La sangre y la salud Dr. Jose Mª Moraleda Departamento de Medicina 22, Marzo 2011

Frotis de sangre periférica normal

J M Moraleda Marzo 2011

Principios básicos

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Funciones de las células de la sangre

Hematíes

Plaquetas Leucocitos

Trasporte de Oxígeno

Defensa contra Infecciones J M Moraleda Marzo 2011

Evitar Hemorragias

Hematopoyesis Y

Y

Y

Producción y desarrollo de las células sanguíneas Objetivo: mantener un número estable de células a lo largo de toda la vida (homeostasis) Lugar: médula ósea espacios intertrabeculares de huesos axiales Y epífisis de huesos largos. Y

Y

Cambia a lo largo del desarrollo embrionario J M Moraleda Marzo 2011

Hematopoyesis. Lugares

Bm.jpg

J M Moraleda Marzo 2011

Hematopoyesis. Lugares

J M Moraleda Marzo 2011 Metcalf D. Stem cells. 2007;25:2390-2395

Hematopoyesis fetal y del adulto FETO

ADULTO Esqueleto Axial

Saco Yolk

Higado y Bazo

Huesos Largos

Meses

Años

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Esquema de la Hematopoyesis Granulocitos neutrófilos

Monocitos - macrófagos

C. Stem Mieloide C. Stem Pluripotente

Eosinófilos

Celula Stem Pluripotente

C. Stem Pluripotente

GLOBULOS ROJOS

PLAQUETAS

C. Stem Linfoide

Sistema inmune: Linfocitos B y T

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Hematopoyesis: Elementos Fundamentales 1. Células stem (células madre, tronco, germinales) 1. Células Stem à Progenitores H. à células maduras.

2. Micromedioambiente hematopoyético: Nicho + Células del estroma: Producen matriz extracelular y citocinas a) Matriz extracelular: Laminina, fibronectina, colágeno a) Laminina, fibronectina, colágeno (oporte físico de las células stem). b) Moléculas de adhesión (selectinas, integrinas)

b) Citocinas: producidas por c. del estroma, linfocitos y monocitos a) Factores de crecimiento: EPO, G-CSF, Trombopoyetina b) Interleucinas: IL-1, IL-3, IL-6, etc. J M Moraleda Marzo 2011

Microambiente Hematopoyético

Yin T. et al The Journal of Clinical Investigation, 2006

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Células Stem Hematopoyéticas Métodos de identificación

1. Los Trasplantes de MO 2. Cultivos de colonias “in vitro”: LTC-IC CFU-GM BFU-E

3. Anticuerpos monoclonales J M Moraleda Marzo 2011

Factores de Crecimiento Promueven la proliferación, diferenciación y maduración celular • Multipotenciales: – Stem-cell factor (c-kit), IL3, GM-CSF

• Monopotenciales: – Serie roja: Eritropoyetina (EPO) – Serie blanca: • Granulocitos: G-CSF • Monocitos: M-CSF

– Serie plaquetaria: Trombopoyetina J M Moraleda Marzo 2011

Hematopoyesis SCF FL G-CSF TPO IL-3 IL-6 IL-11

C. Madre Mieloide

FL TPO SCF

C. Madre Pluripotente

SCF FL IL-7

C. Madre Linfoide

G-CSF IL-11 IL-6

Pro-B

Pro-T

TPO IL-3 FL IL-3

CFU-Meg

BFU-E

SCF IL-3 GM-CSF

SCF IL-3 IL-9 GM-CSF

CFU-E TPO EPO IL-6 IL-11

Plaquet.

CFU-GM

Epo

G. Rojos

CFU-Eo

IL-3 IL-6 GM-CSF

CFU-G G-CSF

Neutrófilos

IL-5

CFU-Ba

IL-3

CFU-Mast SCF IL-3 IL-4

CFU-M

Pre-B

M-CSF

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Monocitos

Eosinóf.

Basófilos

Mastocitos

Pre-T

SCF IL-17

Célula B

IL-3

IL-1 IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-9 IL-12

C. Plasmáticas

IL-2 IL-6 IL-7 IL-8 IL-9 IL-12

Células T

Eritropoyesis • Proceso fisiológico de maduración de la serie roja en la M.O. • Representa 30 a 35% de la hematopoyésis.

• Tiempo de maduración de proeritoblasto a reticulocito: 5 - 7 días. • La Eritropoyetina es fundamental para la maduración J M Moraleda Marzo 2011

Eritropoyesis. Fisiopatología - Factor de crecimiento que se produce en las células peritubulares del riñon - Necesaria para la proliferación y maduración eritroide - En la patología renal se produce anemia como consecuencia de la falta de EPO - El exceso de EPO produce poliglobulia

Eritrocito = Hematíe = Globulo rojo Célula anucleada. Forma de disco biconcavo. Diámetro: 7,5-8 µm Espesor: 2 µm. Volúmen: 80 a 100 fL Alta flexibilidad y deformabilidad Estructura: Proteinas, lípidos, enzimas intracitoplasmáticas. Alto contenido de Hb, proteina especializada en el intercambio de gases (02 C02)

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Anemia. Signos clínicos

Coiloniquia

Palidez de piel y mucosas

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Queilitis, glositis, rágades

Granulopoyesis Mieloblasto Alta relación N/C, nucléolo No gránulos

Promielocito* Tiene nucléolo, granulos 1º (lisosomas)

Caracteristicas generales granulpoyesis • Disminución progresiva del tamaño • Aparición de gránulos (1ºs y después gránulos específicos) • Condensación y lobulación del núcleo

Mielocito neutrófilo Granulos específicos Nucleo oval, no nucleolo Neutrófilo madurol Metamielocito neutrófilo Nucleo indentado

Cayado / bastonado Nucleo condensado, Aún sin segmentaciones

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Maduración mieloide Mieloblasto

Promielocito

Mielocito

Metamielocito

MADURACION J M Moraleda Marzo 2011

Cayado

Segmentado

CINÉTICA Y DISTRIBUCIÓN GRANULOCITOS Pool medular mitótico: Mieloblastos (1 mitosis) Promielocitos (1-2 mitosis) Mielocitos (2 mitosis)

6 días

Pool medular postmitótico o madurativo: Metamielocitos Cayados Segmentados

6 días adicionales de permanencia en médula ósea

Pool periférico marginal Pool periférico circulante

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Trastornos de los leucocitos Infecciones

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Trastornos de los leucocitos Leucemias

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Trombopoyesis. Citocinas

J M Moraleda Marzo 2011 N Engl J Med 1998; 339:746-754

Trombopoyesis. Diferentes estadios

Promegacariocito Megacariocito basófilo Megacariocito granular y liberador de plaquetas.

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Trombopoyesis

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Trastornos de la Hemostasia

Gingivorragias

Hematomas

Purpura petequial

Equímosis

Hemorragia retiniana

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Hemartrosis

Linfopoyesis

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Trastornos de los linfocitos Linfomas

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El estudio de la sangre en el laboratorio J M Moraleda Marzo 2011

Extracción de sangre periférica

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Estudio de la sangre periférica l

Hemograma e índices hematimétricos

l

Frotis sanguíneo

l

Reticulocitos

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Hemograma. Contador automático

Hemograma automatizado

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Serie roja. Indices hematimétricos Número de glóbulos rojos: 5.5 ±1, 4.8 ± 1 x1012/l Hematócrito (Hct): 0.47 ±0.07, 0.42 ±0.05 - l/l (%) Hemoglobina (Hb): 15±2.5, 14 ±2.5 - g/dl Volumen Corpuscular medio (VCM) – Volumen medio de los GR: Hcto/GR: 80 -100 fl • Hemoglobina Corpuscular media (HCM) – Hb media en GR: Hb/GR: 28-32 pg/l • Concentración HB corpuscular media (CHCM) – Síntesis de Hb dentro del GR: Hb/Hcto: 30-36 - g/dl • Anchura distribución de GR (ADE) – Indice de variación del tamaño: 13 • • • •

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Anemia microcítica

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Serie blanca. Leucocitos l

Fórmula leucocitaria: Proporción de cada subtipo al contar 100 leucocitos en la sangre periférica

l

Nº absoluto: % celulas x total leucocitos (es más importante que la fórmula)

l

Rango de referencia – basados en poblacion normal de edad, sexo y etnia similar J M Moraleda Marzo 2011

Hemograma. Valores normales de leucocitos Leucocitos: 4500 - 11500 / mL = 4,5 - 11,5 x 109/ L

Leucocitos Neutrofilos Linfocitos Monocitos Eosinofilos Basofilos

%

Nº Absoluto mL

Rango mL

100 50 – 70 20 – 45 4 – 10 1–4 0–1

7500 4500 3000 500 300 80

4500 - 11500 2500 - 7500 1300 - 4000 150 - 800 50 - 600 10 - 150

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Frotis de sangre periférica

A. Hematíes; B. Linfocito grande granular; C. Leucocito Neutrófilo; D. Eosinófilo; E. Segmentado; F. Monocito; G. Plaquetas; H. Linfocito; I. Cayado; J. Basofilo J M Moraleda Marzo 2011

Frotis de sangre periférica normal

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Interpretación de frotis sp (GR) A. Normal B. Micro/hipo C. Macrocito D. Dianocito E. Esferocito F. Heinz G. Esquizocito H. Eritroblasto I. Policromat J. Dacriocito

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J J M Moraleda Marzo 2011

Anemia microcitica hipocrómica (deficiencia de Fe)

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Esferocitosis Hereditaria /AHAI

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Drepanocitosis

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Infección por Plasmodium (Malaria)

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Reticulocitos Tinción de azul cresilo

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Otras pruebas de sangre para el estudio de las anemias J M Moraleda Marzo 2011

Metabolismo del Hierro Sideremia y Capacidad total de fijación del Hierro Capacidad Total

= Transferrina No Saturada + Sideremia

Fijación de Hierro

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Hemosiderina en orina Tinción de Perls

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origen

A2

C

S

F

NORMAL HB S HB C Talasemia Maior Talasemia Minor NORMAL

ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINAS J M Moraleda Marzo 2011

A

+

Electroforesis de Hemoglobinas Gel de agarosa

Hb A Hb F Hb S Hb C

HbA

HbA

HbA

HbF

HbS

HbS

HbC

HbC

HbA

HbF HbS

HbA

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HbA

HbS

HbS

HbC

Test de Coombs directo Anemia Hemolítica Autoinmune

GR PACIENTE (cubiertos con Ig)

SUERO DE COOMBS (anti-Ig humana) J M Moraleda Marzo 2011

PRUEBA POSITIVA (aglutinación)

Estudio de la médula ósea

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Evaluación de la MO – Morfología convencional • Forma y estructura elemental de la célula – Citoquímica: • Basada en la identificación de componentes celulares en el citoplasma o el núcleo mediante reacciones químicas específicas. – Inmunofenotipo • Se basa en la identificación mediante anticuerpos monoclonales de moléculas en la membrana o el citoplasma celular – Citogenética • Estudio de los cromosomas – Estudios de biología molecular • Identificación de anomalías en los genes y/o las proteínas J M Moraleda Marzo 2011

Aspirado y biopsia de Médula ósea

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Aspirado de médula ósea Normal

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Aspirado de médula ósea infección por Leishmania

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Biopsia de médula ósea

La BMO permite estudiar arquitectura medular y el micromedioambiente J M Moraleda Marzo 2011

Hipocelular Anemia aplásica

Normal

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Hipercelular Neoplasias SMD SMP Deficit B12 Hemólisis Otros

Médula ósea citoquímica

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Aspirado MO. Tinción de Perls (para ver depositos de hierro – en azul-)

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Aspirado MO. Tinción esterasas Leucemia monocítica

Blastos + (en rojo)

Control negativo

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Médula ósea Inmunofenotípo

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Inmunofenotipo Citometría de flujo

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Inmunofenotipo. Citometría de flujo. Leucemia aguda

0

256

512

768

1024

FSC-H -> RABADAN SP.011

10 0

10 1

10 2

CD15-FITC -> RABADAN SP.005

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

10 4

0 10 JM

1

2

3

10 10 Moraleda Marzo10 2011

HLA.DR-FITC -> RABADAN SP.007

10 1

10 2

10 3

10 4

CD33-PE -> RABADAN SP.005

CD11b-FITC -> RABADAN SP.011

10 3

10 0

10 4

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

MPO-PE -> RABADAN SP_SUP+CITO.003

Médula ósea Citogenética y Biología molecular J M Moraleda Marzo 2011

Aspirado MO. Estudio citogenético Leucemia mieloide crónica t(9;22)

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Citogenética Citogenética molecular

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¿Qué impacto tiene la biotecnología….? Biomarcadores y estudios de Microarray

• La colección de genes alterados constituye una firma molecular • Mediante el uso de estas firmas es posible: – clasificar molecularmente los tumores – estratificar los pacientes en grupos:pronóstico, mayor o menor susceptibilidad a fármacos, etc. J M Moraleda Marzo 2011

Perfiles de expresión génica por microarrays

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Otras pruebas utilizadas en Hematología J M Moraleda Marzo 2011

Imágenes de Radiografía simple

Rx de tórax de un paciente con Linfoma de Hodgkin

Imágenes líticas en un Mieloma múltiple

Imágenes de TC

TAC craneal con imagen infiltrativa

TAC abdominall con imagen infiltrativa

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Imágenes de PET

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Técnicas de Aféresis celular

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Características de las Células Madre Hematopoyéticas 1. Auto-replicación 2. Diferenciación en las tres líneas hematopoyéticas 3. Capacidad de reconstituir la hematopoyesis e inmunidad a largo plazo J M Moraleda Marzo 2011

Antígenos de membrana de la célula Stem CD133

VLA

CD34

CD177

CXCR4

Célula Stem

Moléculas de superficie que pueden servirnos para identificar la célula stem y seleccionarla. – Ac monoclonales:

• Anti CD34 • Anti CD117 • Anti CD133

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Fuentes de células stem. Médula ósea

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Fuentes de Células Stem. Sangre periférica S t e m

FR

a

CS

Pr

as e t o

G-

4

kit

RC CX ti ec

SDF-1

na

kitL

on br

VC AM -1

IL-8

Fi

VLA -4

Flt3-L

Matriz extracelular J M Moraleda Marzo 2011

G-CSF

Fuentes de Células Stem. Cordón Umbilical

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Máquinas de aféresis

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• Células mononucleadas • Plaquetas • Granulocitos • Plasmaféresis

Nuevos Tratamientos

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Trasplante de Medula ósea PH: Medula ósea, SP, CU

INFUSION Donante Inmunosupresion

Paciente Quimioterapia

Radioterapia

Metotrexate Ciclosporina

APLASIA ACONDICIONAMIENTO INJERTO J M Moraleda Marzo 2011

Terapia dirigida o Terapia de “dianas” CD19

slg

CD20

DR

CD22

Linfocito B

Proteínas de superficie posibles dianas para IT: – Anticuerpos monoclonales (Ac) desnudos

– Ac conjugados • radioisótopos • drogas • toxinas

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Press O, et al. Cancer J Sci Am. 1998:4(suppl 2):s19–s26.

Rituximab: Ac monoclonal quimérico Ratón / Humano Región variable de ratón, se une específicamente al Ag CD20 en las células B

Región constante k de origen humano

Región Fc de la IgG1 de origen humano que trabaja en sinergia con mecanismos efectores

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Anticuerpos Monoclonales Radiomarcados Anticuerpos no marcados

Anticuerpos radioactivos

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Cromosoma 9

Cromosoma 9 Cromosoma Filadelfia

Cromosoma 22 Gen Bcr

Translocación

Gen fusión Bcr-Abl

Gen Abl

PROGENITOR HEMOPOYÉTICO TRANSFORMADO

Proteína de fusión Bcr-Abl

Transcripción del gen de fusión Bcr-Abl

RNAm Bcr-Abl

Región Tirosín quinasa

Proteína de fusión Bcr-Abl

Unión DNA

Adhesión celular anómala Supervivencia celular prolongada Proliferación celular descontrolada

Cromosoma Filadelfia Fisiopatología de la LMC

STI: Mecanismo de Acción Estructura química del STI571

Substrato Fosforilación

Proteína Bcr-Abl

STI571 Substrato No fosforilación

Unión al sitio de unión de ATP

Transformación maligna

Proteína Bcr-Abl

Molly Nash fue trasplantada con las células de la sangre del cordón umbilical de su hermano seleccionado tras diagnóstico preimplantacional No AF P = 3/4

Posible donante P = 1/16

HLA compatible P = 1/4

Preimplantation Diagnosis for Fanconi Anemia Combined with HLA Matching. Verlinsky et al. JAMA, 285:3130, 2001. J M Moraleda Marzo 2011 27

Futuro Þ Podríamos usar una simple firma molecular para asignar el riesgo y poner el tratamiento? Þ El uso de la Terapia celular. Medicina Regenerativa

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Plataformas de microarrays

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El futuro: Terapia celular. Medicina Regenerativa

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Terapia celular en el miocardio 1. Obtención Células Stem Hematopoyéticas

2. Selección de Poblaciones

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3. Implante intracardíaaco

Terapia celular en SNC Celulas Madre Hematopoyeticas Neuroesfera Celulas Madre Neurales

in vitro proliferacion

SVZ

VZ

migracion

in vivo Células Neurales: Neuronas Astroglía J M Moraleda Marzo 2011 Oligodendroglía

Diferenciación Madur-Func.

Programa de TPH y Terapia celular HUVA

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Programa TPH • Primer Alo-TPH el 2/5/07 • Desde entonces (a 31/12/10): Pacientes

Tipo de Trasplante

Niños

Adultos

Alogénico

32

31

63

Autólogo

16

96

112

TOTAL

48

127

175

TOTAL

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Terapia celular • Ensayo ELA finalizado • Ensayos isquemia crítica (D/noD) • Ensayo membrana amniótica y heridas • Terapia celular en Traumatología • Terapia celular en Odontología Becas y Proyectos. Curso U.Mar en Mazarrón Pacientes Tipo de Ensayo

Realizados

Pendientes

ELA

11

0

11

Isquemia crítica EEII

2

18

20

Heridas y membrana amniotica

2

8

10

TOTAL

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GRACIAS POR SU ATENCIÓN MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN

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