Instituto de Investigaciones Biotecnológicas Universidad Nacional de General San Martín

MICROBIOLOGIA GENERAL Guia de Trabajos Prácticos Segundo cuatrimestre de 2009

Profesor a cargo: Dra. Nora Iñón de Iannino Jefe de Trabajos Prácticos: Dr. Rodrigo Sieira Ayudantes: Dra. Mara Roset Dr. Andrés Ciocchini Dra. Inés Marchesini Lic. Juan Manuel Spera Lic. Florencia Iannino Lic. Lucas Bukata Lic. Soledad Guidolín Lic. Mariela Del Giudice Lic. Claudia Hermann Colaboradores: Bqca. Berta Cazzulo Liliana Sferco Agustina Chidichino

2 OBJETIVOS GENERALES 1) Manipulación general en el laboratorio de microbiología. 2) Introducción al mundo microbiológico: nomenclatura, diferenciación, observación. 3) Conocimiento fundamentado de los requerimientos de los microorganismos y de las consecuencias de su desarrollo en el medio. 4) Introducción a la metodología científica: planteamiento de objetivos, desarrollo experimental, elaboración de conclusiones, búsqueda bibliográfica, escritura de informes.

CONDICIONES DE REGULARIDAD DE LA MATERIA 1) Aprobación de los dos parciales teórico/prácticos con nota mayor o igual a cinco. Se podrá recuperar sólo uno. 2) Aprobación de los trabajos prácticos, la cual estará dada por: a) 80% de asistencia b) 80% de parcialitos aprobados. Los parcialitos se tomarán al comienzo de cada trabajo práctico y se evaluarán con las siguientes notas: D (desaprobado), R (regular), B (bien) y MB (muy bien). Aclaración: la acumulación de dos notas R equivalen a un parcialito desabprobado. Importante: Se permitirá desaprobar sólo 2 parcialitos, siendo obligatoria la recuperación de uno de los dos (quedará a criterio de los profesores cuál será el parcialito a recuperar). c) Aprobación de los informes de TP que se deberán entregar al finalizar cada trabajo práctico. d) Aprobación de monografías.

APROBACION DE LA MATERIA DEL ALUMNO REGULAR 1) En forma promocional: con nota mayor o igual a siete en los dos parciales teórico/practicos y nota mayor o igual a siete en los trabajos prácticos (esta nota estará dada por la evaluación de los parcialitos, informes, monografías y nota de concepto general). 2) Con examen final: nota mayor o igual a cinco.

NORMAS DE SEGURIDAD Uno de los aspectos básicos del trabajo en el laboratorio de microbiología es saber mantener normas de seguridad mínimas para evitar infecciones con los microorganismos con los que se trabaja. En el curso propiamente dicho algunos microorganismos utilizados pueden ser potencialmente patógenos, así mismo se realizarán aislamientos de fuentes naturales pudiendo aparecer algún posible patógeno por lo que se pide seguir las siguientes reglas: 1) No se puede comer, beber, fumar ni maquillarse en el laboratorio, ni llevarse a la boca ningún elemento que haya sido utilizado en el laboratorio (biromes, marcadores, dedos, etc.) 2) Es obligatorio asistir al laboratorio con guardapolvo, preferentemente de mangas largas y con puño. Las personas de pelo largo deben concurrir con el mismo atado y/o recogido. 3) Si un cultivo es volcado, informar inmediatamente al docente con el que se procederá a limpiar la zona con una solución bactericida. 3) El material contaminado (tips, pipetas, tubos), se descartará en envases provistos a tal efecto. 4) No volcar los cultivos en las piletas.

3 5) Una vez finalizada la clase lavarse las manos escrupulosamente con agua y jabón y con algún desinfectante (proceder del mismo modo durante la clase si accidentalmente se toca algún cultivo). …………………….

BIBLIOGRAFIA Libros de texto recomendados: -Microbiology. Prescott-Harley-Klein. Ed. Mc Graw-Hill. -Microbiología. Brock-Madigan. Ed. Prentice-Hall Textos de microbiología disponibles en internet: -Todar´s

online

textbook

of

bacteriology

http://www.textbookofbacteriology.net -Bacerial/prokaryotic phylogeny: http://www.bacterialphylogeny.com/index.html

(University

of

Wisconsin-Madison):

4

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Trabajos prácticos y seminarios Horario: miércoles y viernes de 14 a 17 hs. Comienzo de trabajos prácticos: 21/8/09 Fecha límite de entrega de monografías: 18/11/09

T.P. Nº

tema

fecha

1

Normas de seguridad. Metodología general de trabajo. Técnicas de cultivo. Esterilidad

Vie 21/8

-Introducción. -Teórica TP 1.

mie 26/8

vie 28/8

8

2

Diversidad microbiana. Interacciones entre microorganismos que coexisten en un mismo hábitat.

Características macro y microscópicas de cultivos bacterianos. Tinciones. Microscopía.

-Problemas TP 1.

14 hs

Armado de columnas de Winogradsky.

mie 2/9 15:30 hs

Vie 4/9

mie 9/9

vie 11/9

3

-Placas de cultivo. -Diluciones seriadas. -Plaqueo de soluciones.

Crecimiento bacteriano. Curva de crecimiento. Recuento de viables

Entrega de temas de monografías

-Teórica TP 2.

-Preparación de frotis -Tinciones. -Observación con microscopio. -Problemas TP 2. -Teórica TP 3.

mie 16/9 -Curva de crecimiento con glucosa.

5

. -Análisis de resultados y problemas del TP 3. Vie 18/9 4

Aislamiento de bacterias. Medios de enriquecimiento, selectivos y difierenciales. Diversidad metabólica

-Teórica TP 4.

mie 23/9

5

Metabolismo bacteriano. Pruebas bioquímicas y determinación de géneros. Resistencia a antibióticos.

vie 25/9

-Pasar a medio selectivo.

mie 30/9

-Análisis de resultados y problemas del TP N° 4.

vie 2/10

----------------------

mie 7/10

-Consultas pre-parcial

vie 9/10

----------------------

mie 14/10

PARCIAL TEORICO/PRACTICO

vie 16/10

-Teórica TP N° 5.

mie 21/10

vie 23/10

6

Protozoos. Metodología general de trabajo. Cultivo. Microscopía

7

Genética bacteriana. Transformación. Mutación. Transposición y complementación funcional.

-Largar cultivos en medios de enriquecimiento

mie 28/10

vie 30/10

-IMViC y Kligler. -Catalasa/Oxidasa. -Antibióticos. -Motilidad. -Análisis de resultados y problemas del TP N° 5

-TP N° 6

-Teórica TP N° 7 -Conjugación Agrobacterium pgm. -Conjugación Agrobacterium wt

6

mie 4/11

vie 6/11

8

-Estría pgm. -Dilución y plaqueo wt.

-Discusión de resultados y problemas TP 7.

mie 11/11

-------------------------------

vie 13/11

Entrega de monografías

mie 18/11

PRESENTACIÓN DE MONOGRAFÍAS

vie 20/11

-Columna de Winogradsky. Observación de resultados

mie 25/11

-------------------------------

vie 27/11

SEGUNDO PARCIAL TEORICO/PRACTICO

7 TP Nº 1 METODOLOGÍA GENERAL DE TRABAJO Objetivo 1: Aprendizaje de la técnicas básicas que se utilizan para el cultivo de microorganismos. a) Preparación de medios de cultivo. Uso de balanzas, mediciónde pH. b) Técnicas de esterilización. c) Trabajo en condiciones de asepsia. Preparación de placas dePetri, tubos con medio de cultivo sólido y líquido. d) Técnicas de siembra en cultivo líquido y en cultivo sólido:estriamiento, punción, rastrillado, volcado. Objetivo 2: Detección de contaminantes, presencia de microorganismos en el medio ambiente. a) Observación de la presencia de microorganismos en nuestroambiente. b) Control de trabajo en condiciones de asepsia c) Control de asepsia. Desarrollo: 1) Para realizar trabajos en condiciones de asepsia se deberá limpiar el area de trabajo (mesada) con la sustancia desinfectante provista por el docente, acto seguido se deberá encender el mechero bunsen. 2) Se prepararán placas de Petri con agar nutritivo fundido y mantenido a 45-50ºC. Volcar el medio en condiciones de asepsia (20-30 ml/placa) y esperar a que solidifique. Luego secar las placas invertidas en estufa a 42ºC.

3) Se prepararán tubos de ensayo con agar nutritivo fundido por volcación (10 ml/tubo). Se taparán con la torunda de algodón, se dejaran enfriar y se secarán en estufa a 42ºC.

4) Se harán diluciones seriadas de agua previamente autoclavada: 1/10, 1/100, 1/1000, y se sembrarán 0,1ml de cada dilución en distintas placas de Petri por la técnica del rastrillado.

5) Con un hisopo se tomarán muestras de distintos lugares: mesada, mano, etc. y se aplicará sobre una placa de medio nutritivo sólido.

f) Se comparará el crecimiento que resulta de apoyar en un medio de cultivo sólido la yema del dedo antes y después de un lavado con etanol 70%. Las placas y tubos sembrados se cultivarán 24-48 h a 37ºC. Se deberán observar las colonias desarrolladas teniendo en cuenta las siguientes características macroscópicas:

8 FORMA TAMAÑO COLOR BORDE ELEVACION SUPERFICIE

CUESTIONARIO T.P. 1 1) Defina los siguientes términos: Desinfección, Desinfectante, Antisepsia, Germicida, Bactericida, Bacteriostático, Bacteriolítico. 2) Discuta la siguiente afirmación: La muerte de una población bacteriana, del mismo modo que el crecimiento de la misma, es por lo general exponencial o logarítmica, es decir, la población se reduce en una fracción constante a un intervalo de tiempo constante. Este proceso se representa en el siguiente gráfico:

Min. de tratamiento

9 Por lo tanto, dado que la destrucción de la población es logarítmica, es teóricamente imposible eliminar a todos los microoganismos de una población por más que se incremente la extensión de tiempo usada en el tratamiento. 3) Describa cómo funciona un autoclave. ¿Qué condiciones se deben cumplir para esterilizar por calor húmedo? ¿Cuáles son las tres cosas que uno debe hacer al operar un autoclave para que el proceso sea seguro? 4) ¿Qué métodos usaría para esterilizar: pipetas de vidrio y placas de petri, agar nutritivo, soluciones de antibióticos, paquetes de placas de petri plásticas, solución de glucosa 2M, solución de glucosa 0,2M, interior de una cabina de flujo laminar, aceite mineral, material quirúrgico? 5) ¿Qué características de un material o sustancia deben tenerse en cuenta para la elección de un método de esterilización? 6) ¿Por qué se requiere mayor tiempo de esterilización en horno que en autoclave? ¿Cuál es el agente esterilizante en cada caso? 7) ¿Cómo decontaminaría un erlenmeyer de vidrio donde fue crecido un cultivo de Bacillus subtilis y uno utilizado para crecer Escherichia coli? 7) Un tubo que contiene medio M9 + 0,5 % de glucosa fue autoclavado y posteriormente incubado a 37°C durante 72 horas. Al cabo de dicho tiempo se detectó crecimiento de microorganismos. a) ¿Qué parámetros debería controlar para que el proceso de esterilización se lleve a cabo de manera adecuada? b) Una vez solucionado el inconveniente, ¿Cómo determinaría si dicho caldo nutritivo está efectivamente estéril? 8) ¿Cómo realizaría un control de esterilización y un control de esterilidad?

10

TP Nº 2 CARACTERÍSTICAS MACRO Y MICROSCÓPICAS DEL DESARROLLO BACTERIANO.

Objetivo: entrenamiento en la preparación de extendidos y en distintas técnicas de coloración. Observación de distintas morfologias y agrupamientos bacterianos.

1. Coloración de Gram. Gram halló una técnica basada principalmente en la coloración de las células con cristal violeta. Mediante esta técnica, aquellas células capaces de mantener el colorante violeta luego de un proceso de decoloración son consideradas Gram+ y las que no lo retienen y por lo tanto pueden ser coloreadas por un segundo colorante de contraste, son Gram-. Dado que se trata de células su visualización es por microscopía. Desarrollo: A) FIJACION Se tomará una ansada de cada colonia a analizar crecida en agar nutritivo y se la resuspenderá en una gota de agua colocada sobre un portaobjeto limpio, desengrasado y previamente rotulado. Se dejarán secar al aire estos materiales junto a la llama del mechero y posteriormente se los fijará por calor, pasando el preparado por encima de la llama SIN QUEMARLOS. B) TINCION: 1-Cubrir el portaobjeto con la solución de Cristal Violeta y dejar en contacto 1 minuto. 2-Volcar el colorante y lavar con agua corriente. 3-Cubrir con la solución de Lugol (1 minuto). 4-Lavar con agua corriente. 5-Decolorar por arrastre con la solución decolorante(alcohol/acetona). (5 segundos). 6- Lavar con agua para parar la acción del decolorante. 7-Contrastar con la solución de Safranina por 1 minuto. 8-Lavar suavemente con agua corriente y dejar escurrir el porta en posición vertical. 9-Una vez seco el material teñido, se lo examinará usando aceite de inmersión bajo el microscopio óptico con el aumento de 100x. Se deberán reconocer las características morfológicas y tintoriales de las distintas bacterias provistas. Se deberá informar el agrupamiento, forma, coloración según la siguiente guia: FORMA: cocos (esféricas), bacilos (bastones, cilindros), cocobacilos (bastones cortos, ovoidales), vibrios (bacilo en forma de coma), espirilos (bacilos en forma de tirabuzón). AGRUPAMIENTO: aislado (individual), diplos, tetradas, cadenas, racimos, empalizadas

11 2. Coloración de esporas. Técnica Schaeffer-Fulton. Esta técnica permite distinguir las esporas del cuerpo vegetativo del microorganismo y determinar su localización y forma. Desarrollo: 1) Preparar el extendido del microorganismo y fijar por calor. 2) Cubrir todo el porta con solución de verde de Malaquita al 5% en agua. 3) Calentar a la llama hasta que emita vapores y seguir el calentamiento durante 3 minutos SIN PERMITIR QUE SE SEQUE EL COLORANTE. Si esto ocurriera agregar mas sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente. 4) Lavar con agua y cubrir con solución de SAFRANINA, dejar actuar 30 segundos. Lavar con agua , secar y observar al objetivo de inmersión 6) INFORMAR: morfologia, color y tipo de espora.

CUESTIONARIO T.P. 2 1) Describa en detalle la composición y estructura del peptidoglicano, pared Gram (+) y pared Gram (-). 2) En la coloración de Gram: ¿Cuál es el colorante de Gram y cuál el de contraste? ¿Qué es el mordiente? 3) Usted debe realizar coloración de gram para una serie de especímenes. Comienza a realizar la coloración y en el último paso se da cuenta de que le falta la solución de safranina. Decide de todos modos no perder mas tiempo y observa los preparados al microscopio. ¿Puede dar con certeza un informe distinguiendo cuáles especímenes son Gram (-) y cuáles Gram (+)? 4) ¿Qué clase de imágenes proveen y con qué propósitos suelen ser usados los microscópios de campo claro, de campo oscuro, de contraste de fase, de epifluorescencia, electrónicos de transmisión, electrónicos de barrido, y de fuerza atómica (AFM)? 5) ¿Por qué en la tinción de endosporas por el método de Schaeffer-Fulton el colorante verde de malaquita no se pierde en el paso de lavado? 6) ¿Podría utilizar un colorante básico como primer colorante en la tinción de esporas? 7) ¿Por qué no se tiñen las células alcohol -ácido resistentes por la coloración de Gram? 8) ¿Qué características debe tener un colorante para ser empleado en una tinción negativa? 9) Las tinciones de Gram, esporas y Ziehl Neelsen permiten determinar diferencias estructurales en células de distintos géneros. ¿Cuáles son esas diferencias y cuál es el paso de cada coloración que las pone en evidencia? ¿Qué tipos de colorantes se utilizan en cada caso?

12 10) Bacillus subtilis presenta color violeta al microscopio óptico luego de una tinción de Gram y color rosado al efectuarse una coloración de esporas. ¿Por qué motivo el cristal violeta en el primer caso y la safranina en el segundo tiñen la bacteria de esa manera? 11) Indique cuál o cuáles de las tinciones realizadas en los trabajos prácticos ponen en evidencia diferencias estructurales de la pared bacteriana. Explique brevemente. 12) Diga si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas y justifique su respuesta. a) En una tinción negativa los colorantes utilizados tienen afinidad sólo por la pared bacteriana. b) En la tinción de esporas el verde de malaquita no tiñe el citoplasma celular porque es removido por los solventes orgánicos que se utilizan en el paso de decoloración. c) Las células Gram negativas no se tiñen con cristal violeta porque el mordiente no puede atravesar la pared de peptidoglicano. d) En la coloración de ácido resistencia lo que permite que la fucsina atraviese la pared bacteriana es el calentamiento.

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TP Nº 3 CURVA DE CRECIMIENTO Y RECUENTO DE VIABLES

Crecimiento Bacteriano Como todos los seres vivos las bacterias crecen, se multiplican y mueren, pero además tienen la ventaja de conservar su viabilidad por largos períodos de tiempo, y luego reiniciar su ciclo celular cuando las condiciones del medio se revierten favorablemente. Independientemente del lugar donde se encuentre, una sola célula bacteriana dará lugar a una población a través de un crecimiento rápido; sin embargo, este proceso está autolimitado dado que una de las consecuencias es la alteración misma del entorno. Del análisis de los resultados experimentales obtenidos a partir de cultivos líquidos bacterianos, se pudo obtener la gráfica del ciclo de vida. Este consta básicamente de cuatro etapas o fases a saber: latencia o fase lag, crecimiento logarítmico (también llamado exponencial), fase estacionaria y de muerte. Se pretende que los alumnos puedan identificar y analizar el crecimiento bacteriano utilizando varias técnicas de uso frecuente en el laboratorio microbiológico.

Objetivos: 1) Analizar el crecimiento bacteriano teniendo en cuenta la densidad óptica y el recuento de colonias del cultivo a distintos tiempos de incubación. 2) Graficar los datos experimentales a fin de obtener la curva de crecimiento para cada cultivo.

Desarrollo: Se trabajará a partir de cultivos de Escherichia coli desarrollados a 37ºC en medio TB con agitación . 1) Separar en forma aséptica cada 30 minutos una alícuota de 2 ml del cultivo en estudio. (Luego de tomar la muestra retornar inmediatamente el erlenmeyer a las condiciones de incubación). 2) Leer la turbidez que presentan las muestras (o sus diluciones) a una longitud de onda de 600 nm utilizando un espectrofotómetro. Calcular la DO/ml de cultivo. 3) Hacer diluciones seriadas y sembrar de cada una 0,1 ml en una placa de Petri con medio LB. Incubar a 37ºC una noche y luego hacer un recuento de colonias y calcular el número de unidades formadoras de colonia (UFC)/ml de cultivo. Elegir la placa en donde el número de colonias este entre 50 y 200. La curva de crecimiento bacteriano para cada cultivo se hará sobre papel semilogarítmico. Se graficarán las UFC/ml en función del tiempo y los datos de absorbancias para cada tiempo.

14 CUESTIONARIO T.P. 3 1) Calcule la tasa de crecimiento medio (k) y el tiempo de generación medio (g) de un cultivo que se incrementa desde 5 x 102 hasta 1 x 109 células en 10 hs. 2) Si el tiempo de generación media para un cultivo es de 180 min. y se inicia el cultivo con 3 x 103 células, cuantas bacterias habrá después de 24 hs de cultivo en fase exponencial? Cuántas generaciones habrán transcurrido? 3) Discuta la siguiente afirmación: ”en una colonia todas las células crecen a la misma velocidad”. 4) Usted necesita obtener un cultivo con 5 x 109 células totales. Como conoce la tasa de crecimiento medio y el tiempo de generación, realiza sus cálculos y se da cuenta de que requiere 12 horas de cultivo para llegar a dicha masa partiendo de un stock con 103 células/ml. Descongela el stock con la semilla estandarizada e inocula el cultivo, se va a su casa a descansar y a las 12 horas regresa al laboratorio. Retira el cultivo de la incubadora y estima el número de células en 2 x 107.¿Qué es lo que ha ocurrido? 5) Se dispone de 6 ml de un cultivo bacteriano con 8,4 x 108 UFC/ml. ¿Qué diluciones debería realizar para contar aproximadamente 40 colonias por placa, si se siembra 0,1 ml de dicha dilución? 6) Partiendo de un cultivo bacteriano que tiene 4 x 108 UFC/ml : ¿Cómo procedería para obtener 80 colonias en una placa de agar nutritivo? Indique los volúmenes a utilizar. 7) ¿Qué dilución debería realizar para obtener 2 ml de una suspensión de bacterias que contenga 2 x 105 UFC totales, si parte de un cultivo que contiene 2 x 109 UFC/ml? 8) Un cultivo bacteriano de 10 ml tiene un recuento de 250 UFC cuando se plaquea 0,1 ml de la dilución 10-4. Si 2 ml de ese cultivo se inoculan en 100 ml de medio fresco para realizar una curva de crecimiento: ¿Cuál es la concentración bacteriana inicial? ¿Qué diluciones realizaría del mismo para contar 100 colonias si sembrara 0,1 ml? 9) Un fabricante de yogurt afirma que sus productos contienen 4 x 106 bacterias lácticas viables /ml. ¿Qué método de recuento utilizaría para corroborar ese número? Describa el protocolo, condiciones y materiales que utilizaría para realizar dicha determinación. 10) Enumere las ventajas y desventajas de los siguientes métodos de recuento de bacterias: i) turbidez, ii) recuento en placa, iii) conteo directo al microscopio. 11). Para un cultivo exponencial de Escherichia coli se realiza una curva de calibración de recuento en placa vs. turbidez (D.O. leída a 600 nm). A partir de la misma se establece una relación UFC./ml por unidad de D.O. de 4 x 107 . a) ¿Qué ventajas tiene realizar una curva de calibración de recuento vs. turbidez? b) ¿Qué diluciones debería realizar para contar 100 colonias en una placa de agar nutritivo sembrada con 0,1 ml de un nuevo cultivo de E. coli con una D.O. de 0.5. 12) Un investigador dispone de una curva de calibración de DO vs UFC/ml para E. coli en caldo nutritivo ¿Podría utilizar la misma curva para uncultivo de: Bacillus megaterium y otro de Micrococcus luteus? Justifique su respuesta. 13) ¿A qué se llama crecimiento diauxico? Dibuje una curva de crecimiento diauxica indicando las distintas fases de crecimiento. 14) a)Explique la causa del crecimiento diáuxico de E. coli en un medio de crecimiento que contiene como fuente de carbono glucosa y lactosa en una relación 1:3 respectivamente.

15 b) Correlacione temporalmente el crecimiento de la población bacteriana anterior con los eventos que ocurren a nivel molecular en la regulación del operón lac. 15) ¿ Cómo interpreta las siguientes curvas de crecimiento de E. coli en un medio de cultivo que contiene como fuente de carbono glucosa y sorbitol?

16

TP Nº 4 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DIVERSIDAD METABÓLICA Medios de enriquecimiento, selectivos y diferenciales: Para aislar un microorganismo de la naturaleza se debe conocer previamente los requerimientos nutricionales del mismo y las condiciones ambientales propicias para su desarrollo. Los alumnos deberán buscar en la bibliografía las características metabólicas y el hábitat de los microorganismos que se van a aislar. En base a los estudios realizados sobre el metabolismo y los requerimientos nutricionales de las bacterias, se han desarrollado medios de cultivo para facilitar el trabajo en el laboratorio cuando se parte de materiales que supuestamente tendrían más de una especie bacteriana. Así tenemos medios que permiten: a) favorecer el crecimiento de un microorganismo sobre otros, es decir "enriquecerlo" con respecto a una especie; b) "seleccionar" el crecimiento de determinadas bacterias, inhibiendo el de otras; y c) poder "diferenciar" colorimétricamente las distintas especies bacterianas .

Metodologia general de trabajo: 1) Inocular la muestra (agua, tierra, alimentos) en un caldo de enriquecimiento que puede ser selectivo o no, para favorecer el crecimiento del organismo de interés. 2) Incubar a temperatura y tiempo adecuados 3) Tomar una muestra del caldo ya crecido y estriar en medio sólido selectivo con el objeto de inhibir la flora acompañante del microorganismo que se desea aislar. Este medio puede a su vez ser diferencial (diferencia a una determinada cepa o especie en base a alguna característica de la colonia). 4) Incubar a temperatura y tiempo adecuados. 5) Observar el crecimiento de las colonias y hacer repique a agar nutritivo para realizar coloración de Gram. Posteriormente se identificaran los microorganismos en base a pruebas bioquímicas.

Microorganismos a usar: Echerichia coli, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus,Streptococcus spp. Lactobacillus spp., Pseudomonas aeruginosa, Azotobacter spp.

Aislamiento de E. coli 1-Tomar 10 ml de muestra de agua y sembrar caldo Mc Conkey 2X 2-Incubar 48 hs a 37ºC. 3-Observar crecimiento (formacion de gas en campana de Durham y viraje del indicador a amarillo indica probable presencia de E. coli). 4-Tomar muestra con el ansa y estriar en agar Mac Conkey y agar EMB 5-Observar colonias con brillo verde metálico en EMB y rojas en Mac Conkey .

17 Aislamiento de Staphylococcus aureus 1-Agregar 10 g de ricota a un erlenmeyer con agua peptonada estéril. (1/1000 peptona de caseína en agua destilada) 2-Agitar e incubar 2 h a temperatura ambiente. 3-Mezclar caldo cerebro-corazon con 13% de NaCl con el agua peptonada con ricota en partes iguales. 4-Incubar 48h a 37ºC. 5-Si hay crecimiento, tomar una muestra con ansa y estriar en agar manitol salado y agar azida. 6-Incubar 48 h a 37ºC. 5-Observar crecimiento.

Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa 1-Sembrar 0,5 ml-1ml de agua en caldo M9 (2X) 2-Incubar 48 h a 42 grados. 3-Si hay crecimiento (turbidez) tomar muestra con el ansa y estriar sobre agar cetrimida. 4-Incubar 48 h a 37 grados. 5-Observar crecimiento de colonias con pigmento verde.

Aislamiento de Bacillus cereus y Bacillus subtilis 1-Agregar 10 g de arroz a 50ml de PBS estéril. 2- Agitar durante 10 min. 3- Calentar a 80 C durante 5 min. 4- Tomar 1ml de sobrenadante y pasarlo a caldo nutritivo. 5-Incubar 48 h a 37ºC. 6-Estriar en agar Mossel con emulsión de yema de huevo (selectivo y diferencial). 7-Incubar 48 h a 37 ºC. 8-Observar el crecimiento de colonias con halo rosa-púrpura con precipitado blanco espeso (cereusmanitol -,lecitinasa +) y colonias con halo amarillo (subtilis, manitol +,lecitinasa -).

Aislamiento de Lactobacillus spp. 1-Realizar diluciones seriadas de yogurt en Sn fisiológica estéril y sembrar 0,1ml de cada una en agar MRS. 2-Incubar 48h a 37ºC en microaerobiosis 3-Calcular el recuento de bacterias viables lácticas y observar los distintos fenotipos de colonias crecidos en agar MRS 2. 4-Seleccionar 2 fenotipos distintos y estriarlos en agar Rogosa. 5-Incubar en condiciones de microaerobiosis a 37ºC.

Aislamiento de Azotobacter y otras fijadoras de nitrogeno atmosferico. 1-Agregar 10 g de tierra a 10 ml de agua estéril 2-Agitar y dejar decantar 3-Inocular 2 ml a caldo Fred y Waksman 4-Incubar 48 h a 28ºC con agitación 5-Si hay crecimiento tomar una muestra con ansa y estriar agar Fred y Waksman

18 Medios a utilizar: CALDO NUTRITIVO Extracto de Carne 3,0 g Peptona de Carne 5,0 g Agua destilada c.s.p. 1l pH= 7,0±0,2 Para el AGAR NUTRITIVO agregar 15 g de Agar

CALDO MAC CONKEY Peptona de Caseína 20,0 g Lactosa 10,0 g Bilis de Buey desecada 5,0 g Púrpura de Bromocresol 0,01 g Agua destilada c.s.p. 1l pH= 7,4±0,2

AGAR-AZIDA: Brain Heart Infusion Azida sodica Agar Agua c.s.p.

AGAR MAC CONKEY Peptona de Caseína Peptona de Carne Cloruro de Sodio Lactosa Sales biliares Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua c.s.p. pH= 7,1±0,1

37 g 0,3 g 15 g 1l

17,0 g 3,0 g 5,0 g 10,0 g 1,5 g 0,03 g 0,001 g 13,5 g 1l

CALDO CEREBRO-CORAZON Infusión de cerebro 12,5 g Infusión de corazón 5,0 g Proteosa Peptona 10,0 g D(+) Glucosa 2,0 g NaCl 5,0 g Di- Sodio hidrogenofosfato 2,5 g Agua c.s.p. 1 l

CALDO TIOGLICOLATO Peptona de Caseína Extracto de Levadura L(+) Cisteina D(+) Glucosa NaCl Tioglicolato de Sodio Resarzurina sódica Agua c.s.p.

CALDO M9 2X NH4Cl 1,0 g Na2HPO4 6,0 g K2HPO4 3,0 g NaCl 0,5 g Glicerol o Asparragina 5,0 g Agua c.s.p. 1l Sulfato de Magnesio 1M 1ml Cloruro de Calcio 0,01 M 10ml (AUTOCLAVAR APARTE)

CALDO MRS (de Mann, Rogosa y Sharpe) Peptona Universal 10,0 g Extracto de Carne 5,0 g Extracto de Levadura 5,0 g D(+) Glucosa 20,0 g Di-potasio hidrogenofosfato 2,0 g Tween 80 1,0 g Di amonio hidrogenocitrato 2,0 g Acetato de sodio 5,0 g Sulfato de Magnesio 0,1 g Sulfato de Manganeso 0,05 g Agua c.s.p. 1l

AGAR CETRIMIDA: Peptona de Gelatina MgCl2 Cetrimida glicerina SO4K2 Agar Agua c.s.p.

CALDO LB (Luria, Bertani) Triptona Extracto de Levadura NaCl Agua c.s.p. Para el AGAR LB agregar 12 g de AGAR.

20 g 1,4 g 0,3 g 10 ml 10 g 13,6 g 1l

15,0 g 5,0 g 0,5 g 5,5 g 2,5 g 0,5 g 0,001 g 1l

10,0 g 5,0 g 10,0 g 1l

19

CALDO TERRIFIC Triptona 12,0 g Extracto de Levadura 24,0 g Glicerol 4 ml Agua c.s.p. 0,9 l Luego de autoclavar, dejar enfriar a 60ºC, agregar 100 ml de una Sn autoclavada de 2,31 g de KH2PO4 y 12,54 g de K2HPO4.

AGAR MOSSEL Peptona de Carne 10,0 g Extracto de Carne 1,0 g D(-)Manitol 10,0 g NaCl 10,0 g Rojo Fenol 0,025 g Agar 12,0 g Agua c.s.p. 0.9 l Luego de autoclavar agregar 100 ml de EMULSION DE YEMA DE HUEVO ESTERIL AL 50% y 0,1/0,001 Polimixina B

AGAR EMB (EOSINA-METILEN BLUE) Peptona de Carne 10,0 g Di potasio hidrogeno fosfato 2,0 g Lactosa 10,0 g Eosina Yellow 0,4 g Azul de Metileno 0,065 g Agar 15 g Agua c.s.p. 1l pH=7,0±0,2

AGAR MANITOL SALADO- ROJO FENOL Peptona de Carne 10, 0 g Extracto de Carne 1,0 g NaCl 75,0 g D(-)Manitol 10,0 g Rojo Fenol 0,025 g Agar 12,0 g Agua c.s.p 1l pH=7,4±0,1

AGAR ALMIDON Extracto de Carne Peptona Almidon soluble Agar Agua c.s.p pH=7,2±0,1

AGAR HIERRO-2 AZUCARES DE KLIGLER Extracto de Carne 3.0g Extracto de Levadura 3,.0 g Peptona 15.0 g Proteosa Peptona 5,0 g Lactosa 10.0 g Glucosa 1,0 g Sulfato Ferroso 0,2 g NaCl 5.0 g Tiosulfato de Sodio 0,3 g Rojo Fenol 0,024 g Agar 12,0 g Agua c.s.p. 1l pH=7,4

3,0 g 5,0 g 2,0 g 25,0 g 1l

AGAR ROGOSA Peptona de Caseína Extracto de Levadura D(+)Glucosa Potasio di Hidrogeno fosfato Citrato de Amonio Tween 80 Acetato de Sodio Sulfato de Magnesio Sulfato de Manganeso Sulfato de Hierro III Agar Agua c.s.p. pH=5.5±0,1

10,0 g 5,0 g 20,0 g 6.0 g 2,0 g 1,0 g 15,0 g 0,575 g 0,12 g 0,034 g 15,0 g 1l

CALDO Fred y Waksman Manitol SO4Mn PO4HK2 FeCl3 6 H2O SO4Mg. 7H20 CaCO3 NaCl Agua c.s.p. Para el Agar agregar 15 g de Agar.

10 g trazas 0,5 g trazas 0,2 g 3g 0,2 g 1l

20 MEDIO MINIMO CON AMILOSA K2HPO4 NaH2PO4. H2O NH4Cl MgSO4. 7 H2O KCl CaCl2 Cl3Fe Amilosa Agua c.s.p.

3g 1,14g 1g 0,3 g 0,15 g 0,01g trazas 2g 1l

21 CUESTIONARIO T.P. 4 1) Defina los siguientes conceptos: medio definido, medio complejo, medio diferencial, medio de enriquecimiento, medio selectivo, cultivo puro. 2) ¿A cuál de estas categorias corresponden los medios descriptos en la guía de T. P.: medio definido, medio complejo, medio diferencial, medio de enriquecimiento, medio selectivo? 3) ¿Qué función cumple la emulsión de yema de huevo en el agar Mossel, las sales biliares en el agar Mac Conkey, la azida sódica en el agar Azida y el cetiltrimetilammonium bromide en el agar Cetrimida?

4) Describa los pasos y la composición de los medios que utilizaría para aislar un microorganismo capaz de utilizar benceno como fuente de carbono y energía. ¿Dónde recogería las muestras? 5) Dados los siguientes elementos nutricionales: glucosa, peptonas, extracto de carne, bases nitrogenadas, NH4Cl, Na2HPO4, KCl, MgCl2, NaCl, FeCl3, CuCl2, CoCl2 a) ¿Cuáles elegiría para formular un medio de enriquecimiento y un medio mínimo? b) En el caso del medio de enriquecimiento, indique la función de cada elemento elegido: ¿Qué otro tipo de compuestos agregaría para obtener un medio de enriquecimiento selectivo para gram negativos? 6) Diseñe un protocolo para aislar cuatro microorganismos, presentes en una muestra de agua, que reúnen las siguientes características: Microorganismo A: Aerobio estricto, forma esporas, bacilo Gram positivo, glucosa positivo, licuefacción de la gelatina positivo. Microorganismo B: Anaerobio facultativo, cocobacilo Gram negativo, glucosa positivo. Microorganismo C: Anaerobio facultativo, cocobacilo Gram negativo, glucosa positivo, lactosa positivo. Microorganismo D: Aerobio estricto, bacilo Gram negativo, glucosa positivo. 7) Contando únicamente con el equipo de laboratorio (microscopio, autoclave, mechero, ansa, material de vidrio) y las siguientes drogas: agar, manitol, asparragina, peptona, sales biliares, cloruro de sodio, agua destilada y colorantes para efectuar tinciones diferenciales, esquematice la marcha analítica para obtener cultivos puros a partir de una mezcla de microorganismos que incluye Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa. 8) ¿Qué tipos de medios son el agar manitol salado y el agar Mossel? ¿Para qué sirven cada uno de sus constituyentes? ¿Podría reemplazar el manitol por otro azucar y el rojo fenol por rojo neutro? 9) Diseñe un medio que le permita diferenciar microorganismos Gram negativos que degradan la maltosa con producción de ácido de los que no lo hacen. 10) Discuta las siguientes afirmaciones: a- Para determinar la carga bacteriana de una muestra debe realizarse un enriquecimiento previo. b- Un enriquecimiento selectivo se realiza en medio líquido pues hay libre competencia por los nutrientes.

22 c- El paso de aislamiento selectivo y/o diferencial puede hacerse en medio líquido. d-La premisa fundamental en un protocolo de aislamiento es conseguir un cultivo puro. 11) La composición del caldo nutritivo es: extracto de carne, peptona y cloruro de sodio en agua a pH 7. La composición del caldo Mc Conkey es: peptona, lactosa, sales biliares, púrpura de bromocresol y cloruro de sodio en agua a pH 7. ¿Cuál es la función de cada uno de los componentes en cada medio? 12) ¿Cuál de los siguientes medios utilizaría para enriquecer selectivamente en un microorganismo respirador anaeróbico, metabolismo no fermentativo, Gram negativo? Medio A: medio basal mínimo, glucosa, NH4Cl, tioglicolato de sodio. Medio B: medio basal mínimo, glucosa, NO3Na, tioglicolato de sodio. 13) Los principales componentes del agar Rogosa utilizado en el aislamiento de Lactobacillus son: glucosa, extracto de levadura, extracto de carne, peptonas, acetato de sodio, tween 80 (pH 5,5). Explique cuál es la función de cada uno de ellos y por qué la incubación se realizó en anaerobiosis. 14) Discuta los siguientes enunciados y justifique: a) Cualquiera de los siguientes medios podría ser utilizado para diferenciar aquellos microorganismos capaces de fermentar la lactosa:

Medio 1

Medio 2

Medio 3

Medio 4

Peptona carne

Peptona carne

NH4Cl

NH4Cl

Lactosa

Extracto carne

Lactosa

Lactosa

Rojo fenol

Lactosa

Rojo fenol

Glucosa

Agua

Rojo fenol

Agua

Rojo fenol

Agar

Agua

Agar

Agua Agar

b) Especies del género Bacillus pueden ser aisladas en placas de agar Mc Conkey. c) Bacillus cereus y Staphylococcus aureus pueden ser diferenciados en una placa de agar Mossel al cual no se le adicionó yema de huevo ni polimixina B 15) En el estudio de la esporulación de Bacillus cereus, cuya espora es oval y central, se observaron al microscopio bacilos con esporas terminales características de Bacillus subtilis. Diseñe un medio de cultivo que le permita diferenciar ambos microorganismos.

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TP Nº 5 PRUEBAS BIOQUÍMICAS La utilización de medios selectivos y diferenciales, las tinciones de Gram, características de las colonias y motilidad en el estudio de una determinada bacteria nos brinda una gran información sobre el género bacteriano con el que se está trabajando. Una vez aislada una bacteria determinada, se le pueden realizar una serie de pruebas que evalúan su actividad bioquímica. Esto permite hacer una identificación final de la especie en cuestión, es decir se estudian ciertos sistemas enzimáticos que son únicos de cada especie y que sirven como marcadores de identificación. En el laboratorio, esos sistemas enzimáticos se detectan inoculando la colonia bacteriana bien aislada y fresca (24-48 hs de crecimiento) en una serie de medios de cultivo que contienen sustratos específicos e indicadores químicos para detectar cambios de pH o presencia de subproductos específicos.

Objetivos: a) Identificar distintas especies pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. b) Diferenciar distintas especies de Pseudomonas. c) La diferenciación entre Estafilococos y Estreptococos.

Desarrollo: Se someterán cultivos (de 24-48 hs), de las distintas colonias aisladas a distintas pruebas bioquímicas

1) Prueba de la Oxidasa Esta prueba sirve para determinar la presencia de la enzima citocromo oxidasa en preparaciones de microorganismos. Permite diferenciar enterobacterias, distintas especies de Streptococcus, Staphylococcus y Micrococcus (-) de Pseudomonas y Aeromonas (+). Se debe partir de cultivos puros de bacterias crecidos en agar nutritivo 18-24 h Metodología: A) Levantar con el ansa una colonia del cultivo puro. B) Aplicar la colonia sobre el disco embebido en el reactivo de Kovacs para Oxidasa (naftol+dimetilparafenilendiamina) extendiendo bien el material. C)-Esperar 5-10 seg y observar la coloración Prueba Positiva: la tira vira a color azul por oxidación del compuesto a azul de indofenol Prueba Negativa: no hay modificación

2) Prueba de la Catalasa Esta prueba es para detectar presencia de la enzima catalasa en preparaciones de microorganismos. Diferencia Streptococcus (-),Clostridium (-), de Staphylococcus (+), Bacillus (+) y Micrococcus(+). Metodología: A) Colocar una gota de agua en un portaobjeto limpio. B) Colocar una ansada de la colonia a probar sobre la gota y mezclar (no dejar secar). C) Agregar 2 gotas de Agua oxigenada.

24 Resultado positivo: formación de burbujas debido a la producción de O2 a partir del H2O2 por acción de la enzima.

3) Prueba del agar hierro-dos azucares de Kligler Permite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar un hidrato de carbono especifico incorporado a un medio de crecimiento básico asi como la producción de gas y acido sulfhídrico. Se suele utilizar para la identificación de distintas especies de la familia Enterobacteriaceae. Metodología: 1- Inocular cada uno de los microorganismos aislados por punción y por estría en el mismo tubo de agar hierro de Kligler. 2- Incubar a 37ºC durante 18-24 h 3- Observar entre las 18 h y las 24 h de cultivo (ni antes ni despues) Resultados: El uso de un hidrato de carbono implica la liberación al medio de productos ácidos capaces de ser detectados por un indicador de pH. Si el microorganismo en cuestión es incapaz de usar el H de C, consume entonces las peptonas del medio liberando productos que alcalinizan el mismo. Al interpretar los datos de la prueba debe tenerse en cuenta los siguientes aspectos: A) Utilización del hidrato de carbono: *Si el microorganismo en estudio solo fermenta glucosa i) en superficie:reacción alcalina, color rojo ii) en profundidad: reacción acida, color amarillo *Si el microorganismo es capaz de fermentar tanto glucosa como lactosa: i) en superficie: reacción acida, color amarillo ii) en profuindidad: reacción acida, color amarillo *Si el microorganismo no es capaz de fermentar glucosa ni lactosa (no enterico) i) en superficie: reacción alcalina, color rojo ii) en profundidad: si es aerobio entonces no hay crecimiento ni cambio de color; si es facultativo entonces hay reacción alcalina y color rojo * Si el microorganismo no es capaz de fermentar lactosa pero si de oxidarla i) en superficie: reacción acida en tiempos cortos (color amarillo) luego reacción alcalina y color rojo. ii) en profundidad: no hay crecimiento ni cambio de color. B) Produccion de gas • • C) Produccion de SH2

• •

Si el microorganismo en estudio es aerogenico, la produccion de H2 y CO2 se manifiestan por la formacion de burbujas y/o el desprendimiento de del agar del fondo del tubo, dejando un area clara Si el microorganismo en anaerogenico, entonces no hay liberacion de gases Si el microorganismo produce este acido, el mismo reaccionará con el hierro formando un precipitado de SFe insoluble (color negro) Si no produce el acido no habrá reacción

25 4) Pruebas del IMViC (INDOL-ROJO METILO-Voges Proskauer-Citrato) Estas cuatro pruebas son muy útiles para distinguir bacterias coliformes entre si.

Producción de INDOL Mide la capacidad del microorganismo de producir indil a partir de triptofano por acción de la enzima triptofanasa. Metodología: 1) Inocular tubos con agua de triptona con una ansada de cultivo puro crecido 18-24 h en agar nutritivo. Dejar un tubo sin inocular como testigo. 2) Incubar a 37 por 48 h. 3) Colocar sobre el tubo unas gotas de reactivo del indol de Kovacs (alcohol amílico, paradibenzaldehído acido). Dejar reposar hasta aparición de anillo rojo en superficie. prueba positiva: formación de anillo rojo en fase alcohólica (compuesto quinónico derivado del indol) prueba negativa: anillo amarillo en superficie.

VOGES PROSKAUER y Rojo de Metilo Estas dos pruebas permiten detectar el tipo de fermentación (butilenglicólica o acido mixta) que realiza el microorganismo. La prueba de Voges-Proskauer sirve para comprobar la capacidad de algunos organismos de producir acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir de la frementación butilenglicólica de la glucosa. Klebsiella pneumoniae y Enterobacter (+). Escherichia coli y otras especies de Klebsiella (-). La prueba del Rojo Metilo sirve para comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales acidos d ela fermentación (ácido mixta) de la glucosa. Escherichia coli (+) y Klebsiella, Enterobacter (-). Metodología: 1- Inocular tubos conteniendo caldo MR-VP con una ansada de cultivo fresco crecido en agar nutritivo. 2- Incubar a 37 por 48 h 3- Dividir el contenido del tubo en dos partes iguales 4- Para determinar presencia de acetoína (Voges) agregar a 1 ml de cultivo 0.6 ml de Reactivo de Barrit y 0,2 ml de KOH al 40%. 5- Agitar suavemente y dejar reposar 5-10 min. Prueba positiva: color rosado-rojo en la superficie que se intensificará al cabo de unas horas (presencia de acetoína). Prueba negativa: sin cambio de color (amarillo) en la superficie. 6-Para detreminar Rojo Metilo, agregar al segundo tubo unas 5 gotas de indicador rojo de metilo al 0,1%. Prueba positiva: si el cultivo continua siendo de color rojo, entonces el pH esta por debajo de 4,4. Hay fermentación ácido-mixta. Prueba negativa: color amarillo en la superficie, pH=6.

26 Aprovechamiento de Citrato (Medio Citrato de Simmons) Esta prueba permite determinar la capacidad del microorganismo para utilizar citrato como única fuente de carbono. Salmonella, Arizona, Citrobacter,Klebsiella y Enterobacter (+) E. coli, Shigella, Edwarsiella, Yersinia, Actinobacillus (-) Metodología: 1-Inocular placas con agar citrato de Simmons con una ansada de cultivo fresco crcido en agar nutritivo. 2-Incubar a 37ºC por 48 h 3-Observar si hay desarrollo de colonias.

5) Prueba de motilidad. Este ensayo permite detectar la presencia de flagelo en el microorganismo que se estudia. Cada tipo de microorganismo aislado se le hará la prueba de motilidad, sembrándolas POR PUNCION en un medio sólido blando con agar al 0.4% a fin de detectar las bacterias con motilidad positiva y negativa. Se utilizaran cepas controles.

6) Sensibilidad a antibióticos Los antibióticos son sustancias químicas producidas por ciertos microorganismos que son activas contra otros microorganismos. Distintos antibióticos tienen distinta forma de acción sobre distintos componentes de los microorganismos (pared celular, síntesis de proteínas, síntesis de ARN, etc). A su vez, los microorganismos crean mecanismos de resistencia a los antibióticos que también pueden ser de diverso tipo (alteración de la permeabilidad al mismo, alteración del blanco, desarrollo de vías alternativas, inactivación del antibiótico) Objetivo: Se determinará sensibilidad a antibióticos de los distintos microorganismos aislados en las clases anteriores. Se utilizará el sistema de monodiscos. Metodología: Se mezclan 0,1 ml de cultivo bacteriano de 24 hs en caldo nutritivo, con 3 ml de agar blandonutritivo (0,7% de agar) mantenido a 40ºC. Se vuelca la mezcla en placas, previamente preparadas y solidificadas de agar nutritivo (1,5%de agar). Se deja solidificar y luego se coloca, sobre la superficie de cada placa, los discos de papel de filtro estériles embebidos en los diferentes antibióticos a ensayar. Se incuban las placas a 37 ó 28ºC según de donde provino el aislamiento. La clase siguiente se determinará el grado de sensibilidad de cada microorganismo usado, midiendo el diámetro de los halos de inhibición.

7) Prueba de la hidrólisis de almidón Las bacterias del género Bacillus poseen la capacidad de sintetizar α-amilasa, una enzima capaz de hidrolizar enlaces α(1-4) de polímeros de glucosa (ej: almidón). Metodología: a partir de placas de agar almidón sembradas con estrías de distintas cepas bacterianas se realizará lo siguiente: 1-Cubrir la totalidad de la placa con la solución de Lugol. 2-Observar la tinción del almidón (coloración azul) o un halo transparente en las zonas donde hubo hidrólisis de almidón.

27 CUESTIONARIO T. P. 5 PRUEBAS BIOQUIMICAS 1) Defina el concepto de especie bacteriana. ¿En qué difiere del concepto de especie animal? 2) Mencione tres técnicas clásicas utilizadas para clasificar bacterias. 3) ¿Como cree que afectaría a la clasificación bacteriana la adquisición de plásmidos, transposones o profagos? 4) ¿Es útil la prueba de la catalasa para distinguir entre que dos generos bacterianos? 5) ¿Qué permiten diferenciar las pruebas de fermentación? 6) ¿Para qué se utiliza el test del IMViC? 7) Para el test MR: ¿Qué proceso esta siendo evaluado? ¿Qué indicador se utiliza? ¿Qué color indica un resultado positivo? 6) Para el test VP: ¿Qué proceso esta siendo evaluada? ¿Qué indicador se utiliza? ¿Qué color indica un resultado positivo? ¿Qué relacion existe entre MR y VP? 8) Para la prueba del citrato ¿Qué proceso se detecta? ¿Qué indica un resultado positivo? 9) Los productos terminales de la degradacion del trp son indol y pirúvico. ¿Por qué se evalua la presencia de indol en vez de pirúvico como indicador de actividad triptofanasa? 10) Diga si es verdadero o falso a) En el agar EMB y en el agar Fe de Kligler se pueden diferenciar microorganismos que realizan fermentación ácido-mixta de aquellos que realizan fermentación butilenglicólica. b) Las pruebas bioquímicas Rojo de Metilo y Voges-Proskauer, pueden realizarse en cualquiera de los siguientes medios: i) Extracto de carne, peptona de carne, agua. ii) Peptona, glucosa, buffer fosfato, agua. 11) ¿Qué resultados espera obtener en las pruebas bioquímicas de agar hierro de Kligler y óxido/fermentación de lactosa como única fuente de carbono, para microorganismos con las siguientes características metabólicas? a) Aerobio estricto que no utiliza la lactosa como fuente de carbono b) Anaerobio facultativo que no utiliza la lactosa como fuente de carbono

28 c) Anaerobio facultativo que utiliza la lactosa como fuente de carbono 12) A partir de una muestra de agua del Río de la Plata, se obtienen cultivos puros de 5 microorganismos (A, B, C, D, E). A cada uno de ellos se le realizan las pruebas de agar hierro de Kligler, Rojo de Metilo y Voges Proskahuer, obteniéndose los siguientes resultados: Kligler Rojo de Metilo Voges Proskahuer A) Ac/Ac con gas +/B) Alc/SC sin gas -/C) Alc/Ac sin gas +/D) Alc/Ac con gas -/+ E) Ac/Ac con gas -/+ A partir de los resultados obtenidos: a) ¿Qué características metabólicas puede inferir para cada uno de los microorganismos aislados? b) ¿De qué otra forma podría determinar la capacidad de utilizar la lactosa por parte de los cinco microorganismos? 13).Discuta las siguientes afirmaciones; a) El color rojo de las colonias en agar McConkey se debe a los productos ácidos generados por la fermentación de la lactosa. b) Si en la prueba de O/F tanto en el tubo abierto como en el cerrado se observó crecimiento con viraje del indicador al amarillo (ácido) indica que el microorganismo oxidó y fermentó la glucosa del medio. c) A diferencia de la prueba de agar hierro Kligler, los resultados de la prueba del Rojo de Metilo son independientes del tiempo de lectura. d) La aparición de un producto coloreado en la primera parte de la prueba de reducción del nitrato se considera positiva. e) Para el enriquecimiento de Staphylococcus aureus es suficiente incubar la muestra 2 horas en agua peptonada. 14) En una placa sembrada a partir de un cultivo de E. coli se observa una presunta contaminación con Pseudomonas aeruginosa. Indique por lo menos 3 pruebas bioquímicas y los resultados esperados de las mismas que le permitirían comprobar que se trata de estos dos microorganismos.

ANTIBIOTICOS 1) Diseñe un protocolo para determinar la concentración inhibitoria mínima de un antibiótico para un determinado microorganismo. ¿Es este protocolo aplicable en el caso de un bacteriostático, un bactericida lítico y un bactericida no lítico? 2) Para obtener un césped de un microorganismo se siembra con hisopo una placa que contiene: agar, glucosa, NH4Cl, MgSO4, K2HPO4 y se aplican distintos discos de papel embebidos con diferentes cantidades de un determinado antibiótico. Luego de 48 horas de incubación se observa un halo de inhibición alrededor del disco que contiene 5 µg de antibiótico. Cuando se hace lo mismo pero utilizando

29 un medio que contiene agar, triptona y extracto de levadura, se observa un halo de inhibición del mismo tamaño que el anterior sólo a partir del papel que contiene 50 µg del antibiótico. Discuta al menos dos posibles explicaciones para estos resultados. 3) Diseñe un protocolo experimental para comprobar que una bacteria A libera al medio un compuesto con actividad antibiótica. ¿Cómo determinaría si dicho compuesto es bactericida o bacteriostático? 4) Se dispone de dos cultivos bacterianos: uno en estado de crecimiento estacionario y otro en estado de crecimiento exponencial. Si se agrega la misma concentración de penicilina en ambos cultivos ¿Qué resultados esperaría obtener? Grafique y explique. 5) Se inoculan caldos nutritivos con Staphylococcus aureus y se incuban a 37°C, tomando alícuotas a distintos tiempos para medir número de células viables y D.O.600 A los 120 minutos (fase log) se agregan a cada cultivo diferentes agentes: a) penicilina, b) cloranfenicol, c) agua. A los 240 minutos, los cultivos se centrifugan a baja velocidad, se resuspenden en un volumen igual de medio fresco y se continúa la incubación. Esquematice las curvas de crecimiento esperadas en cada caso (número de células viables y D. O. 600) Justifique. 6) ¿Qué efecto espera obtener si se agrega en forma combinada un bacteriostático y un antibiótico de acción sobre síntesis de pared a un cultivo bacteriano en crecimiento exponencial? 7) En un antibiograma, una cepa de E. coli presenta un halo de inhibición 3 veces mayor para el antibiótico A que para el antibiótico B. ¿Qué conclusión se puede extraer de esta prueba? Justifique. 8) Se dispone de tres sustancias obtenidas por síntesis química con presunta actividad antimicrobiana para bacterias gram negativas. a) ¿Cómo determinaría cual de las tres presenta mayor actividad? b) ¿Qué parámetros debería tener en cuenta en el ensayo experimental? c) ¿Cómo determinaría su mecanismo de acción? 9) a) ¿A qué se debe la aparición de colonias dentro de la zona de inhibición del crecimiento en un ensayo de concentración inhibitoria mínima? b) ¿Qué resultados esperaría obtener al comprobar la CIM de las bacterias que forman estas colonias en relación a las que crecen por fuera del halo de inhibición? ¿Cómo la calcularía?

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TP Nº7 GENETICA BACTERIANA La transferencia de material genético en bacterias se da básicamente mediante tres procesos conocidos como: transformación, transducción y conjugación. En la transformación, las bacterias permiten la entrada de ácidos nucleicos directamente del medio externo; cuando esto sucede se dice que las bacterias son “competentes”. En la naturaleza, bajo ciertas condiciones, algunos microorganismos puedan alcanzar el estado de competencia e incorporar material genético extraño, por ejemplo: Bacillus spp. (bacilo Gram positivo capaz de esporular), Haemophilus spp. (cocobacilo Gram negativo) y Neisseria spp. (bacilo Gram negativo). Sin embargo, en el laboratorio se pueden tratar las células de un cultivo bacteriano para que sean competentes. El método más común es el del tratamiento con Cloruro de Calcio, este compuesto químico actúa a nivel de la membrana en Gram negativos facilitando la entrada del ácido nucleico. También se puede lograr el mismo objetivo mediante un shock eléctrico, en este caso se deben procesar las células de un cultivo bacteriano para que sean “electrocompetentes” y disponer de un aparato llamado electroporador.

Comisiones A y B Objetivos: Día 2 1) 2) 3) 4)

Transformar células competentes de Escherichia coli con un plásmido recombinante. Transformar las mismas células competentes con el plásmido vector. Hacer los controles necesarios (se discutirán en el práctico). Preparar las placas de Petri con los medios y reactivos necesarios.

Día 3 5) Discutir los resultados obtenidos experimentalmente. 6) Calcular la eficiencia de transformación para las bacterias competentes utilizadas.

Desarrollo: Transformación 1) Tomar del freezer un tubo eppendorf conteniendo las células competentes y descongelar en hielo. 2) Agregarle el plásmido. 3 ) Dejar 30 min. en hielo. 4) Incubar el tubo durante 45 segundos en un baño de agua de 42°C (sin agitar). 5) Incubar en hielo y durante 2 min. 6) Pasar el contenido del tubo eppendorf a un tubo de ensayo conteniendo 0.9 ml del medio SOC (a temperatura ambiente). 7) Incubar 45-60 min. a 37°C, con agitación. 8) Tomar 100µl del cultivo y sembrarlos en una placa de LB con los reactivos necesarios para seleccionar a las transformantes. Incluir los controles adecuados. (Guardar el resto del cultivo a 4°C). 9) Incubar las placas 18 hs. a 37°C.

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CAMBIOS GENÉTICOS El genoma de una bacteria puede sufrir cambios debidos a mutaciones o a la incorporación de un ADN exógeno, muchas veces trayendo como consecuencia un cambio en el fenotipo de la bacteria. Mutación: cambio heredable en la secuencia de bases de ácidos nucleicos de un organismo. La incorporación del ADN exógeno dentro de una bacteria puede producirse por transducción (transporte de ADN por bacteriófagos), transformación (incorporación de fragmentos de ADN a bacterias competentes) o por conjugación (transferencia de ADN entre dos bacterias por contacto físico entre ellas).

Objetivos: Producción de cambios en el genotipo de una bacteria por: a) conjugación y complementación funcional b) transposición y generación de mutantes por inserción Desarrollo:

Comisión A a) Complementación funcional de una mutante por conjugación biparental Bacteria receptora: cultivo de la mutante pgm de Agrobacterium tumefaciens, carente de la enzima fosfoglucomutasa. Esta mutante es incapaz de transformar Glu-6-P en Glu-1-P, por lo tanto es incapaz de generar ADP-Glu y UDP-Glu, los dadores de glucosas activadas para la síntesis de todos los polisacáridos estructurales y de reserva que contengan glucosa. Esta mutante es pleiotrópica y por carecer del exopolisacárido tiene un fenotipo DARK al iluminar con UV placas conteniendo calcoflúor. Esta mutante es resistente al antibiótico Kanamicina. Bacteria donadora: un cultivo de Escherichia coli S17.1, que contiene el plásmido pCC15, el cual lleva la secuencia completa del gen pgm de A. tumefaciens. Esta cepa es resistente al antibiótico Carbenicilina, dicha resistencia es portada en el plásmido pCC15. PROCEDIMIENTO. Se toman 1 ml de cada cultivo líquido (dadora y receptora) y se centrifugan en un mismo tubo eppendorff. Una vez centrifugados se lava con 1 ml de medio LB. Se centrifuga nuevamente, se resuspende en 30 µl de LB y se deposita sobre una placa de LB sólido, sin antibióticos. Se incuba a 28o C por una noche. Al día siguiente se plaquea por rastrillado la mezcla de conjugación en el medio selectivo: Medio LBKanamicina (50 µg/ml)-Carbenicilina (100 µg/ml)-Calcoflúor 0,02%.Se plaquean también en el mismo medio, la cepa receptora y dadora por separado como control. Incubar 48 hs a 28°C. Observar la reversión del fenotipo DARK a BRIGHT al iluminar la placa con luz UV.

37 Comisión B: b)Mutación por inserción del transposón Tn5. Un cultivo silvestre de Agrobacterium tumefaciens será sometido a conjugación con la cepa E. coli S17.1 λpir portando el vector suicida pUTminiTn5Km. Este paso de conjugación permitirá movilizar el vector pUTmini Tn5 Km desde E. coli a A. tumefaciens. Dado que el vector pUTmini Tn5 Km es SUICIDA, es decir, es incapaz de replicar autónomamente en cualquier contexto genético excepto cuando esta presente el gen pir, el vector no podrá soportar replicación en A. tumefaciens y se perderá en las sucesivas divisiones de la bacteria. Sin embargo el transposón mini Tn5 podrá transponer hacia el genoma de A. tumefaciens antes que el vector que lo porta se pierda. Este evento de transposición lo podremos evidenciar facilmente dado que el mini Tn5 porta un gen marcador que confiere resistencia a Kanamicina. En consecuencia todas las colonias de A. tumefaciens capaces de crecer en placas conteniendo Kanamicina son potenciales receptoras del transposón. Para contraseleccionar las E. coli dadoras se agregará cloranfenicol dado que esta cepa es sensible y la A. tumefaciens receptora es naturalmente resistente. PROCEDIMIENTO: -Tomar 1 ml de cultivo líquido de A. tumefaciens (silvestre, fenotipo Bright) y 1ml de E. coli S17.1 λpir pUTmini Tn5Km y mezclarlos en tubo eppendorf. -Centrifugar 10 min. -Eliminar el sobrenadante y lavar con 1ml de medio LB fresco. Volver a centrifugar. -Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 35 µl de LB fresco. -Tomar el material resuspendido y colocarlo en el centro de una placa de LB. Incubar a 28°C hasta el día siguiente. -Levantar el botón bacteriano y plaquear por rastrillado en medio de selección conteniendo LBKanamicina 50µg/ml-Cloramfenicol (20 µg/ml)-Calcofluor 0,02%. Como control plaquear en el mismo medio selectivo la cepa dadora y la receptora. -Incubar a 28°C durante 48 hs. -Observar la aparición de colonias de A. tumefaciens resistentes a Kanamicina. Observar la presencia de colonias mutantes DARK.

CUESTIONARIO T. P. 7 1) Explique las 3 formas básicas de transferencia de material genético entre bacterias. Esquematice. 2) Explique en qué consiste el método de transformación mediante cloruro de calcio. 3) Explique en qué consiste el método de transformación mediante electroporación. 4) ¿A qué se llama bacteria competente? ¿Cómo se calcula la eficiencia de competencia? 5) ¿Para qué se incuban las bacterias transformadas en medio SOC durante 1h con agitación a 37°C?

38 6) ¿Qué es una colonia satélite? 7) En la conjugación bacteriana: ¿Qué es una cepa dadora? ¿Qué características debe poseer? 8) Explique qué son los genes mob y los genes tra. ¿Dónde se encuentran? ¿Qué funciones codifican? 9) ¿Qué caracerísticas debe poseer un plásmido para ser conjugativo? ¿Y para ser autotransferible? ¿Qué me puede decir acerca del tamaño (en pares de bases) de los plásmidos autotransferibles? 10) ¿Qué son los fenotipos BRIGHT y DARK de Agrobacterium tumefaciens? ¿Cómo se observan? 11) ¿Qué son los elementos transponibles? Esquematice.

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TP Nº8 ECOLOGIA MICROBIANA Columna de Winograsdky y Ciclo del Azufre Objetivos: a) Efectuar el seguimiento del desarrollo de un ecosistema acuático a partir de las observaciones y el estudio de la columna de Winogradsky. b) Identificar los diversos grupos bacterianos involucrados en el ciclo del S0. c) Interpretar desde un punto de vista ecológico las interacciones existentes en el nicho que es objeto de estudio.

Construcción de la columna de Winogradsky: Materiales: - Tubos de vidrio de aprox. 50cm de longitud - Fuente de luz incandescente - SO4Ca, CO3Ca y PO4HK2 - Papel de Filtro o Residuos Vegetales - Fango proveniente de pantano, zanja o río con aguas estancadas, como fuente de inóculo Procedimiento: Se montarán 2 columnas de Winogradsky (columnas A y B). Para cada una se realizará lo siguiente: 1) Colocar 400g del inóculo en el interior de la columna tratando de no removerlo en exceso al efectuar la operación. 2) Adicionar: 4g de CO3Ca 4g de SO4Ca 4g de PO4HK2 trozos de papel de filtro o papeles vegetales 3) Completar con agua de red hasta aprox. la 3/4 partes del tubo, vertiéndola suavemente sobre las paredes. Controlar periódicamente el nivel de agua durante el transcurso de la experiencia (verificar que no queden atrapadas burbujas de aire). Luego tapar la columna con tapones de algodón. Cubrir la columna con papel de aluminio evitando que reciba luz durante el lapso de una semana. 4) Al término de este periodo descubrir la columna A y exponerla a una fuente de luz dejando la columna B tapada. Incubar ambas columnas a T° ambiente (20-22°C). Tomar nota de los cambios observados en la columna A durante todo el experimento para su posterior interpretación. Identificación de los diversos grupos microbianos involucrados en el ciclo de S0 Géneros de microorganismos que participan en el ciclo del S0: Desulfovibrio: Bacteria reductora de SO42-. Anaerobia obligada. Reductora del H2S a partir del SO42mediante respiración. Desulfotomaculum: Bacteria esporogena reductora del SO42-. Anaerobia obligada. Reductora del H2S a partir del SO42- mediante respiración.

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Chromatium: Bacteria púrpura del S. Anaerobia obligada y fotodependiente. Oxida H2S a H2SO4 mediante fotosíntesis anoxigénica. Chlorobium: Bacteria verde del S. Anaerobia obligada y fotodependiente. Oxida H2S a H2SO4 mediante fotosíntesis anoxigénica. Rhodospirillum: Bacteria púrpura no del S. Anaerobia, microaerófila o aerobia. Usa compuestos orgánicos tanto para efectuar fotosíntesis en ausencia de O2, como para efectuar respiración en su presencia. Puede usar fotosintéticamente bajas concentraciones de H2S oxidándolo a SO42- sin formar S0 como intermediario. Chloroflexus: Bacteria verde no del S. Descubierta recientemente, se asemeja por sus propiedades metabólicas y nutricionales a las rojas no sulfureas. Beggiatoa: Bacteria deslizante oxidadora del H2S. Aeróbica o microaerofílica. Oxida H2S a SO42dando como intermediario al S0 por medio de metabolismo respiratorio. Thiothrix: Bacteria no-deslizante oxidadora del H2S. Aeróbica o microaerofílica. Oxida H2S a SO42dando como intermediario al S0 por medio de metabolismo respiratorio. Thiobacillus: Bacteria oxidadora del H2S y otros compuestos del S. Aeróbica. El producto final de la oxidación es el H2SO4, generado mediante metabolismo respiratorio. No acumulan S0 en su interior. Todos los géneros arriba mencionados pertenecen a la división II del reino Procariota, la división Bacterias. Un segundo miembro del reino Procariota, perteneciente a la división I: Cianobacterias, suelen participar del ecosistema estudiado. Cianofíceas, o algas verde-azuladas: organismos aerobios pertenecientes a una gran variedad de géneros distintos. Utilizan agua y H2S para llevar a cabo fotosíntesis. Procedimiento para la toma y siembra de muestras: Para la toma del inóculo se deberá tener en cuenta la relación del microorganismo a estudiar con el oxigeno, siendo necesario extraer los anaerobios del seno del sedimento y los aerobios de la parte líquida de la columna. El color y la turbidez desarrolladas en las columnas será de gran orientación para el criterio de la toma. Para esta extracción se usara una pipeta Pasteur de 60 cm de longitud con boquilla de goma en su extremo para faciltar la extracción. Es aconsejable un tratamiento cuidadoso para no alterar demasiado las condiciones del ecosistema.

Siembra en medio líquido: Se comenzará con siembra en medio líquido antes de pasar a medios sólidos. Respecto de los aerobios, se cutivarán en tubos de ensayo con 4-5 ml del medio apropiado para el microorganismo en cuestión. Los anaerobios, se cultivarán en frascos de penicilina o tubos con tapa a rosca, los cuales se cubrirán con el medio apropiado hasta el tope. Luego de agregado el inóculo se cerrarán con las tapas a rosca y se sellarán con parafina, procurando no dejar burbujas en su interior.

Siembra en medio sólido:

41 Se procederá a sembrar los medios sólidos una vez obtenido desarrollo positivo en medios líquidos. Los aerobios se sembrarán directamente como ya se ha explicado a lo largo del curso. En caso de tratarse de organismos deslizantes, es recomendable colocar una mínima alícuota proveniente del medio líquido en la parte central de la placa de Petri. Estos organismos móviles se alejarán del centro de la misma, autopurificándose ya que dejarán tras sí cualquier otro contaminante no móvil. Los anaerobios se cultivarán en tubos agarizados de la siguiente manera: Se coloca 1-2 ml de medio sólido fundido a punto de solidificar. Se agrega una alícuota de la muestra, agitando con suavidad para evitar laformación de burbujas. Se adiciona mas medio a punto de solidificar, completando el llenado del tubo con tapon vaspar (o sellándolo con vaselina-parafina)

Observación Se realizarán observaciones macroscópicas y microscópicas de los organismos que se desarrollen en los medios seleccionados. La información a extraer es la siguiente: Macroscópica: turbidez, desarrollo de color, movilidad, olores característicos. Tamaño, forma, color y movilidad de las colonias. Microscópicas: tamaño, forma, color, Gram, inclusiones citoplasmáticas.

CUESTIONARIO T. P. 8 1)¿Qué ventajas y desventajas encuentra en el uso de columnas de vidrio para el desarrollo de las columnas? 2) ¿Cuál es la importancia de la selección de una fuente de luz incandescente? ¿Puede ser sustituida por otra fuente de luz? 1) ¿Cuál es el rol que cumple cada droga (incluido el papel de filtro) en el desarrollo del ecosistema?¿Se puede prescindir de alguna de ellas? Justifique. 2) ¿Cómo influye el origen del inóculo usado? ¿Cuáles serian las consecuencias de usar muestras provenientes de aguas de libre curso? 3) ¿Por qué es necesario mantener el nivel del agua de los tubos por encima de la mitad de la longitid de los mismos? ¿Qué pasaria si esto no se cumpliera? 4) ¿Qué ocurriría si las columnas no se hubieran dejado al abrigo de la luz por 7 dias? 7) ¿Qué tipos de bacterias se encuentran asociadas con las zonas de color púrpura y verde de la columna de Winogradsky? 8) ¿En qué zona de la columna esperaría encontrar un anaerobio estricto? 9) Describa una sucesión microbiana en la columna de Winogradsky 10) ¿Qué gradientes se forman en la columna de Winogradsky? ¿Qué elementos se utilizan en el laboratorio para garantizar la formación de los mismos? 11) a) Ubique en relación al gradiente de SH2 a los siguientes microorganismos: bacterias reductoras de sulfato, bacterias verdes del azufre, bacterias púrpuras del azufre, cianobacterias, diatomeas. b) En base a que otro/s parámetro/s ambientales podría ubicarlas. Justifique en todos los casos. 12) A partir de libros de texto, citas bibliográficas o búsquedas a través de internet, obtener más información sobre el metabolismo y los requerimientos de oxígeno de los organismos que pueden estar presentes en la columna de Winogradsky. Muchos de estos microorganismos se mencionan más abajo.

42 Utilizando la información obtenida, dibujar una columna de Winogradsky y ubicar los microorganismos en el lugar apropiado. Thiobacillus sp., Clostridium sp., Algae, Desulfovibrio sp., Cyanobacteria, Chromatium sp., Rhodospirillum sp., Chlorobium sp.