LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA PARA ENFERMEDADES DE LOS PECES LCV-ALGETE N. FRIAS SORIANO P. FERNANDEZ SOMALO

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ORGANIGRAMA MMAMRM

Secretaría de Estado de Medio Rural y Agua

Secretaría de Estado de Cambio Climático

Se.G. DE MEDIO RURAL

Se.G. DEL MAR

D.G. RECURSOS AGRÍCOLAS Y GANADEROS

JACUMAR.

S.G. SANIDAD DE LA PRODUCCION PRIMARIA

LCV

LNR Enfermedades Peces

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Coordinadora General de Laboratorios Laboratorio Central de Veterinaria de Algete Servicio de Garantía de Calidad

Servicio de Apoyo

Lab.. Central de Sani dad Animal de Santa Fe

Directora Técnica de Sanidad Animal

Director Técnico de Genética Molecular Director Adjunto de Sanidad Animal

Servicio de I+D

Servicio de Biobancos

Director Adjunto de Genética Molecular

Dpto. de Patología de Mamíferos y Control de Biológicos

Dpto. de Gestión de Recursos Zoogenéticos

Dpto. de Patología de Aves y otras Especies

Dpto. de Identificación Genética

Dpto. Ictiopatología

Dpto. de Control de O.G.M.

Dpto. de Enfermedades Emergentes

Dpto. Genotipado

Dpto. de Bacteriología

Dpto. P.C.R.

Dpto. Salmonelosis

Dpto. Animalario Dpto. Encefalopatías Espongiformes Transmisibles

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COODINADORA

DIRECTORA SANIDAD ANIMAL

DIRECTOR GENÉTICA MOLECULAR

ICTIOPATOLOGIA

VIROLOGIA

PARASITOLOGIA

BACTERIOLOGIA

PECES

ANATOMÏA PATOLÓGICA

PCR

INVESTIGACIÓN+ DESORROLLO

ANIMALARIO

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Edificio Central

Laboratorio de EET’s Laboratorio de Genotipado

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REFERENCIAS LCV

LNR EN LCV Referencias a nivel nacional Laboratorio Nacional de Referencia de Peste Equina Africana (R.D. 29/12/89) Laboratorio Nacional de Referencia de Leucosis Enzoótica Bovina(O.M.28/2/86) Laboratorio Nacional de Referencia de Enfermedades de Peces (R.D. 22/9/94) Laboratorio Nacional de Referencia de Aujeszky (R.D. 28/4/95) Laboratorio Nacional de Referencia de Influenza Aviar (R.D. 28/4/95) Laboratorio Nacional de Referencia de Newcastle (R.D. 28/4/95) Laboratorio Nacional de Referencia de Salmonelosis en animales (R.D. 28/4/95) Laboratorio Nacional de Referencia de EET´s ( UE 2005) Laboratorio Nacional de Referencia para el análisis del gen resistente a las ETTs Laboratorio Nacional de Referencia de Filiaciones en Equidos (R.D. 25/5/07) Laboratorio Nacional de Referencia de Fiebre Aftosa (R.D. 17/11/04) Laboratorio Nacional de Referencia para distintas zoonosis (R.D. 01/10/04)

Referencias a nivel internacional Laboratorio de Referencia de Peste Equina Africana para la UE (DOCCEE 10/6/92) Laboratorio de Referencia de Peste Equina Africana para la OIE (10/3/93) 6

Red de Laboratorios de animales acuáticos ¾

Laboratorios Nacionales de Referencia z Enfermedades de los peces y crustáceos: Laboratorio Central de Sanidad Animal del MMARM Algete (Madrid). z

Enfermedades de los moluscos bivalvos: Instituto de Investigaciones Marinas del CSIC, Vigo (Pontevedra).

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Red de Laboratorios de animales acuáticos ¾

LABORATORIO DESIGNADO Asturias SERIDA (Gijón)

¾

LABORATORIO DESIGNADO Cantabria (Santander)

¾

LABORATORIO DESIGNADO Galicia (Lugo)

¾

LABORATORIO DESIGNADO Aragón FV (Zaragoza)

¾

LABORATORIO DESIGNADO Castilla León (Soria)

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R.D. 1614/2008 Anexo IV: Lista de Enfermedades de peces ¾

EXÓTICAS z

z

¾

Necrosis Hematopoyética Epizootica (NHE o EHN) Síndrome Ulceroso Epizoótico (SUE o EUS)

NO EXÓTICAS z z z z

Septicemia Hemorrágica Viral (SHV o VHS) Necrosis Hematopoyética Infecciosa (NHI o IHN) Enfermedad del Herpes virus Koi (KHV o EHVK) Anemia Infecciosa del Salmón (AIS o ISA) 9

Funciones de los Laboratorios Nacionales de Referencia (I) ¾

Comprometerse a informar al organismo competente, cuando sospechen la aparición de cualquiera de las enfermedades que figuran en el anexo IV del R.D.

¾

Garantizar la confirmación de los resultados positivos de todos los focos de enfermedades exóticas, así como de los focos primarios de enfermedades no exóticas enumerados en el anexo IV 10

Funciones de los Laboratorios Nacionales de Referencia(II) ¾

Facilitar el adiestramiento o la puesta al día de expertos en diagnóstico de laboratorio.

¾

Coordinar los métodos empleados en España para diagnosticar las enfermedades de las que son responsables.

¾

Organizar periódicamente pruebas comparativas nacionales (pruebas de anillo) de los procedimientos de diagnóstico con los laboratorios oficiales de las CCAA. 11

Funciones de los Laboratorios Nacionales de Referencia(III) ¾

El MMAMRM podrá autorizar que un laboratorio nacional de referencia situado en España aproveche las competencias y la capacidad de otros laboratorios respecto a una o varias de las enfermedades de que se encargan, siempre que dichos laboratorios cumplan los requisitos pertinentes establecidos.

¾

No obstante, el laboratorio nacional de referencia seguirá siendo el punto de contacto para el citado Ministerio y para el laboratorio comunitario de referencia. 12

Funciones de los Laboratorios Nacionales de Referencia (IV) ¾

Cooperar con el laboratorio comunitario de referencia y participar en las pruebas comparativas organizadas por ellos

¾

Funcionar y ser evaluados y acreditados con arreglo a la norma EN ISO/IEC 17025:2005 “Requisitos generales relativos a la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración”, o aquella que la sustituya o desarrolle.

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ACTIVIDADES DE DIAGNOSTICO El diagnóstico esta dirigido, fundamentalmente, a detectar enfermedades incluidos en el Anexo IV del RD 1614/2008

Diagnóstico bacteriológico Diagnóstico parasitológico. Diagnóstico virológico. 14

ENFERMEDADES BACTERIANAS DE LOS PECES Principales enfermedades bacterianas que se diagnostican en el laboratorio: YERSINIOSIS BKD ó enfermedad bacteriana renal FURUNCULOSIS VIBRIOSIS ESTREPTOCOCOSIS FLAVOBACTERIOSIS PASTEURELOSIS EDWARDSIELLOSIS SEPTICEMIA por AEROMONAS móviles LCV-ALGETE 15

METODOS DE DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICOS •Examen microscópico directo sobre cortes, improntas o extensiones de las muestras utilizando diferentes tipos de tinciones •Siembras en medios generales y selectivos (TSA, BHI, Cytophaga, TCBS.….) •Incubación a temperaturas entre 15 - 22ºC •Identificación: morfológica y mediante pruebas bioquímicas, serológicas e inmunoenzimáticas •Confirmación por pruebas moleculares: PCR y secuenciación parcial del 16s RNA 16

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18

LNR ¾ BACTERIOLOGÍA ¾ ICTIOPATOLOGÍA z z

VIROLOGÍA PARASITOLOGÍA

¾ ANATOMÍA PATOLÓGICA ¾ PCR ¾ NUEVOS DESARROLLOS ¾ ANIMALARIO 19

PARASITOLOGÍA ¾ Análisis de las muestras remitidas. z

Recogidas por servicios oficiales de CCAA que no disponen de laboratorios de peces.

¾ Análisis para emisión de certificados de

exportación: z

Ausencia de determinados parásitos en pescado congelado utilizado como cebo.

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MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICOS ¾ Examen macroscópico ¾ Examen microscópico de muestras en fresco z z z z z

Raspados intestinales Flotación (recuento de huevos en heces) Músculo, hígado, gónadas Aletas, branquias. Arcos branquiales (digestión ácida/básica)

¾ Examen hematológico ¾ Examen histopatológico 21

Parásitos Ooquiste Eimeria

Ooquiste de Goussia

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ACTIVIDADES VIROLOGÍA (I) ¾

Diagnóstico de muestras de los programas de vigilancia remitidos por algunas CCAA. ¾ Confirmación de los resultados positivos de todos los focos de enfermedades de las que son responsables. ¾ Mantenimiento de un cepario de casos confirmados. ¾ Suministrar a los laboratorios designados reactivos para el diagnóstico. z z z

¾

Células Cepas de referencia Antisueros

Cooperación con el Laboratorio Comunitario de Referencia para la elaboración de encuestas epidemiológicas de las enfermedades listadas en colaboración con las CCAA.

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ACTIVIDADES VIROLOGÍA (II) ¾ ¾

Facilitar el adiestramiento o la puesta al día de expertos en diagnósticos de laboratorio. Participación en Ring Test para las enfermedades listadas: z z z z

¾

NHI, SHV, NPI y VPC LCR (Aarhus DK) KHV OIE (CEFAS) Weymouth UK ISA Por determinar EHN LCR (Aarhus DK) en 2009

Organización de Ring Test con los laboratorios designados por las CCAA. 24

DIAGNOSTICO VIROLOGICO ¾ Enfermedades

incluidas en el ”Anexo IV” del RD 1614/2008 ¾ Necrosis Pancreática Infecciosa ¾ Viremia Primaveral de la Carpa y otros rhabdovirus relacionados. ¾ Enfermedad del Sueño ¾ Nodavirus VER

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Anexo IV: Lista de Enfermedades de peces ¾

EXÓTICAS z z

¾

Necrosis Hematopoyética Epizootica (NHE o EHN) Síndrome Ulceroso Epizoótico (SUE o EUS)

NO EXÓTICAS z z z z

Septicemia Hemorrágica Viral (SHV o VHS) Necrosis Hematopoyética Infecciosa (NHI o IHN) Enfermedad del Herpesvirus Koi (KHV o EHVK) Anemia Infecciosa del Salmón (AIS o ISA) 26

METODOS DE DIAGNOSTICO VIROLOGICO ¾ NHI

y SHV, en el Real Decreto 138/1997 (2001/183/CE). ¾ Aislamiento vírico en cultivos celulares. ¾ Identificación del virus: z z z

Seroneutralización Inmunofluorescencia Técnicas Inmunoenzimáticas (ELISA)

¾ Técnicas

de PCR 27

AISLAMIENTO VIRICO EN CULTIVOS CELULARES I Las líneas celulares más habituales en los programas de vigilancia de SHV y NHI, son: ¾ EPC (Epithelioma papulosum cyprini) Son células epiteliales de piel de carpa. ¾ FHM (celulas epiteliales), junto con EPC se emplean para las encuestas de vigilancia. ¾ RTG-2 (tejido gonadal de trucha arcoiris) Son células de gónadas y tienen una forma fibroblástica. ¾ BF-2 (fibroblastos de alevín de bluegill).

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AISLAMIENTO VIRICO EN CULTIVOS CELULARES II ¾

SSN-1(Fhis striped snakehead fry), se emplea para el aislamiento del virus de la encefalopatía y retinopatía de la lubina (VER o VNN).

¾

SHK-1( Atlantic salmon head kidney) se emplea en el aislamiento de la Anemia infecciosa del salmón (ISA)

¾

KF ( Koi fin) En el aislamiento de Herpes Virus Koi (KHV) 29

CULTIVOS CELULARES

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SERONEUTRALIZACION ¾

Consiste en Neutralizar el virus con su antisuero específico impidiendo por tanto el ECP. No SN

Si SN 31

SDV CPE BF-2 CELLS

SDV CPE in BF2-cells

BF2-cells

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INMUNOFLUORESCENCIA ¾ ¾ ¾

Sobre cultivos infectados y fijados. Adición de anticuerpos Pab o Mab Tinción con antisuero conjugado con fluorocromo. 2º Ab

1 º Ab Virus

Célula 33

ELISA DETECCIÓN Ag ¾

Kits Comerciales: z z z z

SHV NHI NPI SVC

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PCR ¾ ¾

Apoyo a los distintos departamentos. Confirmación de aislados. z z z z z z

¾

Para todas las enfermedades listadas VER SDV IPN SVC BKD

Secuenciación parcial del 16s RNA

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GELES DE ELECTROFORESIS PARA PRODUCTOS DE AMPLIFICACION EN PCRs DE NHI Y SHV Necrosis Hematopoyética

Septicemia Hemorrágica

Marcador

Marcador

de DNA

Marcador 1ª PCR

de DNA

2ª PCR

de DNA

1ª PCR

697pb

682pb 548pb

LCV-ALGETE 36

INVESTIGACION + DESARROLLO ¾ Implementación de nuevas técnicas z

PCR Multiplex para NHI, SHV y NPI

¾ Puesta a punto de PCR tiempo real ¾ Genotipar: z z z z

SHV: I, II, III, IV NHI: G, M IPN: VPC: I, II, III, IV

¾ Secuenciación

Caracterización 37

¾ PCR Multiplex para VHS, IHN e IPN

VHSV IHNV IPNV

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ANIMALARIO ¾ Obtención de anticuerpos policlonales,

mediante inyección de virus purificados en conejos.

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GRACIAS POR SU ATENCIÓN