22/04/2008

Seminario N° 2 Microbiología General

Microscopia y Tinciones

Microscopía Conceptos básicos: NA, resolución, partes del microscopio. Microscopios: campo claro, campo oscuro, contraste de fases fluorescencia, fases, fluorescencia confocal, confocal interferencia, interferencia electrónico de barrido, de transmisión, fuerza atómica, efecto tunel. -------------------------------------------------------------------------------Preparación de extendidos. Tinciones: simples, diferenciales, especiales.

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Límite de resolución

Antony van Leeuwenhoek

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Descripción de Van Leeuwenhoek de los “pequeños animáculos“ presentes en la placa dental. (First edition, Delft in Holland, 12 September 1683, to Francois Aston, Pag.11). Dibujó bacilos, micrococos y espirilos.

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Apertura numérica Máxima AN (teórica) En objetivos secos: n = 1 y alfa = 90° entonces AN = 1 En la práctica AN = 0.95 (ángulo 72 °)

En objetivos de inmersión: Índice de refracción

n = 1.51 y alfa = 90° entonces AN = 1.51 En la práctica AN = 1.45

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Apertura numérica

Apertura Numérica (AN) = n . sen (alfa) n = índice de refracción del medio entre el objeto y el objetivo (alfa) = mitad del ángulo descripto por el cono de luz que ingresa al objetivo.

Uso de un condensador

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Uso de Aceite de inmersión

•Máximo teórico de AN = 1: α = 90°, sin α = 1, naire = 1 •Práctico: AN máx. = 0.95 ángulo de apertura ~ 72° •Máximo teórico AN = 1.51: α = 90°, sin α = 1, noil = 1.51

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Poder de Resolución Distancia mínima entre dos puntos para que estos sean vistos como dos objetos individuales R = λ / (NA objetivo + NA condensador) R = λ /(2 NA) Si luz verde λ = 550 nm , NA = 1.4 (para inmersión) Entonces R = ?

Microscopio óptico Ocular Cabezal

Revolver Objetivos

Brazo

Ajuste de la platina Platina C d Condensador d

Macrométrico Micrométrico

Fuente de luz Base

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Distancia de trabajo

Diafragma

Microscopía de campo claro

Campo claro

Contraste de fases

Campo Oscuro

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Microscopía de campo oscuro 9 La luz reflejada sobre el espécimen entra al objetivo. Entonces observo el espécimen sobre un f d oscuro. fondo 9 Permite observar microorganismo vivos (sin teñir)

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Microscopía de contraste de fases 9 Convierte diferencias pequeñas en el n y la densidad celular en variaciones de intensidad de luz fácilmente detectadas. detectadas 9Permite observar microorganismo vivos (sin teñir) y seguir eventos dinámicos en células vivas (migración, división, etc.)

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Microscopía de Interferencia Diferencial (Nomarski) Aprovecha los efectos de interferencia entre las ondas que atraviesan la célula, para crear una imagen de la estructura celular viva, nítida y tridimensional

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Célula epitelial de mejilla humana

Campo Claro

Nomarski

Campo Oscuro

Microscopía de fluorescencia

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Microscopía de fluorescencia 9 Sensibilidad: Mediante fluorocromos permite detectar la presencia de moléculas en baja cantidad (DNA, proteínas)

Microscopía Confocal 9 Capacidad de obtener la imagen en secciones (planos) controlando la profundidad del espécimen. 9 Elimina el background !

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Microscopía Confocal vs Microscopía de fluorescencia Fluorescencia Pierde detalle por alta señal de emisión Confocal Las secciones plano por plano permiten evidenciar diferencias en estructuras

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Microscopía electrónica MICROSCOPIO DE LUZ

MICROSCOPIO ELECTRONICO

Iluminación

Haz de luz

Haz de electrones

Longitud de onda

2000 Å - 7500 Å

370 nm

Lentes

Vidrio

Electromagnéticas

Medio

Atmósfera

Vacío

Resolución

0,2 um = 200 nm

0,0003 um = 0,3 nm

Magnificación

10 x - 2000 x

100 x - 450000 x

Focalización

Mecánica

Eléctrica

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Microscopio electrónico de transmisión

Microscopio electrónico de barrido

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Microscopio de Fuerza Atómica (AFM)

Microscopio de túnel de barrido (Tunneling)

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Preparación de extendidos y tinciones

Colorantes Benzeno

Solvente orgánico sin color

Cromógeno

+ Grupo químico que imparte

Cromoforo Color al solvente

Colorante

+

Grupo químico que permite la iniciación Auxocromo del cromóforo permitiendo la formación de sales y la unión a fibras y tejidos

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Tinción Simple

Se utiliza para la visualización de la morfología, g , el tamaño y la disposición p

Tipos de

Gram

Separa entre grupos

tinciones Tinción Diferencial

Ácido alcohol resistentes Flagelos

Visualización de estructuras

Cápsula Esporas

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Preparación p de un extendido

Tinción simple (procedimiento)

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Tinción negativa (procedimiento)

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Tinción de Gram

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Tinción de Gram

Tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR)

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Tinción de Esporas (Schaeffer-Fulton)

Tinción de Esporas (Dorner)

Tinción de Cápsula

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Manipulación de cultivos

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