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MICOLOGIA

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

2011

2 TRABAJOS PRÁCTICOS N°1 y 2 TEMA: CANDIDIASIS Objetivos El alumno deberá: > Reconocer la presencia de levaduras, seudomicelio y/o filamentos en materiales biológicos por exámenes directos o coloración. > Conocer la macro y micromorfología de los agentes productores de Candidiasis. > Utilizar medios cromogénicos para la detección de mezcla de levaduras. > Utilizar técnicas rápidas para la identificación de Candida albicans y Candida dubliniensis. > Utilizar otros métodos de identificación para especies de levaduras no Candida albicans. > Interpretar los resultados del laboratorio para los distintos materiales clínicos y relacionarlos con las posibles causas predisponentes en una ficha de anamnesis. Materiales > Caja de trabajo > Materiales clínicos; secresión vaginal, orina, escamas de piel o uñas, hisopados de mucosa. > Extendidos de materiales clínicos teñidos con GN, MGG y ZN. > Cultivos en Sabouraud glucosa de C albicans, C. dubliniensis, C glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis. > Cultivos en CHROMagar Candida de C albicans, C. krusei, C. tropicalis. > Kit de identificación API 20 C Aux e ID32. > Placas de Petri con Agar Harina de Maíz (AHM). > Tubos de hemólisis con 0,5 ml de suero. > Microscopio> Placas de CHROMagar Candida Actividades: > Análisis micológico de materiales clínicos. > Observar y describir los extendidos de materiales profundos teñidos con GN, MGG y ZN. > Observar y describir la macromorfología de las colonias de Candida. Efectuar un preparado directo de estas colonias con Líquido de montar y Gueguén. Describir la micromorfología.

3 > Observar los diferentes colores de las colonias de Candida en medio CHROMagar Candida. > Sembrar las diferentes especies de Candida en AHM. Incubar durante 48 hs a 28 °C. > Sembrar las diferentes especies de Candida en suero. Incubar durante 2 hs 30 ' a 37 °C y observar la formación de tubos germinativos , > Observar y describir la micromorfología de las colonias de Candida en AHM. > Leer los resultados obtenidos para una levadura incógnita en un blister de API 20 C Aux. Realizar la identificación de las levaduras utilizando el Manual correspondiente. > Observar los cultivos correspondientes a diferentes materiales clínicos con desarrollo de colonias de levaduras e interpretar los resultados. > En una ficha de anamnesis, señalar las posibles causas predisponentes, los materiales a extraer y qué resultados se esperan obtener en caso de una Candidiasis. > Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas

4 TRABAJO PRACTICO N°3 TEMA: DERMATOFITOSIS: GENEROS MICROSPORUM Y EPIDERMOPHYTON Objetivos: El alumno deberá: > Extraer material de las dermatofítias de las zonas convenientes y en forma correcta para asegurar la mayor probabilidad de éxito en el examen micológico. > Conocer

y

realizar

correctamente

el

procedimiento

para

la

observación

microscópica del material de las lesiones. > Reconocer las formas parasitarias en material de piel y faneras, diferenciándolas de las formas saprofíticas sobre material queratinoso. > Ser capaz de sembrar el material proveniente correctamente en los medios de cultivos adecuados, conociendo la composición y razón de uso de cada uno de ellos. > Conocer las características macromorfológicas típicas (aspecto, color, superficie, etc.) y las posibles variaciones (pleoinorfísmo) de las colonias de dermatofitos (géneros Microsporum y Epidermophyton) más comunmente aisladas de las lesiones humanas en nuestro medio. Materiales: > Caja de trabajo: ansa, espátula, gancho, hilo, portaobjetos, cubreobjetos, papel de filtro, gasa, colorante Gueguén, líquido de montar, KOH 20% P/V, Tinta china (1:2 con agua destilada), pinza, espátula de Drigalsky. > Microscopios. > Colonias en Sabouraud-glucosa de; Microsporum canis, Microsporum gypseum y Epidermophyton floccosum. > Preparados provenientes de cultivos de adhesión de ; Microsporum canis, Microsporum gypseum y Epidermophyton floccosum. > Escamas de piel y faneras con elementos fúngicos provenientes de dermatofitias. Actividades; > Observar y describir macromorfológicamente las colonias de Microsporum canis, Microsporum gypseum y Epidermophyton floccosum. > Observar y describir micromorfológicamente cepas de Microsporum canis, Microsporum gypseum y Epidermophyton floccosum. > Observar exámenes directos de escamas de piel, pelos y uñas parasitados. > Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas

5 TRABAJO PRACTICO N°4 TEMA: DERMATOFITOSIS: GÉNERO TRICHOPHYTON Objetivos: El alumno deberá: > Extraer material de las dermatofitias de las zonas convenientes y en forma correcta para asegurar la mayor probabilidad de éxito en el examen micológico. > Conocer y realizar correctamente el procedimiento para la observación microscópica del material de las lesiones. > Reconocer las formas parasitarias en material de piel y faneras, diferenciándolas de las formas saprofíticas sobre material queratinoso. > Ser capaz de sembrar el material proveniente correctamente en los medios de cultivos adecuados, conociendo la composición y razón de uso de cada uno de ellos. Conocer las características macromorfológicas típicas (aspecto, color, superficie, etc.) y las posibles variaciones (pleomorfísmo) de las colonias de dermatofitos (género Trichophyton) más comunmente aisladas de las lesiones humanas en nuestro medio. > Reconocer por observación microscópica los elementos estudiados del micelio vegetativo y de reproducción asexuada del género Trichophyton. > Conocer el fundamento y ser capaces de realizar las siguientes técnicas para: formación de órganos perforadores sobre pelos estériles in vitro, comprobación de la capacidad de síntesis de la ureasa determinación de requerimientos nutricionales utilizando los medios:"Trichophyton agar" y utilización del medio de agar púrpura de Bromo-cresol, glucosa leche. > Aplicar los resultados obtenidos del estudio morfológico y fisiológico a claves taxonómicas con el objeto de ubicar un dermatofito dado en el género y especie correspondiente, > Saber aplicar los recursos con que cuenta el laboratorio micológico en el diagnóstico de casos de cronicidad y de portador sano. > Conocer los criterios a tener en cuenta en los diagnósticos diferenciales. Materiales: > Caja de trabajo. > Microscopios. > Colonias en Sabouraud-glucosa de: T. rubrun, T. mentagrophytes y T. tonsurans. > Preparados provenientes de cultivos de adhesión de: T. rubrum, T. mentagrophytes y T. tonsurans. > Escamas de piel y faneras con elementos fúngicos provenientes de dermatofitias.

6 > Medio de agar púrpura de Bromo-cresol, glucosa, leche. > Medio de Christensen. > Medio diferencial "Trichophyton agar": -N° 1: Caseína agar -N° 2: Caseína + Inositol agar -N° 3 : Caseína + Inositol + Tiamina agar -N° 4 - Caseína + Tiamina agar -N° 5.- Caseína + ácido nicotínico agar -N° 6:- Nitrato de amonio agar -N° 7:- Nitrato de amonio + Histidina agar Actividades; > Observar y describir macromorfológicamente las colonias de T. rubrum, T. mentagrophytes y T. tonsurans. > Observar y describir micromorfológicamente cepas de T. rubrum, T. mentagrophytes y T. tonsurans. > Realizar examenes directos de materiales parasitazos: escamas de piel, pelos y uñas. > Realizar la siembra de T. rubrum, T. mentagrophytes en medio de Christensen. Incubar durante 4 días a 28 °C. > Sembrar las cepas de T. rubrum, T. mentagrophytes por la técnica del anzuelo queratinoso. Incubar durante 4 semanas a 28 °C. > Realizar la siembra de T. rubrum, T. mentagrophytes en medio de agar púrpura de Bromo-cresol, glucosa, leche. Incubar durante 7 días a 28 °C. > Utilizar el test de Trichophyton agar":Nº1 y Nº4 (Incubado durante 15 días a 28 °C) para diferenciar: T. rubrum, T. mentagrophytes y T. tonsurans. > Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas

7 TRABAJO PRÁCTICO N°5 TEMA: INFECCIONES POR ESPECIES DE MALASSEZIA Objetivos: El alumno deberá: > Reconocer en examen microscópico directo de escamas la forma parasitaria del agente etiológico de pitiriasis. > Conocer la macro y micromorfología de especies de Malassezia spp. > Conocer los fundamentos e interpretación de pruebas fisiológicas utilizadas par la identificación de las distintas especies Malassezia. Materiales > Caja de trabajo > Materiales clínicos: escamas de piel. > Cultivos en Agar Dixon modificado (ADm) de Malassezia spp. > Preparados de especies de Malassezia. > Cultivos en CHROMAgar Malassezia de especies de Malassezia > Tubos con Agar-Esculina en columna sembrados con especies de Malassezia. Peróxido de hidrógeno 10%- Pipetas Pasteur de vidrio o palillos de madera. Actividades: > Realizar exámenes directos con KOH 20 % y Azul de lactofenol de escamas de piel. > Observar y describir la macromorfología de las colonias de Malassezia spp. > Observar y describir la micromorfología de las diferentes especies de Malassezia spp. > Realizar prueba de la Catalasa: La presencia de catalasa en la cepa en estudio se determina por el agregado de una gota de peróxido de hidrógeno 10 vol. a una ansada de cultivo sobre un portaobjeto nuevo y limpio. La aparición de burbujas es considerada una prueba positiva, sin importar la magnitud de éstas. > Interpretar los resultados de la prueba de desdoblamiento de la esculina: Se evalúa la actividad β-glucosidasa usando tubos de agar-esculina. Una ansada de levaduras jóvenes se inocula por punción en el agar y se incuba 5 días a 32º C. El desdoblamiento de la esculina en esculetina + glucosa se revela por el oscurecimiento del medio, con liberación de sales de hierro soluble que se encuentran incorporadas al medio. > Interpretar

los

desarrollos

obtenidos

en

placas

de

CHROMAgar-Malassezia

modificado. Registrar los colores obtenidos, tamaño, producción o no de precipitado. > Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas

8 TRABAJO PRACTICO N°6 TEMA: TRICHOSPORONOSIS - GEOTRICOSIS Objetivos El alumno deberá: > Conocer la macro y micromorfología de Trichosporon sp. y Geotrichum sp. agentes productores de Trichosporinosis y Geotricosis. > Reconocer la micromorfología de Trichosporon sp., Geotrichum sp. por observación del desarrollo en agar harina de maíz, preparados directos de las colonias y cultivos de adhesión, Materiales > Caja de trabajo > Cultivos en Sabouraud glucosa de Trichosporon sp. y Geotrichum sp. > Placas de Petri con Agar Harina de Maíz (AHM) sembrado con Trichosporon sp y Geotrichum sp, > Cultivos en CHROMagar Trichosporon sp. y Geotrichum sp., Actividades: > Observar y describir la macromorfología de las colonias de Trichosporon sp. y Geotrichum sp. > Observar y describir la micromorfología de Trichosporon sp. y Geotrichum sp. en AHM. > Observar los diferentes colores de las colonias en medio CHROmagar Candida. > Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas

9 TRABAJO PRACTICO N°7 TEMA: CRIPTOCOCOSIS Objetivos El alumno deberá: > Reconocer en examen microscópico directo de LCR, con tinta china y Gueguén, la forma parasitaria del agente etiológico de la Criptococosis. > Conocer y describir la macro y micromorfología de Cryptococcus neoformans en medio Sabouraud glucosa. > Conocer y describir la micromorfología de Cryptococcus neoformans en medio agar chocolate y AHM. > Desarrollar habilidad para identificar en forma presuntiva y definitiva las levaduras de este género. Materiales > Caja de trabajo > Materiales clínicos: LCR. > Cultivos en Sabouraud glucosa de Cryptococcus neoformans. > Placas de Petri con Agar Harina de Maíz (AHM) sembrado con Cryptococcus neoformans. > Placas de Petri con Agar chocolate sembrado con Cryptococcus neoformans. > Placas con Agar Semilla de girasol Actividades: > Realizar exámenes directos con tinta china y Gueguén de LCR. > Observar y describir la macromorfología de las colonias de Cryptococcus neoformans. > Observar y describir la micromorfología de Cryptococcus neoformans en Sabouraud, agar chocolate y AHM. > Realizar pruebas bioquímicas mínimas para identificación presuntiva •

Prueba de ureasa

•

Siembra en medio semilla de girasol

•

Siembra en medio CGB, (diferencial de C neoformans y C Gatti)

> Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas

Técnicas: Pruebas bioquímicas necesarias para la identificación del género Cryptococcus

10 1) Siembra de levaduras en el medio diferencial Agar semillas de girasol. La técnica se basa en la detección de la actividad de la enzima fenoloxidasa presente en estas levaduras, dando un compuesto de color marrón. 2) Determinación de la producción de ureasa en medio de Christensen (medio empleado en pruebas bioquímicas bacteriológicas). Incubar por 4 días a 28º C 3) Prueba rápida para la detección de actividad ureasa en levaduras. Reactivos: Solución A: (guardar en frasco color caramelo) REACTIVO 1 WIENER Fenol 50g Nitropursiato de sodio 0.25 gr Agua destilada csp 1000ml Solución B: (no usar luego de 3 meses) REACTIVO 2 WIENER NaOH 25gr Hipoclorito de Na 80g/00 26.5 ml Agua destilada csp 1000ml Solución de urea 0.6 g% en agua destilada (preparar en el momento) Técnica: Se parte de un cultivo de 24-48 hs, en Sb-G. 1. Suspender colonia en 0.5 ml de solución de urea 0.6%, 2. Incubar 10’ a 37ºC 3. Agregar 0.5 ml Rvo A REACTIVO 1 WIENER 4. Agregar 0.5 ml Rvo B REACTIVO 2 WIENER 5. Incubar 5’ 6. Usar controles positivo C neoformas, negativo C albicans Interpretación: POSITIVO: NEGATIVO.

Azul intenso Celeste o verde pálido

4) Prueba para diferencia C neoformans de C Gatti Medio canavanina-glicina-azul de bromotimol (medio CGB) El evaluar la capacidad de asimilar la L-canavanina y la glicina, nos permite realizar la determinación de la variedad del Cryptococcus en estudio. Datos todos estos, importantes en lo referente, al estudio epidemiológico de la criptococosis Solución A: Glicina 10 g; fosfato de potasio monobásico KH2PO4 1 g; sulfato de magnesio MgSO4 1 g; tiamina-HCl 1 mg; sulfato de L-canavanina 30 mg; agua destilada100 ml; pH 5,6. Se esteriliza por filtración (0,45 m). Solución B: Azul de bromotimol 0,4%; agua destilada 100 ml. Para 100 ml del medio: • •

solución B 2 ml; agua destilada 88 ml; agar 2 g; solución A 10 ml.

11 Se mezcló la solución B con el agua destilada y el agar. Se esteriliza en autoclave y, al entibiar, se agrega la solución A. Se distribuye a razón de 4 ml por tubo, dejando solidificar con taco y bisel. A partir de un cultivo de 48 horas de crecimiento a 35°C en medio de SbGl, se procedió a realizar la siembra en la superficie del bisel. Se dejaron a temperatura ambiente y se observaron diariamente hasta un máximo de 5 días. Interpretación de los resultados: • •

Color amarillo o amarillo-verdoso = C. neoformans; Color azul de cobalto = C. gattii.

12 TRABAJO PRACTICO N° 8 TEMA: HISTOPLASMOSIS Objetivos El alumno deberá: > Reconocer la macro y micromorfología de Histoplasma capsulatum. > Reconocer la forma parasitaria de Histoplasma capsulatum. Materiales > Colonias de Histoplasma capsulatum en Sabouraud-glucosa cultivadas a 28°C. > Colonias de Histoplasma capsulatum en Sabouraud-glucosa cultivadas a 37°C. > Preparados directos de las colonias del hongo a 28° y 37°C. > Coloraciones con la técnica de Giemsa y May Grunwald Giemsa de materiales obtenidos de pacientes. > Caja de trabajo > Microscopio Actividades > Observar y describir la forma parasitaria a partir de materiales clínicos. > Observar y describir la macromorfología de este hongo a 28° y 37°C. > Observar y describir la micromorfología en los preparados directos de las colonias a 28° y 37°C. > Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas

13 TRABAJO PRACTICO N° 9 TEMA: SENSIBILIDAD A ANTIFÚNGICOS Objetivos: > Conocer las distintas metodologías utilizadas para la determinación de sensibilidad antifúngica para hongos filamentosos y levaduriformes. > Utilizar le método de Difusión en Disco para la determinación de actividad antifúngica de levaduras del género Candida. > Interpretar los resultados de las distintas metodologías y evaluar su importancia en el tratamiento del paciente. Materiales: > Caja de trabajo. > Microscopio. > Cultivos de cepas de Candida > Placas de Petri con Agar Mueller Hinton modificado. > Discos conteniendo Anfifúngicos comerciales > Escala de Mac Farland Actividades: > Aplicar la técnica de Difusión en Disco para levaduras del género Candida. > Interpretar los resultados obtenidos de determinaciones realizadas por el método de Difusión en Disco, de Microdilución en Caldo y E-test. > Evaluar ventajas y desventajas de las distintas metodologías.

14 TRABAJO PRACTICO Nº 10 TEMA: PARACOCCIDIOIDOMICOSIS Objetivos: > Reconocer la macro y micromorfología de Paracoccidioides brasiliensis. > Reconocer las formas parasitarias de Paracoccidioides brasiliensis. Materiales: > Caja de trabajo > Microscopios > Colonias de P. brasiliensis en Sabouraud glucosa cultivadas a 28°C y en SABHI (Sabouraud glucosa:agar cerebro corazón) cultivadas a 37°C. > Preparados directos de las colonias de P. brasiliensis a 28 y 37°C . > Corte histológico teñido con Gomori-Groccott de testículo de cobayo infectado con P. brasiliensis. > Preparados de lesiones clínicas de pacientes teñidos con la técnica de May GrunwaldGiemsa y Gomori-Groccott. Actividades: > Observar y describir la macromorfología de P. brasiliensis a 28 y 37°C.. > Observar y describir la micromorfología en los preparados directos de las colonias correspondientes. > Observar y describir las formas parasitarias de este hongo. > Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas .

15 TRABAJO PRACTICO N° 11 TEMA: COCCIDIOIDOMICOSIS Objetivos El alumno deberá: > Reconocer la macro y micromorfología de colonias de Coccidioides sp. en medio de Sabouraud-glucosa. > Reconocer las formas parasitarias de Coccidioides sp. Materiales > Colonias en Sabouraud-glucosa de Coccidioides sp. > Cultivos de adhesión de Coccidioides sp. > Preparados de esférulas de Coccidioides sp en de cortes histológicos realizados con material de testículo de cobayo con PAS, y de biopsia con giemsa. > Preparados con KOH de Coccidioides sp de biopsia > Caja de trabajo > Microscopio Actividades > Observar y describir la macromorfología del desarrollo de Coccidioides sp. En Sabouraud-glucosa a 28°C. > Observar y describir la micromorfología del desarrollo de Coccidioides sp. En Sabouraud-glucosa a 28°C. >

Observar y describir las formas parasitarias de Coccidioides spp en cortes de tejido en fresco y con coloraciones permanentes..

> En una ficha de anamnesis, señalar las posibles causas predisponentes, los materiales a extraer y qué resultados se esperan obtener en caso de una posible Coccidiodomicosis. > Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas

16 TRABAJO PRÁCTICO N° 12 TEMA: ASPERGILOSIS Objetivos El alumno deberá: > Reconocer la presencia de filamentos en materiales biológicos por exámenes directos o coloración. > Conocer la macro y micromorfología de los agentes productores de Aspergilosis. > Interpretar los resultados del laboratorio para los distintos materiales clínicos y relacionarlos con las posibles causas predisponentes en una ficha de anamnesis. > Analizar la importancia de los estudios serológicos en pacientes inmunocompetentes e inmunocomprometidos. > Identificar taxonómicamente las especies frecuentemente involucradas en las diferentes patologías en el hombre. Materiales > Caja de trabajo. > Extendidos de materiales profundos teñidos con GN, MGG y ZN. > Cultivos en Czapek y APD de Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger y A. terreus. > Preparados de cultivos de adhesión de Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger y A. terreus > Microscopios. Actividades; > Observar y describir los extendidos de materiales profundos teñidos con GN, MGG y ZN y Groccot. > Observar y describir la macromorfología de las colonias de las especies de Aspergillus. > Observar y describir la micromorfología de las colonias de Aspergillus. > Discutir resultados de pruebas micoserológicas. >

En una ficha de anamnesis, señalar las posibles causas predisponentes, los materiales a extraer y qué resultados se esperan obtener en caso de una posible Aspergillosís. Señalar la importancia del diagnóstico serológico.

> Identificar taxonómicamente una cepa del género Aspergillus aislada de material clínico. > Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas

17 TRABAJO PRACTICO N° 13 TEMA: INMUNODIAGNOSTICO Objetivos El alumno deberá: > Conocer los métodos de preparación de los antígenos usados en reacciones serológicas para el estudio de las micosis > Aprender a realizar la técnica de inmunodifusión de Outcherlony > Conocer la técnica inmunológica de aglutinación de partículas de látex para el diagnóstico de Criptococosis > Interpretar los resultados obtenidos en el estudio del estado inmunológico de pacientes afectados con las micosis sistémicas. Materiales > Portaobjetos con capa delgada de agar precipitinas. Tubos con agar precipitinas > Antígenos y antisueros fúngicos. Sueros de pacientes. > Plantilla y sacabocado, Agua destilada, cajas de petri. > Caja de trabajo. > Kit comercial de aglutinación de partículas de látex para diagnóstico de Criptococosis Actividades > Armado de los portaobjetos con la placa delgada de agar precipitinas. > Preparación de agar precipitinas y realizar con la plantilla las perforaciones correspondientes. > Observar e interpretar resultados de reacciones inmunológicas practicadas según técnica de Inmunodifusión de Outcherlony. > Conocer y desarrollar técnicas auxiliares de diagnóstico: “producción de exoantígenos.

Técnica: INMUNODIFUSION DE OUTCHERLONY

Preparación de los portaobjetos: Se diluye 1 ml de agar para inmunodifusión en 7 ml de agua destilada y se coloca en baño de agua a 70 ºC; se cubre los portaobjetos perfectamente limpios y desengrasados con alcohol; con una película de esta preparación, se desparrama con el dedo para que quede rugoso y se deja secar en la estufa de 37 ºC hasta que se forme una capa seca y opaca. Luego se agregan entre 2.5 y 2.8 ml de agar para inmunodifusión sin diluir por portaobjetos. Una vez solidificados se los colocan en cámara húmeda y se conservan en heladera hasta el momento de su uso. Pueden guardarse hasta una semana en estas condiciones.

18 Realización de la prueba: Con un sacabocados de 4 mm, se cortan el agar de acuerdo con un esquema de 6 hoyos periféricos y uno central. Previo El cortador se usa en posición vertical.

Los cilindros de agar se retiran con aguja o espátula. En el orificio central se coloca el antígeno correspondiente y en los periféricos los sueros problema y un suero control positivo. Todas las cavidades se llenan hasta el borde La incubación se hace a temperatura ambiente durante 72 horas, pero es conveniente observar diariamente la reacción. Finalizada la incubación, los portaobjetos se cubren con una solución de citrato de sodio pH 8.2 durante 2 horas con el objeto de hacer desaparecer los halos formados por los sueros que dificultan la observación de las bandas de precipitación y para eliminar las bandas producidas por una proteína llamada sustancia C. Luego de ese lapso se vuelca el tampón y se procede a ver la existencia de bandas de precipitación que indican presencia de anticuerpos precipitantes en el suero estudiado. Es necesario colocar una fuente de iluminación debajo de la placa para la mejor visualización de los resultados. En casos de pruebas positivas se debe realizar una titulación, efectuando diluciones seriadas al doble y repitiendo la prueba. Siempre se debe realizar una coloración final, sobre todo en casos de pruebas negativas (para confirmarlas), y en casos de titulaciones; se observa que bandas muy débiles se observan luego de esta maniobra.

19 TRABAJO PRACTICO N°14 TEMA: ZIGOMICOSIS Objetivos; > Reconocer en cortes histológicos de materiales clínicos la morfología de los hongos causantes de Zigomicosis. > Reconocer la macromorfología de cepas de Rhizopus, Mucor, Absidia y Cunninghamella. > Reconocer la micromorfología diferencial de los cultivos de Rhizopus, Mucor, Absidia y Cunninghamella. Materiales: > Caja de trabajo. > Microscopio. > Cultivos de cepas de Rhizopus, Mucor, Absidia y Cunninghamella. > Placas de Petri con Agar Sabouraud-glucosa. > Placas de Petri estériles. > Soportes en V. > Agua destilada estéril. > Vaspar. > Cortes histológicos de tejidos de pacientes con Zigomicosis teñidos por las técnicas de Hematoxilina-Eosina y Groccott.


Lupa estereoscópica.

Actividades; > Observar y describir la macromorfología de las colonias de Rhizopus, Mucor, Absidia y Cunninghamella. > Observar las colonias con Lupa estereoscópica. > Aplicar técnica de microcultivo y observar la micromorfología de las cepas estudiadas. > Establecer similitudes y diferencias entre las características morfológicas de las cepas de Rhizopus, Mucor, Absidia y Cunninghamella. > Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas

20 TRABAJO PRÁCTICO N° 15 TEMA: ESPOROTRICOSIS Objetivos: > Reconocer microscópicamente las formas parasitarias de Sporothrix schenkii. > Reconocer macro y micromorfológicamente las colonias de Sporothrix schenkii. > Relacionar las caracteísticas morfológicas observadas con el dimorfismo de Sporothrix schenkii > Relacionar el cuadro clínico de la enfermedad con los factores predisponentes y vías de infección del hongo. Materiales: > Caja de trabajo. > Microscopio. > Cortes histológicos de cola y pata de rata teñidos por las técnicas de PAS y Groccott. > Cultivos de Sporothrix schenkii en Sabouraud-glucosa a 28 °C. > Preparados obtenidos por la técnica de cultivo de adhesión a 28 °C en Sabouraud-glucosa y Agar-harina de maíz. Actividades: > Observar la forma parasitaria de Sporothrix schenkii en cortes histológicos y coloraciones. > Observar y describir macro y micromorfológicamente las colonias de Sporothrix schenkii. > Observar cola de rata inoculados en forma experimental. > Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas

21 TRABAJO PRACTICO N° 16 TEMA: MICETOMA. Objetivos: El alumno deberá: > Reconocer las formas parasitarias de actinomicetales y eumicetes productores de micetomas. > Aplicar los conocimientos de los pasos del análisis micológico a un examen correcto de un presunto micetoma. > Reconocer la macromorfología y micromorfología de Madurella mycetomatis, M.grisea, Pseudoalescheria boydii (Scedosporium apiospermum) > Usar e interpretar guías que permiten diferenciar a los agentes productores de micetomas eumicóticos. Materiales; > Caja de trabajo. > Microscopios. > Colonias desarrolladas en Sabouraud glucosa, Agar harina de maíz y Agar papa dextrosa de las cepas mencionadas. > Preparados de cultivo de adhesión de M. mycetomatis, M. grisae y Pseudoalescheria boydii (Scedosporium apiospermum). > Frotis y cortes histológicos con elementos parasitarios actinomicetales y eumicetes productores de micetomas. > Gránulos de muestras de micetomas. Actividades; > Observar y describir macroscópicamente las colonias de las cepas mencionadas. > Diferenciar las formas parasitarias de actinomicetales y eumicetes productores de micetomas. >

Observar microscópicamente los preparados provenientes de cultivos de adhesión de M. mycetomatis, M. grisea y Pseudoalescheria boydii (S. apiospermum).

> Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas

22 TRABAJO PRACTICO N° 17: TEMA: NEUMOCISTOSIS Objetivos El alumno deberá: > Realizar una observación / mostración de coloraciones de materiales respiratorios, (BAL, esputo), provenientes de pacientes con esta micosis, para adquirir conocimiento sobre las formas parasitarias de la misma. Materiales > Extendidos de materiales profundos teñidos con Azul de toluidina. > Microscopios. Actividades; > Observación microscópica con aumento 100 x

Técnica: Búsqueda de Pneumocystis en Materiales Biologicos Técnica de Tinción Azul de Toluidina Preparación de reactivos Reactivo de Sulfatación • Acido Acético Glacial 45 ml • Acido Sulfúrico 15 ml Reactivo Azul de Toluidina • Azul de Toluidina 0.16 gr. • Agua Destilada 60 ml • Acido Clorhidrico 2 ml Alcohol Etílico Absoluto 140 ml Preparación de la muestra a procesar: • Lavado broncoalveolar: centrifugar a 2.500 rpm 5 min. Y realizar con el sedimento al menos tres frotis • Esputo ó secreción bronquial: Agregar perlas de vidrio y dos o tres gotas de hidróxido de sodio al 10 %. Realizar al menos 6 frotis. Técnica de coloración 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Reactivo de Sulfatación 10 minutos Agua corriente bajo la canilla (lado opuesto al preparado) 1 minuto Reactivo azul de toluidina 5 minutos o 10 minutos o mas según la antiguedad del reactivo Alcohol etilico al 95 % 10 segundos Alcohol etílico puro 10 segundos Alcohol etílico puro 10 segundos Xilol (no es indispensable) 10 segundos

23 TRABAJO PRÁCTICO N° 18 TEMA: HIALOHIFOMICOSIS Objetivos El alumno deberá: > Reconocer la presencia de filamentos en materiales biológicos por exámenes directos o coloración. > Conocer la macro y micromorfología de los agentes productores de Hialohifomicosis: Penicillium sp, Fusarium sp, Scopulariopsis sp. y Acremonium sp. > Interpretar el valor de los resultados del laboratorio en los distintos materiales clínicos y relacionarlos con las posibles causas predisponentes en una ficha de anamnesis. > Identificar taxonómicamente las especies frecuentemente involucradas en las diferentes patologías en el hombre. Materiales > Caja de trabajo: ansa, espátula, gancho, hilo, portaobjetos, cubreobjetos, papel de filtro, gasa, colorante Gueguén, líquido de montar, KOH 20% P/V, pinza. > Extendidos de materiales profundos teñidos con GN, MGG y ZN. > Cultivos en Czapeck, APD, MEA y SNA de Penicillium sp., Fusarium sp., Scopulariopsis sp. y Acremonium sp. > Preparados de cultivos de adhesión de Penicillium sp., Fusarium sp., Scopulariopsis sp. y Acremonium sp. > Microscopios. Actividades; > Observar y describir los extendidos de materiales profundos. > Observar y describir la macromorfologia de las colonias de las especies de Penicillium sp., Fusarium sp., Scopulariopsis sp. y Acremonium sp. > Observar y describir la micromorfología de las colonias de Penicillium sp., Fusarium sp. Scopulariopsis sp. y Acremonium sp. > En una ficha de anamnesis, señalar las posibles causas predisponentes, los materiales a extraer y qué resultados se esperan obtener en caso de una posible Hialohifomicosis. > Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas

24 TRABAJO PRÁCTICO N°19 TEMA: CROMOBLASTOMICOSIS Objetivos: > Reconocer en cortes histológicos de materiales clínicos la forma parasitaria de los agentes de Cromoblastomicosis. > Reconocer la macromorfología de estos hongos dematiáceos. > Reconocer microscópicamente los distintos tipos de reproducción de estos hongos: Cladosporium, Phialophora y Rhinocladiella. Materiales: > Caja de trabajo. > Microscopio. > Cultivos de cepas de Phialophora verrucosa, Fonsecaea pedrosoi, Rhinocladiella aquaspersa, Cladophialophora carionii. > Cortes histológicos de pata de ratón inoculado, teñidos por las técnicas de Groccott. > Preparados obtenidos por la técnica de cultivo de adhesión de Phialophora verrucosa, Fonsecaea pedrosoi, Rhinocladiella aquaspersa, Cladophialophora carionii. Actividades; > Observar la forma parasitaria de los agentes de Cromoblastomicosis. > Observar y describir la macromorfología y la micromorfología de estas especies. > Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas

25 TRABAJO PRÁCTICO N° 19 TEMA: FEOHIFOMICOSIS Objetivos: > Reconocer en cortes histológicos de materiales clínicos la forma parasitaria de los agentes de Feohifomicosis. > Reconocer la macromorfología de estos hongos dematiáceos. > Reconocer microscópicamente los distintos tipos de reproducción de estos hongos: anelides, fíalides, etc. Materiales: > Caja de trabajo. > Microscopios. > Cultivos de cepas de Curvularia Iunata, Alternaría sp., Wangiella dermatitidis. > Cortes histológicos de pata de ratón, teñidos por las técnicas de Gomori-Groccott. > Preparados obtenidos por la técnica de cultivo de adhesión de Curvularia Iunata, Alternaría sp., Wangiella dermatitidis . Actividades: > Observar la forma parasitaria de los agentes de Feohifomicosis. > Observar y describir la macromorfología de estas especies. > Observar y describir la micromorfología de estas especies obtenidas por cultivo de adhesión. > Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas