MEMORIA DEL TALLER TEÓRICO PRÁCTICO VIRORED 2016 El Taller Teórico Práctico Virored 2016 ha tenido lugar en el Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudios de la Salud (ICGES), en Ciudad de Panamá, de 25 a 27 de abril. En esta ocasión se ha pretendido que el tema principal de la reunión versara sobre la puesta al día del conocimiento de la situación de los virus trasmitidos por vector artrópodo, con especial foco en el virus Zika, dada la situación epidémica actual en las Américas. Además, se realizó una sesión corta sobre virus respiratorios emergentes. La reunión fue abierta con unas palabras de bienvenida del Dr Pascales, en representación de ICGES, que fueron seguidas de una intervención del Dr José Cardier, vicegestor del Área de Salud de Cyted, quien puso de manifiesto el interés estratégico de Virored para Cyted. Durante los tres días tuvieron lugar presentaciones sobre la situación general de las arbovirosis en América (Dra Marta Contigiani, Universidad de Córdoba, Argentina), presentaciones de contenido clínico, sobre diagnóstico clínico diferencial de las infecciones por dengue, chikungunya y Zika (Dra Ana Belén Arauz, Hospital Santo Tomás, Panamá), sobre las complicaciones producidas por el virus Zika debidas a infección en el embarazo y los cuadros neurológicos (Dr Xavier Saenz-Llorens, Hospital del Niño, Panamá). Se revisó la situación actual del virus Zika en Brasil (Dra Ana Bispo, Fiocruz, Brasil) y en el resto de países de la red, tanto americanos como europeos. Se actualizaron aspectos del diagnóstico de laboratorio de virus Zika (Dra Maria Joao Alves, Portugal), y los métodos diagnósticos de alfavirus (Dra Sandra Goñi, Universidad de Quilmes, Argentina), comparando la detección directa por PCR con las aproximaciones serológicas. En la sesión sobre virus respiratorios emergentes (CoV-Mers, Gripe, respiratorio sincitial) (Dra Elsa Baumeister, ANLIS, Argentina, Dra Inmaculada Casas, ISCIII, España y Dr Juan Arbiza, Universidad de Montevideo), se puso en común la experiencia de España y Argentina sobre las actuaciones realizadas para la atención de posibles casos importados de CoV-MERS y por otra parte se puso de manifiesto la dificultad del aislamiento de los virus de influenza A (H3) estacionales. La reunión pretendió tener un componente práctico, que se plasmó en la realización de tres demostraciones prácticas, una sobre PCR en tiempo real específica para virus Zika, dengue y chikungunya, en el que se compararon los métodos de la compañía Altona y los del CDC, ampliamente utilizados por los laboratorios de la red; otra sobre PCR en tiempo real diferencial de chikungunya y Mayaro desarrollada en colaboración por diferentes laboratorios de la Red (ISCIII-UNQ), que tenía por objetivo su validación, y una tercera sobre Serología, en la que se puso en evidencia la dificultad de realizar diagnóstico diferencial entre los virus Zika y dengue. Los métodos de qPCR comparados mostraron resultados similares en cuento a la detección de los virus dengue y Zika; sin embargo, se obtuvieron resultados discrepantes con el virus chikungunya que necesitan ser confirmados. El método múltiplex de detección diferencial chikungunya-Mayaro mostró buenos resultados comparativos, aunque no pudo ser validado completamente al no disponer material genético de todas las muestras clínicas, sobre todo de Mayaro. La realización de estas actividades prácticas fue posible gracias a la contribución de las empresas Altona y EuroImmun y, sobre todo, a la colaboración en su realización de Dimelza Arauz y de María Chen (ICGES). Otro objetivo de la reunión fue poner en común la disponibilidad de metodologías diagnósticas en los laboratorios de la red, con el fin de identificar posibles colaboraciones. En este contexto se identificaron las siguientes: 1. Evaluación de ensayos para diagnóstico serológico de dengue desarrollados en Perú (Dra Paquita García [Centro Nacional de Salud Pública - Instituto Nacional de Salud, Perú] y laboratorios de la red); 2. Puesta a punto de ensayos para la caracterización de avidez de IgG frente a Zika (Dra Maria Joao Alves y Dr Fernando de Ory, ISCIII); 3. Caracterización molecular de virus RSV (Dr Juan Arbiza, y otros países, que se contactarán en el futuro inmediato); y 4. Posibilidad de transferencia de la PCR múltiple MAYVCHKV para los laboratorios interesados.

Igualmente se discutió la actividad de la red y las perspectivas de futuro. En lo que se refiere al primer aspecto se hizo una revisión de los controles de calidad distribuidos por Virored en los dos últimos años (Dra Anabel Negredo, ISCIII). Los controles de calidad fueron valorados como de gran utilidad para cumplir los objetivos de la red. Además, se discutió acerca de las pasantías realizadas en los dos últimos años, como herramientas que permiten la formación de personal investigador y la incorporación de tecnología a los laboratorios de Virored, poniéndose de manifiesto su gran utilidad para el cumplimiento de los objetivos de la red. En cuanto a las perspectivas de futuro, se identificó la necesidad de distribuir un control de calidad para la detección por PCR del virus Zika, objetivo que se plantea para el presente año, desde el ISCIII, considerándose de gran interés la realización de pasantías futuras, siempre en función de la disponibilidad económica. El informe del coordinador científico (Dr Fernando de Ory) versó sobre la actividad desarrollada desde verano de 2014, en lo referido a transferencia de tecnología, asesorías efectuadas, controles de calidad distribuidos, estancias realizadas y reuniones que han tenido lugar. Entre 2014 y 2015 se han concedido 13 pasantías, siendo un aspecto importante que todos los países solicitantes con instituciones adheridas a la red han sido beneficiarios de estancias. Un aspecto de gran interés es que las convocatorias se han adaptado a las necesidades que se han ido detectando en el ámbito de la red (ébola y chikungunya en 2014, Zika en 2015). Un último aspecto no menos importante se deriva de las colaboraciones que se abren entre el laboratorio receptor del pasante y el del beneficiario de la pasantía. Se hace hincapié en que en los productos de estas colaboraciones (publicaciones y otros) se refleje el reconocimiento a Virored. Igualmente, en los dos últimos años, se han celebrado dos reuniones de la red. La primera en Montevideo: “Simposio Virored 2014: Virus Emergentes en IberoAmérica y amenazas globales”, a la que asistieron 35 participantes, de 19 instituciones, de 14 países, y la actual, en la que han asistido 37 participantes, de 19 instituciones (más dos no adheridas), de 15 países (más uno no adherido), incluyendo representación de OPS, Cyted y la compañía Altona. Se puso de manifiesto la cofinanciación de ambas actividades (pasantías y reuniones). En este sentido se agradeció especialmente la generosa financiación aportada tanto por la DICyT y FCIEN, para la reunión de Uruguay, y la de ICGES para la presente en Panamá. Durante los dos últimos años se ha producido la adhesión de Nicaragua (Universidad Nacional Autónoma) (noviembre de 2014), del Departamento de Laboratorios de Salud Pública de Uruguay (abril 2016), estando en trámite la adhesión del Instituto Medicina Tropical, Universidad Central de Venezuela. Se presentó la iniciativa para solicitar financiación para un consorcio de investigación sobre Zika, en el contexto del programa-marco Horizonte 2020 de la Unión Europea, para la que se ha solicitado la participación de los laboratorios de Virored. La propuesta está liderada por el Centro de Investigación Cooperativa en Biociencias (Bilbao, España), coordinada por Dr. Nicola G. Abrescia. Desde la coordinación de la propuesta se decidió que la presentación debería ser realizada de forma muy preliminar, sin entrar en excesivos detalles. Dadas las características de nuestra red se entendió que la participación de Virored debe depender del Instituto de Salud Carlos III, siendo la Dra. Mari Paz Sánchez-Seco quien, en función de su condición de Coordinadora de Arbovirus de Virored, actúe en representación. Se discutió sobre la forma de participación de los laboratorios, que en el estado actual de la propuesta tiene que ser necesariamente a través de Virored. Aunque en el estado inicial de la propuesta no se contempla que los laboratorios participen como partners, puesto que el número actual se considera proporcionado a la propuesta, no se excluye que en sucesivos años pueda ser. La aportación que se espera de Virored es la obtención de muestras de casos humanos con información clínicoepidemiológica de calidad, y de mosquitos. El consorcio proporcionará la financiación para la realización de los estudios en cada país que aporte estas muestras. En lo que se refiere a la posibilidad de financiación global para Virored, en el estado actual solo se contempla, la posible financiación de expertos para participar en las reuniones de nuestra red que puedan tener lugar.

La reunión terminó manifestando todos los participantes el agradecimiento al ICGES, en las personas de las Dras Sandra L. López-Vergés y Brechla Moreno, por la excelente organización del evento.

Anexo I. Agenda

Taller Teórico Práctico Virored INSTITUTO CONMEMORATIVO GORGAS DE ESTUDIOS DE LA SALUD Panamá 25-27 de abril

25 DE ABRIL 8:00-8:30 8:30-9:00

9:00-9:30 9:30-10:00 10:00-10:30 10:30-10:45 10:45-11:15 11:15-11:45

11:45-12:45

12:45-13:45 13:45-14:15 14:15-15:30

15:30-16:30

Acreditación Bienvenida. Dirección del ICGES Programa Cyted: importancia de Virored. José Cardier Situación general de las arbovirosis en las Américas. Marta Contigiani Diagnóstico clínico de las infecciones por dengue, chikungunya y zika. Ana Belén Arauz Complicaciones por virus Zika: embarazo y cuadros neurológicos. Xavier Saez-Llorens Café Diagnóstico de laboratorio de infecciones por virus Zika. Maria Joao Alves Altona Diagnostics Hans Kuhn Diagnóstico de CHIK / DENV / ZIKV Volkan Duvan PRACTICA 1. PCR en tiempo real específica para virus Zika, Dengue y Chikungunya. Dimelza Arauz/María Chen/Anabel Negredo Comida/Reunión Comité Científico Actualización y situación actual del virus Zika en las Américas. Ana María Bispo El virus Zika en los países de la red: situación. Disponibilidad y necesidades diagnósticas. DISCUSION ABIERTA. Moderadoras: Ana Bispo/Maria Joao Alves PRACTICA 1 (continuación). PCR en tiempo real específica para virus Zika, Dengue y Chikungunya. Lectura e interpretación de resultados. Dimelza Arauz/María Chen/Anabel Negredo

26 DE ABRIL 8:30-9:00

Evaluación de controles de calidad, 2014-15. Anabel Negredo

9:00-9:15

1.Situación del diagnóstico de CoV-MERS en Europa. Reactivos y técnicas de WHO-ECDC. Inmaculada Casas 2. Situación del diagnóstico de CoV-MERS en Iberoamérica. Reactivos y técnicas CDC. Elsa Baumeister 3. Situación de Influenza: caracterización de Gripe A (H3). Elsa Baumeister/Inmaculada Casas 4. Situación de RSV para su adecuación a la vigilancia global: Acciones conjuntas a desarrollar. Juan Arbiza 5. Discusión general: ECDC vs CDC carencias de los laboratorios e implementación: CoV MERS; Acciones a desarrollar: valoración del interés de los laboratorios; Planificación de dichas acciones en función del interés: Realización de acciones: ¿Quién? ¿Dónde? ¿Cómo? ¿Cuándo? Elsa Baumeister /Inmaculada Casas/Juan Arbiza Café

SESIÓN DE VIRUS RESPIRATORIOS

9:15-9:30

9:30-9:45 9:45-10:00

10:00-10:30

10:30-10:45

10:45-11:15 11:15-12:15 12:15-12:45 12:45-13:45 13:45-16:30

Métodos diagnósticos Alfavirus. PCR vs serología. Sandra Goñi PRACTICA 2. PCR en tiempo real diferencial de Chikungunya y Mayaro. Sandra Goñi/Anabel Negredo Pasantías de Virored. DISCUSION ABIERTA Moderador: Fernando de Ory Comida/Reunión Comité Ejecutivo PRACTICA 3. SEROLOGIA. Inmunofluorescencia para virus Zika, Euroimmnun Maria Joao Alves/Fernando de Ory PRACTICA 2 (continuación). PCR en tiempo real diferencial de Chikungunya y Mayaro: lectura e interpretación de resultados. Sandra Goñi/Anabel Negredo

27 DE ABRIL 8:30-9:30 9:30-10:30 10:30-10:45 10:45-11:15 11:15-11:45 11:45-12:45 12:45-14:00

Evaluación y discusión de las clases prácticas Necesidades de laboratorios de la red. DISCUSION ABIERTA Moderador: Fernando de Ory Café Informe del Coordinador Científico Fernando de Ory Perspectivas de futuro y Evaluación de la Red. DISCUSION ABIERTA Moderador: Fernando de Ory Conclusiones y Clausura Comida

Ponentes: José Cardier (Programa Iberoamericano Cyted, Ciencia y Tecnología para el desarrollo) Marta Contigiani (Instituto de Virología Dr. J. M. Vanella, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina) Ana Belén Araúz (Hospital Santo Tomás, Panamá) Xavier Sáez Llorens (Hospital del Niño, Panamá) Maria Joao Alves (Instituto Nacional de Saúde Dr Ricardo Jorge, Portugal) Hans Kuhn (altona Diagnostics GmbH, Alemania) Volkan Duvan (altona Diagnostics GmbH, Alemania) Ana María Bispo (Laboratorio de Flavivirus, IOC/Fiocruz, Brasil) Anabel Negredo (Centro Nacional de Microbiología, ISCIII, España) Inmaculada Casas (Centro Nacional de Microbiología, ISCIII, España) Elsa Baumeister (INEI, ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán, Argentina) Juan Arbiza (Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Uruguay) Sandra Goñi (Universidad Nacional de Quilmes, Argentina) Fernando de Ory (Centro Nacional de Microbiología, ISCIII, España) Organización: Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudios de la Salud (ICGES) Sandra Laurence Lopez-Verges, Brechla Moreno Instituto de Salud Carlos III Ana Vázquez, Fernando de Ory Prácticas: Dimelza Arauz (ICGES) María Chen (ICGES) Anabel Negredo Sandra Goñi María Joao Alves Fernando de Ory

Patrocinadores

Organización

Anexo II. Participantes Nombre correo Elsa Baumeister [email protected] Sandra Goñi [email protected] Marta Contigiani [email protected] Gerhaldine Morazan [email protected] Rosario Rivera [email protected] [email protected] Ana Bispo Rita Nogueira [email protected] Elizabeth Saenz Bolaños [email protected] Eduardo Jurado [email protected] [email protected] Inmaculada Casas Ana Isabel Negredo [email protected] Fernando De Ory Manchon [email protected] Leticia del Carmen Castillo [email protected] [email protected] Alma Nuñez León Marlene Muñoz Gaitan [email protected] José Gonzalez [email protected] [email protected] Xania León María Chen [email protected] Dimelza Araúz [email protected] Daniel Castillo [email protected] [email protected] Sandra López Alcibiades Guerra [email protected] Shirley Villalba [email protected] Alejandra Rojas [email protected] [email protected] Dana Figueroa R María Paquita García Mendoza [email protected] Maria João Alves [email protected] María Noelia Morel [email protected] Adriana Delfraro [email protected] Juan Arbiza [email protected] Nahir Martínez** [email protected] Daría E. Camacho [email protected] Jesús D. Reyes [email protected] José Cardier [email protected] Hans Kuhn [email protected] Volkan Duvan [email protected] Leticia Franco [email protected] *país no adherido; **de institución no adherida

País Argentina Argentina Argentina Belice* Bolivia Brasil Brasil Costa Rica Ecuador España España España Guatemala Mexico Nicaragua Panamá Panamá Panamá Panamá Panamá Panamá Panamá Paraguay Paraguay Perú Perú Portugal Uruguay Uruguay Uruguay Venezuela Venezuela Venezuela Cyted Altona Altona OPS

Anexo III. Prácticas Taller Teórico Práctico Virored Panamá 25-27 de abril, 2016 Guion para la Práctica 1. PCR en tiempo real específica para virus Zika, dengue y chikungunya (Altona Kits) OBJETIVO Realizar una PCR en tiempo real comparativa para los virus Zika, dengue y chikungunya con el protocolo establecido por el CDC y los kits comerciales de Altona. Valoración de la sensibilidad de cada técnica con muestras clínicas.

MATERIAL Muestras Se emplearán muestras caracterizadas de casos de infección por virus Zika, chikungunya y dengue. El RNA de las diferentes muestras biológicas estará ya extraído previamente para su uso directo en las diferentes técnicas. Material - Termociclador Tiempo Real 7500 Fast de Applied Biosystem - RealStar® Zika Virus RT-PCR Kit (Altona) - RealStar® Dengue Virus RT-PCR Kit (Altona) - RealStar® Chikungunya Virus RT-PCR Kit (Altona)

PROCEDIMIENTO 1. REAL TIME RT-PCR CHIKV (ALTONA) Ref: 012013 Una vez obtenido el RNA se añaden 10 µl del mismo a la placa de 96 pocillos que contienen una mezcla de reacción (premix) con 21 µl de: MÁSTER MIX Master A Master B CI (tapón verde) Muestras: C- (Agua) C+ (tapón rojo)

X1 5 µl 15 µl 1 µl

Xn 5 µl Xn 15 µl Xn 1 µl Xn

Detalles programación: Fluorocromos: FAM (tapón rojo) para ZIKV, DENV y CHIK. JOE (tapón verde) para CI Volumen de reacción final: 30 µL Ramp Rate: Default Referencia Pasiva: ROX para ZIKV y CHKV / en Dengue: NINGUNA La reacción se inicia con la retrotranscripción (20 min a 55ºC), seguido de una desnaturalización a 95ºC durante 2min, posteriormente ocurre una amplificación con 45 ciclos de 15 seg a 95ºC y 45 seg a 55ºC (medida de fluorescencia) y 72ºC durante 15 seg.

Taller Teórico Práctico Virored 2016 Panamá 25-27 de abril, 2016

Guion para la Práctica 1. Mayaro-Chikungunya OBJETIVO Realizar un ensayo de PCR en tiempo real para la detección múltiple y diagnóstico diferencial con virus Mayaro (MAYV) y chikungunya (CHIKV).

MATERIAL Muestras Se emplearán muestras problema de posibles casos de infección por los virus Mayaro y chikungunya. Las muestras ya han sido extraídas y se les ha hecho una retrotranscripción para pasarlas a cDNA, que es el tipo de muestra que necesita este ensayo. Emplearemos una Master Mix de Qiagen optimizada para el uso en Múltiplex-PCR, para más de dos sondas. Para ello, 8 muestras problema se analizarán en una qRT-PCR específica para los virus MAYV y CHIKV, dando lugar a la identificación independiente de cualquiera de los dos agentes que esté involucrado en la infección. Material - Termociclador Tiempo Real 7500 Fast de Applied Biosystem - QuantiTect Multiplex PCR Kit (Qiagen) PROCEDIMIENTO Se ensayará la técnica de qRT-PCR sobre el ADNc sintetizado previamente. Una vez obtenido el ADNc se añaden 5 µl del mismo a la placa de 96 pocillos que contienen una mezcla con 20 µl de la siguiente reacción (premix): X1 Premix QP RT MM 2X Alfa RT_S 100 uM Alfa RT_AS 100 uM Sonda MAYV 10 uM Sonda CHKV 10 uM Sonda CI 10 uM CI (2000 copias) Agua Total (sin molde)

12,5 µl 0,3 µl 0,2 µl 0,75 µl 0,5 µl 0,5 µl 1 µl 4,25 µl 20 µl

Muestras: C- (Agua) C+ CHKV 103 copias/µl C+ MAYV 103 copias/µl Detalles programación: Fluorocromos: FAM para CHIK JOE para MAYV y NED para CI Volumen de reacción final: 25 µL Ramp Rate: Default Referencia Pasiva: ROX

xn

La reacción se inicia con una desnaturalización inicial y activación de la polimerasa de 15 min a 95ºC, seguido de 40 ciclos de 15 seg a 95ºC y 1 min a 60ºC (medida de fluorescencia).

Taller Teórico Práctico Virored 2016 Panamá 25-27 de abril, 2016 Guion para la Práctica 3. Serología OBJETIVO Realizar un ensayo para detectar anticuerpos IgG e IgM frente a virus Zika, para el diagnóstico diferencial con virus Chikungunya y valoración de reactividad cruzada con virus dengue.

MATERIAL Muestras Se emplearán muestras caracterizadas de casos de infección por virus Zika, Chikungunya y dengue. Las muestras estarán preparadas para su uso directo (el pretratamiento no se realizará durante la práctica) Material - IIFT Arboviral Fever Mosaic 2 (IgG or IgM), Euroimmun - Absorbente de IgG (suero anti-IgG humana), Euroimmun

PROCEDIMIENTO Los portas, los reactivos y las muestras a ensayar deben estar a temperatura ambiente Preparación del ensayo Preparación de solución de lavado: un sobre se disuelve en 1 L de agua destilada y se mezcla con 2 mL de Tween 20 Pretratamiento de muestras 2. Ensayo de IgM Se tratan las muestras para eliminar IgG (para eliminar interferencias debidas a la presencia simultánea de IgG y factor/es reumatoide/s). - 10 µL de muestra + 40 µL de diluyente de muestra + 50 µL de absorbente de IgG. - Agitación en vórtex - Incubación 15 min a temperatura ambiente - Centrifugación a 4000 rpm, 5 min - Se emplea el sobrenadante, que es una dilución 1:10. 3. Ensayo de IgG - Se diluyen las muestras: 10 µL de muestra + 90 µL de diluyente de muestra - Se realizan diluciones en base 10, para obtener las que se van a ensayar Las muestras y diluciones a ensayar durante la práctica están prediluidas y pretratadas Realización del ensayo - Se dispensan las diluciones (30 µL/pocillo) de acuerdo con el siguiente esquema: 1 2 3 4 5

-

#1, 1/10

#1, 1/100

#1, 1/1000

#1, 1/10000

#1, 1/10

6

7

8

9

10

#2, 1/10

#2, 1/100

#2, 1/1000

#2, 1/10000

#2, 1/10

Se incuba 30 min a temperatura ambiente, en cámara húmeda Se lava con solución de lavado, un lavado rápido y otro de 5 min Se escurren los portas, sin secar Se dispensan el conjugado anti-IgG o anti-IgM, en los pocillos correspondientes Se incuba como antes

-

Se lava como antes Se escurren, se dejan secar y se montan los portas con glicerina tamponada Se observa en microscopio de fluorescencia a 200 aumentos

LECTURA Cada pocillo incorpora seis chips que incluyen células infectadas por los seis virus, de acuerdo con el siguiente esquema:

1. Virus Zika 2. Virus Dengue 1 3. Virus Dengue 2

6. Virus Chikungunya 5. Virus Dengue 4 4. Virus Dengue 3

La detección de anticuerpos específicos frente a virus Zika se observa como presencia de fluorescencia fina o gruesa de localización citoplásmica (figura, izquierda). Frente a los virus dengue la fluorescencia es fina a gruesa, con cuerpos de inclusión (figura, derecha). En el caso de virus Chikungunya la fluorescencia es homogénea, con mayor intensidad en la membrana (figura, centro). En cualquier caso, la intensidad es variable, dependiendo de la concentración de anticuerpos presentes en la muestra.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS -

La presencia de IgM específica frente a virus dengue o virus Zika indica infección probable por estos virus. - La presencia de IgG específica frente a virus dengue o virus Zika indica infección previa por alguna de estos virus. Para la caracterización definitiva de las respuestas serológicas frente a los flavivirus se requiere la confirmación por técnica de neutralización. - La presencia de IgM específica frente a virus Chikungunya indica infección reciente por el virus (en ausencia de circulación de otros Alfavirus) - La presencia de IgG específica frente a virus Chikungunya indica infección previa por el virus