MICROSCOPIA INTRODUCCIÓN Existen diversos métodos de estudio de la célula y de los tejidos, el principal instrumento para investigar estas estructuras es el microscopio; existen así diferentes tipos, dependiendo de la estructura y tamaño de las muestras. Los microscopios más importantes son el óptico y el electrónico, cada uno de estos tienen sus extensiones correspondientes como por ejemplo: Microscopia óptica − de contraste − de fase − de interferencia − entre otros. Microscopia electrónica − de transmisión − de alta aceleración − de barrido Ambos instrumentos tienen que utilizar diversas técnicas preparatorias, cada una dependiendo del microscopio, estas técnicas son: a) fijación b) inclusión c) corte d) tinción cada técnica la conoceremos en profundidad en el proceso de observación de tejido de este informe, donde veras gracias a estas técnicas preparatorias cada estructura muy bien definida, gracias al tipo de tinción. Gracias a este tipo de instrumentos y sus diversas especialidades podremos ver y estudiar con mayor facilidad las células y tejidos. Objetivos • conocer los diferentes tipos de microscopios • Comprender las funciones de los microscopios electrónico y óptico; y conocer sus partes. • Comprender la utilidad de cada microscopio • Comprender el manejo del microscopio óptico • Conocer y aprender a observar una muestra cualquiera en el microscopio óptico

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• Llevar a la practica las diferentes precauciones dadas • Aprender sobre las tinciones MARCO TEORICO Existen muchos tipos de microscopios cada uno desarrollado con cualidades distintas par la observación de diferentes estructuras, algunos de ellos son: • Microscopio óptico • Microscopio de campo oscuro • Microscopio de fluorescencia • Microscopio de túnel de barrido • Microscopio de ultravioleta • Microscopio de polarización • Microscopio de contraste de fase • Microscopio electrónico de barrido • Microscopio digital • Microscopio cuántico MICROSCOPIO ÓPTICO El microscopio óptico se compone por parte mecánica y óptica. Los componentes ópticos constan de tres sistemas de lentes. 1.− El condensador ilumina el objetivo estudiado. 2.− El objetivo aumenta el objeto y hace que la imagen se vea en el ocular. 3.− El ocular incrementa aún más la imagen y la proyecta sobre la retina del ojo. Cabe destacar que este microscopio tiene un alto poder de resolución. Existe método para la preparación de muestras utilizadas en el microscopio óptico, los pasos son: 1.− Fijación: en este proceso la descomposición de la célula muerta, y se mantiene su estructura morfológica. Los líquidos fijadores utilizados son el alcohol, el acido acetilico y el formaldehído o formol. 2.− Inclusión y corte: como el material resultante de la fijación es muy blando para poder cortarlo, se procede a endurecer el material en una sustancia plástica que generalmente es parafina o resina, quedando apto para que se realice el corte con un instrumento llamado micrótomo. 3.− Tinción: este método es utilizado para colorear artificialmente las estructuras celulares. MICROSCOPIO ELECTÓNICO Esta construido por un cañón de electrones y un conjunto de lentes magnéticos que están dentro de una columna hecha al vació para evitar que los electrones se dispersen. El haz o flujo de electrones pasa a través de una muestra muy delgada y luego es enfocada para ampliar la imagen. Para la preparación de muestras utilizadas en el microscopio electrónico se emplean técnicas similares a las del microscopio óptico.

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1.− Fijación: consiste en ocupar glutaraldehido en vez de formol, ya que consigue una mejor preservación de los tejidos, luego se aplica osmio el que permite que se produzca un contraste en la muestra al chocar los electrones. 2.− Inclusión: se realiza en resinas plásticas, que proporciona una mayor dureza. 3.− corte: se utiliza un instrumento llamado ultramicrotomo que realiza cortes extremadamente finos, este instrumento utiliza cuchillos especiales muy afilados que pueden ser vidrio o diamantes. 4.− Contraste: como no se utiliza colorante o tintas aquí se emplean átomos de metales pesados, como el plomo y el uranio que acentúan el contraste proporcionado por el osmio. MATERIALES Y METODOS Los materiales que utilizamos en esta ocasión en el laboratorio de microscopia y en nuestra investigación fueron: • Microscopio óptico • Muestra de testículo de rana • Muestra de ovario de gata • Mielencéfalo de rata • Aceite de inmersión • Solución de alcohol • Paño par limpiar los objetivos Métodos • conocer las partes del microscopio y la correcta manipulación de éste. • luego colocar las muestras en la platina del microscopio. • colocar la muestra con el mínimo de poder de resolución 4X. • observar detalladamente la muestra que se nos paso. • mientras observamos las muestras, dibujamos lo observado tratando de distinguir sus partes. • luego de terminar el dibujo cambiar de aumento esta ves a la resolución de 10X. • realizamos lo mismo que en el objetivo anterior, observar y dibujar. • aumentaremos la resolución esta ves a 40X, y realizaremos los mismo procedimiento que con las muestras anteriores. • finalmente aumentaremos la resolución a 100X, con este objetivo es necesario utilizar aceite de inmersión para poder tener una mejor visión de la muestra. • luego de terminar de ver la muestra se baja la platina se cambia los objetivos con el revolver asta el mínimo (4X) y se limpia el objetivo de 100X con una solución de alcohol para sacar los restos de aceite de inmersión. − con las demás muestras se realizo lo ya antes nombrado. Resultado y discusión Esquema I−A Objetivo : Observación de testículos de mamíferos Material : Testículo de mamífero

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Método : Mediato (ósea que se ocupa tinsión) Tinción : Hematoxilina−eocina Aumento : 4X Observación: En la muestra se puede apreciar células, que podrían ser gónadas o células gameticas, que en su interior presentan un desmembramiento de la membrana interna, estas células se ven conectadas por un tejido conectivo. Discusión: En el campo visual se denota muchas estructuras ovoides, que corresponden a los tubulos seminíferos, en su interior presentan unas pequeñas partículas que corresponden a las células espermatogenicas, las cuales se encuentran en mayor número hacia la periferia y en el centro casi nada, el poder de aumento solo permite ver esto. Esquema II−A Objetivo : Observación de testículos de mamíferos Material : Testículo de mamífero Método : Mediato (ósea que se ocupa tensión) Tinción : Hematoxilina−eocina Aumento : 10X Observaciones: La figuras se ven mucho más grandes y se ven mejor las estructuras internas de la célula gametica, dentro de esta hay partículas que se tiñen mejor, que podrían ser los túbulo seminíferos, también se aprecia mejor el desprendimiento de partes de membrana que se encuentra mas particionado hacia el centro (se parece mucho a la figura de las crestas mitocondriales) Discusión: Al tener mayor poder de aumento, se denota mejor las estructuras internas, se ven menos tubulos seminíferos pero ahora son mas grandes, también las células espermatogenicas se aprecian mucho mejor, se evidencia que hay unas mas grandes que otras, las mas grandes están en la periferia y en el centro hay algunas células pequeñas. Esquema III−A Objetivo : Observación de testículos de mamíferos Material : Testículo de mamífero Método : Mediato (ósea que se ocupa tensión) Tinción : Hematoxilina−eocina Aumento : 40X Observaciones: Ahora se ve una sola célula, mas definida, donde se puede apreciar el desprendimiento de membrana y que junto a este desprendimiento hay muchas particulas que se encuentran mas teñidas que otras y encontrandose hacia hacia la periferia de la celula, donde estan en mayor numero y tamaño. 4

Discusión: Ahora solo se ve en el campo visual un solo túbulo seminífero y en su interior se puede apreciar claramente las distintas fases de desarrollo de las células espermatogenicas, en la periferia están los espermatogonios y en el centro algunos espermatocitos, también en algunas células espermatogónicas se ven unas manchas negras que deberían corresponder a las células de Sertoli. Esquema IV−A Objetivo : Observación de testículos de mamíferos Material : Testículo de mamífero Método : Mediato (ósea que se ocupa tensión) Tinción : Hematoxilina−eocina Aumento : 100X (aceite de inmersión) Observaciones: Solo se ve parte de la celula gametica, donde ahora apreciamos el desarrollo de distintas particulas, es decir, en la periferia las particulas son mas grandes y numerosas, dentro de estas particulas se aprecian unas manchas oscuras. Discusión: En el campo visual ahora ya no se ve el túbulo seminífero, solo parte de él, ahora solo se ven células espermatogónicas, pero lo que logramos ver fueron algunos espermatogonios y espermatocitos primarios, y en el interior de algunos espermatogonios hay una especie de nucleolos que corresponden a las células de Sertoli. Esquema I−B Objetivo : Observación de Ovario de gata Material : Ovario de gata Método : Mediato Tinción : Hematoxilina−eocina Aumento : 4X Observaciones: Se ven diversas estructuras, entre las cuales se ve unas manchas rojas, tiene unas figuras ovoides que están rodeadas de pequeñas manchas rojas, en el interior de esta especie de ovoide o huevo, tiene un citoplasma y un núcleo. Discusión: En el campo visual se aprecian diversas figuras circulares que no fueron teñidas que corresponde a los folículos a diferencia de los gametos masculinos, los gametos femeninos son muchos mas grandes. También se ve diferentes clases de tejidos conectivos y se ven unas zonas muy teñidas, que corresponde a los vasos vasculares, los folículos están inmersos en el estroma del ovario. Esquema II−B Objetivo : Observación de Ovario de gata Material : Ovario de gata 5

Método : Mediato Tinción : Hematoxilina−eocina Aumento : 10X Observaciones: Solo se aprecia un ovoide, en el cual hay una membrana plasmática, dentro de la cual se observa un citoplasma, y en el se encuentra una especie de núcleo en el cual hay unas manchas parecidas a el nucleolo. Alrededor de la celula ovoide, hay unas manchas rojas con formas diversas. Discusión: Cuando incrementamos poder de aumento se denota mucho uno de los folículos primarios se alcanza a ver la membrana basal de el folículo, se aprecia una esfera mas pequeña dentro del folículo, la cual tiene un poco de tinsión que corresponde al oocito y también se ve mejor el estroma del ovario que rodea al folículo. Esquema III−B Objetivo : Observación de Ovario de gata Material : Ovario de gata Método : Mediato Tinción : Hematoxilina−eocina Aumento : 40X Observaciones: En el núcleo se ven los poros nucleares que está rodeado por unas partículas que dan al interior (células de las granulosas)del citoplasma (células de las granulosas), terminando en otras partículas, llegando así al exterior del núcleo. Discusión: En el campo visual ahora solo se observa parte del oocito que corresponde a la zona pelusida, luego se ven hartas partículas esféricas teñidas que podría ser células de la granulosa, también se aprecia parte de la membrana basal. Esquema IV−B Objetivo : Observación de Ovario de gata Material : Ovario de gata Método : Mediato Tinción : Hematoxilina−eocina Aumento : 100X (aceite de inmersión) Observaciones: En el núcleo ahora se puede apreciar los poros nucleares con mayor nitidez, rodeado por una especie de estructura amarilla que está envuelta por partículas, llegando al especie de células de granulosas. Discusión: Podemos observar que se aprecian mejor las células de la granulosa, que en el campo visual cubren la gran mayor parte, también se ve parte del oocito y después la zona pelusida no se aprecian más estructuras. 6

Esquema I−C Objetivo : Observación de bulbo raquídeo sin madurar de rata Material : Mielencefalo de rata Método : Mediato Tinción : Van gieson Aumento : 4X Observaciones: Se puede apreciar que la célula está rodeada por un límite celular, que están incrustadas en ella pequeñas partículas de color café. También hay unos filamentos que llegan hacia el límite celular. Discusión: Esquema II−C Objetivo : Observación de bulbo raquídeo sin madurar de rata Material : Mielencefalo de rata Método : Mediato Tinción : Van gieson Aumento : 10X Observaciones: En el límite celular ahora se puede apreciar dentro de ella unos filamentos y otras partículas pequeñas. Discusión: dentro de la estructura ahora se pueden apreciar a las partículas que corresponden a las neuronas Esquema III−C Objetivo : Observación de bulbo raquídeo sin madurar de rata Material : Mielencefalo de rata Método : Mediato Tinción : Van gieson Aumento : 40X Observaciones: En el límite celular, las partículas se aprecian más grande y ahora se aprecian unas manchas que no se habían visto, que es el núcleo. Discusión: por lo investigado Esquema IV−C 7

Objetivo : Observación de bulbo raquídeo sin madurar de rata Material : Mielencefalo Método : Mediato Tinción : Van gieson Aumento : 100X (aceite de inmersión) Observaciones: Ahora se nota más el núcleo que está rodeado por varias partículas Discusión: DESARROLLO DE PREGUNTAS 1.− ¿Qué diferencia existe en la preparación de una muestra para microscopia electrónica y óptica? Los pasos a seguir son muy parecidos pero existe diferencias para la fijación, en el microscopio óptico es más habitual usar formaldehído mientras que para la microscopia electrónica se usa glutaraldehido, otra diferencia podemos notarla en las tinciones que son las responsables de identificar algunas unidades estructurales de la célula, en las ópticas se usa tinciones que colorean artificialmente los componentes celulares y en la electrónica se emplean átomo de metales pesados. 2.− ¿Qué tipos de tinción existen en microscopia óptico? Describa las distintas funciones y sus aplicaciones. • Tinción de Gram: se distinguen las bacterias • Tinción de giemsa: se aplica en frotis de sangre • Verde malaquita: tinción de esporas • Verde malaquita más orseina: células vegetales • Hematoxilina eocina: principalmente tejidos (núcleo y citoplasma) • Tinción de PAS revela glicoproteina neutras, musina y el glucogeno • Entre otras. 3.− ¿Qué métodos existen para poder marcar una muestra en microscopia electrónica? Para marcar las muestras de un microscopio electrónico no se emplean colorantes como en la óptica, si no que se utilizan átomos de metales pesados como el Uranio y el Plomo los que actúan como contraste proporcionado por el osmio. 4.− ¿Qué diferencia existe entre Micrótomo y ultramicrótomo? − Ambos son tipos de instrumentos para cortar muestras, sus nombres depende del espesor del corte. Micrótomo: instrumento para cortar partes finas de tejidos de los ejemplares (espesor: algunas micras) Ultramicrótomo: micrótomo modificado para cortar muestras ultra finas para ser examinadas en el microscopio electrónico. Su punta o filo son de cristal o diamante (espesor 20 y 80 nanómetros) 5.− ¿Qué función tiene el aceite de cedro? − Es un sustitutivo del xilol, como agente clarificante, en la preparación de especimenes para el examen microscópico. 8

6.− ¿Por qué es necesario que las muestras sean teñidas? ¿Cual es su objetivo? − Como la célula esta compuesta principalmente de agua y ésta es transparente es prácticamente improbable que se pueda distinguir con éxito su estructura, es por eso que se utilizan tintas para su tinción, estas tintas tienen la característica de ser especificas para algunas estructuras. SEGÚN LO INVESTIGADO A.− ¿Qué microscopio es el más adecuado para estudiar células in vivo? Microscopio de contraste de fase y el mas especifico para este tipo de células es el microscopio de nomarski. B.− ¿Qué método de tinción marca a los grupos glucosaminoglicanos? El método llamado Pas (ácido periódico mas reactivo de schiff) el reactivo de schiff se prepara en base de fuccina básica, que se trata con metadisulfito de sodio dando un leuco derivado incoloro al que llamamos reactivo schiff. Primero se pone un poco de acido periódico, al haber glucosaminomicano se libera CHO y este grupo amino se le pone reactivo de schiff quedando la muestra de un color rojo o púrpura. C.− ¿Que rol cumplen los alcoholes, la parafina y algunos metales pesados en la metodología de la preparación de una muestra? ¿Para que tipo de microscopio es cada una de ellas? Los alcoholes tienen un rol de fijación y se usan en el microscopio óptico. La parafina se usa para que en la muestra se forme un bloque un tanto sólido para que sea más fácil la manipulación y posterior corte de la muestra, y estas muestras se usan en el microscopio electrónico. Los metales pesados se utilizan para contrastar el tejido en estudio y se usan en el microscopio electrónico. CONCLUSIÓN Hemos comprobado que el microscopio es un instrumento de gran importancia y utilidad para el desarrollo científico, en parte es esencial para el estudio más profundo de la biología como ciencia, ya que nos permite observar y analizar imágenes que no son visible para el ojo humano. Con las muestras dadas en el laboratorio nos hemos dado cuenta de muchas cosas nuevas para nosotros, como por ejemplo las diferentes clases de microscopios, de la real utilidad e importancia de éstos y de las diferencias estructurales de los tejidos observados. Durante el desarrollo del laboratorio, aprendimos la función que cumple la tinción y el cómo aplicarla, todo esto se debe a que la célula posee como mayor componente el agua y es por eso que muchas estructuras no son claramente visibles, por esta razón, las células son teñidas para poder observar con mayor claridad o nitidez sus diversas estructuras. Por ende existen diferentes tinciones las cuales están creadas para reconocer estructuras específicas. También debemos siempre tener presente que en la observación microscópica del espécimen observado o la muestra a observar aparecerá invertida, por lo que debemos tener muy presente en nuestra mente cuando estamos en frente a un microscopio, lo que veremos, estará en sentido contrario y no debemos confundirnos por este hecho, un ejemplo de esto, es que si observáramos un trozo de papel con letras podríamos ver que las letras se van a apreciar invertidas, y que las estructuras celulares se apreciarán en forma bidimensional y 9

tridimensional. BIBLIOGRFÍA De Robertis, E., Hib, J. Fundamentos de Biología Celular y Molecular de De Robertis. 4ta ed. Buenos Aires. El Ateneo, 2004. Pp.401−411. Geneser, Finn. Histología. 3° ed. Buenos Aires, Panamericana.2005.Pp.32−35. Junqueira,L., Carneiro, J. Biología básica.4° ed. España.Masson. 1996. Pp.3−14. http://html.rincondelvago.com/microscopio−optico.html Visitada el día 10/04/06 Ultima actualización febrero 2005

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