Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005

Introducción de Derivados de Naftaleno en la 2´-Desoxitimidina como Marcadores No Radioactivos. Marquiza Sablón Carrazana1, Chryslaine Rodríguez-Tanty1, Rafaela Pérez1, Hermán VélezCastro 2, Anaís Fernández Villalobos 2, Lázaro Betancourt Nuñez3, Suchitil Rivera Marrero 4. 1

Centro de Neurociencias de Cuba. Ave 25 y 128, CP: 11600, C. Habana, Cuba; e-mail:

[email protected]. 2 Centro de Química Farmacéutica. 3 Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. 4 Facultad de Radioquímica, Instituto Superior de Ciencias y Tecnologías Nucleares. RESUMEN: La detección y la identificación de secuencias de ADN se han convertido en metodologías de rutina para el diagnóstico de enfermedades genéticas e infecciosas, así como para los estudios forénsicos y las investigaciones arqueológicas. Las técnicas de marcaje radioactivo y no radiactivo han sido empleadas para la detección de secuencias de ADN, debido a su alta sensibilidad. En métodos de detección que emplean marcadores no radioactivos se utilizan compuestos químicos (marcas láser, marcas inmunoquímicas, etc.) que pueden ser identificados por vías alternativas. En este trabajo se describe la síntesis química de algunos derivados de naftaleno que servirán como base para introducir luego a los derivados nucleosídicos adecuados. Así, se describe la introducción, a través de reacciones de acilación, de brazos espaciadores de diferentes longitudes en la posición 1- del naftaleno. Se presenta también la reacción del nucleósido derivado de la timidina, 5-aminometiluridina, con la. Se determinaron las propiedades físico-químicas de los compuestos: Pf y CCD, y además se realizó la elucidación estructural mediante las técnicas espectroscópicas de IR, RMN (1H y 13C) y Masas. ABSTRACT: The detection and identification of DNA sequences are routine methodologies for diagnosing genetic and infectious diseases, and also, forensic and archaeological researches. Radioactive and non-radioactive labelling techniques have been used to detect DNA sequences due to its high sensitivity. The non-radioactive detection method employs chemical compounds (laser and immunochemical labels) that can be identified by alternatives methods. In the present work, the chemical synthesis of several naphthalene derivatives is described. These compounds will be useful to introduce appropriate nucleoside derivatives. The introduction of various spacer arms with different lengths into 1-position of naphthalene, through acylation reactions, is also described. The reaction between the thymidine derivative, 5-aminomethyluridine, and the 4-[(2, 5-dioxo1-pyrrolidinyl)oxy]-N-(1-naphthyl)-4-oxobutanamide is presented. The chemical-physical properties (Tf and TLC) of obtained compounds were determined, and also, the structural elucidations through spectroscopic techniques (IR, 1H- and 13 C-NMR, Masas) were made. Palabras claves: 5-aminometiluridina, reacciones de acilación, derivados de naftaleno. Key words: 5-aminomethyluridine, acylation reactions, naphthalene derivatives.

INTRODUCCIÓN En los últimos años, la detección y la identificación de secuencias de ADN se ha convertido en una metodología de rutina para el diagnóstico de enfermedades genéticas e infecciosas, así también como para los estudios forénsicos y las investigaciones arqueológicas.1-3 Sin embargo, uno de los aspectos de mayor preocupación consiste en la obtención de resultados confiables y seguros, debido a las pequeñas cantidades de ADN con que se trabaja. Esto hace que se requiera del empleo de métodos muy sensibles que garanticen una alta confiabilidad en los resultados.4 Las técnicas de marcaje radioactivo han sido una de las más empleadas para la detección de secuencias de ADN, debido a su alta sensibilidad.1-3 Como marcadores fundamentales se emplean nucleótidos trifosfatados que contienen, en posición α de la cadena fosfatada, los radioisótopos 32 P o 35 S. Desafortunadamente, este método presenta desventajas como son: el tiempo de vida medio del

Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005 radioisótopo más empleado es corto (isótopo 32 P); el tiempo de exposición para la autoradiografía es prolongado; la manipulación de los isótopos resulta dañina para la salud; el conteo de la radioactividad requiere de un equipo especializado, el cual es costoso, y la eliminación de los desechos radioactivos constituye un problema debido a que producen contaminación ambiental.4, 5 De manera alternativa, han surgido métodos de detección que emplean marcadores no radioactivos para el marcaje de secuencias de ADN, con las cuales se eliminan las desventajas asociadas al empleo de marcadores radioactivos.6-9 Para ello se han empleado otros compuestos químicos (marcas láser, marcas inmunoquímicas, etc) que pueden ser identificados por vías alternativas. El empleo de marcadores inmunoquímicos con respecto a los marcadores láser presentan la ventaja que son menos caros en su procedimiento de obtención y de detección. El laboratorio de Síntesis Orgánica del Departamento de Biología Molecular del Centro de Neurociencias ha trabajado desde 1990 en el desarrollo de esta temática, lo que ha permitido la obtención de un nuevo marcador inmunoquímico, el radical p-bromobenzoilo, así como del anticuerpo monoclonal correspondiente. Se ha comprobado que este anticuerpo monoclonal no presenta reacción cruzada con los nucleósidos pirimidínicos y presenta una alta afinidad por la marca (Ka =1,54 x 109 mol/L).10-14 De igual manera que la marca p-bromobenzoilo, puede emplearse como un nuevo marcador a algunos derivados de naftaleno, cuya detección posterior puede ser realizada mediante inmunofluorescencia. Este trabajo tiene objetivo describir la síntesis química de algunos compuestos de naftaleno que servirán como base para introducir luego a los derivados nucleosídicos adecuados.

MATERIALES Y MÉTODOS Todos los reactivos y disolventes fueron puros para síntesis provenientes de la firma Merck. El progreso de las reacciones y la pureza de los productos obtenidos se observó mediante Cromatografía en Capa Delgada (CCD). Se utilizaron placas preelaboradas de gel de sílice Merck de 0,25 mm de grosor con indicador fluorescente (254 nm). La fase móvil empleada para el desarrollo de los cromatogramas fue acetato de etilo. Las temperaturas de fusión fueron determinadas en un equipo Electrothermal, modelo 9100. Las determinaciones de Tf no fueron corregidas. Los espectros infrarrojos se registraron en un espectrómetro de marca ATI Mattson Genesis Serie FTIR con transformada de Fourier (FTIR) en el intervalo de 400 a 4000 cm-1. Se hicieron un total de 35 barridos para cada muestra. Las muestras sólidas fueron preparadas en pastillas de bromuro de potasio a temperatura ambiente. La intensidad de las señales se clasificaron en fuerte (f), media (m) y débil (d). Los espectros RMN-1H y RMN-13C fueron registrados en un equipo de la marca Bruker modelo AC 250F a 250,13 y 62.8 MHz respectivamente. Se empleó tetrametilsilano (TMS) como estándar interno. Las muestras se disolvieron en cloroformo deuterado (CDCl3). La multiplicidad de las señales para los espectros fue designada de la siguiente forma: singulete (s), doblete (d), triplete (t), cuadruplete (q), multiplete (m) y banda ancha (a). Las sustituciones de los átomos de carbono se obtuvieron a partir de los espectros Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer (DEPT) y fueron designadas las señales de la siguiente forma: carbono primario (p), secundario (s), terciario (t), el cuaternario (c). Los espectros de Masas por ionización electrospray fueron registrados en un espectrómetro Micromass, con geometría ortogonal QTOF-2. Los espectros fueron procesados con el programa MassLinx v3.5 (Micromass, UK). Obtención del ácido 4-(1-naftilamino)-4-oxobutanoico (1). Se disuelven 3 g de 1-naftilamina (20.95 mmol) en 30 mL de 1,4-dioxano y luego, a esta disolución, se adicionan 4.19 g de anhídrido succínico (41.9 mmol). La mezcla de reacción se calienta a reflujo durante 1 hora. Se enfría a –20 oC para precipitar un sólido violeta que se filtra al vacío y se lava con dioxano. Este sólido se recristaliza de etanol, empleando carbón activado. Se obtienen 2.4 g de sólido blanco. Tf=166.5-168 oC, Rend. 47.2 %. 1H-RMN (DMSO-d6/313K): 12.07 (1H, s, -COOH); 9.87 (1H, s, NH); 8.13-7.45 (7H, m, CH); 2.72 (2H, m, -CH2); 2.60 (2H, m, -CH2). IR: 3500 (d, ν CHsp2), 1714 (f, ν C=O), 1656 (f); 1533 (f) 1500 (m); 1431 (m); 1398 (f); 1348 (m); 1250 (f), 1203 (m); 1170 (m); 913 (m), 789.8 (m), 775 (m). CCD: Rf: 0.3. Obtención de la 4-[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxy]-N-(1-naftil)-4-oxobutanamida (2). A 32 mL de 1,4-dioxano anhidro, se adicionan 2 g del ácido 4-(1-naftilamino)-4-oxobutanoico (III) (8.23 mmol), 1.42 g de N-hidroxisuccinimida (NHS) (12.34 mmol) y 2.54 g de diciclohexilcarbodiimida (DCC) (12.33 mmol). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 2 días. Una vez concluida

Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005 la reacción, determinado por CCD, la mezcla de reacción se filtra para separar la diciclohexilurea que se forma. A continuación, la fase líquida se concentra hasta la tercera parte de su volumen inicial, se enfría y el sólido blanco que precipita se filtra y se lava con agua y éter. Se seca al aire sobre papel para obtener 2.29 g de producto. Tf.: 168-171oC, Rend.: 81.8 %. 1H-RMN (DMSO-d6/313K): 9.97 (1H, a, NH); 8.06-7.40 (7H, m, CH); 2.95 (4H, m, 2 CH2); 2.58 (4H, s, 2 CH2). 13 C-RMN (DMSO-d6/313K): 171.67 (-2 CO); 171.29 (- 2 CO); 133.73 (c, 1); 128.08 (t, 3); 127.83 (c, 10); 126.00 (t, 6); 125.77 (t, 8); 125.57 (t, 7); 125.13 (t, 5); 122.90 (t, 4); 122.58 (c, 9); 121.59 (t, 2); 38.48 (s, 3´); 31.38 (s, 4´); 30.73 (s, 7´, 8´). IR: 3283 (m); 2916 (m); 1729 (f, ν C=O), 1666 (f); 1562 (m), 1208 (m); 1104 y 1083 (m). CCD: Rf: 0.5. Procedimiento general de la reacción de 2 con diferentes aminas para obtener 3 y 4. Se disuelve 2 en el disolvente adecuado a temperatura ambiente y a esta disolución se adiciona el agente nucleofílico estudiado. La temperatura y los tiempos de reacción se muestran en la Tabla 1. Tabla1. Condiciones de la reacción entre la 4-[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxy]-N-(1-naftil)-4-oxobutanamida (2) y diferentes agentes nucleofílicos. Agente nucleofilico

Disolvente

Temp. (o)

Tiempo (h)

etilendiamina

1,4-dioxano o DMF

reflujo

2–5

1,4-butilendiamina

1,4-dioxano o DMF

reflujo

5

β-alanina

1,4-dioxano

reflujo

2

Ácido 1-aminohexanoico

DMF

reflujo

12

5-aminometiluridina

DMF

50

24

RESULTADOS Y DISCUSIÓN El derivado 1 se obtuvo a partir de la reacción de la 1-naftilamina con anhídrido succínico, en 1,4dioxano como disolvente, con un rendimiento de un 47 % y una elevada pureza (Fig. 1). O

O 2´

HN

NH2

COOH

HN

a

b

9

1

2

10

6 5

COOR

1

8 7

´ 4

2

O 6´

3 4

R:

9´

Condiciones: a.- Anhídrido Succínico, 1,4-dioxano, reflujo 1h., 47 %; b.- DCC, NHS, 1,4-dioxano, temperatura ambiente 2 d., 81 %.

7´

N 8´

O

Fig.1 Procedimiento de obtención de la 4-[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxy]-N-(1-naftil)-4-oxobutanamida (2). El espectro de 1H-RMN del compuesto 2 muestra cinco señales que agrupan a todos los protones de la molécula. Entre ellas se destaca la señal a 12.07 ppm correspondiente al protón del grupo carboxilo. La señal a 9.87 ppm integra al protón del grupo amino y las señales de los protones de los dos grupos metilenos aparecen separadas a 2.72 y a 2.60 ppm. En el espectro de masas se observa un pico de m/z 244 (M+1)+, que permite corroborar la estructura de este compuesto.

Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005 Los ésteres de N-hidroxisuccinimida han sido ampliamente utilizados en el campo de la síntesis química ya que los mismos son agentes acilantes suaves y selectivos a grupos aminos primarios.15 Así, el compuesto 2 se obtuvo a partir de la reacción de acilación de 1 con N-hidroxisuccinimida (NHS), en presencia de diciclohexilcarbodiimida (DCC) y dioxano como disolvente, con un rendimiento de un 81.8 % (Fig.1). El espectro de 1H-RMN de este compuesto muestra cuatro señales que agrupan a todos los protones de la molécula. Se observa la desaparición de la señal a 12.07 ppm del protón del grupo ácido y la aparición a 2.58 ppm de un multiplete que agrupa a los cuatro protones del grupo succinimido. Asimismo, en el espectro de 13C-RMN aparecen todas las señales de los átomos de carbono de la molécula. Entre ellas se destaca la aparición de las señales de los dos grupos carbonilo y los dos grupos metilénicos pertenecientes al grupo succinimido. En el espectro de masas se observa un pico de m/z 341 (M+1)+, que permite corroborar la estructura de este compuesto. Con el propósito de elongar la cadena, posteriormente se realizó la reacción de sustitución del grupo succinimido de 2 con diferentes diaminas alifáticas o aminoácidos: etilendiamina, 1,4-butilendiamina, βalanina y ácido 1-aminohexanoico, para así obtener 3 (a-d) (Fig.2). En todos los casos ocurre un ataque nucleofílico del átomo de nitrógeno del grupo amino primario sobre el átomo de carbono del grupo carbonilo lo que provoca la sustitución del grupo succinimido de 2. O

O

HN

COOR

HN

COOR´

O

3

2 N

R:

O

-R´

Producto 3 a

-HN(CH2)2NH2

b

-HN(CH2)4NH2

c

-HN(CH2)2COOH

d

-HN(CH2)5COOH

Fig. 2 Reacción de la 4-[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxy]-N-(1-naftil)-4-oxobutanamida (2) con diferentes diaminas alifáticas o aminoácidos: etilendiamina (3a), 1,4-butilendiamina (3b), β-alanina (3c) y ácido 1-aminohexanoico (3d). En la tabla 2 se muestran los resultados de la síntesis de 3 a partir de la reacción de 2 con las diaminas y aminoácidos citados. Tabla 2. Resultados obtenidos en la reacción de la -[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxy]-N-(1-naftil)-4oxobutanamida (2) con diferentes agentes nucleofílicos (diaminas o aminoácidos). Agente nucleofílico

Rf a

Tf (oC)

Rend. (%)

Prod.

Data espectral

Etilendiamina

0

259-261

84.4

3ac

Masas: m/z 286 (M+1)+ d

1,4-Butilendiamina

0

-

18.1-31.8

3bc

Masas: m/z 314 (M+1)+ e

β-Alanina

0.15

180.5-181.8

b

3c

Masas: m/z 315 (M+1)+ d

ácido 1aminohexanoico

0.3

229-231

b

13

C-RMN: 9.92 (1H, s, -COOH); 8.057.50 (7H, m, CH); 3.55 (1H, a); 2.69 (2H, t); 2.4 (2H, t); 1.69 (5H, m); 1.1 (6H, m) a CCD realizada en acetato de etilo como fase móvil. b Rendimiento bajo por pérdida de producto en la etapa de aislamiento. c Se obtiene fundamentalmente producto colateral cuando se adiciona lentamente la diamina al derivado 2. d Señal a m/z 511 (M+1)+ cuando se obtiene producto colateral bajo condiciones de c. e Señal a m/z 539 (M+1)+ cuando se obtiene producto colateral bajo condiciones de c. 3d

Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005 Los compuestos obtenidos, 3a, 3b, 3c y 3d, fueron debidamente caracterizados mediante las técnicas espectroscópicas de IR, 1H- y 13C-RMN y Masas. En la tabla 2 se muestra la data espectral más relevante que confirma las estructuras antes mencionadas. De los resultados mostrados en la tabla 2, se observa que cuando se adiciona lentamente la diamina estudiada a una disolución del compuesto 2, no se forma el compuesto 3 deseado. En estos experimentos se favorece la formación de diaminas N,N´-disustituidas (Fig.3) que se producen por la reacción de 3a y·3b con 2 (que se encuentra en exceso al inicio de la reacción).

O

O NH

HN

NH

NH O

O

I (M+1=511)+

O

O NH

HN

2

O

II

NH

NH O

(M+1=539)+

Fig. 3 Estructuras químicas de los productos colaterales formados en la reacción de las diaminas, etilendiamina (compuesto I) y 1,4-butilendiamina (compuesto II), con el derivado 4-[(2,5-dioxo-1pirrolidinil)oxy]-N-(1-naftil)-4-oxobutanamida (2). Estos productos colaterales fueron aislados y caracterizados mediante espectroscopía de 1H-RMN y Masas. En los espectros de Masas se observaron los picos moleculares correspondientes a las diaminas disustituidas, (M+1=511)+ (Fig. 3, I) y (M+1=539)+ (Fig. 3, II), que se forman cuando se emplean etilendiamina y 1,4-butilendiamina, respectivamente. Asimismo, la reacción de 2 con el nucleósido, 5-aminometiluridina,14 se realizó en presencia de trietilamina y DMF como disolvente (Fig. 4). O

O

O NH

O

N

O

O

N

OH

+

2

NH

NH

H2N

NH

O

O

OH

4 OH 5-aminometiluridina

Tf: 138-141 oC

OH

Fig. 4 Esquema de la reacción entre la 4-[(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)oxy]-N-(1-naftil)-4-oxobutanamida (2) y el nucleósido 5-aminometiluridina. En esta reacción se aísla un sólido, con un intervalo de temperatura de fusión (Tf) igual a 138-141 oC, que fue caracterizado mediante espectrometría de Masas.

Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005 En el espectro de Masas se observó que la señal más intensa se corresponde con un valor de m/z de 579 (M + 1)+, que evidencia la formación de un compuesto con estructura química aún desconocida. También se observa una señal a m/z 483 (M + 1)+, que se corresponde con el pico molecular del producto deseado 4, lo que confirmó la obtención del mismo.

CONCLUSIONES A partir de reacciones de acilación de la 1-naftilamina se obtuvieron nuevos derivados de naftaleno que portan un brazo espaciador activo. Los rendimientos de síntesis y la pureza son aceptables. Se comprobó que el orden de adición en la reacción, entre el derivado 2 y las diaminas, determina la formación de compuestos mono- y disustituidos.

Se comprobó, de forma preliminar, que mediante la acilación de la 5-aminometiluridina con 2 es posible obtener un nuevo compuesto nucleosídico. El mismo puede ser utilizado como marca inmunoquímica.

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