la práctica. 6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Realizar la discusión con base a la composición del medio de cultivo, el papel que desempeñan cada uno de los componentes, el uso y compara con lo que se establece en la Norma Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993. 7.CUESTIONARIO 1.- Indica tres diferentes fuentes de carbono orgánicas y tres inorgánicas 2.- Indica una fuente de Nitrógeno orgánica y una inorgánica 3.- ¿ Cuál es el papel del fosfato monobásico de potasio y del fosfato dibásico de potasio en un medio de cultivo? 4.- ¿Por qué se necesita ajustar el valor del pH en los medios de cultivo? 5.- ¿Cuál es el papel de las sales biliares en algunos medios de cultivo? 6.- Buscar la formulación del medio SIM y clasificar según los criterios establecidos e indicar la función de cada uno de los ingredientes. 8.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CONSULTADAS Atlas, R., Microbiology, Maxwell-McMillan, Co. 1998. Koneman, Diagnóstico Microbiológico, Ed. Panamericana, 1997. Lymch, M.J.; et al. Métodos de laboratorio. Ed. Panamericana. 1996. Brock, T.D. Biología de los Microorganismos. Ed. Prentice-Hall. 1996. Stanier, R.Y.M. Microbiología. Ed. Prentice-Hall. 1997. 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CONSULTADAS

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PRACTICA No.2d TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS: AISLAMIENTO 1. INTRODUCCIÓN La segunda etapa para caracterizar e identificar a los microorganismos procariotas y determinar sus necesidades nutricionales, su respuesta al medio ambiente, actividad metabólica, patogenicidad, etc., es necesario aislarlos del medio en que se encuentran (suelo, agua contaminada, alimentos, sitios contaminados, aire, etc.), para obtener cultivos puros o axénicos, es decir, cultivos que se originan de una sola clona y pertenecen a una sola especie. Existen procedimientos a través de los cuales se pueden aislar los microorganismos, entre los más utilizados se encuentran: la estría cruzada, las diluciones decimales (con sus variantes por vaciado en placa y extensión con varilla de vidrio) y por la técnica de Hungate. El aislamiento por estría cruzada, establece un gradiente de dilución por medio de las estrías cruzadas en la superficie de un medio sólido, dando origen a colonias aisladas, con esta técnica no se puede contar, solo nos permite aislar y analizar la morfología colonial (Figura 1).

Figura 1. Aislamiento por estría cruzada El aislamiento por diluciones decimales (Figura 2), establece un gradiente de dilución decimal en un medio líquido, lo cual permite aislar los microorganismos en las diluciones más altas, y para poner de manifiesto a los microorganismos aislados se utilizan dos técnicas: el vaciado en placa y la extensión con varilla de vidrio (Figura 3)

Fig. 2 Diluciones decimales

Fig. 3 Aislamiento por vaciado en placa y por extensión con varilla de vidrio

La técnica por vaciado en placa, se utiliza para obtener colonias aisladas y para contar número de bacterias en la muestra. La técnica consiste en colocar una alícuota de la dilución de la muestra en un medio sólido fundido y mantenido a 45°C, se homogeniza y se deja gelificar, posteriormente se incuba a una temperatura adecuada hasta obtener crecimiento visible. Los microorganismos se desarrollan sobre la superficie e incluidas en el medio de cultivo.

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La técnica por extensión con varilla de vidrio, se utiliza para aislar, contar y analizar morfología colonial de las bacterias. La técnica consiste en colocar una alícuota de la dilución sobre un medio de cultivo previamente gelificado, la cual se distribuye uniformemente sobre la superficie del medio de cultivo con una espátula de vidrio estéril. Los microorganismos solo se desarrollan en la superficie del medio de cultivo. El aislamiento por la Técnica de Hungate, establece un gradiente de dilución en medio de cultivo sólido fundido contenido en un tubo de Hungate y mantenido a 45°C, el cual es posteriormente rotado bajo enfriamiento para que las colonias aisladas queden embebidas en el medio de cultivo gelificado y adherido a la pared del tubo. Esta técnica se utiliza para aislar y contar número de bacterias en la muestra. Morfología colonial Cuando una célula bacteriana es inoculada sobre la superficie de un medio nutritivo sólido, ésta comienza a reproducirse exponencialmente; después de formarse algunos miles o millones de células, se hace visible esa masa celular, a la cual llamamos colonia. Una vez que se obtienen colonias de microorganismos, se analiza la morfología colonial bajo los siguientes criterios generales, Forma, tamaño, color, bordes, superficie, elevación, opacidad, consistencia y aspecto, destacando cualquier otra característica que ayude a la identificación del microorganismo (Figura 4) Forma: puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide, etc. Tamaño: estimar el diámetro en mm. Superficie: lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concéntricos, etc. Elevación: aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umbilicada Borde: liso, ondulado, lobulado, rizado , festoneado, filamentoso Color: blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc. Opacidad: transparente, opaca, translúcida Consistencia: dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa Aspecto: húmedo, seco Luz reflejada: mate o brillante Luz transmitida: transparente, translúcida, opaca

Figura 4. Morfología colonial de procariotes Cabe mencionar que también se analiza el crecimiento del microorganismo en medio líquido, anotando las características de crecimiento. 2. OBJETIVO GENERAL Aislar, contar y describir la morfología colonial de microorganismos procariotes obtenidos de diferentes hábitats

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2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Aislar microorganismos procariotes por la técnica de estría cruzada, diluciones decimales con vaciado en placa y extensión con varilla de vidrio. Cuantificar los microorganismos aislados con base a los criterios establecidos en la NOM-092-SSA1-1994 Describir la morfología colonial de los microorganismos aislados 3. MATERIAL Y REACTIVOS Por equipo 7 pipetas estériles de 2 mL 1 matraz con 120 mL de agar cuenta estándar - 3 placas Petri con agar nutritivo estéril. - 3 placas Petri con agar EMB estéril. - 6 placas Petri estériles - 6 placas con agar cuenta estándar estéril - 1 matraz con 90 ml de solución salina al 0.85% estéril -6 tubos de 16 X 150 mm con 9 mL de solución salina al 0.85 % estéril - 3 Tubos de ensayo conteniendo agar nutritivo inclinado. - 1 varilla de vidrio acodada -cucharas desechables - Asa bacteriológica. - Mechero - Cerillos ó encendedor. - Gradilla. -Kit para tinción de Gram y aceite de inmersión - Porta y cubre objetos. - Etanol al 70 % y Etanol al 100% Microorganismos: Suspensión de: Escherichia coli, Bacillus subtilis. - Suspensión mixta de bacterias - Muestras de agua tratada -Muestras de suelo del jardín 4. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA TÉCNICA DE AISLAMIENTO POR ESTRÍA CRUZADA Al inicio del trabajo en el laboratorio, establecer una zona aséptica entre dos mecheros encendidos sobre la mesa de trabajo previamente desinfectada. Realizar todas las operaciones de cultivo y aislamiento bajo esta zona aséptica. 1. Siguiendo las instrucciones del profesor, incinerar al rojo vivo el asa bacteriológica, iniciando por el filamento y terminando en la circunferencia del asa. 2. Destapar el tubo que contiene el cultivo de E. coli y tomar el inóculo con el asa estéril, depositando el inóculo sobre la superficie de la placa de EMB (Agar Eosina Azul de Metileno), deslizar el asa con el inóculo sobre el medio de cultivo y hacer una serie de estrías como indique el profesor (Ver esquema). 4. incinerar y enfriar el asa en el agar antes de realizar otro estriado. 5. Después de finalizar las estrías cerrar la caja, etiquetarla y colocarla en posición invertida sobre la mesa. 6. Realizar las siembras por duplicado. 7. Etiquetar las placas con fecha, técnica y microorganismo. 8. Incubar las bacterias a 37 °C durante 24 horas. 9. Repetir el procedimiento en las placas que contienen Agar nutritivo. 10. Describir la morfología colonial de una colonia aislada, en EMB y Agar Nutritivo

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TÉCNICA DE AISLAMIENTO POR DILUCIONES DECIMALES (Tres equipos trabajan con agua y tres con suelo) NOTA: Es importante tomar en cuenta las siguientes consideraciones antes de realizar las diluciones. a. Etiquetar perfectamente los tubos con la dilución correspondiente. b. Cada vez que se realice una dilución, agitar perfectamente antes de tomar la alícuota correspondiente. c. Realizar cada dilución con una pipeta estéril diferente. d. Introducir la pipeta en su envoltura original para su esterilización o colocar la pipeta en un frasco con benzal. e. Cuidar de no salirse del área aséptica para evitar alguna contaminación. Preparación de diluciones 1. Colocar la balanza en la zona aséptica y pesar 10 g de la muestra de suelo con la ayuda de una cuchara previamente desinfectada con al alcohol al 70%, transferir la muestra a un matraz que contiene 90 mL de solución salina estéril al 0.85% (Dilución 10 -1). 2. Homogenizar y esperar a que sedimente. 3. Realizar diluciones decimales de 10-2 a 10-7. Transferir un mL de la dilución 10-1 a un tubo que contenga 9 ml de solución salina 0.85 % estéril y así sucesivamente hasta 10-7 4. Para la muestra de agua, transferir 10 mL de la muestra al matraz que contiene 90 mL de solución salina al 0.85% estéril (Dilución 10-1) y proseguir como se menciona en el numeral 3.

90 mL SS

10-1

10-2

10-3

1:10

1:100

1:1000

10 g de suelo ó 10 mL de agua contaminada en 90 mL de SS estéril

9 mL SS

9 mL SS

10-4

10-5

1:10 000

1:100 000

9 mL SS

9 mL SS

10-6 1:1000 000 9 mL SS

10-7 1:10 00 0000 9 mL SS

PREPARACIÓN DE DILUCIONES DECIMALES

a) EXTENSIÓN CON VARILLA DE VIDRIO 1. Con una pipeta estéril de 1 mL tomar 0.1 mL de la dilución 10-5 de la muestra (suelo o agua) y colocarla en el centro de la superficie de una caja de Petri que contiene agar cuenta estándar gelificado. 2. Sumergir una varilla de vidrio acodada en etanol, dejar escurrir y pasarla por la flama del mechero.

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3. Enfriar la varilla de vidrio en un extremo de la superficie de la caja con Agar y con ella extender la alícuota por toda la superficie. 4. Una vez extendida la muestra tapar la caja Petri y colocar la varilla en el vaso con etanol 5. Permitir que seque la superficie de la caja, cerca de la flama del mechero, de la misma manera inocular la segunda caja y repetir con las diluciones 10-6 y 10-7. 6. Etiquetar las cajas con fecha, técnica, grupo, equipo, dilución y nombre del microorganismo. 7. Incubar las cajas en posición invertida a 37 °C durante 24 horas. 8. Contar solamente las colonias de las cajas que se encuentren entre 25 y 250 UFC. 9. Multiplicar el número de unidades formadoras por el inverso de la dilución y reportar UFC/ mL o g. Revisar la NOM-092-SSA1-1994. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Secretaria de Salud México.

TÉCNICA EXTENSIÓN CON VARILLA

b) TÉCNICA DE VACIADO EN PLACA 1. Con una pipeta estéril tomar 1.0 mL de la dilución 10-5 de la muestra bacteriana y colocarla en el centro de una caja Petri vacía estéril, en condiciones asépticas. Se puede utilizar la misma pipeta utilizada en la técnica anterior. 2. Vaciar 15 ml de Agar cuenta estándar, mantenido a 45 °C, homogeneizar por rotación sobre la superficie de la mesa, siguiendo las indicaciones del profesor. 3. Dejar enfriar el medio durante unos minutos. 4. Repetir el procedimiento con la dilución 10-6 y 10-7 recordando que el sembrado de las diluciones se hace por duplicado. 5. Incubar las cajas en posición invertida a 37 °C por 24 horas.

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6. Contar solamente las colonias de las cajas que se encuentren entre 25 y 250 UFC. 7. Multiplicar el número de unidades formadoras por el inverso de la dilución y reportar UFC/ mL o g. Revisar la NOM-092-SSA1-1994. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Secretaria de Salud México. OBTENCIÓN DE COLONIAS AISLADAS 1. Seleccionar una colonia morfológicamente distinguible y aislada para su observación y descripción, realizarle tinción de Gram y observar al microscopio. La colonia aislada deberá estar formada por un solo tipo de microorganismos, homogéneos microscópicamente en forma, tamaño y tinción. 2. Sembrar la colonia aislada, por estría simple en un tubo de agar nutritivo e incubar en las mismas condiciones para crecimiento de bacterias.

5.0 RESULTADOS, ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Describir morfología colonial y dibujar morfología microscópica de los aislados Anotar las ventajas y desventajas de las técnicas de aislamiento empleadas, medio empleado y número de dilución. Comparar los resultados obtenidos para el suelo y el agua en los diferentes equipos, con base al número de microorganismos obtenidos por gramo o mililitro de suelo. Discutir los cálculos con base a los criterios establecidos en la NOM-092-SSA-1994 6. CUESTIONARIO A.Realizar un esquema del aislamiento de una cepa bacteriana B.¿Qué es un cultivo axénico o puro? C. ¿Qué importancia tiene la obtención de un cultivo puro? D. ¿Cuál es el fundamento de la técnica de aislamiento por estría cruzada? E. ¿Cuál es el fundamento de la técnica de aislamiento por vaciado en placa? F. ¿En qué casos se utiliza la técnica de extensión con varilla? G. ¿Para qué se hacen las diluciones? ¿Es posible sembrar una muestra en forma directa? 7.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CONSULTADAS

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PRACTICA No. 3 RUTAS METABÓLICAS PARA LA OBTENCIÓN DE ENERGÍA: RESPIRACIÒN Y FERMENTACIÒN 1.0 INTRODUCCION Los estudios de clasificación e identificación de las bacterias pueden iniciarse con la detección de sus requerimientos de Oxígeno. Las bacterias, varían considerablemente en sus requerimientos de oxígeno gaseoso. Algunas bacterias no crecen en ausencia de oxígeno (bacterias aerobias), mientras que, otras no se desarrollan en presencia de él (bacterias anaerobias). Otras más se adaptan a su presencia o ausencia (bacterias anaerobias facultativas). Otras bacterias denominadas microaerofílicas, requieren pequeñas cantidades de oxígeno libre y las bacterias aerotolerantes pueden crecer a presiones de oxígeno menores que la presión atmosférica. El Oxígeno es el aceptor final de electrones en la respiración aerobia, y la enzima Citocromo oxidasa le transfiere el par electrónico, formando agua como producto final. Por otra parte, el peróxido de Hidrógeno es el producto final del metabolismo oxidativo aeróbico de los carbohidratos, si se acumula es letal para las células bacterianas, pero algunos microorganismos producen la enzima catalasa que es una hemoproteína (Proteína del Hierro y azufre) que transforma al Peróxido de Hidrógeno en Oxígeno y agua; ambas enzimas están presentes en los organismos aerobios y anaerobios facultativos. En tanto que en la respiración anaerobia, las sales inorgánicas como el Sulfato, Fierro, Azufre, Nitrato, Manganeso, fungen como aceptores finales de electrones. Los microorganismos pueden asimilar los carbohidratos por vía oxidativa (respiración) en presencia de oxígeno o por vía fermentativa en ausencia de oxígeno, esta característica particular de cada bacteria nos permite establecer los criterios para su identificación. Los productos del rompimiento de los carbohidratos por los microorganismos son principalmente ácidos orgánicos como el ácido Pirúvico, ac. Láctico, ac. Acético y en algunos casos, la producción de CO2. Los microorganismos anaerobios fermentan compuestos orgánicos por un proceso denominado fosforilación a nivel de sustrato y en el laboratorio se ilustra con la fermentación de carbohidratos. Determinación del tipo de metabolismo oxidativo o fermentativo en el Medio OF Las bacterias fermentadoras producen ácido en los dos tubos con y sin sello de aceite mineral. Las bacterias oxidativas presentan producción de ácido solo en el tubo sin aceite mineral. Las bacterias que no utilizan por ninguna vía el carbohidrato presente en el medio, no alteran el medio OF. La interpretación de los resultados de los tubos OF, se realiza de acuerdo al crecimiento y al cambio del indicador que se presenta en los tubos como se indica en el esquema de la Figura 1.

Figura 1. Esquema de Fermentación-Oxidación en el medio OF Asimilación oxidativa o fermentativa de carbohidratos en Caldo Rojo de fenol.- En los tubos con los carbohidratos y rojo de fenol, se determina si hay oxidación o fermentación de carbohidratos por cambio de color del indicador de rojo a amarillo y producción de gas (Figura 2)

Figura 2. Esquema para la interpretación de la asimilación de carbohidratos

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Utilización de Citrato o Malonato como fuente de carbono y energía. Algunas bacterias tienen la capacidad de utilizar el Citrato o el Malonato provenientes del Ciclo de Krebs, como fuente carbono y energía, por lo que la asimilación aerobia de estos compuestos se manifiesta por el crecimiento en la zona de la estría. Determinación de la enzima Citocromo oxidasa La enzima citocromo oxidasa, transfiere el par electrónico al reactivo p-fenilen metilen diamina, en lugar del Oxígeno, dando como resultado un compuesto colorido. Determinación de la enzima catalasa La catalasa transforma al Peróxido de Hidrógeno en Oxígeno y agua, si está presente en el cultivo, se detecta la presencia de burbujas (Oxígeno). 2.0 Objetivos 2.1 Objetivo general Realizar la primera etapa en la identificación de las bacterias, determinando sus requerimientos de oxígeno y el tipo de metabolismo utilizado para la asimilación de carbohidratos. 2.2 Objetivos particulares  Cultivar tres géneros bacterianos en presencia y ausencia de oxígeno.  Determinar el tipo de metabolismo oxidativo o fermentativo en el Medio OF  Determinar la asimilación oxidativa o fermentativa de carbohidratos en Caldo Rojo de fenol  Determinar la fermentación de carbohidratos en Medio VP-MR  Realizar el cultivo de bacterias en medios de cultivo conteniendo Citrato o Malonato como fuente de carbono y energía.  Determinar la presencia de Citocromo oxidasa y Catalasa en los cultivos bacterianos 3.0 MATERIALES Y REACTIVOS POR EQUIPO 3.1 Cepas bacterianas  Pseudomonas aeruginosa.  Escherichia coli  Proteus sp  Cepa aislada en la práctica anterior 3.2 Medios de cultivo (Por alumno) Cada Alumno trabajará una de las cepas de colección y su cepa aislada en la práctica anterior: 4 Tubos con 4 mL de Medio OF con glucosa como fuente de carbono 4 Tubos con 4 mL de Medio OF con lactosa como fuente de carbono 4 Tubos con 4 mL de Medio OF con Sacarosa como fuente de carbono 2 Tubos con 8 mL de caldo rojo de fenol, campana de Durham y Glucosa 2 Tubos con 8 mL de caldo rojo de fenol, campana de Durham y Lactosa 2 Tubos con 8 mL de caldo rojo de fenol, campana de Durham y sacarosa 2 tubos con Agar TSI 4 Tubos con 3 mL de Medio MR-VP 2 Tubos con 3 mL de Citrato de Simmmons 2Tubos con 3 mL de Caldo Malonato 1 Papel impregnado con p-feniletilendiamina Solución de Peróxido de Hidrógeno al 3% 1 Frasco con aceite mineral estéril.

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Alfa naftol y KOH 4.0 DESARROLLO EXPERIMENTAL  Etiquetar cada tubo con el nombre de la Cepa bacteriana, Nombre del alumno, grupo y fecha.  Realizar una suspensión de la cepa pura en un tubo que contenga 5 mL de solución salina estéril.  Inocular en este orden las pruebas bioquímicas.  Incubar a 35° C durante 24 horas e incubar una serie de medios de cultivo sin inocular para observar las reacciones por cambios de coloración MEDIOS DE CULTIVO FORMA DE INOCULAR tubos con Caldo rojo fenol glucosa tubos con Caldo rojo fenol lactosa tubos con Caldo rojo fenol sacarosa 2 tubos con 4 mL de Medio OF con glucosa 2 tubos con 4 mL de Medio OF con lactosa 2 tubos con 4 mL de Medio OF con Sacarosa 2 tubos con Agar TSI Medio MR-VP (Rojo de metilo) Medio MR-VP (Voges-Proskauer Utilización de citrato (Citrato de Simmmons) Utilización de malonato (Caldo Malonato) Prueba de citocromo oxidasa Prueba de la catalasa

Por asada Por asada Por asada Por picadura y a un tubo agregar 0.5 mL de aceite mineral Por picadura y a un tubo agregar 0.5 mL de aceite mineral Por picadura y a un tubo agregar 0.5 mL de aceite mineral Por asada y picadura Por asada Por asada, Incubar 48 horas Por estría Por asada Por asada. En una tira de papel impregnada del reactivo de oxidasa, colocar una asada de cada cultivo, por separado. Por asada

4.5 Esquemas para inocular los diferentes medios de cultivo

Determinación del metabolismo oxidátivo/fermentativo en medio Hugf y Leifson

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Utilización de Citrato como única fuente de carbono

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Utilización de Malonato como única fuente de carbono

Presencia de la enzima Citocromo- oxidasa.

Presencia de la enzima catalasa

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5.0 RESULTADOS Leer las pruebas bioquímicas tomando en cuenta las indicaciones de la siguiente tabla. FERMENTACIÓN Y RESPIRACIÓN MEDIOS DE CULTIVO 2 tubos con Caldo rojo fenol glucosa 2 tubos con Caldo rojo fenol lactosa 2 tubos con Caldo rojo fenol sacarosa 2 tubos con 4 ml de Medio OF con glucosa

FORMA DE LEER

RESULTADOS

+Positiva: el medio se torna amarillo con la producción de gas, la campana está llena de gas - Negativa: El color del medio es rosa-rojizo. + Positiva: el medio se torna amarillo con la producción de gas, la campana está llena de gas - Negativa: El color del medio es rosa-rojizo. + Positiva: el medio se torna amarillo con la producción de gas, la campana está llena de gas - Negativa: El color del medio es rosa-rojizo. TUBO SIN SELLO DE ACEITE Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios Fermentativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios Sacarolitico: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios. TUBO CON SELLO DE ACEITE Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios Fermentativo: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin cambios Sacarolitico: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin cambios.

2 tubos con 4 mL de Lo mismo que el párrafo anterior Medio OF con lactosa 2 tubos con 4 mL de Lo mismo que el párrafo anterior Medio OF con Sacarosa 2 tubos con Agar TSI Fermentación de Lactosa y Sacarosa, Utilización de glucosa, producción de ácido sulfhídrico Medio MR-VP (Rojo Agregar 2 gotas de rojo de metilo, agitar ligeramente de metilo) + Positiva: Color rojo en la superficie del medio de cultivo (Producción de acetil-metil-carbinol). -Negativa: No hay cambio en el color Medio MR-VP agregar 6 gotas de  naftol y 2 gotas de KOH, sin agitar. (Voges-Proskauer +Positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo. - Negativa: El cultivo no cambia de color Utilización de citrato + Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a

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de sodio (Citrato de Simmmons)

azul intenso - Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color.

Utilización de malonato de sodio (Caldo Malonato)

Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinización (color azul). Negativa: No hay desarrollo

Presencia de citocromo oxidasa

Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un pedazo de papel filtro impregnada con el reactivo (N.N.N.N-tetrametil-pfenilendiamina). + Positiva: aparición de un color azul violeta. - Negativa: No hay cambio de color. Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un portaobjetos que contiene 2 gotas de peróxido de hidrogeno y observar. + Positiva: Presencia de burbujas de oxígeno. - Negativa: Ausencia de burbujas de oxígeno.

Presencia de catalasa

6.0 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 1.- Discute e ilustra con las rutas metabólicas que utilizan los microorganismos para la respiración o fermentación de carbohidratos. Discutir la importancia de las pruebas bioquímicas realizadas para la identificación de microorganismos así como el uso de las tablas para identificar a los microorganismos. 2.- ¿Que Indicadores se utilizan en los medios utilizados en las pruebas de esta práctica y en que se fundamenta cada prueba de fermentación y enzimática? 3.- ¿Que otras enzimas utilizan los microorganismos que utilizan la respiración aerobia? 4.- ¿Que otras enzimas utilizan los microorganismos que utilizan la respiración anaerobia durante la reducción desasimilatoria de sulfatos y nitratos? 5.- De acuerdo a los resultados obtenidos y comparando con una tabla metabólica o bioquímica ¿que tipo de metabolismo tienen cada uno de los microorganismos utilizados en esta práctica? 6. Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica. 7.0 CUESTIONARIO 1. ¿Qué pasaría si las pruebas bioquímicas se dejaran más de 24 horas? 2. ¿Por qué siempre que se identifica una bacteria se pone una serie de pruebas bioquímicas sin inocular? 3. Explicar por qué en las pruebas de fermentación de azúcares en tubos con campana de Durham se emplea un indicador de pH, cual es el indicador y cuál es su rango de sensibilidad. 4. ¿Qué otros azúcares se pueden utilizar para la fermentación de azúcares? 5. ¿Cuál es el fundamento de las pruebas de utilización de citrato y malonato y cual es el indicador de pH que se emplea en estas pruebas bioquímicas? 6. ¿Cómo se determina el metabolismo oxidativo y/o fermentativo de la glucosa? 7. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de citocromo oxidasa? 8. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de la catalasa? 8.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS DE LA PRÁCTICA Allen S., Dowell V.R., Sommers H. M. (1989). Diagnóstico Microbiológico. Texto y Atlas color. Editorial Médica Panamericana, México D.F., 533 págs.

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Koneman. E: W Allen, S.D., Dowell, VR., Sommers, H.M. Diagnóstico Microbiológico. Traducción: Wasserman. A. V. Editorial Médica Panamericana. México. 1984. Madigan M.T., Martinko J.M., Parker J. (2006). Brock Biología de los microorganismos. Editorial Pearson Prentice Hall, 10th edición. 1025 págs.wa Mac Faddin. J.F., Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. Traducción Lorenzo, I., Editorial Médica Panamericana, México. 1984. MacFaddin, Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias. Ed. Panamericana, S.A. 1997. Seeley H.W. , Vandemark P.J., Lee J.J. ( 2003). Microbes in action. Laboratory manual of Microbiology. Ed. W. H. Freeman and Co. New York. 450 págs. 9.0 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS CONSULTADAS Bibliografía.- Redacta la bibliografía que consultes de acuerdo a lo establecido en la Práctica No. 1

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PRÁCTICA No. 4 CICLOS BIOGEOQUÍMICOS, (Ciclo del Nitrógeno) 1.0 INTRODUCCIÓN El nitrógeno es un constituyente esencial de todos los seres vivos. Es el principal componente de las proteínas y los ácidos nucleicos de ahí su gran importancia. La conversión y circulación de nitrógeno en la biosfera constituyen el segundo proceso más importante después de las transformaciones del carbono dentro de los ciclos biogeoquímicos. En el ciclo del nitrógeno, éste sufre una serie de transformaciones que involucran compuestos orgánicos e inorgánicos. Las reacciones principales es este ciclo son las siguientes: El nitrógeno sufre una serie de transformaciones que involucran compuestos orgánicos e inorgánicos. Estas reacciones constituyen un ciclo siendo sus procesos principales: 1. Proteólisis.- Este proceso puede llegar hasta la formación de amonio (mineralización), consiste en la degradación de proteínas, liberando generalmente aminoácidos o pequeños péptidos. Estos procesos bioquímicos en los cuales el proceso de degradación de proteinas es incompleto permite a otros organismos aprovechar los intermediarios para su propio metabolismo. Muchas bacterias llevan a cabo este proceso favoreciendo la eliminación de detritus. 2. Amonificación (mineralización).- El nitrógeno orgánico es reincorporado al ciclo a partir de la materia orgánica en descomposición produciendo amonio, CO2 y agua. 3. Nitrificación.- La oxidación biológica del amonio para formar nitritos y nitratos se denomina nitrificación y las bacterias responsables de este proceso reciben el nombre de microorganismos nitrificantes. Éstos, pueden dividirse en dos grupos principales: Nitrosomonas que es característico de las bacterias que oxidan el amoniaco a nitrito (nitritación) y Nitrobacter que representa a las bacterias que oxidan el nitrito a nitrato (nitratación). Ambos grupos de bacterias son quimiolitotróficas. 4. Desnitrificación.- La producción de nitrógeno gaseoso como resultado de la acción microbiológica sobre compuestos de nitrógeno se conoce como desnitrificación. La acción de los microorganismos es típicamente sobre los nitratos y los nitritos, siendo los productos finales de la reacción: nitrógeno molecular (N2), óxido nitroso y ocasionalmente óxido nítrico. Especies de los géneros Pseudomonas, Achromobacter, Bacillus y Micrococcus son las bacterias desnitrificantes más activas, son comúnmente aerobias pero están adaptadas a utilizar nitrato o nitrito en ambientes con baja o nula presencia de oxígeno libre. El nitrógeno molecular es liberado y llega a formar parte de la atmósfera. Este proceso equivale a una pérdida neta de nitrógeno biológico de los suelos y aguas del mundo. 5. Fijación.- La fijación de nitrógeno es el proceso que indemniza la pérdida neta contraída por la desnitrificación; es el proceso de activar el nitrógeno del aire que es inerte (N2) y transformarlo en asimilable (NH3). La capacidad para fijar nitrógeno se halla limitada a los microorganismos procariontes. Desde un punto de vista ecológico los fijadores de nitrógeno más importantes son aquellos que lo fijan en asociación con plantas. Sin embargo las bacterias de vida libre realizan una importante aportación especialmente en suelos pobres o sin abonar. Muchas cianobacterias fijan nitrógeno que pueden ser la principal fuente de entrada de nitrógeno en diferentes ecosistemas (tundra, océanos, etcétera). 2.0OBJETIVOS 2.1OBJETIVO GENERAL 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 2.2.1Describir el ciclo del nitrógeno y el papel de los microorganismos en el proceso de la fijación de nitrógeno. 2.2.2 Analizar el proceso de la fijación de nitrógeno que realizan los microorganismos de la muestra. 2.2.3 Distinguir la morfología colonial y microscópica de las colonias desarrolladas.

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3.0 MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 MATERIAL BIOLÓGICO Muestra de suelo rizosférico (frijol, haba, chícharo, lenteja, trébol u otra leguminosa) o muestra de agua (residual). 3.2 MATERIALES Y EQUIPO 1Varilla de vidrio acodada (varilla de Driglasky) 5Pipetas serológica de 1 mL Estéril 1Pipeta serológica de 10 mL Estéril 1Caja de Petri de 20 x 100 mm Limpia 3.4 REACTIVOS, SOLUCIONES Y MEDIOS DE CULTIVO 1 Frasco de dilución con 90 mL de solución salina al 0.85% de NaCl estéril . 4Tubos de ensaye de 16 x 150 mm con tapón de rosca con 9 mL de solución salina al 0.85% estéril. 5Tubos de ensaye de 16 x 150 mm con tapón de rosca con 4.5 mL de medio para nitrificadores fase I. 5 Tubos de ensaye de 16 x 150 mm con tapón de rosca con 4.5 mL de medio para nitrificadores fase II. 5Tubos de ensaye de 16 x 150 mm con tapón de rosca con 4.5 mL de medio para desnitrificadotes y campana de Durham. 6 Cajas de Petri con agar leche. 6 Caja de Petri con agar gelatina. 1Frasco de Reactivo de Griess A. 1Frasco de Reactivo de Griess B. 1Matraz Erlenmeyer de 125 mL con 25 mL de alcohol etílico. 1Frasco con HgCl2 (concentrado). 4.0 DESARROLLO EXPERIMENTAL A) PREPARACIÓN DE DILUCIONES Pesar y colocar 10 g de suelo a una botella de dilución conteniendo 90 mL de solución salina fisiológica estéril (NaCl 0.85%) quedando una dilución de 10-1, tapar la botella y agitar vigorosamente. Tomar 1 mL de la dilución anterior y transferir a un tubo con 9 mL de solución salina estéril (dilución 10-2), de ésta tomar la misma cantidad y transferir a un segundo tubo (dilución 10-3) y así sucesivamente hasta obtener una dilución de 10-5. Cuidar de homogeneizar perfectamente la solución antes de cada transferencia. B) PROTEOLISIS Tomar alícuotas de 0.1 mL de las diluciones 10-2, 10-3 y 10-4 y colocarlas en cajas de agar gelatina y de agar leche. Distribuir uniformemente en la placa usando una varilla de vidrio acodada estéril. Incubar a 28º C durante 48 h. En las cajas con agar leche, contar aquellas colonias que tienen un halo transparente, en las cajas de agar gelatina agregar unas gotas de HgCl2 y contar aquellas colonias que presenten también un halo transparente. C) AMONIFICACIÓN Inocular cada tubo que contiene medio de Stuart con 0.5 mL de las diluciones 10-2 a 10-4 (tres tubos por dilución). Incubar a 28º C durante 7 días. Incluir un tubo no inoculado como testigo. Evaluar el proceso de amonificación a los 8 días; registrando como positivos los tubos que cambiaron el color del medio de rojo a rosa intenso.

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D) NITRIFICACIÓN FASE I (NITRITACIÓN) Inocular a cada tubo conteniendo medio inorgánico con amonio como fuente de nitrógeno (nitritación) con 0.5 mL de las diluciones 10-4 a 10-5 (dos tubos por dilución). Incubar a 28º C durante 14-21 días. Incluir un tubo no inoculado como testigo. Después de la incubación, agregar cinco gotas de cada uno de los reactivos de Griess a cada tubo a probar. Un color rosa intenso o rojo, indica la presencia de nitritos. Si el medio no desarrolla color indica que aún falta tiempo de incubación para que el proceso se lleve a cabo, o bien, que la reacción ha llegado hasta nitratos. A los tubos que dieron negativo para nitritos, agregar granalla de zinc. Si se desarrolla un color rojo el tubo será positivo para la nitritación. Sólo hacer esta última prueba en los tubos con medio para nitritación FASE II (NITRATACIÓN) Inocular a cada tubo conteniendo medio inorgánico con nitrito como fuente de nitrógeno (nitratación) con 0.5 mL de las diluciones 10-4 a 10-5 (dos tubos por dilución). Incubar a 28º C durante 14-21 días. Incluir un tubo no inoculado como testigo. Después del período de incubación, agregar cinco gotas de cada uno de los reactivos de Griess a cada tubo a probar. La prueba es positiva para los tubos que no desarrolle color o la reacción sea débil. En el tubo testigo se debe desarrollar un color rojo o rosa intenso. E) DESNITRIFICACIÓN Inocular a cada tubo conteniendo medio para desnitrificadores con 0.5 mL de las diluciones 10-4 a 10-5 (dos tubos por dilución). Incubar a 28º C durante 7 días. Incluir un tubo no inoculado como testigo. Registrar como lectura positiva cuando observe producción de gas en la campana de Durham. F) FIJACIÓN Hacer un frotis de las bacterias fijadoras de nitrógeno a partir de un nódulo radical de frijol, haba, trébol, alfalfa o de otra leguminosa. G) MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA Teñir los frotis anteriores por la Técnica de Gram. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión y describir la morfología microscópica. 5.0 RESULTADOS 5.1Registrar los resultados obtenidos en las tablas 4.1 y 4.2 5.2 Con los resultados obtenidos determinar las UFC/g ó mL de microorganismos proteolíticos y amonificadores. Tabla 5.1 Número de microorganismos representantes de los procesos del Ciclo del Nitrógeno (Cuenta en Placa). PROCESO DILUCIÓN UFC/g (Base Seca) CON LECHE PROTEOLISIS

CON GELATINA

Tabla 5.2 Número de microorganismos representantes de los procesos del Ciclo del Nitrógeno. PROCESO TUBOS POSITIVOS POR Ufc/g DILUCIÓN Amonificación Nitrificación Nitritación Nitratación Desnitrificación

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Dibujar los microorganismos fijadores de nitrógeno observados. Indicando la amplificación a la que se hicieron las observaciones. 6.0 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Para cada una de las fases del Ciclo del Nitrógeno dé un ejemplo de un microorganismo que participe en ella. De acuerdo con la fuente de nitrógeno empleada en cada proceso escribir las reacciones que se llevan a cabo y analizar. Discutir sobre las implicaciones ecológicas que representan sus resultados. Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica. 7.0 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS DE LA PRÁCTICA Atlas R. M. Bartha, R. Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental. 4ª. Edición, Addison Wesley. 2002. 130 Págs. Madigan, Martinko, Parker. Brock Biology of the microorganims. 10th. edition, Prentice may, 2005. 892 Págs. Schlesinger W.H., Biogeoquímica. Editorial Ariel S.A. Barcelona. 2000. 577 Págs. 8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS CONSULTADAS Redacta la bibliografía que consultes de acuerdo a lo establecido en la Práctica No. 1

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PRACTICA No.5a CRECIMIENTO MICROBIANO 1.0 INTRODUCCIÓN Al hablar de crecimiento microbiano nos referimos al incremento del número de células, es decir el crecimiento poblacional constituído por millones de células. Al conocer las condiciones para el crecimiento microbiano, podemos predecir la rapidez con que crecerán estos en distintas situaciones y determinan la forma de controlar su crecimiento, estos requerimientos pueden ser físicos y químicos. Los aspectos físicos incluyen la temperatura, el pH y la presión osmótica y entre los requerimientos químicos están el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno, las sustancias minerales, el oxígeno y los factores orgánicos de crecimiento. Las bacterias se reproducen generalmente por fisión binaria, una división celular da lugar a dos células, la división de estas células produce cuatro y así sucesivamente. El tiempo necesario para que una célula se divida y por consiguiente para que su población se duplique, es lo que se llama tiempo de generación o tiempo de duplicación, puesto que, para los organismos unicelulares; cada duplicación constituye una nueva generación, varía considerablemente entre los diferentes microorganismos. La mayoría de las bacterias tienen un tiempo de generación de una a tres horas. Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de líquido o en gramo de material sólido. Los métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeñas, después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total. Los métodos recomendados para medir la población son: • Recuento en placa • Diluciones seriadas. • Siembra por vaciado en placa. • Siembra por extensión con varilla. • Filtración. • Método del número más probable. • Recuento directo al microscopio (cámara de Neubauer). Hay otros 3 métodos llamados indirectos: • Turbidimetría. • Actividad metabólica. • Peso seco. Es importante diferenciar entre el crecimiento de las células individuales y el crecimiento de poblaciones de células (proliferación). El crecimiento de una célula es el aumento en su tamaño y peso y generalmente es la antesala de la división celular. Por otra parte, la proliferación es el aumento del número de células a consecuencia del crecimiento y la división celulares. Una vez que se proveen de nutrientes necesarios al microorganismo, la célula empieza a crecer y/o a producir algunos metabolitos. Fases del crecimiento En un cultivo microbiano todas las partes están sujetas a las mismas condiciones de temperatura, pH, concentración de nutrientes, en la figura 1, se indican diferentes fases que ocurren en un cultivo, en donde se refleja los cambios en la biomasa con respecto al tiempo. En cada una de las fases del crecimiento microbiano ocurren cambios en la población, mismos que determinan la forma de la curva de crecimiento.  I. Fase lag Es un período de adaptación, cuando un cultivo de microorganismos es llevado de un ambiente a otro. Los microorganismos sufren una reorganización tanto en su velocidad de crecimiento como en sus constituyentes macromoleculares. Durante esta etapa la masa celular puede cambiar sin cambiar el número de células.

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 II. Fase exponencial Es un período de balance o de estado estacionario en el crecimiento, durante el cual la velocidad específica de crecimiento es constante. La composición química del medio de cultivo está cambiando debido a que los nutrientes se están consumiendo y productos metabólicos son producidos.  III. Fase estacionaria Los nutrientes se agotan y los productos tóxicos se acumulan. La masa total puede permanecer constante pero el número de células puede descender. La tasa de crecimiento es igual a la tasa de muerte.  IV. Fase de declinación o muerte La tasa de muerte es mayor que la tasa de crecimiento. Los nutrientes se agotan y se acumulan productos tóxicos

Fig.1 Fases del crecimiento microbiano. Parámetros de la curva de crecimiento Si se sigue el crecimiento de un cultivo en lote a través de la multiplicación de la masa, nos interesarían tres parámetros que son la producción, la tasa de crecimiento y el periodo de latencia. La producción es la diferencia entre la masa bacteriana inicial y la máxima: X = Xmax- X0 La tasa de crecimiento exponencial es una medida de la velocidad del crecimiento celular (velocidad específica de crecimiento celular) se designa con la letra griega μ en la fase exponencial del crecimiento. Se calcula a partir de las densidades bacterianas X0 y Xt en los tiempos t0 y t, en la fase de crecimiento exponencial según μ = ln Xt – ln X0 t – t0 El tiempo de duplicación es td = ln 2 / μ Los métodos que vamos a utilizar en el laboratorio de técnicas microbiológicas es el de cuenta viable por extensión con varilla, y por turbidimetría que es un método indirecto que mide la densidad de una suspensión por su extinción, en algunas ocasiones se utiliza el nefelómetro. 2.0 OBJETIVOS 2.1 Objetivo General El alumno aplicará las técnicas más utilizadas para el recuento de microorganismos para determinar el crecimiento microbiano y algunos parámetros matemáticos que lo definen. 2.2 Objetivos Específicos 2.2.1 El alumno llevará a cabo el seguimiento de un cultivo sumergido con y sin agitación a nivel matraz de Escherichia coli 2.2.2 El alumno cuantificará el número de microorganismos viables a través del recuento por diluciones y vaciado en placa como unidades formadoras de colonias (UFC) a diferentes intervalos de tiempo. 2.2.3 El alumno estimará el crecimiento microbiano por la técnica de turbidimetría y comparación con el nefelómetro de McFarland.

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3.0 MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS 3.1 MATERIAL Por cinética (para una sección del laboratorio): • 1matraz nefelométrico con 50 mL de caldo nutritivo estéril (matraz semilla ó para inocular) • 10 Matraces de 125mL con 25 mL de caldo nutritivo estéril (matraces de crecimiento) • 1 matraz de 1 L con 600 mL de agar cuenta estándar (para el vaciado en placa) • 1 juego de nefelómetro de Mac Farland • 2 celdas y un portaceldas para espectrofotómetro • 120 tubos de 16 x 150 mm con 9 mL de solución salina (para las diluciones) • Pipetas de 2,5 y 10 ml estériles • 40 Cajas de Petri estériles (para el vaciado en placa) 3.2 REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO • NaCI ó peptona • Caldo nutritivo • Agar cuenta estándar 3.3 EQUIPO • Espectrofotómetro • Autoclave • Horno • Incubadora a 37° C • Contador de colonias 3.4 CEPAS: Cepa de Escherichia coli 4.0 DESARROLLO EXPERIMENTAL PRIMERA SESIÓN 4.1 PREPARACIÓN DE MATRAZ SEMILLA 4.1.1 Inocular en condiciones de esterilidad un matraz nefelométrico conteniendo 50 mL de caldo nutritivo estéril con 2.5 mL de una suspensión de Escherichia coli ajustado al tubo 3 del nefelómetro de Mac Farland (aproximadamente 6

3x10 de células de E. coli). Inocular los matraces de cinética con esta suspensión. NOTAS A.- El día de la cinética tomar en condiciones de esterilidad 3 mL y medir la turbidez en el espectrofotómetro. B.- De lo que quede en la pipeta realizar una tinción de Gram para verificar la pureza de nuestro matraz semilla. C.- Enjuagar una celda espectrofotométrica con benzal y luego en condiciones de esterilidad enjuagarla con alcohol, ahora con una pipeta estéril tomar 3 mL de caldo nutritivo del matraz de cinética y colocarlo en la celda espectrofotométrica y colocarle parafilm (este es el blanco para ajustar el espectro y poder leer cada muestra). 4.2 INOCULACIÓN DE MATRACES DE CINÉTICA 4.2.1 Homogeneizar la suspensión microbiana del matraz semilla y tomar una muestra de 2.5 mL de esta suspensión en condiciones de esterilidad e inocular el mismo volumen a 10 matraces (de 125 mL) con 25 mL de caldo nutritivo estéril (etiquetados previamente desde t0 hasta t9 para la cinética y homogeneizarlos nuevamente. 4.2.2 Cada uno de los matraces corresponderá a un tiempo de cinética de 90 minutos, el primer matraz (tiempo cero) se separa de los demás para procesar como se indica en el punto 4.4.2, los demás matraces se colocan en agitación aproximadamente a 120 rpm y se retirarán de la agitadora en cada muestreo para tratarlos como el primer matraz.

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4.2.3 Después de retirar cada 90 minutos los matraces correspondientes y tratarlos como en el punto 4.4.2 se guardan en refrigeración para continuar en la siguiente sesión con el tratamiento de las muestras para la determinación de cuenta viable y en UFC/mL. 4.3 MUESTREO PARA DETERMINACIÓN DE TURBIDIMETRÍA Y RETIRO DE MATRACES DE CINÉTICA 4.3.1 Con una pipeta de 5 mL tomar inmediatamente la primera muestra de 3 mL en condiciones asépticas, ésta será la muestra de tiempo cero (t0), se ocupa para la técnica de turbidimetría. Después colocar el matraz en refrigeración para su posterior tratamiento de cuenta viable. 4.3.2. Cada hora, o según los tiempos establecidos, en condiciones de esterilidad se retiran los matraces correspondintes y se toma una muestra de 3 mL para determinar la absorbancia por turbidimetría. Recuerda que inmediatamente después de tomar la muestra debes colocar el matraz en refrigeración. 4.4 DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO POR TURBIDIMETRIA Tiempo

t0

Dilución 10-5, 10-6

t1

t2

t3

t4

t5

t6

t7

t8

t9

t10

10-6, 10-7

10-7, 10-8

10-8, 10-9

10-9, 10-10

10-11, 10-12

10-12, 10-13

10-13, 10-14

10-14, 10-15

10-15, 10-16

10-15, 10-16

4.4.1 Prender el espectrofotómetro con el paso de luz bloqueado y ajustar a 100% de transmitancia y cero de absorbancia con la celda que contiene el caldo nutritivo (blanco) a una longitud de onda de 540 nanómetros (seguir indicaciones y recomendaciones de uso por los profesores). 4.4.2 Tomar 3 mL de muestra de cada una de los matraces desde el tiempo cero hasta el tiempo final en condiciones de esterilidad y colocarla en la celda espectrofotométrica. Tapar la celda con parafilm, y leer en el espectrofotómetro para registrar la absorbancia; esta lectura corresponde a la turbidimetría adquirida por aparición de células a lo largo de la cinética. 4.4.3 Después de obtener la lectura desecha el contenido en benzal, y enjuaga la celda con benzal, para posteriormente enjuagarlo con agua, junto al espectro tenemos los frascos de desecho. No olvidar colocar los matraces en refrigeración para continuar con la técnica de recuento de colonias en la siguiente sesión. SEGUNDA SESIÓN 4.5 DILUCIONES PARA REDUCCIÓN DE CARGA MICROBIANA 4.5.1 Sacar de refrigeración los matraces de la cinética y homogenizar cada uno antes de abrirlos en condiciones asépticas 4.5.2 Tomar un mililitro del matraz de cinética, bajo condiciones asépticas y pasarlo a un tubo que contenga 9 mL -1

de solución salina fisiológica, para realizar la dilución 10 . Mezclar el tubo, tomar un mililitro y colcarlo en otro tubo -2

con 9 mL de solución salina para obtener la dilución 10 . 4.5.3 El número de diluciones que se realicen dependerá del crecimiento que se encuentre por turbidimetría, si la -6

-7

turbidez alcanza una absorbancia de 0.2, entonces realizar hasta las diluciones 10 y 10 . Conforme aumente el número de microorganismos aumenta el número de diluciones, recordemos que debemos tener un intervalo de conteo. 4.5.4 Se sugiere seguir la siguiente tabla llegando a las correspondientes diluciones para cada tiempo: Tabla1. Diluciones a realizar para los diferentes tiempos de la cinética microbiana 4.6 DETERMINACIÓN DE CUENTA VIABLE POR VACIADO EN PLACA 4.6.1 De las últimas 2 diluciones realizada a cada tiempo tomar 1 mL y colocarlo en una caja Petri estéril previamente etiquetada, (técnica, dilución, equipo y tiempo).

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4.6.2 Adicionar aproximadamente 15 mL de agar cuenta estándar a una temperatura de 45° C, recordar las recomendaciones de la técnica de vaciado en placa. 4.6.3 Homogeneizar por rotación en la superficie de la mesa y dejar enfriar hasta que solidifique el agar e incubar a 37° C durante 24 horas. 4.6.4 Contar las colonias de cada placa, considerando únicamente las placas que contengan entre 25 y 250 colonias. 4.6.5 Calcula el número de bacterias viables por mL de cultivo, multiplicando por el inverso de la dilución. 5.0 RESULTADOS 5.1 Turbidimetría: anota los resultados obtenidos de lecturas de absorbancia en los tiempos correspondientes. MUESTRA TIEMPO (min) ABSORBANCIA (nm) T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 5.2 Cuenta viable por vaciado en placa: Anota el número de colonias que se desarrollaron en las cajas petri con agar cuenta estándar. MUESTRA TIEMPO (min) DILUCIÓN No. de UFC/mL T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10  Anota el número de células totales que se contabilizaron en cada uno de los tiempos de la cinética.  Con los resultados obtenidos del método de cuenta viable determina el número de unidades formadoras de colonias en los 25 mL del medio de cultivo.

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 Construye una gráfica del número de UFC/mL vs tiempo, señalando en la curva las diferentes zonas de crecimiento.  Construye una gráfica de Absorbancia vs Tiempo (horas).  Construye una gráfica del ln del número de UFC/mL vs tiempo (horas).  Determina la velocidad específica de crecimiento máxima.  Calcula el tiempo de generación de la cepa estudiada. 6.0 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 Discute las ventajas y desventajas de los métodos empleados. 6.2 Analiza y discute sobre la base de lo anterior y a la investigación bibliográfica realizada, los resultados obtenidos en esta práctica. 6.3 Discute la conveniencia o no de construir una curva de calibración con los resultados de turbidimetría y de cuenta viable para un microorganismo dado, de ser conveniente explica para qué podrá servir. Elabora las conclusiones sobre la base de los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica. 7.0 CUESTIONARIO ¿Es posible diferenciar células muertas de las vivas en todos los métodos utilizados? Define el término crecimiento microbiano Define el término Velocidad Específica de Crecimiento Menciona los factores de que depende la fase de muerte Explica fisiológicamente qué sucede en la fase lag. ¿Por qué es importante la cinética microbiana en la ingeniería ambiental? 8.0 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS DE LA PRÁCTICA Atlas, R. W. 1988. Microbiology. Second edition. Mc. Millan Public, U. K. 807 pág. Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. 1997. Biología de los Microorganismos. Octava edición. Prentice Hall, España. 956 pág. Moat, A. G., J. W. Foster, M. P. Spector. 2002. Microbial Phisiology. Fourth edition. Wiley-Liss, USA. 715 pág. 9.0 REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS CONSULTADAS Enlistar las referencias bibliográficas como se te indica en la práctica 1.

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PRÁCTICA No. 5b FACTORES AMBIENTALES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO MICROBIANO 1.0 INTRODUCCIÓN El crecimiento microbiano se afecta por diferentes factores físicos como la Temperatura, Desecación, Radiaciones, Ondas sonoras, Presión hidrostática, Presión osmótica, pH. De igual forma agentes químicos como los desinfectantes, antisépticos, quimioterápicos, antibióticos, metales pesados y los Halogenuros, tienen efecto letal sobre la mayoría de los microorganismos. La temperatura es el factor ambiental que ejerce una variada influencia sobre el crecimiento microbiano, el crecimiento microbiano se ve afectado de manera importante por la temperatura por lo que los microorganismos se clasifican en psicrofílicos: (0 °C a 20 ºC), los mesofílicos crecen entre 20 y 40 ° C y los termofílicos: crecen entre 40 y 80 ° C. El Punto térmico mortal (PTM) es la forma más común de determinar la sensibilidad al calor de los microorganismos, y se define como la temperatura mínima necesaria para que todos los organismos de una población mueran en 10 minutos. El tiempo térmico mortal (TTM), es otra constante que se determina para cada microorganismo y es el tiempo mínimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensión a 70ºC. La elevada concentración de solutos en la célula genera una presión interna que recibe el nombre de presión osmótica; las bacterias poseen paredes celulares rígidas y por lo general no presentan cambios muy pronunciados de forma y tamaño cuando experimentan plasmólisis o plasmoptisis. Existen microorganismos que crecen en medios con alta concentración de solutos y reciben el nombre de osmofilicos, como son los halofílicos, que crecen en altas concentraciones de sal y los sacarofílicos, que crecen en altas concentraciones de azúcar. De acuerdo al pH óptimo en el cual se desarrollan, los microorganismos se clasifican en acidófilos, neutrófilos, basófilos. Los metales pesados presentan actividad antimicrobiana, actúan generalmente por medio de la precipitación de enzimas o de otras proteínas esenciales para la célula o interfieren con algunas funciones celulares, el mercurio, la plata, el arsénico, el zinc y el cobre son los más utilizados, se utilizan en bajas concentraciones ya que tienen buena actividad antimicrobiana. Compuestos halogenados como el yodo, cloro, el hipoclorito, actúan como oxidantes de los constituyentes celulares, como las proteínas. Los antibióticos se definen como substancias producidas por un microorganismo, la cual a bajas concentraciones inhibe el crecimiento de los microorganismos, por su modo de acción, los antibióticos se pueden clasificar como bactericidas, bacteriostáticos, macrólidos, polipéptidos y grupo misceláneo. La pasteurización es un proceso térmico en el que se aplica un calentamiento moderado seguido de un enfriamiento brusco, con la finalidad de reducir la carga microbiana presente en productos que son termo sensibles, este proceso no es un método de esterilización, puesto que existen microorganismos que resisten la pasteurización, a los cuales se le conoce con el nombre de termodúricos; ejemplo de ellos son algunas especies de los géneros: Streptococcus, Micrococcus, Corynebacterium, Lactobacillus, Arthrobacter, Bacillus y Clostridium. 2.0 OBJETIVOS 2.1 Objetivo General Determinar la influencia de algunos factores ambientales sobre el crecimiento de los microorganismos. 2.2 Objetivos Específicos Determinar la temperatura óptima de crecimiento, el punto térmico mortal (PTM) y el tiempo térmico mortal (TTM) de algunos microorganismos. Determinar el efecto de la presión osmótica y pH sobre el crecimiento de los microorganismos. Determinar el efecto de algunos metales pesados, halógenos y antibióticos sobre el crecimiento de los microorganismos.

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3.0 MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 MATERIAL POR EQUIPO  Pipetas de 1,2,5 y 10mL estériles.  Tubos de 13x 100mm con 5 mL de caldo nutritivo  Placas con agar nutritivo  Tubos con 9 rnL de solución salina fisiológica  Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivos pH 3. 5  Tubos de 13x l00 mm con 3 mL de caldo nutritivo a pH 7.0  Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivo a pH 9.0  Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivo con 1% de cloruro de sodio  Tubos de 13x100 mm con 3 mL de caldo nutritivo con 3% de cloruro de sodio  Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivo con 5% de cloruro de sodio  3 Matraces con 120 mL de agar cuenta estándar  Discos de papel filtro de 1 cm de diámetro  Cajas de Petri estériles  Pinzas de disección  Discos de papel filtro impregnados con hipoclorito de sodio  Discos de papel filtro impregnados con yodo  Sensidiscos con diferentes antibióticos 3.2 EQUIP0  1 termómetro  1 refrigerador a 4°C  1 incubadora a 25°C  1 incubadora a 35°C  1 baño María a 50°C  1 baño María a 60°C  1 baño María a 70°C  1 baño María a 80°C  1 baño María a 92°C  1 autoclave  Probetas  Horno 3.3 CEPAS MICROBIANAS  Bacillus sp.  Pseudomonas sp.  Escherichia coli 4.0 DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1 DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA ÓPTIMA DE CRECIMIENTO 4.1.1 Preparar una suspensión del microorganismo se utilizara el mismo microorganismo en todos los experimentos. 4.1.2 Etiquetar 4 tubos con 3 mL de caldo nutritivo con: nombre del microorganismo, fecha, equipo, grupo y con las siguientes temperaturas, 5°C, 28°C, 35°C y 50°C. 4.1.3 Inocular cada uno de los tubos con 0.1 mL de la suspensión microbiana, dejar un tubo sin inocular que servirá como testigo. 4.1.4 Incubar los tubos a la temperatura correspondiente durante 24 horas.

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4.1.5 Después de este tiempo observar si hay crecimiento haciendo anotaciones con un signo (+) dependiendo de cuanto turbidez se observe y si no hay crecimiento con un signo (-).

4.2 DETERMINACIÓN DEL PUNTO TÉRMICO MORTAL (PTM) 4.2.1 Etiquetar una serie de 7 tubos conteniendo cada uno 3 mL de caldo nutritivo, con las siguientes temperaturas: 35°, 50°, 60°, 70°, 80° y 92° C y un tubo que se mantendrá a temperatura ambiente, 4.2.2 Inocular cada tubo con 0. 1 mL de la suspensión microbiana. 4.2.3 Calentar los tubos a las temperaturas correspondientes durante 10 minutos. 4.2.4 Dividir una caja Petri con agar nutritivo en 7 partes (Fig. 1) y marcar con 37°, 50°, 60°, 70°, 80°, 92° C y el testigo 4.2.5 Sembrar por estría simple sobre el agar en su correspondiente temperatura. 4.2.6 Incubar la placa durante 48 horas a 25° C si se sembró a mohos y a 35° C, 24 horas si se trata de bacterias y levaduras. 4.2.7 Observar si hay crecimiento en cada una de las temperaturas.

4.3 DETERMINACION DEL TIEMPO TERMICO MORTAL (TTM) 4.3.1 Etiquetar una serie de 7 tubos conteniendo cada uno 3 mL de caldo nutritivo, con los siguientes tiempos 5, l0, 15, 20, 25 y 30 minutos y un testigo a temperatura ambiente. 4.3.2 Inocular cada tubo con 0, 1 mL de la suspensión microbiana 4.3.3 Calentar los tubos a 70° C en un baño María durante los tiempos indicados 4.3.4 Dividir una caja Petri con agar nutritivo en 7 partes (Fig. 1) y marcar con 5, l0, 15, 20, 25 y 30 minutos y un testigo a temperatura ambiente. 4.2. 5 Sembrar por estría simple sobre el agar en su correspondiente tiempo. 4.2.6 Incubar la placa durante 48 horas a 35° C, 24 horas si se trata de bacterias 4.2.7 Observar si hay crecimiento en cada una de los tiempos.

4.4 TINDALIZACIÓN DE SUELO DE JARDÍN  Pesar 100 g de suelo de jardín, tomar 1g de muestra de aproximadamente y conservar en refrigeración, el resto de la muestra, calentarla a 100°C, durante 1 hora en el horno de calor seco,

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 



transcurrido ése tiempo incubar la muestra a 37°C durante 24 h. Después de la incubación, tomar una muestra de aproximadamente 1g de muestra y conservar en refrigeración Repetir este procedimiento durante dos ocasiones más. Realizar el recuento microbiano de cada una de las muestras conservadas en refrigeración, con las diluciones 10-3, 10-4 y 10-5, por vaciado en placa.

Calcular el porcentaje de reducción microbiana de la población inicial, es decir antes de la tindalización.

EFECTO DE LOS FACTORES FISICOQUIMICOS EN EL CRECIMIENTO CELULAR 4.5- EFECTO DEL pH 4.5.1 Marcar los 4 tubos de caldo nutritivo con los diferentes pH con: el nombre de la cepa, grupo, equipo. 4.5.2 Inocular con 0. 1 mL de la suspensión cada uno de los tubos. 4.5.3 Incubar los tubos a 35° C durante 24 horas 4.5.4 Después de este tiempo observar presencia o ausencia de crecimiento observando la turbidez para los diferentes pH. 4.6-EFECTO DE LA PRESION OSMOTICA SOBRE EL CRECIMIENTO 4.6.1 Etiquetar los tubos que contienen 3 mL de caldo nutritivo con diferentes concentraciones de cloruro de sodio (1%, 3% y 5%.) con nombre de la cepa, grupo y equipo. 4.6.2 Inocular con 0. 1 mL de la suspensión cada uno de los tubos. 4.6.3 Incubar los tubos a 35° C durante 24 4.6.4 Después de este tiempo observar presencia o ausencia de crecimiento observando la turbidez para los diferentes pH. 4.7- METALES PESADOS (Fig.3) 4.7.1 Impregnar discos de papel filtro con los siguientes compuestos. AgNO3, CuSO4 4.7.2 Marcar una caja Petri con agar nutritivo con: nombre de la cepa, grupo, equipo, nombre del metal. 4.7.3 Sembrar por estría masiva la caja y colocar los discos sobre la placa. 4.7.4 Incubar la placa a 35 ° C durante 24 horas 4.7.5 Observar el crecimiento del microorganismo y medir el halo de inhibición de c/u de los agentes utilizados. 4.8 COMPUESTOS HALOGENADOS (Fig. 4) 4.8.1 Impregnar discos de papel filtro con los siguientes compuestos: hipoclorito de sodio y de yodo. 4.8.2 Marcar una caja Petri con agar nutritivo con: nombre de la cepa, grupo, equipo, nombre del metal. 4.8.3 Sembrar por estría masiva la caja y colocar los discos sobre la placa. 4.8.4 Incubar la placa a 35 ° C durante 24 horas 4.8.5 Observar el crecimiento del microorganismo y medir el halo de inhibición de c/u de los agentes utilizados.

AgNO 3

CuSO 4

Fig. 3 Metales pesados

Fig. 4 Compuestos halogenados

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4.9 EFECTO DE LA ACTIVIDAD DE ANTIBIÓTICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO (fig. 5) 4.9.1 Marcar una placa con agar nutritivo con el nombre de la cepa, grupo, equipo. 4.9.2 Sembrar la placa por estría masiva. 4.9.3 Colocar un multidisco o discos individuales sobre las placas sembradas con las cepas. 4.9.4 Presionar ligeramente cada disco sobre el cultivo con ayuda de pinzas de disección para poner en contacto el antibiótico con la cepa 4.9.5 Incubar las placas a 35 ° C durante 24 horas. 4.9.6 Después del tiempo de incubación medir el diámetro del los halos de inhibición del crecimiento producido y anotar los resultados.

Fig. 5 Efecto de la actividad de los antibióticos 5.0 RESULTADOS 5.1 DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA ÓPTIMA DE CRECIMIENTO TEMPERATURA 5°C 28°C 37°C Turbidez 5.2 PUNTO TÉRMICO MORTAL TEMPERATURA Turbidez

37°C

5.3 TIEMPO TÉRMICO MORTAL TIEMPO Turbidez

5´

50°C

60°C

10´

15´

70°C

55°C

80°C

20´

92°C

25´

30´

5.4 TINDALIZACIÓN Porcentaje de reducción microbiana___________________ 5.5 EFECTOS DEL pH EFECTO DEL Ph CRECIMIENTO

3.5

5.6 EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA CONCENTRACIÓN DE NaCl CRECIMIENTO

5.7 EFECTO DE METALES PESADOS METAL DIÁMETRO DEL HALO DE INHIBICIÓN (mm)

5.0

5%

7.0

9.0

7%

Ag

9%

Cu

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5.8 EFECTO DE COMPUESTOS HALOGENADOS HALÓGENO DIÁMETRO HALO DE INHIBICIÓN (mm) 5.9 EFECTO DE LOS ANTIBIÓTICOS ANTIBIOTICO DIÁMETRO HALO DE INHIBICIÓN (mm)

CLORO

Penicilina

YODO

Eritomicina

otro

6.0 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Basándose en los resultados anteriores y a la bibliografía consultada, analizar y discutir los resultados obtenidos en esta práctica, haciendo énfasis en el efecto causado a nivel molecular de los factores estudiados y la importancia práctica que tiene el conocer el efecto de estos mismos sobre los microorganismos. Elaborar las conclusiones basándose en los resultados, al análisis y discusión que se hicieron de estos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica. 7.0 CUESTIONARIO 1. Menciona tres ejemplos de microorganismo mesofílico, 3 de psicrofilicos y 3 de termofílicos 2. Define el término termodúrico 3. Menciona 3 ejemplos de microorganismos cuyo pH óptimo de crecimiento sea ácido, 3 de pH alcalino y 3 de pH neutro. 4. ¿Qué significa actividad de un antibiótico? 5. ¿Cómo actúan los antibióticos utilizados sobre el microorganismo con el que trabajaste? 6. ¿A qué se debe la resistencia a un antibiótico? 7. Explica brevemente que es el efecto bactericida, bacteriostático, fungicida y fungistátIco. 9. ¿Explica la diferencia como actúan los diferentes metales pesados utilizados en el laboratorio. 10. Explica la relación que existe entre la concentración del agente químico y el tiempo de exposición 8.0 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS DE LA PRÁCTICA th

Madigan, Martinko, Parker. Brock Biology of the microorganisms. 10 edition, Prentice Hall, 2005. 892 Págs 9.0 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS CONSULTADAS Escriba la bibliografía consultada para el reporte de esta práctica,

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PRÁCTICA No. 6 MUESTREO RECUENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DEL AGUA: INDICADORES SANITARIOS, BACTERIAS PATÓGENAS 2.0 INTRODUCCIÓN El agua contiene suficientes sustancias nutritivas para permitir el desarrollo de los diferentes microorganismos. Muchas de las bacterias del agua provienen del contacto con el aire, el suelo, animales o plantas vivas o en descomposición, fuentes minerales y materia fecal. La transmisión a través del agua de organismos patógenos ha sido la fuente más grave de epidemias de algunas enfermedades como: fiebre tifoidea, cólera, disentería amibiana, hepatitis infecciosa, etcétera. Un número importante de enfermedades son transmitidas a través del agua. La contaminación fecal en el agua es un factor importante ya que las heces contienen una gran variedad de microorganismos, incluyendo enteropatógenos, los cuales son un riesgo para la salud pública al estar en contacto con el ser humano. Estos enteropatógenos incluyen principalmente a las bacterias de los géneros Salmonella, Shigella y Vibrio, protozoarios como Entamoeba hystolitica o virus, como el de la polio o la hepatitis, que ingresan al agua cuando ésta entra en contacto con la materia fecal. Sin embargo, estos organismos no se encuentran en un número tal que permita su búsqueda de una manera accesible y, sobre todo, confiable. Por otro lado los enteropatógenos en cuestión aparecen sólo ocasionalmente en cantidades suficientes para ser detectados, aún en las heces de individuos enfermos, por lo que se corre el riesgo de consumir agua contaminada solamente por el hecho de no haber hallado ningún enteropatógenos en las muestras analizadas. Con esta base sin demostrar necesariamente la presencia directa de organismos enteropatógenos, se puede hacer un análisis microbiológico para poner de manifiesto a microorganismos que sirvan como indicadores de contaminación fecal. Los microorganismos del grupo coliforme habitan normalmente en el intestino humano y de otros animales de sangre caliente, por lo que su presencia en agua da una indicación sensible de dicho tipo de contaminación. Otras cualidades que hacen a los microorganismos del grupo coliforme indicadores ideales de contaminación fecal son: *Presencia constante en materia fecal *Exclusividad en la materia fecal *Abundancia en la materia fecal *Incapacidad de reproducción en el agua. *Sobrevivencia semejante a la de los organismos enteropatógenos. *Facilidad para demostrarse en el laboratorio Actualmente se ocupan dos grupos microbianos que reúnen todas estas características en un nivel aceptable. Estos grupos son los organismos coliformes y los enterococos fecales: Los microorganismos coliformes son bacilos cortos, Gram negativos, aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas en 48 horas. Esta última propiedad, dado que no es común entre las bacterias, es el punto clave que se utiliza para la identificación de este grupo microbiano. En este grupo se incluye a Escherichia coli considerada como el principal indicador de contaminación fecal, así como a Klebsiella, Citrobacter y Enterobacter cuya fuente no se limita a un origen fecal y que comúnmente son encontrados en muestras de suelo, plantas y granos. Existen dos pruebas oficiales para la determinación de coliformes en muestras de agua. Norma Mexicana de Análisis, NMX-AA-042-1987. Calidad del Agua. Determinación del Número Más Probable ( NMP ) de coliformes Totales, Coliformes Fecales (Termotolerantes) y Escherichia coli presuntiva. Esta norma establece un método para la detección y la cuantificación de los microorganismos coliformes mediante el cultivo en un medio líquido en tubos múltiples y el cálculo de su Número Más Probable (NMP) en la muestra.

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Este método microbiológico para detectar la presencia de microorganismos coliformes en el agua contempla tres fases: a) Prueba presuntiva b) Prueba confirmativa En el método se emplean medios de cultivo preparados con lactosa para observar la producción de ácido y gas. Como medio confirmativo para coliformes totales, el más generalizado es el caldo bilis lactosa verde brillante (BLVB). Para confirmar la presencia de coliformes fecales se utiliza tanto el BLVB como el caldo Escherichia coli (EC). Para confirmar la presencia de Escherichia coli presuntiva, se emplea agua de triptona. Para la correcta aplicación de esta Norma, es necesario consultar las siguientes normas oficiales mexicanas: NOM-014-SSA1-1993 NOM-041-SSA1-1993 NOM-092-SSA1-1994 NOM-110-SSA1-1993 NOM-112-SSA1-1994 NOM-127-SSA1-1994 NOM-127-SSA1-2003 NOM-008-SCFI-1993

Procedimientos sanitarios para el muestreo de agua para uso y consumo humano distribuida por sistemas de abastecimiento públicos y privados. Agua purificada envasada. Especificaciones sanitarias. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis bacteriológico. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable Agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización. Salud Ambiental. Agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización. Sistema general de unidades de medida.

Agua para uso y consumo humano: Aquella que no contiene contaminantes objetables, ya sean químicos o agentes infecciosos y que no causa efectos nocivos al ser humano. Características bacteriológicas: Son aquellas debidas a microorganismos nocivos a la salud humana. Para efectos de control sanitario se determina el contenido de indicadores generales de contaminación microbiológica, específicamente organismos coliformes totales y organismos coliformes fecales. Características físicas y organolépticas: Son aquellas que se detectan sensorialmente. Para efectos de evaluación, el sabor y olor se ponderan por medio de los sentidos y el color y la turbiedad se determinan por medio de métodos analíticos de laboratorio. Límites permisibles de calidad del agua de características bacteriológicas CARACTERISTICA LIMITE PERMISIBLE Organismos coliformes totales 2 NMP/100 ml 2 UFC/100 ml Organismos coliformes fecales No detectable NMP/100 ml Cero UFC/100 ml Los resultados de los exámenes bacteriológicos se deben reportar en unidades de NMP/100 ml (número más probable por 100 ml), CARACTERISTICA LIMITE PERMISIBLE Color 20 unidades de color verdadero en la escala de platino-cobalto. Olor y sabor Agradable (se aceptarán aquellos que sean tolerables para la mayoría de los consumidores, siempre que no sean resultados de condiciones objetables desde el punto de vista biológico o químico).

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Turbiedad

5 unidades de turbiedad nefelométricas (UTN) o su equivalente en otro método.

2.0 OBJETIVOS 2.1 Objetivo General El alumno determinará la calidad sanitaria del agua para consumo humano. 2.2 Objetivos Específicos 2.2.1 Aplicar adecuadamente las técnicas para muestrear agua para consumo humano. 2.2.2 Aplicar adecuadamente las técnicas para cuantificar a los microorganismos indicadores en el agua para consumo humano. 2.2.3 Interpretar la presencia de organismos coliformes totales y fecales y Escherichia coli como indicadores de contaminación fecal reciente en el análisis de agua para consumo humano. 2.2.4 Interpretar la presencia de organismos mesofílicos aerobios en el análisis microbiológico del agua para consumo humano. 3.0 MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 MEDIOS DE CULTIVO 3 tubos con 10 mL de caldo lactosado de doble concentración y campana de Durham. 6 tubos con caldo lactosado concentración sencilla y campana de Durham. 9 tubos con 10 mL de caldo bilis verde brillante al 2% y campana de Durham. 1 matraz con 100 mL de agar cuenta estándar. 1Caja de Petri con medio de agar Eosina Azul de Metileno (EMB) 3.2 MATERIAL 3 cajas Petri 1 pipetas de 2 ml 1 pipeta de 10 mL Un frasco de boca ancha con 0.1 mL de tiosulfato de sodio por cada 100 mL de muestra esteril. 3.3 REACTIVOS Tiosulfato de sodio 1% Reactivo de Kovacs para indol 3.4 EQUIPO 1 autoclave. 1 balanza granataria. 1 refrigerador. 1 incubadora a 35º C. 1Baño María 44.5 °C 1 horno a 180º C.

3.5 MUESTRAS PARA ANALIZAR 1. 3. 5. 7. 9.

Red municipal Tinaco Cisterna Hielo Pozo

2. 4. 6. 8. 10.

Filtro Agua embotellada Llave Baño Agua de fresa

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3.6 MATERIAL BIOLÓGICO MUESTREO Las muestras para el análisis bacteriológico se deben tomar de acuerdo a las instrucciones que le dé su profesor. 4.0DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1 PROCEDIMIENTO PARA TOMA DE MUESTRA PARA ANÁLISIS MICROBIOLOGICO. EN BOMBA DE MANO O GRIFO DEL SISTEMA DE DISTRIBUCIÓN. El agua de los grifos debe provenir directamente del sistema de distribución. No debe efectuarse toma de muestra en grifos que presenten fugas entre el tambor y el cuello, ya que el agua puede correr por la parte exterior del grifo y contaminar la muestra. Deben removerse los accesorios o aditamentos externos como mangueras, boquillas y filtros de plástico o hule antes de tomar la muestra. 1.- Debe limpiarse el orificio de salida con una torunda de algodón impregnada de solución de hipoclorito de sodio con una concentración de 100 mg/l. 2.- Debe dejarse correr el agua aproximadamente 3 minutos o hasta asegurarse que el agua que contenían las tuberías ha sido vaciada totalmente. 3.- Cerca del orificio de salida, deben quitarse simultáneamente el tapón del frasco y el papel de protección, manejándolos como unidad, evitando que se contaminen el tapón, o el papel de protección, o el cuello del frasco. 4.- Debe mantenerse el tapón hacia abajo para evitar contaminación y procederse a tomar la muestra sin pérdida de tiempo y sin enjuagar el frasco; se debe dejar el espacio libre requerido para la agitación de la muestra previa al análisis (aproximadamente 10% de volumen del frasco). Efectuada la toma de muestra, deben colocarse el tapón y el papel de protección al frasco. EN CAPTACIÓN DE UN CUERPO DE AGUA SUPERFICIAL O TANQUE DE ALMACENAMIENTO, CISTERNA. 1.- Deben lavarse manos y antebrazos con agua y jabón, 2.- Debe quitarse el papel de protección evitando que se contamine, y 3.- Sumergir el frasco en el agua con el cuello hacia abajo hasta una profundidad de 15 a 30 cm, abrir y enderezar a continuación con el cuello hacia arriba (en todos los casos debe evitarse tomar la muestra de la capa superficial o del fondo, donde puede haber nata o sedimento y en el caso de captación en cuerpos de agua superficiales, no deben tomarse muestras muy próximas a la orilla o muy distantes del punto de extracción); si existe corriente en el cuerpo de agua, la toma de muestra debe efectuarse con la boca del frasco en contracorriente. Efectuada la toma de muestra debe colocarse el tapón, sacar el frasco del agua y colocar el papel de protección. EN POZO PROFUNDO. Si el pozo cuenta con grifo para toma de muestra, debe procederse como se menciono anteriormente. 1.- Si el pozo no cuenta con grifo para toma de muestra, debe abrirse la válvula de una tubería de desfogue, dejarse correr el agua por un mínimo de 3 min. y como se menciono anteriormente. EN POZO SOMERO O FUENTE SIMILAR. 1.- Cuando no es posible tomar la muestra con la extensión del brazo, debe atarse al frasco un sobrepeso usando el extremo de un cordel limpio. 2.- Deben quitarse simultáneamente el tapón y el papel de protección, manejándolos como unidad, evitando que se contaminen el tapón, o el papel de protección, o el cuello del frasco. 3.- Debe mantenerse el cuello del frasco hacia abajo y se procede a tomar la muestra, bajando el frasco dentro del pozo, y desenrollando el cordel lentamente, evitando que el frasco toque las paredes del pozo. 4.- Efectuada la toma de muestra, deben colocarse el tapón y el papel de protección al frasco. EN BOMBA DE MANO O GRIFO DEL SISTEMA DE DISTRIBUCIÓN O POZO PROFUNDO.

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1.- Debe dejarse correr el agua aproximadamente por 3 min o hasta asegurarse que el agua que contenían las tuberías ha sido vaciada totalmente. 2.- El muestreo debe realizarse cuidadosamente, evitando que se contaminen el tapón, boca e interior del envase; se requiere tomar un poco del agua que se va a analizar, se cierra el envase y agitar fuertemente para enjuagar, desechando esa agua; se efectúa esta operación dos o tres veces, procediendo enseguida a tomar la muestra. 3.- En captación de un cuerpo de agua superficial, tanque de almacenamiento, pozo somero o fuente similar, debe manejarse el envase siguiendo las indicaciones anteriores según sea su caso. MANEJO DE MUESTRAS 1.- Las muestras deben colocarse en hielera con bolsas refrigerantes o bolsas de hielo para su transporte al laboratorio, de preferencia a una temperatura entre los 4 y 10ºC, cuidando de no congelar las muestras. 2.- El periodo máximo que debe transcurrir entre la toma de muestra para análisis microbiológico de 6 horas. IDENTIFICACIÓN Y CONTROL DE MUESTRAS 1.-Para la identificación de las muestras deben etiquetarse los frascos y envases con la siguiente información: 2.- Número de registro para identificar la muestra, y fecha y hora de muestreo, identificación del punto o sito de muestreo, temperatura ambiente y temperatura del agua, pH, SELECCIÓN DE PUNTOS DE MUESTREO La selección de puntos de muestreo debe considerarse individualmente para cada sistema de abastecimiento. Sin embargo, existen criterios que deben tomarse en cuenta para ello. Estos criterios son: 1.- Los puntos de muestreo deben ser representativos de las diferentes fuentes de agua que abastecen el sistema. 2.- Los puntos de muestreo deben ser representativos de los lugares más susceptibles de contaminación: puntos muertos, zonas de baja presión, zonas con antecedentes de problemas de contaminación, zonas con fugas frecuentes, zonas densamente pobladas y con alcantarillado insuficiente, tanques de almacenamiento abiertos y carentes de protección, y zonas periféricas del sistema más alejadas de las instalaciones de tratamiento. 3.- Debe haber una distribución uniforme de los puntos de muestreo a lo largo del sistema. 4.- Los puntos se localizarán dependiendo del tipo de sistemas de distribución y en proporción al número de ramales. 5.- Debe haber como mínimo un punto de muestreo inmediatamente a la salida de las plantas de tratamiento, en su caso. 4.1 ORGANISMOS COLIFORMES POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (Fig. 1) PRUEBA PRESUNTIVA Antes del análisis, mezclar perfectamente la muestra agitándola de manera vigorosa para lograr una distribución uniforme de los microorganismos (dependiendo de la naturaleza del agua y el contenido bacteriano esperado, hacer todas las diluciones necesarias en esta etapa). Ya sea con la muestra original, o con la dilución elegida, se procede como sigue: 1.- Inocular tres tubos con caldo lactosado doble concentración, cada uno con 10 mL de muestra 2.- Inocular tres tubos con caldo lactosado concentración sencilla cada uno con 1 mL de la muestra. 3.- Inocular tres tubos con caldo lactosado concentración sencilla cada uno con 0.1 mL de la muestra. 4.- Incubar todos los tubos a 37º C durante 48 horas. 5.- Transcurrido el tiempo de incubación observar si hubo producción de gas por su acumulación en la campana de Durham. La ausencia de gas en los tubos hace negativa la prueba, aunque haya producción de ácido o haya un crecimiento evidente. 4.2 PRUEBA CONFIRMATIVA A partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva:

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1.-Inocular dos tubos de caldo lactosa bilis verde brillante (BLVB) con dos asadas cada uno. 2.-Para determinar coliformes totales incubar un tubo a 37º C y examinarlo a las 48 horas para ver si hubo producción de ácido y/o gas. La producción de ácido se detecta por el cambio del medio a un color amarillo. 3.-Para confirmar la presencia de organismos coliformes termotolerantes (organismos coliformes fecales), incubar otro tubo a 44º C durante 48 horas.

PRUEBA PRESUNTIVA Caldo lactosado Incubar a 35°C, 24/48 Horas

PRUEBA CONFIRMATORIA Caldo bilis verde brillante Incubar un tubo a 37 °C y Dos tubos a 44.5°C en Baño Maria por 48 horas

10 mL

100mL * 1 mL

0.1 mL

10mL

Fig. 1 Determinación de los Organismos coliformes por la técnica del Número más probable (NMP) 4.-Para confirmar la presencia de Escherichia coli presuntiva, inocular a partir de los tubos positivos de caldo lactosado los tubos de agua de peptonada al 0.1%, que sean necesarios. Incubar a 44º C durante 24 horas. Después añadir de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de kovac’s. El desarrollo de un anillo de color rojo después de agitar suavemente denota la presencia de indol. La detección de E. coli presuntiva se considera una evidencia satisfactoria de contaminación fecal. Sin embargo, pueden efectuarse mayores pruebas para su confirmación si se considera necesario. 5.- De los tubos positivos de Caldo Lactosa Verde Brillante Bilis (BLVB) en la prueba confirmativa, sembrar por estría cruzada una placa de agar Eosina Azul de Metileno (EMB). 6.- Al término del tiempo de incubación de la Prueba Confirmativa, observar la producción de gas en los tubos. Registrar el número de tubos positivos en la tabla siguiente: Prueba Confirmativa para Coliformes Totales Alícuota ( mL )

10

1

0.1

Tubos Positivos Prueba Confirmativa para Coliformes Fecales

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Alícuota ( mL )

10

1

0.1

Prueba Confirmativa para Escherichia coli presuntiva Alícuota ( mL ) 10

1

0.1

Tubos Positivos

Tubos Positivos 5.0 RESULTADOS Anota los resultados de todos los equipos en el siguiente cuadro. Equipo

Tipo de Agua

Organismos coliformes totales

Organismos coliformes fecales

Normas utilizadas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

6.0 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Analice la presencia o ausencia de organismos coliformes totales, fecales y cómo influye el muestreo en el análisis de agua para consumo humano. Establece conclusiones grupales con base a los resultados obtenidos por los equipos de trabajo. 7.0 CUESTIONARIO 1.- Menciona 3 cuidados que se deben de tener al muestrear agua de cisterna, tinaco. 2.- ¿Qué criterios se utilizan para realizar el número de diluciones? 3.- ¿Por qué se les llama microorganismos indicadores a los organismos coliformes? 4.- ¿Cuántos organismos coliformes totales y fecales pueden estar presentes en agua potable y que indica este intervalo? 5.- ¿Qué medios se utilizan para aislar organismos coliformes? Menciona cuales son los inhibidores que contiene y que microorganismos inhibe ai como la función de cada uno de los componentes? 6.- A que se debe la presencia de organismos coliformes fecales en el agua potable. 7.- ¿Menciona en que consiste el proceso de potabilización y purificación de agua? 8.- ¿Qué es desinfección, demanda de cloro, qué es cloro residual y que cantidad de cloro lleva el agua potable y se expresa en ppm? 9.- ¿Cómo inactiva el tiosulfato de sodio al cloro, que reacción ocurre? 8.0 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS DE LA PRÁCTICA 1.-Guías para la Calidad del Agua Potable. Volumen 2 Organización Panamericana de la Salud. 1987.

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2.- Instructivo para la Vigilancia y Certificación de la Calidad Sanitaria del Agua para Consumo Humano. Comisión Interna de Salud Ambiental y Ocupacional. Secretaría de Salud. 1987. 3.-NOM-127-SSA1-1994 Agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización.* 4.- PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-181-SSA1-1998, Salud ambiental, agua para uso y consumo humano. Requisitos sanitarios que deben cumplir las sustancias germicidas para tratamiento de agua, de tipo doméstico. 5.- Romero Rojas Jairo A. Calidad del agua. 2ª edición. 1999. Ed. Escuela Colombiana de Ingeniería. 9.0 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS CONSULTADAS Describe las referencias consultadas de acuerdo a los criterios establecidos en la práctica 1

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PRACTICA No.7 MUESTREO RECUENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DEL SUELO: AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS AMILOLÍTICOS, CELULOLÍTICOS Y ACTINOMICETOS 1.INTRODUCCIÓN La descomposición de compuestos orgánicos que son producto del metabolismo vegetal es un proceso de gran importancia porque permite la reincorporación de sus elementos constituyentes al reciclaje en el ecosistema. La descomposición se realiza por medio de actividades enzimáticas que finalmente oxidan por completo el sustrato y permite la asimilación de los productos por bacterias (Clostridium, Pseudomonas, Xanthomonas, Cellulomonas, Sporocytophayga) y actinobacterias (Nocardia, Thermnoactinomyces, etc.). Existe una sucesión de organismos que compiten por la utilización del sustrato que comienza por sus azúcares, almidón y proteínas más fácilmente asimilables y termina con la acción de microorganismos con capacidad enzimática específica para los sustratos más difíciles de degradar como la celulosa, hemicelulosa, lignina, quitina, pectina, etc. La enzima amilasa hidroliza los polisacáridos almidón y glucogéno a polímeros de glucosa más pequeños como dextrinas y eventualmente al disacárido maltosa. La celulasa digiere la celulosa para producir el disacárido celobiosa. Después los disacáridos producidos pueden ser hidrolizados extracelularmente en sus monosacáridos constituyentes por medio de la actividad de las enzimas maltasa y celobiasa, respectivamente. Las técnicas comunes de aislamiento requiere la incorporación de celulosa o almidón como única fuente de carbono, según el caso, en un medio base mineral. OBJETIVOS Objetivo General El alumno aislará microorganismos del suelo: Actinomicetos y con capacidad para degradar polímeros de glucosa Objetivos Especiíficos: Aislar y cuantificar Actinomicetos Aislar y cuantificar microorganismos del suelo con actividad celulolítica Aislar y cuantificar microorganismos del suelo con actividad amilolítica 1.0 MATERIALES Y REACTIVOS 1.1MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO POR EQUIPO 3 Pipetas de 1 mL estériles 1 Caja de petri estéril 1 varilla de vidrio acodada. 1 Frasco de dilución con 90 mL de agua destilada estéril 4 tubos de ensaye de 16 x 150 con tapón de rosca con 9 mL de agua destilada estéril 8 cajas petri con gelosa almidón 8 cajas petri con agar celulosa rojo congo 8 cajas con Medio Czapeck-Dox 1 frasco con alcohol etílico 1 frasco con lugol 3.2 MATERIAL BIOLÓGICO Muestras de suelo de jardín y de suelo erosionado. DESARROLLO EXPERIMENTAL -Pesar 10 g de la muestra y realizar diluciones decimales hasta 10-4 -Sembrar 0.1 mL de las últimas 3 diluciones en las cajas con el medio para Actinomicetos, Agar celulosa, y gelosa almidón por la técnica de extensión con varilla.

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-Incubar todas las placas a 28° C durante 48 a 72 horas -Una vez terminada la incubación agregar a la placa de agar almidón unas gotas de lugol sobre las colonias crecidas y observar si se forma un halo claro alrededor de la colonia. Contar el número de colonias que crecieron en el medio. -En las placas de celulosa contar las colonias que crecieron en este medio las que muestren una zona de hidrólisis a su alrededor. En las placas con el Medio Czapek-Dox, describir la morfología colonial de tres colonias aisladas. -Realizar una tinción de Gram a las diferentes colonias aisladas en cada medio de cultivo, observar la microscopio a inmersión y describir su morfología microscópica. Conservar en tubos inclinados, las cepas aisladas. 5.0 RESULTADOS Y CUESTIONARIO. Anota los resultados de la cuenta de colonias en los diferentes medios Agar almidón UFC/g

Agar celulosa UFC/g

Agar Czapeck-Dox UFC/g

Describe la morfología colonial. Dibuja la morfología microscópic. Investiga la formulación de cada uno de los medios de cultivo utilizado y relaciona la composición del medio con el aislamiento de los grupos de microorganismos encontrados. 6.0 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS. Discute la importancia de los microorganismos Actinomicetos, celulolíticos y amilolíticos encontrados en la práctica, revisa la bibliografía publicada para determinar de qué otros sitios se pueden aislar estos y cuál es su utilidad. 7.0 CONCLUSIONES Elabora las conclusiones con base a los resultados obtenidos, a la participación de los microorganismos degradadores de celulosa y almidón en los ciclos biogeoquímicos. Describe la importancia de encontrar actinomicetos en el suelo. 8.0 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1.- Alexander, M Introducción to Soil Microbiology, John Wiley & Sons, New York, 2000 2.- Campbell, R. Ecología Microbiana, Edit Trillas, México, 2001 9. BIBLIOGRAFÍA Enumera la bibliografía consultada.

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PRACTICA 8 MUESTREO RECUENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DEL AIRE: BACTERIAS MESOFÍLICAS AEROBIAS Y ORGANISMOS COLIFORMES INTRODUCCIÓN La atmósfera, por no poder sustentar el crecimiento y desarrollo de una comunidad, no puede considerarse como ecosistema. Por lo que este ambiente se considera, exclusivamente, como medio de transporte para los organismos. La cantidad de microorganismos presentes en la atmósfera fluctúan de acuerdo con la variación a lo largo del día y estacional.. Estos valores están influenciados principalmente por la temperatura que crea corrientes de aire que arrastran a los microorganismos que se encuentran en la superficie del suelo, agua, plantas y animales y por la precipitación pluvial. En estudios ecológicos es importante conocer la variación en la población de microorganismos en la atmósfera de un hábitat, en un tiempo determinado. Así mismo, es importante conocer los eventos climatológicos que pueden permitir una amplia distribución de las poblaciones microbianas, junto con esporas y semillas de otros microorganismos. En virtud de que los microorganismos que son transportados por el aire pertenecen a diferentes orígenes, y su impacto en las actividades humanas dependerá del tipo de microorganismos presentes, es necesario establecer objetivos claros para el aislamiento de microorganismos del aire, por ejemplo, se pueden aislar organismos coliformes para determinar el grado de contaminación fecal; detectar la presencia de virus patógenos en espacios cerrados como los hospitales; cuantificar bacterias patógenas en espacios abiertos o cerrados; cuantificar bacterias mesofílicas aerobias en sitios con baja carga microbiana en donde se producen medicamentos estériles o vacunas; determinar cómo está el balance entre bacterias autótrofas y bacterias heterótrofas en una determinada época del año. Para cada caso en particular el éxito del aislamiento dependerá del tipo de muestreo que se realice, el equipo seleccionado para realizarlo y el diseño del medio de cultivo para el aislamiento particular del grupo microbiano de interés. Existen diferentes equipos para muestrear aire, entre otros se encuentran los impactadores de Andersen, de Bukhard, Impactadores en líquido, Impactadores de centrífuga, cada uno de éstos equipos, utiliza un mecanismo particular para introducir un flujo de aire por un tiempo determinado a través de una cámara cerrada que finalmente impacta un medio de cultivo sólido, líquido o una membrana que retiene a los microorganismos, para su posterior identificación y cuantificación. Otro método sencillo y accesible para conocer los microorganismos en el aire, es el método de exposición por tiempo determinado de cajas Petri con medios de cultivo selectivos que garanticen una correcta aproximación de la carga microbiana en el sitio de muestreo, a diferentes alturas. Dentro de los parámetros físicos que permiten caracterizar al aire, se tienen: la temperatura, la humedad atmosférica, la magnitud y dirección del viento, así como la época del año. OBJETIVO GENERAL Cuantificar bacterias mesofílicas aerobias y bacterias del grupo coliforme presentes en el aire en un ambiente abierto. OBJETIVOS PARTICULARES: 1.- Medir los parámetros físicos para cada zona de muestreo. 2.-Cuantificar bacterias mesofílicas aerobias y organismos coliformes, por exposición de placas con medios de cultivo específicos 3.- Establecer la importancia de los grupos microbianos detectados en los sitios de muestreo.

MATERIAL, MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS POR EQUIPO: 4 cajas Petri con agar caseína-peptona-almidón-extracto de levadura (CPS-EL)

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4 cajas Petri con agar rosa de bengala (ARB) 4 cajas Petri con agar eosina-azul de metileno (EMB) Termómetro Psicrómetro Barómetro Altímetro Brújula PROCEDIMIENTO 1. Medición de variables físicas en los sitios de muestreo 1.1 Altitud. Determinar la altitud en metros sobre el nivel del mar (m.s.n.m.) de los sitios de muestreo, utilizando los valores obtenidos del altímetro. 1.2 Temperatura. Para esta determinación se requiere sujetar el termómetro lo más alejado posible del extremo donde se encuentra el bulbo o la bayoneta, de ser posible, se debe sostener con un hilo o alambre. En los sitios de muestreo, suspender el termómetro durante 5 minutos, transcurrido el tiempo, registrar la lectura evitando realizar manipulaciones excesivas. 1.3 Humedad relativa atmosférica. Para medir la cantidad de vapor de agua existente en la atmósfera, se emplea el psicrómetro, que es el instrumento de uso más general que mide la humedad relativa atmosférica. El psicrómetro está compuesto por dos termómetros, uno de los cuales se mantiene húmedo constantemente con un lienzo empapado en el agua de un pequeño recipiente. La evaporación en la superficie del lienzo, enfría el bulbo del termómetro, así que los dos termómetros indican lecturas diferentes. Se obtiene el porcentaje de humedad relativa a partir de la diferencia en las lecturas de ambos termómetros y su interpolación en tablas calculadas ya establecidas. La medición se realiza como sigue: a) Humedecer el termómetro cubierto con agua destilada. b) El par de termómetros (psicrómetro de cabestrillo) son agitados en el aire ó bien se hace que el aire pase a través de ellos por medios mecánicos (por ejemplo: agitando el psicrómetro con la mano), la agitación se realiza por más o menos 20 segundos. c) Tomar las lecturas de las temperaturas de ambos termómetros cuando el termómetro del bulbo húmedo se haya estabilizado (debido a la evaporación del agua de su mecha, el bulbo mojado alcanzará una temperatura más baja que aquella del bulbo seco, lo cual indica la verdadera temperatura del aire, cuanto más baja se la humedad relativa, más fácilmente se evaporará el agua de la mecha y mayor será el descenso del bulbo mojado, o sea, la diferencia de temperatura entre los dos termómetros). d) Interpolar las lecturas obtenidas en las tablas del psicrómetro y obtener finalmente el valor del porcentaje de la humedad relativa. 1.4 Velocidad y dirección del viento. El viento es un factor ambiental de importancia, especialmente en planicies, costas, ó altitudes elevadas en las montañas, influyendo directamente en el incremento de la transpiración de las plantas. Otros efectos menos directos incluyen la transpiración de las masas de aire frío y caliente y el movimiento de las nubes y la niebla que cambian las relaciones del agua y alteran las condiciones luminosas, mezcla el aire y evita las inversiones de temperatura. La tasa de movimiento del aire se expresa como la velocidad promedio durante un intervalo de tiempo, como es el caso de una hora ó un mes. La medición de la velocidad y dirección del viento para cada sitio de muestreo, se realizará observando el entorno de cada sitio y evaluando la magnitud y la dirección del viento utilizando la escala de Beaufort y orientando la dirección del flujo de aire con el empleo de una brújula. 2. Cuantificación de bacterias mesofílicas aerobias y bacterias coliformes Se expondrán las placas con los medios seleccionados, en cada uno de los sitios de muestreo, como sigue:

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2.1 Colocar sobre el suelo un juego de dos placas de los siguientes medios de cultivo: CPS-EL, ARB y EMB, destaparlas y alejarse de ellas. Dejarlas así durante 5 minutos. Transcurrido ese tiempo, acercarse y taparlas. Al alejarse y al acercarse a las placas, se debe evitar levantar polvo. 2.2 Destapar y colocar a 1.5 m de altura con los brazos extendidos, un segundo juego de placas, exponiéndolas horizontalmente, durante 5 minutos, transcurrido este tiempo, taparlas. Marcar todas las cajas y colocarlas en las condiciones de incubación establecidas para cada medio de cultivo. 2.3 Incubar las placas para hongos y bacterias (CPS-EL y ARB) a 28 °C de 2 a 5 días. 2.4 Incubar las placas para coliformes (EMB) a 37 °C de 24 a 48 horas. 3. RESULTADOS 3.1 Determinar en cada caso el promedio de las colonias encontradas para cada estación y en cada ubicación (suelo y hombros) y elabore una tabla comparativa para la parte (B) de la práctica, en donde se considere lo siguiente: Unidades formadoras de colonias UFC/5min en el lugar de exposición. Estación/Ubicación Bacterias (CPS-EL) Coliformes (EMB) Hongos (ARB) 1 suelo 1 hombros 2 suelo 2 hombros 3 suelo 3 hombros 4 suelo 4 hombros y elaborar una gráfica con estos resultados. 3.2 Discutir la distribución de los microorganismos encontrados en cada sitio de muestreo, de acuerdo con el punto de toma de muestra y las características de cada estación. 3.3 Comparar y discutir los resultados de los factores bióticos y abióticos. 3.4 Elaborar una tabla con los resultados de las mediciones de las variables físicas del aire, como sigue: Medición de las variables físicas del aire. Estación Temparatura (°C) Humedad relativa (%) Altitud (msnm) 1 2 3 4 Referencias Bibliográficas: Atlas, R.M. & R. Bartha. Microbial Ecology. Fundamentals and applications. Addison Wesley Massachusets. 2000. Madigan, Martinko, Parker. Brock Biology of the microorganisms. 10th edition, Prentice Hall, 2005. 892 Págs. Prescott L. M., Harley J. P. & Klein D. A. Microbiología. McGraw-Hill Interamericana. 2002. 2004. Bruce E. Rittmann &Perry L. McCarty. Biotecnología del medio ambiente. Principios y aplicaciones. McGraw-Hill, Inc. 2001. 745 Págs.

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APÉNDICE AGAR BACTERIOLÓGICO El agar bacteriológico Bioxon se usa en la preparación de medios de cultivo microbiológicos sólidos y semosólidos. También puede utilizarse en concentraciones menores como retardante de la penetración del oxígeno en medios líquidos. AGAR NUTRITIVO Fórmula en g/L de agua destilada: Peptona de gelatina 5g Extracto de carne de res 3g Agar 15g pH final 6.8  0.2 Método de preparación: Suspender 23 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien y dejar en reposo por 15 minutos. Calentar a ebullición de 1 a 2 minutos. Distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Determinar la funcionalidad del medio de cultivo con microorganismos típicos. AGAR PARA MÉTODOS ESTÁNDAR Fórmula en g/L de agua destilada: Peptona de caseína 5g Extracto de levadura 2.5g Glucosa 1g Agar 15g pH final 7.0  0.1 Método de preparación: Suspender 23.5 g de polvo en un litro de agua destilada. Disolver al calor y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Rojo neutro 0.025mg AGAR CITRATO DE SIMMONS Fórmula en g/L de agua destilada: Fosfato dihidrogenado de amonio1g Fostato dipotásico 1g Cloruro de sodio 5g Citrato de sodio 2g Sulfato de magnesio0.20g Agar 15g Azul d e bromotimol0.8g pH final 6.9  0.1 Método de preparación: Suspender 24.2g de polvo en un litro de agua destilada y dejar remojar durante 5 a 10 minutos. Mezclar bien y calentar suavemente agitando frecuentemente hasta que el medio hierva un minuto Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100 mm y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Se deja enfriar en posición inclinada. AGAR EMB (AGAR EOSINA AZUL DE METILENO) Fórmula en g/L de agua destilada:

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Peptona de gelatina 10g Lactosa 5g Sacarosa 5g Fosfato dipotásico 2g Agar 13.5g Eosina 0.4g Azul de metileno 0.065g pH final 7.2  0.2  Método de preparación: Suspender 36 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. CALDO ROJO DE METILO Y VOGUES PROSKAUER (RM-VP) Fórmula en g/L de agua destilada: Peptona especial No.1 7 g Glucosa 5 g Fosfato dipotásico 5 g Agua destilada 1 000 ml pH final 6.9  0.2  Método de preparación: Suspender 17g del polvo en un litro de agua destilada. Disolver calentando y hervir aproximadamente un minuto si es necesario .Distribuir 6 ml en tubos de 13 X 100 mm y esterilizar en autoclave durante 12 - 15 minutos a 121ºC. Al termino de la incubación el volumen de este tubo se dividirá en dos uno para la prueba del Rojo de metilo y la otra mitad para la prueba de VP. CALDO NUTRITIVO. Fórmula en g/L de agua destilada: Peptona de gelatina 5g Extracto de carne de res 3g pH final 6.9  0.2  Método de preparación: Suspender el almidón en 100 mL de agua destilada. Disolver los demás ingredientes en 900 mL de agua destilada con calentamiento y agitación continua , mezclar ambas suspensiones y esterilizar a 115 °C por 15 minutos en autoclave. CALDO DE MALONATO DE EWING MODIFICADO. Formula en g/L de agua destilada. Extracto de levadura 1g Sulfato de amonio 2g Fosfato dipotásico 0.6 g Fosfato monopotásico0.4g Cloruro de sodio2g Malonato de sodio3g Dextrosa 0.25g Azul de bromotimol0.025g pH final 6.7  0.2  Método de preparación: Disolver 9.3 g de polvo en un litro de agua destilada. Distribuir en tubos de ensaye adecuado y esterilizar en autoclave a 121° C durante 15 minutos.

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CALDO ROJO DE FENOL CON LACTOSA. Fórmula en g/L de agua destilada: Peptona de caseína 10g Cloruro de sodio5g Rojo de fenol 0.018g Lactosa 5g pH final 7.4  0.2  Método de preparación: Disolver 20g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar y calentar frecuentemente hasta s u ebullición y completa disolución. Distribuir y esterilizar en autoclave de 116 a 118 °C durante 15 minutos. CALDO NITRATO Fórmula en g/L de agua destilada: Peptona de gelatina 5g Extracto de carne de res 3g Nitrato de potasio 1g pH final 7  0.2  Método de preparación : Pesar exactamente las cantidades, rehidratar con agua destilada y calentar suavemente hasta disolución total. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100.y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. MEDIO BASAL OF O MEDIO DE HUGH Y LEIFSON Fórmula en g/L de agua destilada: Caseina digerida por enzimas pancreáticas2g Cloruro de sodio 5g Fosfato dipotásico 0.3g gar 2.5g Azul de bromotimol 0.03g pH final 6.8  0.1  Método de preparación: Suspender 9.8 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien, calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Agregar 10 mL de solución de dextrosa estéril por filtración a través de membrana al 10 % a 100 mL de base estéril. (Agregar 10 mL de solución de lactosa estéril al 10 % a 100 mL de base estéril y agregar 10 mL de sacarosa estéril al 10 % a una tercera porción de 100 mL. Otra forma de preparar el medio es agregar los carbohidratos antes de la esterilización en autoclave y esterilizar a 118°C durante 10 minutos. SOLUCIONES Y REACTIVOS Prueba de rojo de metilo. Rojo de metilo 0,1 g Alcohol etílico 300 ml Agua destilada 200 ml Disolver el rojo de metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba, añadir 5 gotas de la solución a 5 ml del cultivo problema. Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se reporta como prueba Negativa. Prueba de Vogues-Proskauer.

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Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo. Alfa naftol 5 g Alcohol etílico absoluto 100 ml  Añadir 0,6 ml de la solución de alfa naftol y 0,2 ml de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 ml de cultivo. Resultados: El desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una reacción Positiva. Prueba de oxidasa. N,N,N,N-Tetrametil-p-Fenilendiamino 0,5 g Agua destilada 100 ml  Conservar en frasco oscuro a 5-10°C. El reactivo se conserva durante 14 días. Sembrar en un tubo de base de gelosa para sangre. Incubar 18 horas a 35ºC. Agregar 0,3 mL de reactivo. Resultado: La reacción positiva se observa por la producción de un color azul en un minuto. Reacción de indol. REACTIVO DE KOVAC P-dimetilaminobenzaldehído 5.0 g Alcohol amílico.o alcohol isoamílico 750 ml Acido clorhídrico concentrado 25 ml  Disolver el p-dimetilaminobenzaldehído en el alcohol amílico y agregar el ácido clorhídrico lentamente, gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco ámbar con tapón esmerilado; el color del reactivo va del amarillo al café claro. Se debe conservar a 4ºC. Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullición, agitando ocasionalmente hasta completa disolución. Enfriar a 60ºC y ajuste el pH de 7,3 ± 0,1. -Solución de ácido sulfanilico Fórmula: Ácido sulfanilico. 8.0 g Ácido acético 5N (una parte de ácido acético Glacial a 2.5 partes de agua)1.0 L Solución de agua oxigenada 1:10. Preparación: Preparar momentos antes de usarla. Colocar 1 mL en 9 ml de agua destilada. Solución de alfa naftil amina Fórmula: Dimetil alfa naftil amina.5.0 g Ácido acético 5 N 1.0 L Solución de alfa naftol Fórmula Alfa naftol.5.0 g Etanol.100.0 ml Reactivo de Ehrlich Fórmula: Para-dimetil amino benzaldehído.2.0 g

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Alcohol etílico absoluto190.0 ml Acido clorhidrico concentrado.40.0 ml Solución de hidróxido de potasio al 40 % Fórmula: Hidróxido de potasio.40.0 g Agua destilada100.0 ml COLORANTES CRISTAL VIOLETA FORMULACIÓN g/100mL. Cristal violeta2.0 Agua destilada80.0 Etanol al 95%20.0 Oxalato de amonio0.8 Preparación:  Disolver el cristal violeta en 20 mL de etanol al 95%.  Posteriormente disolver 0.8 g de oxalato de amonio en 80 mL de agua.  Una vez terminadas las soluciones mezclarlas. YODO (LUGOL). Formulación en g/100mL. Yoduro de potasio2.0 Yodo1.0 Agua destilada100.0 Preparación:  Disolver 2 gramos de yoduro de potasio en agua destilada.  Agregar el gramo de yodo metálico y disolver.  Aforar a 100 mL con agua destilada y colocarlo en un frasco ámbar, ALCOHOL ACETONA Formulación en g/100 mL Acetona50.0 Alcohol etílico100.0 Preparación:  Adicionar lentamente el alcohol etílico a la acetona y mezclar con cuidado.  Guardar en frasco herméticamente cerrado, hasta su uso. SAFRANINA Formulación en g/100mL. Agua destilada100.0 Safranina0.5 Preparación:  Disolver los 0.5 g de safranina en 20 mL de agua destilada.  Después aforar a 100 mL con agua destilada FUCSINA FENICADA Formulación:

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SOLUCIÓN A Fucsina básica0.3 Alcohol etílico al 95%10.0 Mezclar hasta disolución completa SOLUCIÓN B Cristales de fenol5.0 Agua destilada95.0 Preparación:  Combinar las dos soluciones A y B  Filtrar a través de un papel filtro Whatman No 2.  Mantener la solución en un frasco ámbar, protegida de la luz y filtrar nuevamente si es necesario.

AZUL DE METILENO. Formulación g/mL: Azul de Metileno1 g Agua destilada100  Preparación:  Disolver el gramo de azul de metileno en los 100 mL. de agua destilada. VERDE DE MALAQUITA Formulación g/mL. Verde de malaquita10.0 Agua destilada100 Preparación:  Disolver el colorante en el agua.  Filtrar a través de papel filtro Whatman No. 2.  Guardar el colorante en frasco ámbar. PRÁCTICA No. 4 Ciclos Biogeoquímicos (Ciclo del Nitrógeno) Agar Leche Peptona de carne5 g Extracto de levadura3 g Agar bacteriológico15 g Agua destilada1000 mL pH7.2 + 0.2 Suspender los ingredientes en el agua destilada. Dejar remojar durante 15 minutos y hervir hasta completa disolución. Esterilizar en autoclave a 121 °C, 15 minutos. Enfriar hasta aproximadamente 50 °C. Leche en polvo10 g Agua destilada500 mL Disolver perfectamente la leche en el agua destilada. Si es necesario calentar ligeramente. Esterilizar en autoclave a 112 °C (7 libras de presión) durante 15 minutos. Enfriar hasta cerca de 50 °C. Ambas soluciones se mezclan antes de vaciar a los recipientes. Medio para Amonificadores de Stuart KH2PO41 g

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Na2HPO41 g Urea20 g Extracto de levadura0.1 g Rojo de fenol0.01 g Agua destilada1000 mL Medio para Desnitrificadores Solución A KNO31 g Asparagina1 g Azul de bromotimol al 1% (solución alcohólica)5 mL Agua destilada500 mL Solución B Citrato de sodio8.5 g KH2PO41 g MgSO4 .7H2O1 g CaCl2 .6H2O0.2 g FeCl3 .6H2O0.05 g Agua destilada500 mL Las soluciones A y B se preparan y esterilizan por separado. Suspender y disolver todos los ingredientes en el agua destilada. Esterilizar a 121 °C, 15 minutos. Antes del vaciado se hace una mezcla de las soluciones A y B en una relación 1:1. Medio para Nitrificadores (Fase I) (NH4)2SO40.5 g KH2PO41 g FeSO4 .7H2O0.03 g NaCl0.3 g MgSO4 .7H2O0.3 g CaCO3 7.5 g Agua destilada1000 mL Disolver y repartir en tubo. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Medio para Nitrificadores (Fase II) KNO20.2 g KH2PO41 g NaCl0.3 g MgSO4 .7H2O0.1 g FeSO4 .7H2O0.03 g CaCO3 1 g CaCl2 0.3 g Agua destilada1000 mL Disolver y repartir en tubos. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Reactivo de Griess I Ácido sulfanílico0.6 g Ácido acético al 30%100 mL

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Reactivo de Griess II Alfa-naftilamina0.6 g Ácido acético al 30%100 mL

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