Los antibióticos y su guerra contra enterobacterias de los alimentos. RESUMEN Esta investigación se divide en dos partes; la primera consistió en el aislamiento de coliformes fecales encontradas en los alimentos, y la segunda tuvo como objetivo probar la resistencia de los coliformes a algunos antibióticos para gram negativos. Para llevar a cabo la primera etapa se realizaron tres muestreos de cuatro alimentos en los que se elaboraron pruebas de aislamiento, primero de coliformes totales, después de coliformes fecales y posteriormente, de éstos se obtuvieron 10 cepas de la bacteria E. coli y 4 cepas de Klebsiella. En la segunda etapa, de las cepas E. coli y Klebsiella obtenidas, se realizaron pruebas de resistencia a antibióticos con un multidisco de 12 gram negativos. El 100% de las cepas presentaron resistencia a la ampicilina y a la cefalotina y en menor cantidad a otros antibióticos. A las cepas resistentes se les aplicó la prueba de resistencia con diferentes concentraciones (50, 10, 150, 250 y 500 µg) de ampicilina, obteniendo nuevamente resistencia total por parte de E. coli; sin embargo sólo una cepa de Klibsiella presentó resistencia a dos concentraciones (250 y 500 µg). Esta resistencia se debe a distintos factores como son: 1) el uso indiscriminado de antibióticos, 2) las aguas contaminadas por los desechos de animales engordados con antibióticos, dichas aguas son utilizadas para regar las hortalizas de las cuales provienen los alimentos vendidos a las afueras de Colegio de Ciencias y Humanidades Plantel Naucalpan.

1

4. INTRODUCCIÓN 4.1. Marco teórico. 4.1.1. Bacterias Gram Negativas Los tipos bacterianos se dividen en Gram positivas (cocos) y Gram negativas (bacilos). Las bacterias Gram negativas son aquellas que no se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram, pero sí lo hacen de un color rosado tenue, por lo que, se denominan Gram negativas. Esto es debido a que, en medio de la membrana se localiza un espacio llamado periplásmico, relleno de una sustancia denominada periplasma, la cual contiene enzimas importantes para la nutrición, que es donde esretenida la safranina, que le da el característico

color

rosado,(http://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria_Gram_negativa, 2014). 4.1.2. Coliformes Totales La denominación genérica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas características bioquímicas en común. Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir, homeotermos, pero también están ampliamente distribuidas en la naturaleza, existiendo muchos coliformes de vida libre, especialmente en suelos, semillas y vegetales (Merino y Lössch,2014; http://es.wikipedia.org/wiki/Coliforme, 2013). Como mencionamos anteriormente, debido a que una gran cantidad de coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal; producto de la contaminación por heces fecales de humanos y de animales, por tanto son indicadoras del grado de contaminación del agua y los alimentos. (Merino y Lössch,2014; http://es.wikipedia.org/wiki/Coliforme, 2013).

2

Tabla 1.Clasificación científica de las Coliformes Reino:

Bacteria

Phyllum: Proteobacteria Clase:

Gamma Proteobacteria

Orden:

Enterobacteriales

Familia:

Enterobacteriaceae

El grupo coliforme está formado por los siguientes géneros más representativos: 

es.wikipedia.org/wiki/Coliforme

Escherichia

(2013);



Klebsiella



Enterobacter



Citrobacter

Galí,

2010;Merino

y

Lössch, 2014.

Nota: No todos los autores incluyen al género Citrobacter dentro del grupo coliforme.

4.1.3. Enterobacterias Las enterobacterias forman parte de la familia Enterobacteriaceae, bacterias Gram negativas que contiene más de 30 géneros (tabla 1) y más de 100 especies. Los miembros de esta familia presentan forma baciliar, recta o curva, con una anchura

que

anchocolonizan mucosas,

no

excede

los

habitualmente

especialmente

las

µm de

0,5 las

diferentes del

tracto

gastrointestinal y urinario, formando parte de la microbiota, tanto de animales como del ser humano, por lo que también se 3

conocen como coliformes fecales, (Stanier, R. y col., 1992; Galí, 2010; http://es.wikipedia.org/wiki/Enterobacteriaceae, 2013). 4.1.4. Coliformes fecales Los coliformes fecales son un grupo de bacilos con una estructura parecida a la de una bacteria común que se llama Escherichia coli, de ahí su nombre: en forma de coli. Este grupo incluyen bacterias en forma de bacilo cortos, gram negativos, aeróbicos o anaeróbicos facultativos (viven en presencia del oxígeno), son oxidasa negativo y tienen la capacidad de fermentar lactosa con producción de gas y ácido láctico en 48 horas a una temperatura de 35°C+2°C,y dependiendo de la presencia de flagelos pueden ser móviles, además cuentan con la capacidad de producir toxinas. (Galí, 2010;Merino y Lössch,2014). La presencia de coliformes fecales es un indicador de contaminación bacteriana del agua y los alimentos, ya que se encuentran en gran número en el tracto intestinal de humanos y animales, y permanecen por más tiempo en el agua y los alimentos que las bacterias patógenas (bacterias que causan enfermedad) como Salmonella y Shigella, por lo que su presencia indica que posiblemente

también

se

encuentren

organismos

patógenos.

Aproximadamente el 95% del grupo de los coliformes presentes en heces fecales, están formados por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella (Cabrera y colaboradores, 2007). 4.1.5.Klebsiella Klebsiella es una bacteria gram-negativa en forma de varilla y no móviles de la familia Enterobacteriaceae.Esta se encuentra en la flora natural de los seres humanos y animales,pero cuando están fuera de su área del intestino pueden causar infecciones importantes en los seres humanos. Entre todas las especies de Klebsiella, K. pneumoniae es una especie ampliamente estudiada. Esta se puede encapsular, es decir, forma una capa de polisacárido en la pared celular de la bacteria, además de que puede sintetizar ATP (trifosfato de adenosina) por respiración aeróbica, pero también puede obtenerlo a partir de la fermentación anaeróbica. Por lo tanto, es un anaerobio 4

facultativo, puede ser tanto aeróbica como anaeróbica, dependiendo de la situación.

(http://microbiologia2a.blogspot.mx/2013/04/klebsiella-

pneumoniae.htmlMICROBIOOLOGIA Y PARACITOLOGIA, 2014). 4.1.6.Escherichia coli La Escherichia coli o también llamada E. coli, es el principal organismoque se encuentra en el intestino del ser humano y de los animales, por lo que, solo E. coli tienen un origen específicamente fecal, pues están siempre presentes en grandes cantidades en las heces de los seres vivos de sangre caliente y rara vez se encuentran en agua o suelo que no haya sufrido algún tipo de contaminación

fecal

(Goez,

Vázquez

y

Peña,

1999;http://es.wikipedia.org/?title=Escherichia_coli, 2014) La E. coli se transmite a los seres humanos por medio del

consumo de

productos de carne picada cruda o poco cocida y alimentos contaminados con heces fecales. En condiciones normales no causan ningún tipo de daño, además de ser necesaria para el funcionamiento correcto del proceso digestivo, debido a que, por ejemplo, aportan vitaminas del complejo B para el ser humano. Sin embargo, algunas cepas por intercambio de material genético, han adquirido la capacidad de causar infecciones y provocar diarreas (Goez, Vázquez y Peña, 1999;Armora. y Gómes,2012). 4.1.7. Resistencia a los antibióticos en coliformes fecales El concepto de resistencia, indica que un medicamento disminuye su actividad o efectividad en un individuo tras su uso prolongado. Cada vez que se utiliza un antibiótico aumenta la probabilidad de que cualquier individuo que no haya tomado este antibiótico, en el futuro pueda entrar en contacto con alguna bacteria que presente resistencia El proceso de selección natural que se presenta en bacterias, y especialmente en Enterobacterias, es debido a que, estas al contener varios genes de resistencia llamados plásmidos, provocan que al usar cualquier tipo de antibiótico, estos no puedan eliminar a los organismos(Tríptico-Veterinario, 2007).

5

El problema de la contaminación del agua y de los alimentos por parte de las coliformes fecales, es su capacidad para desarrollar rápidamente resistencia a los antibióticos. Se entiende por resistencia, el mecanismo mediante el cual la bacteria puede disminuir la acción de los agentes antimicrobianos. Dicha resistencia puede estar mediada por plásmidos o ser de origen cromosómico (Fernández y colaboradores, 2003).

Figura 1. El material genético bacteriano se encuentra en una región nucleoide, o bien en segmentos cortos, que mutan con facilidad y altamente replicativos llamados plásmidos. Hay segmentos de resistencia a los antibióticos que se conocen como R

Ciertas cepas de bacterias de una misma especie son resistentes a algunas familias de antibióticos, esta resistencia les permite tener ventajas competitivas con respecto a otras cepas,pudiendo sobrevivir en caso que se emplee un antibiótico. La aparición de la resistencia en una bacteria como E. coli se produce a través de mutaciones (cambios en la secuencia de bases de cromosoma) y por la trasmisión de material genético extracromosómico procedente de otras bacterias (Galí, 2010).

6

En el primer caso, la resistencia se trasmite de forma vertical de generación en generación (reproducción asexual, bipartición). En el segundo, la trasferencia de genes se realiza horizontalmente a través de plásmidos (reproducción parasexual. Ver figura No. 2). Los plásmidos son unidades de ADN extracromosómico

que

se

autorreplican y que transportan su propia estructura de replicación,los plásmidos

R

fundamental

tienen en

la

un

papel

resistencia

antibiótica de las enterobacterias (Galí, 2010).esto último no solo permite

la

trasmisión

a

otras

generaciones, sino también a otras especies bacterianas. De esta forma una bacteria puede adquirir la resistencia a uno o varios antibióticos sin necesidad de haber estado en contacto con estos (Fernández y colaboradores, 2003;Galí, 2010).

4.2. Objetivo de la investigación 4.2.1. General Probar el grado de resistencia de E. coli y Klebsiellaaisladas en los alimentos,a12 antibióticos para Gram negativo. 4.2.2. Particulares  Determinar la presencia de Coliformes fecales en muestra de alimentos que se expenden en la vía pública: sándwich, torta, cocktel y ensalada  Aislar E. coli y Klebsiella en cuatro muestras de alimentos: sándwich, torta, cocktel y ensalada.  Realizar prueba de resistencia y sensibilidad a las cepas de E. coli y Klebsiella a 12 antibióticos, con base al diámetro del halo de inhibición. 7

 Aplicar cinco distintas concentraciones de ampicilina a las cepas de E. coli y Klebsiella que presentaron resistencia a los antibióticos.

4.3. Problema En la actualidad algunos antibióticos son utilizados de manera indiscriminada por dos causas principales: la automedicación para combatir una infección de tipo gastrointestinal, y el suministro de estos medicamentos para la engorda de animales en las granjas. Los antibióticos no son retenidos por mucho tiempo en el cuerpo de personas y animales, sino que son desechados en las heces fecales, y estas a su vez, vertidas a las aguas residuales las cuales sirven para riego en los cultivos de frutas y hortalizas. Debemos tomar en cuenta que la mitad del contenido de los excrementos contiene coliformes fecales, bacterias del colón que al estar en contacto con los antibióticos presentes en el ambiente, desarrollarán resistencia a estos. La problemática radica en que las frutas y hortalizas regadas con estas aguas residuales y que contengan coliformes resistentes lleguen a los mercados locales, en nuestro caso, frutas y hortalizas compradas en el mercado o en el supermercado, con las cuales se preparan los alimentos que se venden en los puestos a las afueras de CCH-Naucalpan, y que estos contengan coliformes resistentes. Que si se ingieren en ciertas cantidades por los alumnos pueden provocar una infección, que al ser tratada con antibióticos, prdría ser ineficaz o muy lento, debido a la resistencia que presentan frente a ciertos antibióticos, por lo que, cantidad que antes se utilizaba de este medicamento, no surtiría ningún efecto contra estas bacterias resistentes, y se requerirán de mayores concentraciones para eliminarlas y el tiempo para matarlas sería mayor. Por lo que es de nuestro interés aislar coliformes fecales antibióticos en alimentos que se consumen a las afueras de Colegio de Ciencias y Humanidades Plantel Naucalpan y determinar su resistencia frente a ciertos antibióticos.

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5. DESARROLLO El material que se utilizó para el proyecto de investigación fue el siguiente: Cristalería.

Equipo

-Agitadores

-Autoclave

-Cajas Petri

-Basculas

-Campanas Durham

-Incubadora

-Matraces

-Parrilla

-Morteros

-Estufa

-Pipeta -Probeta -Tubos de ensaye

Material -Asas bacteriológicas -Bolsas -Cubre bocas -Cuchillo -Espátulas -Encendedor

Medios de cultivo. -Agua Peptonada -Caldo Lauril -Caldo Bilis Verde Brillante -Agar EMB -Agar Mac Conkey -Agar Muller Hilton -Agar Nutritivo

-Hisopos -Guantes -Gradillas -Mecheros -Pinzas -Tapones

La preparación y las diluciones de muestras de alimento para su análisis microbiológico se realizaron de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana. NOM110-SSA1-1994. Diario Oficial de la Federación DV 11,16 de Octubre de 1995. la cual consistió:

5.1. Obtención de los diferentes tipos de alimentos. La obtención de las muestras de alimentos consistió en cuatro productos los cuales fueron: torta, sándwich, cóctel y ensalada. Estos productos se compraron en los diversos puestos callejeros a las afueras del CCH Naucalpan. Los alimentos se guardaron en bolsas de plástico para evitar la contaminación y para su traslado al SILADIN. 9

5.2. Macerado de los alimentos y obtención de las diluciones. Ya en el laboratorio, se tomó una muestra de 10 g de cada alimento, tratando de obtener la mayor cantidad de ingredientes contenidos en los mismos. La muestra fue colocada en un mortero y posteriormente macerada a modo de que quedara lo más fragmentada posible. El macerado se colocó en un matraz con 90 ml de agua peptonada, obteniendo la primera dilución 1x10-1. De esta primera dilución se tomó 1 ml y se depositó en un tubo de ensaye que contenía 10 ml de agua peptonada para obtener la segunda dilución 10

1x10-2, de la cual se tomó 1 ml y se agregó a otro tubo de ensaye que contenía 10 ml de agua peptonada, quedando así la tercera y última dilución 1x10-3. Obtenidas las tres diluciones; 1x10-1, 1x10-2y 1x10-3,Estas fueron introducidas a la incubadora por 48 horas a 37°C.

5.3. Prueba presuntiva: Coliformes totales. Tanto para la prueba presuntiva como para la prueba confirmatoria la investigación tomo como base la Norma Oficial Mexicana. NOM-112-SSA11994. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable (NMP). Diario Oficial de la Federación DV 14,19 de Octubre de 1995. La cual consistió en lo siguiente: Después del tiempo transcurrido, de cada dilución se tomó 1 ml de muestra y se colocó en 10 ml de caldo Lauril que contenían una campanilla Durham, la cual sirvió para atrapar los gases que se forman a partir de la actividad microbiana, siendo el principal gas H2S. Por cada dilución se realizaron dos repeticiones, obteniendo un total de 24 tubos, que se colocaron a incubar por 24 horas a 37°C. Los tubos de caldo Lauril que presentaron formación de gas (H2S), dentro de la campanilla, nos indicaron que la muestra era positiva, y por lo tanto presentaba coliformes totales.

5.4. Prueba confirmatoria: Coliformes fecales. De los tubos que dieron positivo, se tomarontres asadas y se depositaron en un tubo ensaye que contenía caldo Bilis Verde Brillante y una campanilla de Durham. Los tubos de ensaye fueron colocados en la incubadora por 24 horas a 37°C. Aquellos tubos en los que se observaron cambios de color, turbiedad y formación de gas H2S nos indicaron la presencia de coliformes fecales.

11

5.5. Aislamiento de enterobacterias: Klibsiellay E. coli. Posteriormente,de las muestras positivas de coliformes fecales, se tomaron dos asadas y se sembraron por el método de estriado, para el aislamiento de colonias en los agares EMB y Mac Conkey a 37°C por 24 horas. (Bioxon, 1996) Transcurrido el tiempo, y teniendo el desarrollo colonial,

se procedió a su

identificación por medio de las características morfológicas y de color que presentaron las colonias aisladas (Ver tabla1 y 2).

Tabla 1. Características coloniales presentadas por Escherichia coliy Klebsiella en medio EMB (Eosin Metil Blue). MICROORGANISMOS Escherichiacolí

CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS Elevadas o ligeramente convexas. De 2 a 3 mm de diámetro. Presentando a la luz transmitida un centro azulnegro, a la luz reflejada con brillo verde metálico. Algunas cepas no muestran brillo metálico. Poca tendencia de desarrollo confluente.

Klebsiellasp

Colonias grandes de 4 a 6 mm de diámetro, elevadas y mucoides con tendencia a unirse. Usualmente no presentan brillo metálico. A la luz transmitida muestran un centro grisáceo café y bordes claros.

Tabla 2. Características coloniales presentadas por Escherichia coli y Klebsiella en medio Mac Conkey. MICROORGANISMO Escherichia coli

CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS De rojas a rosadas. No son mucoides. Pueden rodearse de un precipitado opaco de sales biliares.

Klebsiellasp

Grandes, rosadas, mucoides.

12

Una vez que se identificaron las colonias de E. coli y Klebsiella sp, se preservaron en Agar Nutritivo para su posterior prueba de resistencia a 12 antibióticos para bacterias Gram-negativas

5.6. Pruebas de resistencia a 12 antibioticos para Gramnegativas A las cepas de E. coli y Klibsiella sp que se preservaron en agar nutritivo se les aplico un antibiograma (multidiscos) para determinar su resistencia o sensibilidad a 12 antibióticos para bacterias Gram-negativas (ver tabla No 3).

Tabla 3. Concentración mínima inhibitoria en microgramos (µg), de 12 antibióticos que se aplicó a las cepas aisladas de E. coli y Klebsiella sp.

Antibiótico

Concentración

Antibiótico

µg

Concentración

µg

Amikacina (AK)

30

Gentamicina (GE)

10

Ampicilina (AM)

10

Netilmicina (NET)

30

Carbenicilina (CB)

100

Nitrofurantoína (NF)

300

Cefalotina (CF)

30

Pefloxacina (PEF)

5

Cefotaxima (CTX)

30

Trimetoprim- (SXT)

25

Sulfametoxazol Ceftriaxona (CROM)

30

Cloranfenicol (CL)

30

13

6. RESULTADOS Los resultados obtenidos fueron los siguientes.

6.3. Prueba presuntiva: Coliformes totales. Al

pasar

48

horas

a

una

temperatura 37° C se observó un crecimiento

bacteriano

que

nos

indica la presencia de coliformes totales, el cual se pudo constatar por el enturbiamiento de las tres diluciones

y

formación

de

una

burbuja de gas (H2S) producida por la fermentación bacteriana en caldo lauril. De las muestras positivas se determinó a continuación las coliformes fecales.

6.4. Prueba confirmatoria: Coliformes fecales. A las coliformes totales se les aplicó pruebas con caldo Verde Bilis Brillante para la confirmación de la presencia de coliformes fecales a una temperatura de 37° por 48 horas. Después de este tiempo, aquellos tubos que presentaron formación de gas en las campanas Durham, nos confirmaron la presencia de coliformes fecales en los alimentos. Los resultados obtenidos de las pruebas de coliformes totales y los coliformes fecales, se vaciaron en una tabla para su fácil comprensión (ver tabla 4).

14

Tabla 4. de resultados que muestra los tubos positivos y negativos de coliformes totales y coliformes fecales. Tubos positivos.

Tubos negativos.

Caldo Lauril

26

3

Caldo Bilis Verde

23

2

Brillante

De acuerdo con los resultados que se muestran en la tabla de los tres muestreos, se puede observar que en Caldo Lauril 26 tubos fueron positivos para coliformes totales, y 3 tubos fueron negativos para estas bacterias(Ver tabla 4). Con respecto al Caldo Bilis Verde Brillante, tenemos 23 tubos dieron positivos a coliformes fecales, mientras que 2 tubos no presentaron coliformes fecales (Ver tabla 4).

6.5. Aislamiento de enterobacterias: Klibsiella y E. coli. A las pruebas positivas de coliformes fecales se les colocó en Agar EMB y Mac Conkey, con el fin de aislar a E. coli y a Klebsiella sp, las bacterias más representativas de las heces fecales. De las 23 muestras que se colocaron en dichos Agares, 10 dieron para E.coli y solamente 4 para Klebsiella sp, en Agar EMB y Mac Conkey, como lo podemos ver en las imágenes siguientes.

Imágenes obtenidas de los medios de cultivo, donde se pueden observar las colonias de E.coli y Klibsiella sp, en Agar EMB y Mac Conkey

15

Aislamiento por estriado de colonias de Colonias de E.coli aisladas en Agar EMB,

E. coli en Agar EMB

con su característico brillo verde brillante

Colonias de Klibsiella sp aisladas en Agar EMB con en donde se puede observar el color vino de las colonias.

Aislamiento por estriado de colonias de Klebsiella en Agar Mac Conkey en donde se observa su color rosado en este medio

6.6. Pruebas de resistencia a 12 antibioticos para Gramnegativas A continuación a los aislamientos de E.coli y Klebsiella sp, se les aplicó pruebas de resistencia a 12 antibióticos, siendo los resultados presentados en la tabla número 5.

16

Tabla 5.Rresultados que muestran los promedios de las medidas en centímetros (cm) de los halos de inhibición a 12 antibióticos para Gram-negativas AK

AM

CB

CF CTX CRO CL

GE

NET NF

PEF SXT

1.91 R

0.58 R

2.17

2.51

2.37 1.66 2.01

2.22 2.18 1.80

Klebsiellasp 2.24 R

1.44 R

2.16

2.42

2.10 2.08 2.14

2.12 2.56 3.14

E. coli

En el caso de E.coli, esta presentó halos de sensibilidad mínimos de 0,58cm de diámetro, siendo el halo de inhibición mediano de 1,55 cm de diámetro, mientras la sensibilidad más alta presentó un halo de inhibición de 2.51cm de diámetro de sensibilidad, siendo en su totalidad las cepas resistentes a la ampicilina y cefalotina ver imágenes.

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En el caso de Klibsiella sp, el halo de inhibición mínima fue de 1,44 cm de diámetro, seguido de un diámetro de 2,29cm para un halo de tamaño mediano. Por último, el halo en el que se obtuvo mayor sensibilidad fue de 3.14cm de diámetro. Encontrando con esto, que E. coli presentó menores diámetros de halos de inhibición en comparación con Klibsiella sp. Con los resultados obtenidos de la resistencia que presentaron, tanto E. coli y Klibsiella sp, a la ampicilina, se procedió a preparar concentraciones de ésta, para determinar hasta qué punto son resistentes a dicho antibiótico. Tomando en consideración que la concentración mínima inhibitoria es de 10µg (microgramos) y la máxima concentración que se suministra a las personas es de 500 miligramos. A continuación se detallan las concentraciones que se prepararon: 10µg, 50 µg, 100µg, 250µg, 500µg Es importante resaltar que la ampicilina venía en tabletas de 500 miligramos, por ello, para hacer las diluciones, se colocó y se maceró en un mortero con 10ml de agua destilada, y posteriormente se realizaron las diluciones para obtener éstas concentraciones, tomando en cuenta la fórmula c2=v1xc1/v2. Los resultados obtenidos de esta prueba, se tiene que las cepas de E. coli fueron resistentes a todas las concentraciones del antibiótico ampicilina, mientras que sólo una cepa de Klibsiella sp presentó sensibilidad a 250 y 500µg de ampicilina, siendo las otras cepas resistentes a este antibiótico. Como se puede ver en la imagen inferior y en la tabla número 6.

18

Tabla 6. Resultados que muestran los promedios de las medidas (cm) de los halos de inhibición en las concentraciones de ampicilina.

No. de Muestra y

Concentración de ampicilina en

Diámetro de los halos en

µg (microgramos)

cm (centímetros)

35.Klebsiella

250

1.2

35 Klebsiella

500

2.4

Género

7. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS En las cuatro muestras de alimentos; Cocktel, sándwich, torta y ensalada, se encontraron coliformes fecales, lo cual, como habíamos hecho referencia en el marco teórico y problema, puede deberse a que estas hortalizas se regaron con aguas residuales, por ejemplo, en una investigación realizada por Vega y colaboradores (2005), se encontraron altos niveles de contaminación por bacterias fecales en distintas hortalizas regadas con aguas residuales en la delegación de Xochimilco. Estos niveles sobrepasan los límites permitidos para cada tipo de hortaliza. En otro estudio que se llevo a cabo por Cabrera y colaboradores en el 2007, en la presa Manuel Avila Camacho, se utilizó esta agua para riego de los cultivos en el valle de Tecamachalco importante sitio productor de verduras que surten al mercado poblano. En esta se encontró una gran cantidad de residuos fecales humanos y animales, detectándose coliformes fecales, siendo la Escherichia sp, la bacteria dominante de estas aguas residuales, que son fuente potencial de una amplia variedad de enfermedades gastrointestinales bacterianas, que pueden llegar a impactar en la salud de la población consumidora de estos productos agrícolas si no son desinfectados eficientemente. Las coliformes fecales que más se aislaron en las muestras de alimento, fueron Escherichia coli y en menor cantidad Klebsiella sp., lo que indica, y volvemos a 19

reiterarlo, contaminación por heces fecales. El por qué, E. coli se encontró en mayor cantidad en los aislamientos es debido a que esta bacteria tienen un origen específicamente fecal, está se encuentra siempre presentes en grandes cantidades en las heces de los seres vivos de sangre caliente, y por lo tanto también es la bacteria más importante presente en el colón, tal como lo mencionan también López (1999) y Lösch (2006), por lo que se considera que la detección de esta coliforme fecal constituye una información suficiente como para estimar la naturaleza fecal de dicha contaminación. De acuerdo con nuestra investigación las cepas aisladas de Klebsiella sp y de E. coli al aplicarles la prueba de resistencia a 12 antibióticos. Estas dos bacterias presentaron en todas las cepas aisladas resistencia a la ampicilina (AM) y a la cefalotina (CF), y solo algunas cepas de estos organismos presentaron resistencia a carbenicilina y Trimetoprim-Sulfametoxazol (SXT). Esto posiblemente se debe de acuerdo a Leggett (2014), a que la membrana exterior de esta bacteria resiste los efectos de muchos tipos de antibióticos ya que es impermeable a éstos. Esta característica es dada por plásmidos, que como

se

menciono

en

el

marco

teórico,

son

unidades

de

ADN

extracromosómico que tienen una serie de genes (30 genes) que se denominan R, y que tienen un papel fundamental en la resistencia antibiótica (Galí, 2010). Las cepas de E. coli que presentaron resistencia a los antibióticos puede deberse, como se había mencionado anteriormente, a que se usan indiscriminadamente en tratamientos de personas, y para la engorda de animales de granja. Así lo observó Merino y colaboradores (2006), quienes señalaron que las bacterias resistentes se dan en aquellos países donde hay una excesiva prescripción y/o uso indiscriminado de estos antibióticos por parte del personal del Sistema de Salud Pública, o bien, de los antibióticos suministrados en la medicina veterinaria con fines variados. (Lösch, L.S., Merino, L. A., - Alonso, J. M., 2006). Es importante resaltar que en investigaciones realizadas en los últimos años, se ha demostrado la posible relación entre el consumo de antibióticos por animales y la aparición de bacterias resistentes. El uso veterinario de antibióticos, especialmente los empleados como promotores de crecimiento y engorda animal, podrían ser los 20

causantes directos del incremento de casos de resistencia a los antibióticos, tal como lo menciona Cancho y colaboradores en el 2000. En resumen, los desechos de personas y animales de granja, que contienen grandes concentraciones de antibióticos, van a parar al drenaje y éstos a su vez llegarán a los ríos y por ende, serán contaminados los lagos y las presas, es decir es proceso lineal, que se demuestra en los aislamientos de coliformes fecales que se realizaron en los alimentos que se comercializan a las afueras del Colegio. Aunado a lo anterior, debe resaltarse que E. coli y Klebsiella sp presentaron cien por ciento de resistencia a la ampicilina y cefalotina a las concentraciones mínimas inhibitorias. Resultados similares se obtuvieron en el estudio realizado por Tzoc y colaboradores en el 2004, en donde un 72 % presento resistencia a Cefalotina. Sin embargo en estudios realizados por Nuñez y colaboradores,2012, se encontró que la mayor prevalencia de resistencia está dada por los coliformes frente a ampicilina (34%) y cefalotina (17%). Por otra parte, al aplicar sólo diferentes concentraciones de Ampicilina (10, 50, 100, 250 y 500 µg) a las cepas aisladas de Klebsiella, se comprobó que únicamente una cepa fue sensible a dos concentraciones de este antibiótico (250 y 500 µg), no encontrándose ninguna referencia sobre la resistencia de Klebsiella a la ampicilina, por lo tanto se puede suponer que las frutas y hortalizas que sirvieron para la preparación de los alimentos que se muestrearon posiblemente estén contaminados por Klibsiellas resistentes a la ampicilina. Se debe señalar que para las cepas de E. coli aisladas, se obtuvieron resultados de resistencia en un 100% en la concentración mínima inhibitoria de ampicilina (10 µg) y cefalotina (30µg) como en el estudio elaborado por Lösch, L.S., Merino, L. A., - Alonso, J. M., en el 2006, en el cual se evidenció que el mayor porcentaje de resistencia a los antibióticos ensayados fue E. coli, la cual presentó un porcentaje de resistencia hacia ampicilina del 44,1%, no encontrando datos de comparación con respecto a la Cefalotina.

21

8. CONCLUSIONES Podemos concluir que los alimentos adquiridos por los alumnos en los puestos ubicados a las afueras del CCH-Naucalpan, presentan un alto grado de contaminación por coliformes fecales, siendo las principales coliformes fecales, E.coli y Klebsiella sp. Estas cepas presentaron resistencia a dos antibióticos; Ampicilina y Cefalotina. Esta resistencia pudo ser desarrollada por el uso indiscriminado de estos, producto de la

automedicación y la engorda de animales para consumo

humano; las heces fecales de humanos y animales que son desechadas contienen coliformes fecales resistentes, los cuales van a parar a las aguas residuales y estas servirán para el riego de hortalizas con las que se preparan alimentos que son comercializados a las afueras del colegio De las coliformes fecales aisladas de los alimentos, solo E.coli fue la que presento una gran resistencia a la ampicilina, lo que nos indica que esta bacteria puede ser un peligro potencial para la población estudiantil del colegio. Es así que el inadecuado uso de los antibióticos provoca que continuamente aparezcan cepas, las cuales requieren concentraciones cada vez mayores del antibiótico o nuevos antibióticos más potentes para ser eliminadas.

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