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LA PURIFICACION DE PREPARACIONES ENZYMATICAS PARA LA ENOLOGIA. IMPACTOS SOBRE LA CALIDAD DE VINOS TINTOS Y BLANCOS Rose-Marie Canal-Llaubères Novozymes France, 23, parvis des Chartrons, 33074 Bordeaux Cédex

Introducción Las preparaciones enzimáticas, producidas por microorganismos no modificados genéticamente, contienen numerosas actividades enzimáticas. Los hongos filamentosos ubicuos no patogénicos son aislados del suelo, donde contribuyen con la microflora. El espectro de actividades enzimáticas se explica por la adaptación del microorganismo a su hábitat natural. Las especies empleadas en enología, Aspergillus niger y Trichoderma harzianum, contienen, además de las actividades por las que son cultivadas (pectinasas de A. niger, β-1,3-1,6 glucanasas de T. harzianum), otras actividades como celulasas, β-glucosidasas, xilanasas, galactanasas y proteasas, por mencionar algunas. Ciertas actividades son indeseables en las aplicaciones enológicas, tal es el caso de la cinamil-esterasa (CE) presente en A. niger. En consecuencia, es razonable elaborar peparaciones con niveles de actividad CE débil o bien nula. En la industria, se eligen las condiciones de fermentación para fomentar la producción de actividades “principales”. Es en base a las actividades que se caracterizan las preparaciones enzimáticas. Sin embargo, el espectro enzimático de cada preparación, específico de cada productor, depende de la cepa y de las condiciones de cultivo. Para obtener preparaciones con un solo tipo de actividad es necesario utilizar microorganismos genéticamente modificados (MGM). Luego de haber presentado el origen, las cepas y las condiciones de fermentación, este artículo repasará las actividades enzimáticas responsables de la formación de fenoles volátiles en los vinos y el rol de la purificación en actividades enzimáticas indeseables. Nota: preferimos reservar el término enzima a una proteína con poder catalítico definido (ejemplo: pectin-esterasa). Las preparaciones enzimáticas contienen gran cantidad de enzimas o actividades enzimáticas. ¿Cuáles son las fuentes fúngicas de enzimas? Las especies de hongos, comúnmente empleadas en la industria biotecnológica para la producción de enzimas enológicas, pertenecen a la familia de las Ascomicetas (como todas las especies de Saccharomyces). Estos organismos no son patógenos y colonizan hábitat naturales. Aspergillus niger (Foto 1) es un hongo microscópico filamentoso.

Foto 1 : Esquema de Aspergillus niger Trichoderma harzianum (Foto 2) se aisla del suelo, donde forma parte de la flora natural. Algunas especies son reconocidas como funguicidas y protegen a los cultivos de Botrytis, o podredumbre gris (mildiou).

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Foto 2 : Trichoderma harzianum Aspergillus y Trichoderma son dos microorganismos empleados para la elaboración de preparaciones enzimáticas destinadas a la enología (pectinasas, glucanasas). Las otras preparaciones son extraídas de huevos blancos (lisozima) o de cultivos de Lactobacillus fermentum (ureasa). El uso de preparaciones enzimáticas en la enología obedece a tres niveles de reglamentaciones (Goutel, 1996): comunitario, nacional e internacional, este último basado en las resoluciones de la OIV. La producción de las preparaciones Las preparaciones enzimáticas se obtienen generalmente por fermentación. En la industria, las especies seleccionadas son cultivadas sobre sustratos agrícolas, tales como la harina de soja o almidón de papa. El método más comúnmente utilizado es el cultivo en medio sumergido. Canal-Llaubères (2002) describe las diferentes etapas de producción desde la fermentación hasta la formulación. El resultado de la fermentación es una preparación enzimática con gran cantidad de actividades, desprovista del microorganismo productor. La electroforesis de una preparación de pectinasas, Foto 3, muestra las diferentes bandas que la componen. Cada banda corresponde a una actividad enzimática (de izquierda a derecha: siembra 1, pectinasa producida por una cepa de Aspergillus niger, siembras 2 y 3, pectinasa producida por otra cepa de A. niger, siembra 4, pectina liasa A producida por un MGM, siembra 5, marcadores de peso molecular)

Foto 3: Gel de electroforesis (SDS PAGE) de preparaciones de pectinasas producidas por Aspergillus niger (a la derecha : siembra 5, marcador de peso molecular). Esta foto permite visualizar la complejidad de las preparaciones enzimáticas, obtenidas a partir de un microorganismo no modificado genéticamente (no MGM), comparadas con preparaciones mono componentes (o enzima) producidas por un MGM. Es importante destacar que la enzima no se modifica, quien es modificado es el microorganismo productor. Este, mediante mutaciones genéticas, es inducido a la síntesis del tipo de actividad enzimática deseado. Recordemos que denominamos

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enzima a un prótido de naturaleza catalítica, producido por una célula viva y, como todas las proteínas, son biodegradables. Actividades enzimáticas indeseables De todas las actividades enzimáticas conocidas, algunas han sido identificadas como capaces de originar desviaciones organolépticas (pérdidas de frescura en vinos blancos, aparición de caracteres fenólicos más o menos pronunciados en vinos blancos y tintos). Este es el caso de la cinamil-esterasa, concomitante a las preparaciones de pectinasas elaboradas a partir de cepas de Aspergillus niger. Las mezclas enzimáticas de Trichoderma harzianum son ejemplos naturales de la actividad CE. El nivel de actividad depende del microorganismo y también de las condiciones de fermentación. Purificación y caracterización de la actividad cinamil-esterasa A partir de la introducción de la pectinasas en la Enología para la decantación de mostos, a mediados de los años 70, Burkhardt (1976) notó que su empleo llevaba a una rápida pérdida del bouquet de vinos blancos alemanes. Él atribuyó estos defectos organolépticos a la presencia de una actividad enzimática “depsidasa” producida por Aspergillus niger y contenida en las preparaciones enzimáticas utilizadas. Estas actividades son susceptibles de hidrolizar los compuestos hidroxi-cinamoil tartárico de los mostos blancos. Maurer (1987) calificó estas actividades como “clorogénicas” pero las definió de manera idéntica. Numerosos autores se inclinan a este problema sin siquiera aportar respuestas sobre la identificación de las sustancias volátiles responsables por la pérdida de tipicidad de tales vinos. Los trabajos de Chatonnet et al. (1992) permiten poner en evidencia el rol de las preparaciones de pectinasa sobre el contenido de fenoles volátiles de los vinos. Con anterioridad, Chatonnet et al. (1989) habían demostrado el papel de Saccharomyces cerevisiae en la formación de estos compuestos. Barbe (1995) purificó y caracterizó la actividad de la cinamilesterasa. Se trata de glicoproteína de peso molecular estimado en 240 000Da, formado por dos unidades de 120 000Da. Formación de fenoles volátiles Los fenoles volátiles, vinil- y etil-, contribuyen al aroma de los vinos blancos y tintos. En ciertas concentraciones, estos compuestos pueden aportar languidez mientras disimulan el frutado, o incluso depreciar los vinos por desarrollo de aromas a farmacia, tinta, pintura o clavo de olor (vinil-4-fenol, vinil-4-guayacol) y aromas a establo y sudor (etil-4-fenol, etil-4-guayacol). Estos compuestos provienen del metabolismo de los ácidos fenólicos bajo la acción de microorganismos durante la fermentación. 1. Formación de vinil-fenoles Barbe (1995) demostró la evolución del contenido de vinil-4-fenol y vinil-4-guayacol durante la fermentación alcohólica, con y sin preparaciones enzimáticas pectolíticas. La presencia de vinil-fenoles es únicamente detectada en vinos blancos. Su formación depende de las reacciones enzimáticas mediante la intervención de la cinamato decarboxilasa (CD) de levaduras (Albagnac, 1975). El gen POF1 (fenólico off-flavor), que codifica la síntesis de esta proteína, ha sido clonado por Meaden y Taylor (1991). La actividad CD está con frecuencia presente en Saccharomyces y en la mayoría de las cepas de levaduras enológicas secas activas (Grando et al., 1993). Así, las cepas desprovistas de actividad cinamato decarboxilasa (o pof-) han sido seleccionadas para evitar la formación de vinil-fenoles. En vinos tintos esta actividad es inhibida por los compuestos fenólicos de las uvas tintas (Chatonnet et al., 1989). El contenido de vinilfenoles es más importante en vinos blancos provenientes de tratamientos enzimáticos con pectinasas que presentan una actividad CE, la velocidad de incremento en relación a un vino testigo podrá ser del 50% (Figura 3). Las preparaciones enzimáticas no contienen la cinamato decarboxilasa. La Figura 1 muestra la hidrólisis de ésteres VINIDEA.NET WINE INTERNET TECHNICAL JOURNAL, 2003, N. 7

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tartáricos de los ácidos cinámicos del mosto, bajo la acción de una actividad secundaria de tipo esterasa, presente en las preparaciones enzimáticas. En uvas maduras la concentración de los precursores es 2 a 5 veces más elevada que la de los ácidos fenólicos libres. R

Cinamil-esterasa O

HO

CH

CH

C O

precursores

Acido tartárico

R O HO

CH

CH

C

OH

Ácidos fenólicos libres

Figura 1. Formación de vinil-fenoles en vinos blancos. Etapa 1: hidrólisis de derivados hidroxicinamoil tartáricos por la acción de CE (preparación de pectinasas, Botrytis cinerea). La aparición de vinil-fenoles en vinos es descripta en la Figura 2. Estos compuestos son formados por la decarboxilación de los ácidos cinámicos libres en el mosto y de los ácidos cinámicos provenientes de la hidrólisis de ésteres tartáricos mediante una esterasa presente en las preparaciones pectolíticas, bajo la acción de la cinamato decarboxilasa de Saccharomyces cerevisiae. R O HO

CH

CH

C

Cinamato-decarboxilasa

OH Saccharomyces

R HO

CO2

CH

CH2

Vinil-fenol

Figura 2. Formación de vinil-fenoles de vino blanco. Etapa 2: hidrólisis de los ácidos cinámicos por la acción de CD (Saccharomyces cerevisiae). La puesta a punto de preparaciones pectolíticas, débiles en actividad CE, ha permitido limitar la formación de vinil-fenoles en vinos blancos. Los resultados obtenidos en Sauvignon blanc se presentan en la Figura 3. El empleo de preparaciones pectolíticas clásicas (no purificadas de la actividad CE) para el desfangar los mostos, ocasiona en los vinos un aumento de 2 a 4 veces más en el contenido de vinil-4-fenol, en relación a los vinos testigos. El uso de preparaciones con actividad CE débil limita (FCE), por debajo del umbral de percepción (770 µg/l), el contenido de vinil-4-fenol. Estos resultados han sido confirmados en otros vinos (Muscat).

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Vini-4-fenol (µg/l) 2000

1500

1000

Umbral de percepción

500

0 Testigo

Prep. Pura FCE

Prep. Estandar P. Chatonnet & C. Barbe, 1992

Figura 3. Incidencia de las preparaciones enzimáticas en el contenido de vinil-fenoles en Sauvignon (maceración pelicular de 12 horas a 15°C bajo CO2, desfangado en presencia de pectinasas a 1 g/HL, NTU 100, con el agregado de 10 g/HL de LSA pof+) 2. Formación de etil-fenoles En vinificación en tinto, es común encontrar vinos que presentan un carácter fenólico. Saccharomyces no es responsable de la formación de fenoles volátiles, ya que la actividad CD es inhibida por los compuestos fenólicos (Chatonnet et al., 1997). En vinos tintos la contaminación por Brettanomyces es la responsable de su formación, desarrollando aromas a cuero y, más allá del umbral de percepción, aromas a establo o sudor. Por lo tanto, de acuerdo a Chatonnet, cerca de 1/3 de los vinos de Bordeaux analizados presentan características fenólicas. De la misma manera, Gerbaux señala que los vinos Pinot noir son particularmente sensibles a la contaminación por Brettanomyces. En consecuencia, el 50% del vino en crianza y el 25% del vino embotellado está contaminado. Esta levadura es capaz de decarboxilar los ácidos fenólicos libres en el mosto y los liberados por el empleo de pectinasas (Figura 1). Contrariamente a Saccharomyces, la cinamato decarboxilasa de Brettanomyces no es inhibida por los polifenoles. Ella permite la formación de vinil-fenoles que luego son reducidos a etil-fenoles por intermedio de una vinil-fenol reductasa (VPR) (Figura 4). Los trabajos recientes de Gerbaux et al. (2002) muestran que ciertas prácticas, como la maceración final en caliente y la utilización de pectinasas, en la variedad Pinot noir pueden aumentar el riesgo de formación de estos compuestos en presencia de levaduras contaminantes y pueden superar el umbral de percepción (400 µg/l con una relación de etil-4-fenol/etil-4-guayacol de 10/1). Los autores demuestran que el empleo de pectinasas no purificadas, con actividad CE, incrementan el contenido de etil-fenoles en vinos, y en particular del etil-4-fenol, con la consecuencia negativa sobre la calidad de los vinos. Las preparaciones de pectinasas FCE no ocasionan la modificación de estas sustancias, en comparación con el vino testigo. Por lo tanto, las preparaciones pectolíticas FCE justifican su uso en vinificaciones tintas.

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R

Cinamato -decarboxilasa

O CH

HO

CH

C

OH Brettanomyces

R HO

CO2

CH

CH2

Vinil-fenol reductasa Etil-fenol

Figura 4. Formación de etil-fenoles en vinos tintos. Etapa 2: hidrólisis de ácidos cinámicos por acción de CD (Brettanomyces) y formación de vinil-fenoles. Etapa 3: reducción de vinil a etil-fenoles por acción de VPR (Brettanomyces). El control de la actividad CE La literatura menciona numerosas actividades esterásicas en Aspergillus sp. Esta, por su parte, revela una gran confusión en la nomenclatura de las actividades estarasas fúngicas (tanasa, depsidasa, clorogenasa, ácido hidroxicinámico ester hidrolasa) y varias apreciaciones en el impacto cualitativo. Luego de la identificación y caracterización de la actividad responsable de la hidrólisis de los esteres tartáricos de los ácidos cinámicos, los estudios muestran que es posible eliminar parcialmente la actividad cinamil esterasa de preparaciones peptolíticas mediante ultraflitración por membrana de umbrales de 100.000 Da. La mayor parte de la actividad CE es retenida y permite obtener una pequeña riqueza en actividad CE. En la producción, el método más frecuentemente empleado está basado en el tratamiento de pH de la preparación antes de que su formulación desnaturalice la actividad CE. Sin embargo, este proceso también tiene un impacto sobre otras actividades enzimáticas, haciendo disminuir los rendimientos. Los trabajos de Barbe (1995) permitieron validar este proceso de purificación determinando el contenido límite mínimo de CE para el cual la producción de vinil-fenoles permanecen por debajo de su umbral de percepción. Conclusión Las preparaciones enzimáticas para la enología y, especialmente, las pectinasas pueden contener ciertas actividades indeseables como las cinamil esterasa de Aspergillus niger. Su prescencia, puede en ciertos casos, dañar la calidad de vinos blancos y tintos, produciendo una pérdida de la frescura aromática o exacerbando el carácter fenólico para alcanzar notas pocos placenteras. Los elaboradores manejan las precauciones para purificar las preparaciones de ésta actividad y para proponer preparaciones peptolíticas con actividad cinamil esterasa débil (FCE). Su utilización en los racimos (maceración) o en el mosto (clarificación) permite limitar la hidrólisis de los esteres tartáricos de los ácidos fenólicos. Por lo tanto, la composición inicial de mostos tintos y blancos no es modificada cuando el productor añade estas preparaciones enzimáticas. Bibliografía Albagnac G., 1975. La décarboxylation des acides cinnamiques substitués par les levures. Ann. Techn. Agric., 24,2, 133-141. Barbe C., 1995. Recherches sur les activités estérases contaminantes des préparations pectolytiques. Applications technologiques. Thèse de doctorat de l’université de Bordeaux II, n°348.

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Burkhardt V.R., 1976. Depsidspaltende Nebenwirkung von Enzympräparaten für die Be-und Verarbeitung von Lebensmitteln beobachtet bei der Aufbereitung von Obst-und Traubenmaischen. Dtsch. Lebensmittel-Rdsch., Canal-Llaubères R.M, 2002. Le procéde de production des préparations enzymatiques. Applications à l’œnologie. Revue des Œnologues, 104, 35-37. Chatonnet P., Barbe C., Canal-Llaubères R.M., Dubourdieu D. et Boidron J.N. , 1992. Incidence de certaines préparations pectolytiques sur la teneur en phénols volatils des vins blancs. J. Internat. Sci. Vigne Vin, 26, 4, 253-269. Chatonnet P., Dubourdieu D., Boidron J.N., 1989. Incidence de certains facteurs sur la décarboxylation des acides phénols par la levure. Conn. Vigne Vin, 23, 1, 59-62. Chatonnet P., Viala C. and Dubourdieu D., 1997. Influence of polyphenolic components of red wines on the microbial synthesis of volatile phenols. Am. J. Enol. Vitic., 48, 4, 443-448. Gerbaux V., Vincent B. and Bertrand A., 2002. Influence of maceration temperature and enzymes on the content of volatile phenols in Pinot noir wines. Am. J. Enol. Vit., 53, 2,131-137. Goutel A.M., 1996. Réglementation de l’utilisation des enzymes en œnologie. Rev. Française d’œnologie, 157, 25-27. Grando M.S., Versini G ;, Nicolini G. and Mattivi F., 1993. Selective use of wine yeast strains having different volatile phenols production, Vitis, 32, 43-50. Maurer R., 1987. Pektin und Pektinabbau bei der Weinbereitung. Rebe-wein, (2), 370-374. Meaden P.G. and Taylor N.R., 1991. Cloning of yeast gene which cause phenolic off-flavors in beer. J. Inst. Brew., 97, 5, 353-357.

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