UNIVERSIDAD PRIVADA JOSE CARLOS MARIATEGUI

FACULTAD DE INGENIERIA AGRONÓMICA

MÓDULO NEMATOLOGIA EN HORTALIZAS Y FRUTALES

MOQUEGUA - PERÚ

INDICE PRIMERA UNIDAD LECCIÓN N° 1. GENERALIDADES DE LA NEMÁTOLOGIA 1. CONCEPTOS Y DEFINICIONES 2. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA 3. FILOGENIA 4. MORFOLOGIA DE LOS NEMÁTODOS 4.1. FORMA DEL CUERPO 4.2. COMPONENTES DEL CUERPO 4.3. COLOR DE LOS NEMÁTODOS 4.4. SIMETRÍA DE LOS NEMÁTODOS 4.5. CUBIERTA CORPORAL DE LOS NEMÁTODOS 4.6. CUTICULA O EXOESQUELETO 5. NUTRICIÓN DE LOS NEMÁTODOS 6. RESPIRACIÓN DE LOS NEMÁTODOS 7. DIGESTIÓN DE LOS NEMATODOS 8. EXCRECIÓN DE LOS NEMÁTODOS 9. ÓRGANOS DE LOS SENTIDOS 10. REPRODUCCIÓN DE LOS NEMÁTODOS 11. CICLO DE VIDA DE LOS NEMÁTODOS 12. SINTOMATOLOGÍA DE LAS ENFERMEDADES CAUSADAS POR NEMÁTODOS

LECCIÓN N° 2. NEMÁTODOS DAÑINOS A HORTALIZAS Y FRUTALES 1. MELOIDOGYNE SPP. (NEMÁTODOS AGALLADORES) 1.1. CULTIVOS SUCEPTIBLES A DAÑOS 1.2. BIOLOGIA 1.3. SINTOMAS 1.4. CONTROL 2. PRATYLENCHUS SPP. (NEMÁTODOS LESIONADORES) 2.1. CULTIVOS SUCEPTIBLES A DAÑOS 2.2. BIOLOGIA 2.3. SINTOMAS 2.4. CONTROL

3. GLOBODERA SPP. Y HETERODERA SPP. (NEMÁTODOS QUÍSTICOS) 3.1. CULTIVOS SUCEPTIBLES A DAÑOS 3.2. BIOLOGIA 3.3. SINTOMAS 3.4. CONTROL 4. DITYLENCHUS SPP. (NEMÁTODOS DE LOS TALLO Y LOS BULBOS) 3.1. CULTIVOS SUCEPTIBLES A DAÑOS 3.2. BIOLOGIA 3.3. SINTOMAS 3.4. CONTROL

SEGUNDA UNIDAD LECCIÓN N° 3. PRINCIPIOS DEL CONTROL NEMATOLÓGICO 1. INTRODUCCIÓN 2. PREVENCIÓN 3. CONTROL QUIMICO 4. PLANTAS Y PRODUCTOS ALELOPÁTICOS 5. MEDIOS CULTURALES 5.1. BARBECHO 5.2. ROTACIONES 5.3. SOLARIZACIÓN 5.4. VAPOR DE AGUA 5.5 ENCHARCAMIENTO 5.6. ADICIÓN DE MATERIA ORGÁNICA Y BIOFUMIGACIÓN 6. RESISTENCIA 7. CONTROL BIOLÓGICO

LECCIÓN N° 4. MANEJO INTEGRADO DE ENFERMEDADES NEMATOLÓGICAS 1. INTRODUCCIÓN 2. TOMA DE MUESTRAS PARA DIAGNÓSTICO NEMATOLÓGICO 3. PRECAUCIONES PARA OBTENER RESULTADOS PRECISOS 4. HONGOS CAPTURADORES DE NEMÁTODOS

LECCIÓN N° 5. MÉTODOS PARA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DEL SUELO 1. MÉTODO DE LA BANDEJITA 2. MÉTODO DE TAMIZADO Y DECANTACIÓN DE COBB (1981) MODIFICADO 3. MÉTODO DE CHRISTIE Y PERRY (1951), MODIFICACIONES MÉTODO BAERMAN 4. MÉTODO DE CENTRIFUGACIÓN EN AZÚCAR 5. MÉTODO MODIFICADO DE FENWICK 6. MÉTODO DE LA ACETONA 7. MÉTODO DE BAUNACKE 8. MÉTODO DE LA COCA COLA 9. CONTAJE DE QUISTES Y DE HUEVOS DE GLOBODERA SP.

LECCIÓN N° 6. MÉTODOS PARA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DE TEJIDO VEGETAL 1. MÉTODO DEL LICUADO 2. MÉTODO DEL LICUADO, TINCIÓN Y MICROONDAS 3. MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE HUEVOS DE MELOIDOGYNE SP. 4. MÉTODO DE FUCSINA ÁCIDA-LACTOFENOL

LECCIÓN N° 7. PROCESO DE MUERTE, FIJACIÓN Y MONTAJE DE NEMÁTODOS 1. MUERTE 2. FIJACIÓN 3. MONTAJE

PRIMERA UNIDAD LECCIÓN N° 1. GENERALIDADES DE LA NEMATOLOGIA

1. CONCEPTOS Y DEFINICIONES La Nematología es la ciencia que estudia a los nemátodos. Los nemátodos son animales multicelulares

generalmente

microscópicos

que

poseen

los

principales

sistemas

fisiológicos, con excepción del sistema respiratorio y circulatorio. Los nemátodos (Nematoda Rudolphi, 1808) forman el mayor grupo de asquelmintos (Aschelminthes GROBBEN, 1910) o nematelmintos (Nemathelminthes GEGENBAUER, 1859), con unas 80,000 especies descritas en la bibliografía científica. Algunos investigadores calculan que existen realmente alrededor de un millón de especies. Se les considera como una clase zoológica o, de acuerdo con un número creciente de zoólogos, como un filo independiente. La palabra "Nematodo" procede del término nematoide, que significa "similar a un hilo". Incluye a organismos que reciben nombres comunes como "gusanos redondos", "gusanos filamentosos", "lombrices" o "anguílulas". Los

nemátodos están presentes en todos los ambientes y son casi imperceptibles a

simple vista. La mayor parte de ellos son microscópicos y transparentes, aunque algunos nemátodos marinos pueden medir hasta 9 metros de longitud, pudiendo haber más de un millón de nemátodos por metro cuadrado de suelo.

Figura N°1. Micrografía electrónica de un nemátodo fitoparásito

La caracterización de los nemátodos aún está sometida a revisión. Si bien hay

unas

10,000 especies de nemátodos en total, sólo existen en el suelo unas 1,000 especies. En una sola muestra de tierra, es posible que sólo haya de 10 a 25 especies. Los

nemátodos parasitan plantas y animales que habitan sobre el suelo. De esta

manera, son los responsables de los nudos de la raíz de la vid

y de la formación de

quistes en la soya. La mayor parte de las infestaciones patógenas de las plantas causadas por nemátodos, sólo pertenecen a unas cuantas especies de nemátodos fitopatógenos. Los nemátodos

de

vida

libre

suelen

encontrarse en los 10 cm superiores del

contorno del suelo, habitando un 90% de éstos en los 15 cm superiores de éste. De este modo, los nemátodos resultan activos en capas de agua, si bien algunos resisten los ciclos de sequía, formando quistes, o bien atraviesan un período de reposo. Las poblaciones de nemátodos son mayores en ambientes orgánicos con un pH neutro, aunque su presencia no se restringe a estos ambientes. Asimismo, dichas poblaciones son más numerosas cerca de las raíces de las plantas que en otros lugares. Algunas especies de alimentan

de

la

(población de la

nemátodos parasitan

rica

raíces

población microbiana

que

vivas, habita

mientras cerca

que

de

otras

estas

se

raíces

rizosfera). Estas poblaciones elevadas reflejan el alto contenido de

materia orgánica que hay cerca de las raíces. Los nemátodos presentan altos niveles reproductivos, con cinco y seis generaciones anuales. Pueden depositar miles de huevos, formando “paquetes”. Los nemátodos

no

participan

directamente

en

la descomposición de la materia

orgánica. Por el contrario, son saprófitos o depredadores.

Los

nemátodos

de

vida

libre consumen microorganismos, mientras que los otros se alimentan de rotíferos y protozoos. En vista de que los nemátodos pueden consumir hasta 5,000 células por minuto, ayudan a regular las poblaciones microbianas del suelo. Los nemátodos son parasitados, a su vez, por otros organismos del suelo y son consumidos como parte de la cadena alimenticia del suelo.

Figura N°2. Nódulos en raíces

2. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA Los nemátodos pertenecen al: Reino: Metazoa Sub reino: Eumetazoa División: Bilateralia Sub división: Protostonia Super phylum: Pseudocelolates Phyllum: NEMATA Debido a su gran variedad de formas de vida, los nemátodos se han estudiado por investigadores de distintas disciplinas interesados en grupos particulares. Por ello, se han

investigado

independientemente

los

de

vida

libre,

los

zooparásitos

y

los

fitoparásitos, habiéndose propuesto diferentes formas de clasificación. Su ordenación en géneros, familias y superfamilias es satisfactoria, pero la ordenación en grupos superiores es controvertible. La clasificación más aceptada de los nemátodos es la propuesta por B. G. Chitwood y M. B. Chitwood (1950), según la cual forman un filo dividido en dos clases, Phasmidia y Aphasmidia. La clase Phasmidia (Fasmidios o Fásmidos) o Secernentea (Secernétidos) incluye a los Nematodos provistos de fasmidios, órganos sensoriales, pares en forma de pequeñas bolsas que se ubican en la zona caudal. Estructuras pares similares (anfidios) del extremo anterior, están escasamente desarrolladas. Sistema excretor presente, con uno o dos canales laterales, con o sin células glandulares asociadas.

Los Fásmidos comprenden parte de las especies que habitan en el suelo, la mayoría de los parásitos animales y casi todos los parásitos de los vegetales. Entre los fásmidos se encuentran los estrongilinos, los ascaridinos (grupo al que pertenecen los Ascaris y los Oxiuros) y los espirulinos (al que pertenecen las filarias, como Wuchereria). La clase Aphasmidia (Afasmidios o Afásmidos) o Adenophorea (Adenofóridos) incluye a los que carecen de glándulas fasmidiales y poseen anfidios de formas variables, generalmente bien desarrollados, detrás de los labios. Sistema excretor con una o más células excretoras (renetas). Comúnmente con glándulas hipodérmicas y caudales. La mayoría son de vida libre. Comprenden a casi todas las especies acuáticas, tanto dulceacuícolas como oceánicas, parte de las especies del suelo, parte de los parásitos animales (como las triquinas Trichinella y tricoféfalos Trichuris) y algunos parásitos de los vegetales.

3. FILOGENIA Antiguamente se consideró a los nemátodos como un grupo aislado evolutivamente. Hoy no cabe duda que están emparentados con los Gastrotricos, cuyos representantes marinos presentan claras afinidades con los nemátodos, especialmente por sus faringes y cutículas. Posiblemente también tengan afinidades con los nematomorfos. Según algunos zoólogos, los gastrotricos, nemátodos y nematomorfos derivan de un único grupo de platelmintos turbelarios acélicos. En general, se considera que los gastrotricos son más primitivos. Las relaciones evolutivas con otros grupos de pseudocelomados son menos claras y muchos de sus caracteres comunes podrían deberse a fenómenos de convergencia evolutiva. Dentro del grupo Nematodos es difícil determinar líneas filogenéticas, aún se discute acerca de cuáles deben considerarse más primitivo.

4. MORFOLOGIA DE LOS NEMÁTODOS Los nemátodos son parecidos a los gusanos, con cuerpo vermiforme y un tubo digestivo que recorre longitudinalmente su cuerpo desde la boca al ano. Miden menos de un milímetro de longitud, por lo que se precisan potentes lupas binoculares o microscopios para observarlos.

En algunas especies el cuerpo de la hembra difiere en su forma de la del macho, presentando una silueta en forma de pera o casi esférica debida normalmente a la presencia de huevos. Presentan un dimorfismo sexual marcado, sobre todo en la parte final del cuerpo, el macho es más grueso y corto que la hembra, cuyo cuerpo es absolutamente liso. El cuerpo es homogéneo y carece de apéndices complementarios. Los

nematodos

fitopatógenos se caracterizan por la presencia en su cuerpo del llamado estilete, una espina dura y hueca con la que absorben la savia de las plantas.

4.1. FORMA DEL CUERPO Los nemátodos tiene formas diferentes interna y externamente, pero existe una forma universal que incluso sirvió para darles nombre y es la forma fusiforme, en donde se notan claramente dos ejes, uno longitudinal alargado y otro transversal muy corto. El acortamiento o alargamiento de estos ejes le da forma característica a cada tipo de nemátodo. La forma típica, al corte transversal presente forma típicamente circular y los diámetros anterior y posterior son menores que en el diámetro medio. De acuerdo a las variaciones en las longitudes de los ejes las formas del cuerpo pueden ser: Cilíndrica: Cuando los ejes transversales en sus tres puntos

son casi iguales:

Trichodorus. Subcilindrica: El diámetro anterior es

de menor tamaño que el medio y el

posterior. Tylenchorhynchus, Helycotylenchus. Fusiforme: Ditylenchus Filiforme: El diámetro medio anterior y posterior similar a fusiforme pero el eje longitudinal es bastante largo. Vermiforme ensanchado: Agrandamiento del diámetro más que el anterior y posterior.

Redondeada: Diámetro medio y posterior ensanchados grandemente, se produce atrofia muscular y origina incapacidad de movimiento. Piriforme: Meloydogine Limón Rugoso: Heterodera Ensanchado irregular: Rotylenchulus, Nacobbus, Tylenchulus

4.2. COMPONENTES DEL CUERPO Esencialmente el cuerpo del nemátodo esta constituido por dos tubos o cilindros: uno externo, otro interno y uno interno al tubo digestivo. Los arreglos musculares o músculos de la pared se encuentran en forma longitudinal. Los órganos se encuentran uno a continuación de otro dentro del cuerpo y no uno junto al otro. Los órganos son seriados uno a continuación del otro. La cavidad del cuerpo presente líquido pseudocelomático y la forma redondeada del cuerpo se debe a que la cavidad del cuerpo se mantiene turgente en forma bastante significativa y también a la presencia de la pared del cuerpo que es bastante rígida.

4.3. COLOR DE LOS NEMÁTODOS Los nemátodos generalmente presentan el cuerpo incoloro, transparente. Cuando se observa

coloreado es por el tipo de material alimenticio acumulado en el

intestino. Para su observación se requiere iluminación de abajo hacia arriba.

4.4. SIMETRIA DE LOS NEMÁTODOS La simetría de los nemátodos debería ser bilateral, es decir, que todos los órganos deberían estar por duplicado y al corte transversal deberían aparecer como un espejo ósea uno frente al otro. Pero por procesos evolutivos la simetría bilateral es mínima, predominan en el nemátodo posiciones asimétricas de órganos así como posiciones radiales.

4.5. CUBIERTA CORPORAL DE LOS NEMÁTODOS La pared corporal es un saco músculo-cutáneo, en el que se comprenden el aparato excretor y el sistema nervioso. El saco músculo-cutáneo limita el pseudoceloma, que contiene al aparato digestivo y el reproductor. El cuerpo está cubierto por una cutícula resistente delgada, cubierta quitinosa que a menudo tiene un relieve en forma de anillos y cubre la faringe, digestivo posterior y otras aberturas corporales. La cutícula de la superficie corporal general suele presentar ornamentaciones (punteaduras, verrugas, costillas, espinas o sedas). A veces hay un conjunto variable de prominencias cuticulares (alas), que pueden encontrarse a lo largo de la longitud del cuerpo, en la región cervical o en la región caudal del macho (en algunos se encuentra allí una expansión formada por tres lóbulos, con función copuladora). La pared del cuerpo es la parte del cuerpo que lo pone al nemátodo en contacto con el medio ambiente por un lado y por el otro con el pseudoceloma. Está formado por tres partes fundamentales: la cutícula, la hipodermis (epidermis, subcuticula o lámina media) y la capa muscular. El rol de la pared es el intercambio gaseoso, movimiento y protección de los órganos internos.

4.6. CUTICULA O EXOESQUELETO La cutícula, gruesa, es un producto elástico de las células epidérmicas subyacentes. Entrega un soporte resistente, protege de algunos compuestos tóxicos y permite aumentar o disminuir el volumen corporal sin cambiar la presión del líquido perivisceral. En la cutícula predominan proteínas similares al colágeno, y la capa externa contiene una proteína del tipo de las queratinas, cubierta por una película lipídica. La cutícula consta de tres zonas: capa basal (estriada, laminada o con fibras helicoidales), capa mediana, que varía entre una estructura granular uniforme hasta varillas, fibrillas o canales, y capa cuticular externa, cortical o córtex (frecuentemente anillada y dividida en parte externa e interna).

Estas capas están formadas por fibras entrecruzadas, que confieren cierta elasticidad longitudinal, pero limitan la capacidad de extensión lateral. Las tres capas pueden estar subdivididas en estratos y a ellas se agrega una epicutícula delgada, que puede presentar una cubierta de quinona. La superficie cuticular puede

tener

modificaciones,

punteaduras, que

actúan

verrugas, como

costillas,

órganos

espinas,

sensoriales

o

sedas

u

participan

otras en

la

locomoción. En los nemátodos el crecimiento se acompaña normalmente de cuatro mudas de la cutícula. La cutícula antigua se separa de la epidermis subyacente empezando por el extremo anterior y el animal segrega la cutícula nueva. La cutícula antigua se desprende entera o en fragmentos, pero puede ser absorbida parcialmente por la nueva cutícula. Antes de cada muda, la epidermis se engruesa y forma una gran cantidad de ribosomas. En el animal adulto no hay mudas, pero la cutícula continúa expandiéndose mientras el animal crece. Bajo la cutícula existe una subcutícula o epidermis, generalmente celular, aunque en parásitos a veces es sincicial. La epidermis consta de pocas series de células, generalmente ocho. La epidermis secreta la cutícula, mantiene reservas de nutrientes, contiene fibras de anclaje que unen la musculatura a la cutícula y en algunas especies endoparásitas es una importante superficie de absorción de nutrientes. La epidermis de los nemátodos se expande hacia el interior, formando cuatro crestas o prominencias longitudinales a lo largo de las líneas media dorsal, media ventral y medias laterales (líneas o cordones longitudinales o crestas epidérmicas). Estos cordones son menos prominentes en las zonas dorsal y ventral, y pueden desaparecer en los extremos del cuerpo. Incluyen a los troncos nerviosos (líneas medioventral y mediodorsal) y a los canales excretores (líneas laterolongitudinales) que dividen a la musculatura en cuatro campos. Generalmente los núcleos epidérmicos se restringen a estos cordones. Las zonas de epidermis situadas entre las protuberancias son campos plasmáticos anucleados y delgados. Ciertas especies parásitas, como triquina, carecen de campos laterales; otras como el tricocéfalo presentan un revestimiento muscular no interrumpido (holomiarios).

En muchas especies parásitas y de vida libre hay glándulas cutáneas. Son especialmente constantes tres grandes glándulas adhesivas del extremo posterior del cuerpo, con las cuales los animales pueden fijarse al substrato. El sistema muscular está constituido por células mioepiteliales, las que forman una capa muscular, que corresponde a la musculatura somática general, y músculos especializados.

La

capa

muscular

está formada

por

células

mioepiteliales,

fusiformes, que forman fibras longitudinales, situadas en cuatro bandas o cuadrantes (dos masas musculares dorsales y dos ventrales, separadas en sentido longitudinal por una línea dorsal, una línea ventral y dos líneas laterales, formadas por relieves de la subcutícula, entre los cordones longitudinales. Muchos nemátodos tienen sólo entre dos y cinco músculos en cada campo (meromiarios),

otros

tienen

muchas

células

musculares

en

cada

campo

(polimiarios). Las fibras pueden ser anchas y planas, o bien altas y estrechas, según la especie. Los músculos somáticos comprenden dos tipos principales, aunque pueden encontrarse formas intermedias: celomiarios y platimiarios. Los músculos "celomiarios" presentan fibrillas contráctiles en la periferia, sobre tres lados, faltando en la cara que va a la cavidad corporal; mientras que los músculos "platimiarios" son aquellos en los que las fibrillas contráctiles se limitan a la capa basal, junto a la epidermis. Las células musculares de los nemátodos son las únicas que tienen extensiones nerviosas, cada fibra muscular posee un brazo delgado que va hasta el cordón nervioso longitudinal, dorsal o ventral, donde se produce la inervación. Los músculos especializados se utilizan para el movimiento de partes especiales del cuerpo, por ejemplo los músculos labiales para la prehensión de alimento, músculos faríngeos para engullir, músculos rectales para la defecación y músculos copuladores, asociados a los órganos reproductores, ya sea espículas o vulva. De fuera a adentro, presenta las siguientes capas: Cutícula, muy gruesa, está estratificada, compuesta fundamentalmente de colágeno. Sirve para proteger al animal del ambiente hostil del hospedador, cuando el animal es parásito. Le permite colonizar ambientes hostiles. Esta cutícula es producida por la epidermis subyacente.

Epidermis, Monoestratificada. Puede ser celular o sincitial. Presenta cuatro entrantes hacia el pseudoceloma que reciben el nombre de cordones epidérmicos, que recorren longitudinalmente el cuerpo del animal; uno por la línea mediodorsal, otro por la línea medioventral y otros dos mediolaterales. En los cordones están los núcleos de las células epidérmicas. En el cordón epidérmico dorsal y ventral se localizan los cordones nerviosos longitudinales. En los cordones epidérmicos laterales se localizan los conductos excretores. Musculatura, Es longitudinal y estriada. Son células exclusivas, ya que conectan con el sistema nervioso mediante prolongaciones citoplasmáticas.

Bajo la

musculatura se localiza el pseudoceloma. El hecho de que la musculatura sea longitudinal hace que el movimiento de estos animales esté reducido al serpenteo. La musculatura está dividida en cuatro paquetes o campos musculares, separados por los cordones epidérmicos. Pseudoceloma, El pseudoceloma o pseudocele es una cavidad derivada del blastocelo, ubicada entre las vísceras y la pared corporal, no está tapizada por peritoneo y posee líquido perivisceral en su interior. La cavidad se extiende desde la musculatura hasta el tubo digestivo, y rodea a los órganos

reproductores.

Su

alta

presión

hidrostática

(fuerte

turgencia)

conjuntamente con la cutícula, actúan como antagonista elástico (hidroesqueleto) de la capa longitudinal muscular, lo que se correlaciona funcionalmente con la ausencia de músculos circulares. En las especies pequeñas de vida libre, el pseudocele es reducido o no existe, en las formas grandes, como Ascaris, es voluminoso, ocupado por un tejido muy laxo con células que presentan enormes vacuolas. El líquido perivisceral, a presión, funciona

como

un

hidrostato.

Contiene

metabolitos

orgánicos,

incluyendo

hemoglobina en algunas especies. En nemátodos parásitos suele contener substancias tóxicas, especialmente hemolíticas para el huésped. En las paredes del pseudoceloma existen células fagocitarias fijas, importantes en la defensa interna.

5. NUTRICIÓN DE LOS NEMÁTODOS Muchas especies de vida libre son carnívoras y otras fitófagas. Las formas marinas y de agua dulce se alimentan de diatomeas, algas, hongos y bacterias. Para muchas especies terrestres de nemátodos son importantes como alimento las algas y los hongos. Abundan las especies terrestres que perforan las raíces vegetales para succionar su contenido. Estos nemátodos producen grandes pérdidas comerciales. También hay muchas especies que ingieren partículas de substrato (sedimentívoras), que al igual que las que viven en materia orgánica muerta (estiércol, cadáveres) se nutren en realidad de bacterias y hongos. Algunas especies son saprófagas, se alimentan succionando cadáveres de pequeños animales o plantas muertas, o sus restos en diversos estados de descomposición. El nemátodo del vinagre, Turbatrix aceti, vive en el sedimento del vinagre sin pasteurizar. Los nemátodos son el grupo de consumidores de bacterias y hongos más abundante y cosmopolita, por lo que tienen gran importancia en las cadenas tróficas. El aparato digestivo es casi rectilíneo, raramente ondulado. Se extiende entre la abertura oral (anteroterminal) y la abertura anal (subterminal), que puede faltar. Comprende un estomodeo (boca, cavidad bucal y faringe), un mesenterón (intestino medio) y un proctodeo (intestino terminal, que puede ser recto o cloaca). En la región bucal se manifiestan las mayores variaciones. La boca carece de probóscide, pero a menudo está muy diferenciada y tapizada por cutícula. La superficie cuticular puede espesarse y estar reforzada por bordes, varillas o placas, o llevar dientes afilados, puntiagudos (onchia). La boca está rodeada por un número variable de lóbulos salientes o de labios y sensilas de varios tipos. En muchas especies marinas la boca está rodeada por 6 lóbulos en forma de labio, 3 a cada lado. Debido a fusión, las formas terrestres y parásitas suelen tener sólo 3 labios. Primitivamente los labios y la superficie anterior externa a ellos tienen 18 sensilas. La boca conduce a una cavidad bucal o estoma, más o menos tubular y recubierta por cutícula. Los detalles estructurales de la cavidad bucal están relacionados con los hábitos alimentarios y son importantes en la identificación de las especies. La cavidad bucal puede ser un tubo estrecho o un espacio oval o con forma de taza.

Cuando la cavidad bucal está muy especializada, puede dividirse en una cámara anterior, cerrada por los labios; un prostoma largo, y un telostoma. En algunos carnívoros y vegetarianos, en la cavidad bucal hay un largo estilete oral o lanza bucal, hueco o macizo, que puede salir de la boca mediante acción muscular. Los estiletes sirven para punzar a la presa, y el estilete hueco actúa, además, como un tubo por donde la faringe succiona. El estilete a veces se origina en una modificación del epitelio de la cavidad bucal (estomatostilo) y otras veces por una importante modificación de un diente (odontostilo). Los Nematodos que viven en el interior de tejidos animales y los saprófagos de vida libre se alimentan predominantemente de líquidos y su región bucal se reduce a un poro diminuto que conduce a la faringe. En los Nematodos carnívoros hay frecuentemente dientes, protuberancias grandes, placas cortantes, raspas o dentículos pequeños y abundantes. Detrás de la boca puede haber una cápsula bucal con dientes en su base. La cavidad bucal se abre hacia una faringe tubular denominada esófago o faringeesófago. La luz faríngea es trirradiada en sección transversal, contiene fibras musculares radiales y también está revestida por cutícula. La pared tiene células mioepiteliales y glandulares. En algunos casos es un tubo no especializado, pero generalmente está especializada por regiones y varía ampliamente en cuanto a su forma y a la proporción relativa de tejidos glandulares y musculares. Muchos nemátodos vegetarianos poseen un engrosamiento oval alrededor del centro de la faringe. Entre los zooparásitos la faringe puede presentar diferentes características. Algunos presentan un ventrículo glandular no muscular y posterior, que puede alargarse, o tienen la faringe dividida en una porción anterior corta y una porción muscular posterior más ancha. Las glándulas faríngeas secretan enzimas que inician la digestión del alimento o ayudan a la penetración de los nutrientes a través de la pared celular. Las secreciones enzimáticas se proyectan fuera de la boca realizando una predigestión de los alimentos, previa a su ingestión. Algunos Nematodos tienen una o más protuberancias musculares (bulbos o ciegos) en el extremo posterior de la faringe, que funcionan como bombas que llevan el alimento líquido hacia el intestino. A menudo hay válvulas. Mientras la faringe se llena, una válvula faringo-intestinal está cerrada, y cuando los músculos faríngeos empujan el alimento hacia el intestino, se abre la válvula y la boca se cierra.

La digestión comienza en la luz del intestino y se completa intracelularmente. La digestión intracelular, cuando existe, es poco importante. El epitelio intestinal secreta enzimas digestivas. El intestino almacena alimentos y participa en la síntesis de vitelo. Las reservas de glucógeno y grasas de las células intestinales se utilizan durante el ayuno y la muda. A veces a su alrededor se encuentra una capa muscular. Una válvula en cada extremo del intestino impide que el alimento sea expulsado por la presión del líquido pseudocelómico. Desde la faringe sale un intestino medio tubular, formado por una capa de células epiteliales, que puede ser ciliado o tener un ribete en cepillo, y luego sigue un recto o intestino terminal, corto y aplanado, que está recubierto por cutícula y puede contener glándulas rectales unicelulares. El intestino medio, es un tubo sencillo con alguna escasa especialización regional. Presenta pocas variaciones, aunque el número de células que lo compone varía ampliamente. En algunas especies, presenta en su extremo anterior unas evaginaciones ciegas, y la superficie puede estar plegada. En algunos casos se puede distinguir, histológicamente, una región anterior ventricular, una región media y una prerrectal. El intestino terminal o recto, deriva del ectodermo y está tapizado por la cutícula. Se extiende desde la válvula intestino-rectal hasta el ano, que está en la línea media ventral, antes del extremo del cuerpo, y tiene forma de ojal. El labio del ano y la pared rectal se levantan por acción de un músculo que ayuda a la defecación. La fuerza de expulsión deriva de la presión del pseudocele. En especies parásitas son frecuentes las glándulas rectales grandes y unicelulares. En los machos, el conducto reproductor se une al recto formando una cámara llamada cloaca, aunque en ella no desembocan vías excretoras. Tubo digestivo, Es muy sencillo. Es completo. Comienza en una pequeña cavidad bucal que desemboca en una faringe muy musculosa, también llamada hexófago, que ayuda a la deglución. Se continúa con el intestino, que es muy largo y se extiende por todo el cuerpo del animal hasta el extremo posterior del cuerpo, pare desembocar en el ano, en el caso de las hembras. En los machos, el recto es una auténtica cloaca, ya que en ella desembocan las vías reproductoras. La cloaca comunica con el exterior por el orificio cloacal. La faringe (estomodeo) y el recto (proctodeo) son ectodérmicos; están recubiertos por cutícula.

La digestión es extracelular ya que en el intestino se segregan enzimas

digestivas a la vez que es intracelular.

Hay nemátodos carnívoros, que se alimentan de pequeños invertebrados. Los hay fitófagos que perforan las raíces de las plantas. Hay nemátodos que pueden producir grandes daños a los cultivos agrícolas. Otros se alimentan de algas, bacterias, hongos, etc.

Otros son detritívoros y se alimentan de materia en descomposición. Los hay

parásito de plantas y animales, incluido el hombre.

6. RESPIRACIÓN DE LOS NEMÁTODOS Los

nemátodos carecen de órganos respiratorios diferenciados. Los adultos que viven

como parásitos intestinales son principalmente anaerobios, en ellos falta el ciclo de Krebs y el sistema de citocromos, pero todos pueden utilizar el oxígeno si está disponible. Algunos nemátodos de vida libre y los estados libres de algunos parásitos, son aerobios obligados, y por lo tanto poseen ciclo de Krebs y sistema de citocromos.

7. EXCRECIÓN DE LOS NEMÁTODOS Los nemátodos excretan desechos en forma de amonio, que difunde a través de la pared corporal. El sistema excretor carece de células en llama y de protonefridios. Unos pocos nemátodos carecen de cualquier sistema de excreción. La osmorregulación, la regulación iónica y, quizás, la excreción de otros desechos, se asocian generalmente con estructuras especializadas particulares: una célula o células glandulares excretoras (glándula ventral), sistema de canales excretores (conductos acuíferos), o ambos. Estos sistemas aparecen solamente en nemátodos y dentro del grupo constituyen los órganos más desarrollados. En ambos casos de trata de formaciones unicelulares. Cuando se presentan tanto sistema de canales como glándulas, comparten el mismo poro hacia el exterior. La célula glandular excretora es grande, se encuentra a nivel de la unión de faringe con el intestino medio, protruye en el pseudocele y tiene un conducto en forma de cuello que desemboca medioventralmente en un poro. Su papel excretor es incierto, se han sugerido otras funciones, como secreción de matriz gelatinosa alrededor de los huevos, secreción de una cubierta de glicoproteínas sobre la cutícula y producción de exoenzimas para iniciar la digestión de los tejidos del hospedador. El órgano excretor de tipo glándula ventral se encuentra especialmente en formas de vida libre, así los Nematodos marinos suelen tener una simple célula excretora sacciforme con su cuello abierto hacia el poro excretor.

El sistema de canales excretores, sin cilios, se encuentra dentro de una célula, la célula más grande del cuerpo del animal, generalmente tiene forma de H alargada (célula en forma de H), los dos canales largos se sitúan en los cordones epidérmicos laterales y se unen por uno o varios canales situados en la barra transversal. Este sistema sirve especialmente para la regulación iónica. Del conducto transversal sale un conducto corto impar que desemboca en la superficie del cuerpo en un poro de la región faríngea. A veces el conducto se agranda y forma una ampolla que se llena y vacía rítmicamente. El sistema de canales que corren a lo largo de cordones laterales se encuentra en muchos parásitos y en especies del suelo. En algunos casos este tipo de sistema excretor presenta un par de glándulas cervicales.

8. SISTEMA NERVIOSO El Sistema nervioso es intraepitelial, localizado en la epidermis, la faringe y el digestivo posterior. Existe un anillo nervioso circunfaríngeo, o collar periesofágico (comisura cefálica), con varios ganglios asociados, que rodea al intestino anterior y sobre el cual las células nerviosas se distribuyen generalmente en forma difusa, y varios cordones longitudinales. El anillo nervioso circunfaríngeo está formado principalmente por fibras nerviosas, los cuerpos neuronales se ubican en ganglios. Del anillo nervioso circunfaríngeo, asociado a un cerebro bilobulado, salen hacia adelante nervios que inervan los órganos sensoriales, especialmente las sensilas y los anfidios. Hacia la parte posterior salen troncos nerviosos dorsales, laterales y ventrales dentro de los cordones longitudinales, unidos por comisuras. Algunos son motores (mediodorsal, medioventral, sublaterales), los otros son sensitivos (laterales). Los extremos de las células musculares contactan con los nervios dorsales y ventrales; los nervios laterales se asocian con los canales excretores. El cordón nervioso dorsal, predominantemente motor, se encuentra en el cordón epidérmico dorsal. Los troncos nerviosos laterales, predominantemente sensitivos, se encuentran en los cordones epidérmicos laterales, atravesando los ganglios lumbares y terminando en el ano. El nervio principal es el tronco ventral, que a menudo tiene raíces pares y probablemente deriva de la fusión de dos nervios. En Ascaris el cordón ventral presenta 55 fibras. Existe un sistema simpático faríngeo. Los nervios viscerales inervan el intestino. En las vías nerviosas hay ganglios, concentrados especialmente cerca del extremo posterior, donde hay un ganglio anal o caudal, sencillo o doble.

El sistema nervioso es pues, intraepidérmico. Del anillo surgen los cordones nerviosos longitudinales. Surge uno de cada ganglio (6). De ellos, los dorsales se fusionan para forma un único cordón. Los ventrales corren independientes hasta el poro excretor, donde se fusionan. Se localizan en los cordones epidérmicos. De los cuatro cordones que quedan al final, sólo el ventral presenta ganglios.

9. ÓRGANOS DE LOS SENTIDOS Poseen anfidios y fasmidios. Ambas estructuras son pares. Los anfidios se localizan en el extremo anterior del cuerpo, y los fasmidios en el extremo posterior del cuerpo. Se abren al exterior mediante sendos orificios. Tienen la misma estructura. Están rodeados por una glándula, que vierte su secreción al saco. Hay células neurosensoriales ciliadas, que llevan la información al Sistema Nervioso Central. Tanto anfidios como fasmidios son quimioreceptores. Los fasmidios están especializados en la detección de individuos del sexo contrario. Los órganos sensoriales son relativamente sencillos. Están concentrados en el extremo corporal anterior. Las formas libres las poseen en mayor número que las parásitas. En el tipo fundamental se sitúan en tres círculos y en un par de fosetas laterales. Los círculos constan de 4 o 6 órganos sensoriales. Papilas labiales y cefálicas, Son pequeñas salientes de la cutícula en los labios y en la cabeza. Probables mecanorreceptores. Los deiridios o papilas cervicales se encuentran en muchas especies edáficas o parásitas, pero suelen faltar en las formas acuáticas. Sedas o quetas, Son cerdas alargadas, en la cabeza y cuerpo. Son mecanoreceptores que cuando se estimulan hacen que el animal se aleje del estímulo. Anfidios, Son estructuras pares que desembocan al exterior por un poro cuticular que expone los cilios al ambiente. Se consideran quimioreceptores. Los anfidios alcanzan su máximo desarrollo en los Nematodos acuáticos, son invaginaciones ciegas, tubulares o sacciformes de la cutícula, que contienen un poro exterior, un conducto y una bolsa anfidial. Generalmente se ubican tras las sedas cefálicas. En algunos nemátodos, como Ancylostoma, los anfidios se conectan con grandes glándulas anfidiales (glándulas cefálicas), extendidas en la cavidad corporal.

Los receptores táctiles se presentan bajo la forma de papilas o de sedas, los quimioreceptores, como los anfidios, varían desde un simple poro hasta una compleja estructura tortuosa y espiralada. Los órganos sensoriales llevan una dendrita ciliada englobada en una parte especializada de la pared corporal. En papilas, sedas y anfidios hay una dendrita con un cilio distal. Los fasmidios o glándulas precaudales, son un par de órganos de glándula sensoriales unicelulares que desembocan separadamente a cada lado de la cola, especialmente en especies parásitas. Constan de una glándula, un poro y terminaciones nerviosas. Los fasmidios se relacionan con la reproducción y muestran dimorfismo sexual. Ocelos u ojos (manchas oculares), poco frecuente, va uno a cada lado de la faringe en Nematodos acuáticos. Son ojos compuestos por ocelos, que tienen cúpula pigmentaria y cristalina. Receptores de estiramiento, o cordones epidérmicos, probablemente regulan los movimientos locomotores.

10. REPRODUCCIÓN DE LOS NEMÁTODOS La reproducción es siempre sexual y la fecundación interna. Casi todos los nemátodos son de sexos separados (dioicos o bisexuales), y en la mayoría de los casos el macho es menor que la hembra. Los machos presentan caracteres sexuales secundarios, tales como glándulas ventrales y lóbulos caudales. Existen algunos pocos nemátodos terrestres que son hermafroditas o partenogenéticos. Hay casos en que se desconocen los machos. Las especies hermafroditas son proterándricas, es decir los órganos masculinos y los espermatozoides se desarrollan antes que los órganos femeninos y los óvulos. En ellas existe un ovotestículo. En general se autofecundan. Los espermatozoides se desarrollan primero y son almacenados en las vesículas seminales. La autofecundación ocurre después de la formación y maduración de los óvulos. Periódicamente surge un pequeño número de machos que fecundan cruzadamente a los hermafroditas.

El sistema reproductor es generalmente par. Las gónadas, en número de una o dos, se comunica con el exterior por un poro único, la cloaca, en los machos, y un gonóporo o vulva en las hembras. La posición de la vulva varía, siendo a veces posterior y otras veces anterior. En los machos, hay un testículo tubular, con forma de un cordón macizo apelotonado sobre sí mismo. En algunos nemátodos hay dos testículos, orientados generalmente en forma opuesta.

El o los testículos se convierten imperceptiblemente en un largo

espermiducto o conducto deferente. Cada espermiducto se ensancha en el extremo posterior formando una larga vesícula seminal, donde se acumulan los espermatozoides. Un conducto eyaculador muscular, con glándulas prostáticas, conecta las vesículas seminales con la cloaca. Las secreciones prostáticas son adhesivas y posiblemente facilitan la cópula. La vesícula seminal desemboca en el recto, modificado en una cloaca. La pared de la cloaca está evaginada formando dos sacos que se unen antes de desembocar en la cámara cloacal. La región posterior de los machos presenta una considerable variación. Suele estar curvada en forma de gancho o la cutícula ensanchada en expansiones alares con forma de abanico, constituyendo un accesorio copulador llamado bursa. A veces presentan papilas pedunculadas, sedas sensoriales o expansiones a modo de ventosas. El poro genital masculino está situado muy cerca del ano y tiene ganchos cuticulares (espículas copuladoras), varillas utilizadas para asir a la hembra durante la cópula y para mantener abierto el gonoporo femenino durante la transmisión de espermatozoides. Cada saco contiene una espícula, que generalmente es corta, con forma de hoja aguzada y curva. Las espículas asoman a través de la cloaca y salen por el ano o abertura, mediante músculos especiales, pueden ser evaginadas y retraídas en la bolsa cutánea. Las

espículas

copuladoras

del

macho

asoman

por

la

cloaca

y

el

ano.

Los

espermatozoides, de distintas formas (redondos, cónicos, sinuosos o alargados), se pueden mover lentamente en forma ameboide y carecen de flagelo. Los espermatozoides pueden estar formados por cabeza y cola, la cola suele poseer una larga mitocondria central con microtúbulos laterales. Puede haber uno o dos ovarios, tubulares, cordones apelotonados típicamente pares. Normalmente una gónada está orientada hacia la parte anterior y la otra hacia la parte posterior, con sus extremos opuestos enfrentados.

En muchas especies cada gónada se dobla sobre si misma y en algunas especies parásitas cada gónada es larga y enrollada en espiral. La parte germinativa es terminal, en las especies mayores las células suelen agruparse alrededor de un cordón nutricio central (raquis). La célula más interna de cada gónada, la célula del extremo distal, secreta una substancia promotora de la mitosis, que produce la proliferación de núcleos de células germinales. Cada ovario se prolonga poco a poco convirtiéndose primero en oviducto tubular y luego en un útero largo y muy amplio. En algunos casos hay un ovario único y un solo oviducto. El extremo superior del útero puede funcionar como receptáculo seminal. Cada útero desemboca en un tubo muscular corto común, denominado vagina. La vagina desemboca al exterior por el poro sexual generalmente impar (vulva), situado ventralmente, generalmente en la zona media del cuerpo. El poro sexual femenino está situado en la parte ventral del extremo anterior del cuerpo, aunque a veces se traslada hacia las proximidades del ano. Los huevos son pequeños, generalmente alargados y están rodeados por envolturas muy duras, que les permiten esperar indefinidamente la aparición de condiciones ambientales adecuadas. Existen tres cubiertas: una lipídica, otra cuticular y una tercera proteica, con ornamentaciones. Son numerosos en las especies parásitas. Por ejemplo, una hembra de ascáride pone muchos millones de huevos.

Figura N° 3. Masa de huevos de nemátodos hembras sobre raíces de Viola sp.

Se conocen casos de hembras que produjeron 27 millones de huevos, expulsando 200,000 diariamente. Esta elevada fertilidad puede producir deformaciones, la hembra adquiere

forma

redondeada,

con

intestino,

sistema

nervioso

y

otros

órganos

involucionados, a veces se evagina la vagina y crece intensamente formando una envoltura para el ovario, el útero y los embriones, quedando el cuerpo como un apéndice diminuto.

Las hembras de algunas especies producen una feromona que atrae a los machos. La fecundación es interna. Durante la cópula, las espículas cloacales del extremo posterior en forma de gancho del macho son expulsadas por la abertura cloacal, se enredan en torno a la región de los poros genitales de la hembra y se insertan en el gonoporo femenino, manteniéndolo abierto. Los espermios ameboides migran hacia la vagina y se dirigen al receptáculo seminal, en el extremo superior del útero, donde ocurre la fecundación.

El óvulo fecundado secreta una gruesa membrana de fecundación, que se endurece. A esta capa se agrega otra cubierta externa, secretada por las paredes uterinas, que a menudo presenta estructuras características. La superficie de los huevos está esculpida de diferentes formas específicas para cada especie. Los huevos son retenidos en el útero durante algún tiempo antes de ser depositados. A veces el desarrollo comienza cuando los huevos aún están dentro de la hembra.

Figura N° 4. Hembra y masa de huevos de Meloidogyne sp.

11. CICLO DE VIDA DE LOS NEMÁTODOS Su ciclo de vida tiene una duración de unas tres o cuatro semanas en las condiciones ambientales más adecuadas. Las larvas de los nemátodos, morfológicamente muy parecidas a los adultos, sufren durante su desarrollo cuatro mudas, una al final de cada etapa larvaria. La primera muda se produce cuando aún se encuentran en el interior del huevo y la última es la que define

el

sexo

del

nematodo

adulto

hembras e individuos hermafroditas).

(en

estos

organismos

existen

machos,

La reproducción de estos seres es generalmente sexual, pero en casos especiales puede llevarse a cabo de forma paternogenética

(la hembra genera descendencia sin la

intervención del macho) o hermafrodita (con autofecundación).

12. SINTOMATOLOGIA DE LAS ENFERMEDADES CAUSADAS POR NEMÁTODOS En campo las enfermedades causadas por nemátodos se suelen manifestar como rodales irregulares de crecimiento pobre, de forma circular o elipsoidal, si los síntomas

aparecen

en campo distribuidos de una forma regular, claramente el

problema no será debido a nemátodos.

Figura N°5. Daños producidos por Heterodera en trigo

Los nemátodos pueden producir síntomas característicos en el sistema radicular como agallas, lesiones necróticas en las raíces, proliferación de raíces secundarias y pobre crecimiento radicular, lo que se traduce en clorosis y en general plantas débiles con pobre crecimiento. En cuanto a los síntomas causados por los nemátodos que atacan partas aéreas, podremos observar manchas foliares, putrefacciones y distorsiones en cuello y bulbos, así como agallas en las espigas de algunos cereales. Los principales nemátodos parásitos de plantas y los síntomas que causan se muestran en la siguiente tabla. Cuadro N°1. Síntomas de cultivos susceptibles a los principales nematodos fitoparásitos.

NEMATODO Meloidogyne Pratylenchus Globodera heterodera Ditylenchus Tylenchulus semipenetrans

SINTOMAS

CULTIVOS

Agallas en las raíces

Hortícolas,

Debilitamiento de la planta

frutales, ornamentales.

Lesiones y destrucción de raíces

Hortícolas,

Debilitamiento de la planta

frutales, ornamentales.

Cuentas de collar en raíces

Tabaco,

Debilitamiento de la planta

leguminosas, cereales.

Distorsiones en hojas y bulbos

Ajo, cebolla, otros bulbos,

Decoloración de los bulbos

cereales.

Deterioro radicular

Vid y cítricos.

papa,

cereales, cereales, remolacha,

Debilitamiento de la planta Engrosamiento y necrosis radicular. Xiphinema longidorus

Debilitamiento de la planta

Cultivos perennes

Transmisión de virus Trichodorus paratrichodorus

Engrosamiento y necrosis radicular

Numerosos cultivos

Debilitamiento de la planta Transmisión de virus Aphelenchoides

Distorsiones y necrosis en las hojas

Fresa, crisantemos, lirios y otras ornamentales.

Anguina de los cereales

Distorsiones

de

las

espigas

y

Cereales y pastos

granos

AUTOEVALUACIÓN 1. ¿A que profundidad se encuentran los nemátodos de vida libre, en el suelo? 2. ¿Cuál es el nivel reproductivo anual de los nemátodos? 3. ¿Cuál es la forma típica del cuerpo de los nemátodos? 4. ¿Cómo es la simetría realmente de los nemátodos? 5. ¿Qué sustancias contienen la hipodermis en la cubierta corporal de los nemátodos? 6. ¿Qué es el pseudoceloma? 7. ¿Como es el aparato digestivo de los nemátodos? 8. ¿A que se le denomina anfidios? 9. Explique los síntomas mas comunes de Meloidogyne sp. En el cultivo de hortalizas?

LECCIÓN N°2. NEMÁTODOS DAÑINOS A HORTALIZAS Y FRUTALES 1. MELOIDOGYNE SPP. (NEMÁTODOS AGALLADORES) 1.1. CULTIVOS SUSCEPTIBLES DE DAÑOS Tienen

un

muy

amplio

rango

de

hospedadores,

incluyendo casi todos los

cultivos hortícolas. 1.2. BIOLOGÍA Generalmente pasan el invierno en suelo en forma de huevos. En primavera conforme la temperatura del suelo se incrementa, los juveniles de segundo estado J2, eclosionan, emigran a través del suelo y penetran en las raíces de las plantas hospedadoras, donde establecen sitios de alimentación. Durante el crecimiento, los juveniles van engrosando y mudando hasta convertirse en hembras adultas o machos. Las hembras son redondeadas e inmóviles, los machos filiformes y generalmente abandonan la raíz pues no se alimentan. Las hembras producen

hasta

3000

huevos

Generalmente los nemátodos de

un

mes

dependiendo

envueltos

agalladores

de

en

completan

una su

masa ciclo

gelatinosa. en

menos

la temperatura del suelo y por tanto puede tener

varias generaciones durante un cultivo. 1.3. SÍNTOMAS Como otros muchos nemátodos no causan síntomas característicos en el follaje de la planta. Las plantas infectadas por Meloidogyne sp, muestran amarillamientos, marchitamientos y raíces

reducciones

en

la

producción.

La

infección

de

las

produce engrosamientos característicos o agallas que pueden ser de varios

tamaños dependiendo del número de hembras que alberguen. Figura N°6. Agallas en raíz de Tomate (Meloidogyne sp.)

Figura

N°7.

Anguilulosis

de

la

raíz

(Meloidogyne sp.)

1.4. CONTROL En primer lugar es necesaria la prevención de la entrada del nematodo, pues una vez éste se ha establecido es virtualmente imposible erradicarlo, por lo que importante el uso

de

semilla

y

plantones

certificados

es

y material limpio

nemátodos. Aquellas parcelas en las que se encuentre Meloidogyne deberían mantenerse al margen de

la Producción hortícola por un periodo entre 2 y 4 años. Cultivos no

hospedadores o

resistentes pueden cultivarse para reducir las poblaciones. Las

malas hierbas deben ser eliminadas para evitar que alternativos

a

los

nemátodos.

En

sirvan

como

hospedadores

general, aquellas parcelas donde se vayan

a cultivar hortícolas susceptibles al nematodo deberían ser analizadas regularmente para la presencia de nemátodos agalladores. Si los niveles detectados están por encima del umbral económico de daño se recomienda el uso de un nematicida. Hoy existe un marcado interés en el control biológico de nemátodos como por ejemplo la bacteria Pasteuria sp., parásito obligado que ha sido encontrado sobre Meloidogyne sp. A campo y en experimentos.

Tiene alta especificidad el

hospedante, tolerancia al calor, la desecación y a nematicidas. Produce endospora y se fija sobre la cutícula del nemátodo. Cuando el nemátodo entra a la raíz que infecta, las esporas van adheridas. La bacteria germina en el interior del nemátodo hembra, y se transforma, más tarde, en una bolsa de esporas. En consecuencia, la hembra no puede reproducirse y muere al reventar bajo la presión de las esporas que se liberan nuevamente al suelo y se reinicia el ciclo (Figura N° 8).

Cuadro N° 2. Evaluación de índice de masas de huevos en huéspedes diferenciados utilizados para la identificación de especies y razas de Meloidogyne spp. HUÉSPEDES

ÍNDICE DE MASAS DE HUEVOS

Algodón

0

Tabaco

0

Pimentón

4-5

Patilla

5

Maní

0

Tomate

5

2. PRATYLENCHUS SPP. (NEMÁTODOS LESIONADORES) 2.1. CULTIVOS SUSCEPTIBLES DE DAÑOS Virtualmente casi todas las especies de plantas cultivadas. 2.2. BIOLOGÍA Generalmente sobrevive la estación sin hospedador como juveniles dentro de las raíces o en suelo. Penetran en las raíces jóvenes de las plantas hospedadoras, allí migran a través de las raíces, a menudo destruyendo células.

Las hembras depositan los huevos de uno en uno en el tejido radicular o en suelo y pueden producir hasta 100 huevos a lo largo de su vida. El ciclo de vida se completa generalmente en tres o cuatro semanas dependiendo de la temperatura del suelo, por lo que pueden producir varias generaciones por estación.

Figura N°9. Lesiones en raíz (Pratylenchus sp.)

2.3. SÍNTOMAS Los síntomas en planta son los mismos que en el caso de

los

nemátodos

agalladores. En raíces la penetración de los nemátodos produce pequeñas lesiones necróticas que sirven de entrada a otros patógenos (Verticillium, Rhizoctonia,

etc.).

Las plantas

infectadas

por

nemátodos

lesionadores,

generalmente tienen sistemas radiculares reducidos y las raíces alimenticias destruidas. 2.4. CONTROL El primer paso es usar semilla y plantones libres del nematodo. Debido a su amplísimo rango de hospedadores es difícil controlar rotación

de

sus

poblaciones

mediante

cultivos.

El espárrago se conoce como mal hospedador de casi todas las especies de Pratylenchus. Campos en los que se detecte la presencia de Pratylenchus por encima del umbral económico de daño deberían ser mantenidos en barbecho antes de la siembra. Es muy importante mantener un barbecho limpio de malas hierbas. En algunos casos rotaciones con espárrago, sorgo o pasto del sudan pueden ayudar a reducir las poblaciones de Pratylenchus. En general, como control químico se recomiendan nematicidas granulares no fumigantes.

3. GLOBODERA SPP. Y HETERODERA SPP. (NEMÁTODOS QUÍSTICOS) 3.1. CULTIVOS SUSCEPTIBLES DE DAÑOS En general, las especies de nemátodos quísticos presentan un

rango

de

hospedadores bastante estrecho, Globodera rostochiensis y Globodera pallida parasitan

solanáceas,

Heterodera

avenae

gramíneas,

Heterodera

glycines

leguminosas, Heterodera schachtii crucíferas.

Figura N°10. Hembras de Globodera sp, en raíces

3.2. BIOLOGÍA Los quistes son sacos de huevos rodeados por los restos muertos de las hembras, pueden tener forma de limón Heterodera spp o redondeada Globodera spp. Los nemátodos quísticos sobreviven a la estación sin cultivo como huevos dentro de los quistes, Los exudados radiculares estimulan

de

sus

plantas

hospedadoras

la eclosión de los huevos, los juveniles migran en el suelo hasta

las raíces donde generan sitios de alimentación y comienzan hasta

llegar

a

adultos.

expuestas al suelo. Los machos son

filiformes y salen de la raíz parar fecundar a las entre

50

y

engordar,

Las hembras alcanzan un tamaño que llegan a romper

el tejido radicular con lo que quedan producen

a

hembras.

Las

hembras

100 huevos en una matriz fuera de sus cuerpos, pero

muchos más huevos permanecen dentro de sus cuerpos. Los huevos

producidos

en

la

matriz

generalmente

eclosionan

rápidamente

tras ser producidos, mientras que los que permanecen dentro del quiste, pueden tardar hasta 10 años en eclosionar.

3.3. SÍNTOMAS En general producen los mismos síntomas inespecíficos que nemátodos agalladores y lesionadores. Las hembras formadas pueden observarse durante el cultivo en las raíces del cultivo hospedador como cuentas de collar. 3.4. CONTROL Debido a que los quistes pueden contener huevos viables durante más de 10 años las medidas preventivas para evitar la contaminación del suelo son de especial importancia. Si el nematodo se establece en un campo, el agricultor debe aprender a manejar sus poblaciones y nemátodos.

Gracias

al

optimizar

estrecho

su

margen

producción

en

presencia

de

los

de hospedadores que presentan los

nematodos quísticos, la rotación de cultivos es en la mayoría de los casos una buena estrategia para controlar sus poblaciones. El uso de nematicidas no es tan efectivo como con otros nemátodos debido a la capacidad del quiste para proteger a los huevos.

4. DITYLENCHUS SPP. (NEMÁTODOS DE LOS TALLO Y LOS BULBOS) 4.1. CULTIVOS SUSCEPTIBLES DE DAÑOS Cebolla, remolacha, ajo, zanahoria, tomate, algunos cereales y bulbos.

Figura N°11. Daños en cebolla causados por Ditylenchus sp

Figura N°12. Daños en cebolla causados por Ditylenchus sp

4.2. BIOLOGÍA Ditylenchus sobrevive la estación sin hospedador como juveniles de 4 estadios J4 y adultos en un estado criptobiótico, ya sea en tejido vegetal o en suelo. Cuando la humedad es la adecuada, los nemátodos migran hacia las hojas y tallos de las

plantas

sobrevivir

jóvenes.

Las hembras

hasta 10 semanas. En

pueden

producir

hasta

500

huevos

y

condiciones óptimas el ciclo de vida puede

durar unas tres semanas. Los nemátodos de los tallos y bulbos pueden persistir durante largo tiempo en suelo y son bastante resistentes a la sequía y a las bajas temperaturas.

A

menudo

forman

agregados

de

un

gran

número

de

individuos que se conocen como algodón de gusanos, que actúan como forma de resistencia. No obstante, las poblaciones decrecen rápidamente en ausencia de hospedador. 4.3. SÍNTOMAS Deformaciones en hojas y bulbos son

el

síntoma

más

característico

de

las

infecciones por Ditylenchus. A menudo, las plantas jóvenes pueden morir cuando

las infecciones son altas. Los bulbos infectados presentan capas

concéntricas de hojas marrones y a menudo se pudren durante el almacenaje por infecciones secundarias causadas por bacterias. 4.4. CONTROL Evitar

plantar

semilla

o

plantones

infectados.

El

uso

de

rotaciones

o

barbechos reduce considerablemente las poblaciones de nemátodos de los tallos y bulbos.

El tratamiento con agua caliente de bulbos y semilla mata a los nemátodos, no obstante la temperatura del agua debe ser cuidadosamente mantenida entre 43-46 ºC durante una o dos horas. Como estos nemátodos se mueven por la superficie de las hojas con el agua, la humedad sobre las hojas también debe ser controlada.

AUTOEVALUACIÓN 1. ¿Qué cantidad produce las hembras de Meloidogyne sp? 2. ¿Que tipo de lesiones ocasiona Pratylenchus y que consecuencias tiene? 3. Defina Quiste y explique que genero de nematodos los produce? 4. ¿Cuál es el periodo de vida mas largo de Ditylenchus y en que condiciones se da? 5. ¿En general, cuales son las medidas de control mas recomendadas para los nemátodos?

LECCIÓN N° 3. PRINCIPIOS DEL CONTROL NEMATOLÓGICO

1. INTRODUCCIÓN Hasta

hace

poco

dependían

de

las

opciones

disponibles

para

el

control

de

nemátodos

la intensidad y rentabilidad del cultivo. En cultivos hortícolas y

ornamentales de alta rentabilidad se usaban rutinariamente desinfestaciones del suelo con

nematicidas,

económico y/o

se

mientras que

usaban

variedades

en

programas

resistentes.

No

de

otros cultivos manejo

obstante,

la

de

menor

rendimiento

integrado, incluyendo preocupación

rotaciones

entre consumidores

y organizaciones por los riesgos ambientales de los nematicidas, así como el énfasis

puesto

en

una

agricultura

sostenible

por

organismos

europeos

e

internacionales ha cambiado drásticamente la situación y de una excesiva confianza en los nematicidas, se debe pasar urgentemente a otros sistemas que integren métodos alternativos de control compatibles con el respeto al medio ambiente. Existen diversos métodos de control nematológico alternativos al control químico, desde los tradicionales como el barbecho o la rotación de cultivos, hasta los más novedosos como resistencias Todos

ellos

tienen

ventajas

incorporadas

mediante

biología

molecular.

e inconvenientes y ninguna estrategia por si sola,

parece ser satisfactoriamente efectiva, por lo que el acercamiento más productivo al control nematológico debería involucrar la integración de varios métodos, como prevención, medidas culturales, resistencia y control biológico.

2. PREVENCIÓN En general, control nematológico es esencialmente prevención, porque una vez una planta es parasitada, es imposible eliminar el nematodo sin destruir también el hospedador. encaminadas

No

obstante,

a

se

impedir la

entienden

como

medidas

preventivas

aquellas

extensión de un problema nematológico en una

determinada área. Debido a que la mayoría de los nemátodos entra o se extiende en nuevas áreas

por movimiento de tierras o plantas infectadas, el control fronterizo es

fundamental para evitar la introducción

en

el

país

de

nuevos

organismos

patógenos procedentes de otros países. Plantones y semillas certificadas deberían ser usados siempre.

Una vez que la plaga es detectada en el campo las medidas de cuarentena e higienización del material de labranza permiten controlar su expansión.

3. CONTROL QUÍMICO Aunque

sigue

siendo

el

mayoría de los productos fumigantes

o

no

método químicos

de

control

nematológico

utilizados

fumigantes (granulares

como

y

más

efectivo,

nematicidas,

emulsiones)

ya

presentan

la

sean riesgos

medioambientales, por lo que su uso debe ser limitado siempre que existan alternativas. Por otra parte la economía de producción de la cosecha no permite en muchos casos un retorno suficiente de la inversión para justificar el uso de nematicidas.

4. PLANTAS Y PRODUCTOS ALELOPÁTICOS Existen plantas que liberan productos nematicidas al suelo, bien durante su crecimiento o bien como resultado de la descomposición de sus residuos. Estos

productos

se

conocen

como aleloquímicos, por ejemplo las raíces de sorgo

contienen un compuesto químico, que se degrada en cianuro de hidrógeno que es un

nematicida

poderoso.

Otro

ejemplo

son

los glucosinatos e isothiocianatos,

resultado de la descomposición de las Brasicas. No obstante, existe

una

tremenda

variabilidad dentro las especies de plantas antagonistas respecto a la supresión a las diversas razas de nemátodos, por lo que su uso debe estar siempre supervisado por personal técnico especializado.

5. MEDIOS CULTURALES 5.1. BARBECHO Un barbecho estricto por 1-2 años normalmente reducirá las poblaciones de nemátodos en un 80-90 por ciento. Este efecto puede lograrse en tan sólo

una

estación introduciendo otras medidas culturales. Sin embargo,

barbechar puede ser inaceptable para el agricultor perdida

de

productivo.

materia

orgánica,

peligro

de

debido

erosión

a

la

y perdida

potencial de tiempo

Además

si

se

permite

el

crecimiento

de

malezas

durante el

barbecho,

algunos nemátodos pueden sobrevivir y reproducirse en ellas, haciendo esta practica ineficaz. 5.2. ROTACIONES La rotación con cultivos no hospedadores es a menudo adecuada por si misma para impedir que las poblaciones nematológicas alcancen niveles perjudiciales económicamente. Sin embargo es necesario disponer de una amplia base de datos incluyendo variabilidad entre cultivares y razas de nemátodos. 5.3. SOLARIZACIÓN La

solarización

es un método

de

pasteurización

del

suelo

que

permite

suprimir la mayoría de las especies de nemátodos patógenos eficazmente. Sin embargo sólo es consistente en lugares con veranos cálidos y calurosos. La técnica básica consiste en poner una o dos láminas de plástico transparente encima

del suelo

ligeramente

humedecido

durante

el

verano

y

aproximadamente de seis a ocho semanas.

Figura N°13. Prueba de solarización en campo

5.4. VAPOR DE AGUA Vapor a 80-100 ºC por 30 minutos controla efectivamente algunos nemátodos patógenos. No obstante produce un impacto severo en la zona del suelo donde se desarrollan las

raíces

(rizosfera),

a

la

que

fácilmente reinfectable por otros patógenos.

deja

con

un

vacío

biológico

5.5. ENCHARCAMIENTO Donde el agua es abundante, el encharcamiento del campo se puede usar para el control de nemátodos. La inundación del suelo durante 7-9 meses mata a los nemátodos reduciendo la cantidad de oxigeno disponible para la respiración y aumentando la concentración de sustancias toxicas como ácidos orgánicos, metano

y sulfuro

de

hidrogeno. Sin

embargo

puede

llevar

varios

años

destruir todas las masas de huevos de Meloidogyne. Una alternativa al encharcamiento

continuo

es

utilizar

ciclos

de

inundación,

(mínimo

dos

semanas) alternando secado y pases de disco. No obstante un insuficiente o pobre manejo puede empeorar la situación, ya que algunas plagas y enfermedades se pueden extender fácilmente cuando el suelo está encharcado. 5.6. ADICIÓN DE MATERIA ORGÁNICA Y BIOFUMIGACIÓN Hay evidencias sustanciales de que la adición de materia orgánica o materiales quitinosos en forma de abono o estiércol disminuyen las poblaciones de nemátodos y el daño asociado a ellas, lo que parece ser debido a un incremento

en

las

poblaciones

de

microorganismos

antagonistas

de

los

nemátodos.

6. RESISTENCIA Las variedades resistentes son un método de control más eficaz contra las especies de endoparásitos quísticos dentro

sedentarias

como

Meloidogyne

o

los

nemátodos

(Globodera, Heterodera) que pasan la mayor parte de su ciclo de vida de

las

raíces.

Tomates

y sojas, en particular, han sido intensivamente

seleccionados para resistencia a los nemátodos. No obstante, la obtención de nuevas variedades resistentes es complicada por la habilidad de las especies de nemátodos de desarrollar razas o biotipos que superen la resistencia. Cuando una nemátodos

generalmente

variedad

resistente

se

planta,

las

poblaciones

de

disminuyen, pero en la estación siguiente, los pocos

nemátodos en una población capaces de superar la resistencia empiezan a aumentar, con lo que al cabo de unas generaciones la resistencia ha sido rota, más del 80% de las poblaciones de Meloidogyne incognita muestreadas en invernaderos japoneses rompe la resistencia proporcionada por el gen Mi.

Por otra parte las fuentes de resistencia natural están limitadas a unas pocas especies

de nemátodos y en ocasiones sólo son eficaces frente a una raza de ese

patógeno.

7. CONTROL BIOLÓGICO Microorganismos antagonistas establecidos en el lugar de siembra antes o a la vez que el patógeno pueden ser usados para prevenir la infestación. Varios microorganismos nemátodos.

han

Éstos

sido identificados incluyen

las

como

enemigos

bacterias Pasteuria

naturales penetrans

de y

los

Bacillus

thuringiensis y los hongos Paecilomyces lilacinus, Verticillium chlamydosporium, Hirsutella rhossiliensis, Catenaria spp. Sin embargo, para la mayoría de ellos las formulaciones comerciales no están todavía disponibles.

AUTOEVALUACIÓN 1. ¿Cuál es la principal medida que permite controlar realmente la expansión de los nemátodos? 2. ¿Que son los aleloquimicos? 3. Describa el proceso de la solarización 4. ¿Es conveniente emplear los métodos de control de encharcamiento, hasta que punto? 5. ¿Es efectiva la utilización de variedades resistentes al ataque de nemátodos?

LECCIÓN N° 4. MANEJO INTEGRADO DE ENFERMEDADES NEMATOLÓGICAS

1. INTRODUCCIÓN Con el desarrollo del concepto de manejo integrado de plagas, el seguimiento de las plagas y enfermedades en campo se ha convertido en un componente importante de la agricultura moderna. Mediante la toma de muestras periódica se determinan los niveles de infestación en suelo, infección en planta y los modelos de distribución en campo. Esta información se usa para determinar la estrategia de protección

del cultivo de forma que las poblaciones se mantengan a niveles que no causen perdidas o bien que éstas sean tolerables. Cuadro N°3. Esquema de un programa de control integrado de nematodos. ESQUEMA DE UN PROGRAMA DE CONTROL INTEGRADO DE NEMATODOS

IDENTIFICACIÓN DE NEMETODOS Los Nematodos son identificados, al menos hasta el nivel de genero, utilizando microscopio en laboratorio y técnicas moleculares

CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES DE POBLACIÓN Las densidades reales en suelo o raíces se estiman corrigiendo los valores obtenidos en los recuentos, con la eficacia del método usado para la extracción

RELACIÓN ENTRE DENSIDADES DE NEMATODOS Y EL DAÑO EN EL CULTIVO Las estimaciones de la densidad de población de nematodos se comparan con los umbrales de daño establecidos para un nematodo y cultivo particular

No obstante, las dificultades del proceso de diagnosis nematológica y la creciente complejidad de los programas de manejo integrado, implican que haya una creciente demanda por parte del agricultor decisiones

sobre

control

de

ayuda

profesional

en

la

toma

de

nematológico.

Generalmente, esta ayuda es proporcionada en un primer nivel por técnicos agrícolas que trabajan en campo y poseen un conocimiento profundo del sistema de cultivo empleado, los cuales, diagnostico

y

en

colaboración

enviando con

muestras

a

un

laboratorio

de

un nematólogo recomendarán al agricultor las

medidas de control apropiadas.

2. TOMA DE MUESTRAS PARA DIAGNÓSTICO NEMATOLÓGICO Para la confirmación de un diagnóstico en campo, siempre será necesario el análisis de muestras de suelo y raíces en el laboratorio que nos permitan confirmar la presencia de los nemátodos

sospechados.

Debido

a

que

los

nemátodos

no

pueden

suelo

o

ser

observados directamente

muestras

vegetales

en

campo,

deben

ser

extraídos

del

y luego identificados y contados al microscopio.

Si el cultivo está en pie, deberán tomarse muestras de raíces y suelo, para confirmar que los nemátodos son la causa del problema. En tal caso, el mejor momento para hacer un muestreo de las poblaciones de nemátodos en campo es desde la mitad hasta el final de la estación de crecimiento del cultivo hospedador, cuando los nemátodos están más activos y las densidades son más elevadas. Cuando el muestreo se realiza previo al cultivo, las muestras deben ser tomadas antes de la siembra y siempre antes de cualquier tratamiento con `plaguicidas o fertilizantes. Las densidades en

suelo

de

nemátodos

obtenidas

permitirán

predecir

si

los

niveles

son suficientemente altos como para causar daños a los cultivos y si

algunas medias de control son necesarias. Del mismo modo, estos muestreos predictivos son útiles en cultivos perennes en los que se efectúa un seguimiento regular de las densidades nematológicas y según los datos decidir en que momento aplicar los nematicidas. Para la toma de muestras de suelo se pueden utilizar tanto una palita de jardinero como diversos tomadores especialmente diseñados. El tomador de tipo Auger, es de los mas utilizados y consiste en un cilindro de unos 2-3 cm de diámetro y entre 20 y 40 cm de longitud, abierto por un lado lo que permite obtener catas de estas profundidades. El auger se introduce en el suelo hasta la profundidad deseada se gira varias vueltas para cortar un cilindro de suelo y se saca. La columna de suelo se deposita en una bolsa de plástico con la ayuda de una uña metálica o de madera. En general una muestra se compone de varias catas.

Figura N°14. Tomador de suelo o auger

3. PRECAUCIONES PARA OBTENER RESULTADOS PRECISOS 1° En caso de cultivos establecidos, tomar las muestras de suelo en las áreas periféricas a las zonas dañadas. No tomar nunca muestras en zonas donde las plantas estén muertas. En caso de muestreos previos a un cultivo, tomar las muestra con distintas catas distribuidas regularmente por la superficie de la parcela. 2° La precisión el

número

de

de catas.

nuestra Sin

estimación mejorará con

embargo

el incremento

en

para minimizar costes y tiempo es importante

también reducir el número de catas tomadas. El método seguido para disminuir errores en la estimación, es el de tomar un número elevado de catas en diferentes puntos del campo a

muestrear

y

agruparlas

en

una

muestra

sencilla,

en

la

que

se

estimará

el

número medio de nemátodos. La superficie a incluir en una muestra no debe sobrepasar 2 Hay debe representar un área homogénea dentro de un campo según historial de cultivo, tipo de suelo u otras variables. Campos más grandes deben ser divididos en subparcelas y muestreados separadamente. En general se recomiendan densidades de toma alrededor de 60 catas por Ha. Combinar todas las catas en una bolsa o cubo de plástico, mezclar bien y traspasar aproximadamente 500 cm3

de suelo a una bolsa de plástico para enviar al

laboratorio. 3° Las muestras deben ser tomadas preferentemente alrededor de las zonas de crecimiento radicular, en general entre 5 y 30 cm. de profundidad, y deben incluir suelo y raíces. El suelo no debe estar muy húmedo ni muy seco. En el caso de cultivos arbóreos

se muestreará la llamada zona de goteo del árbol, en la vertical del borde

marcado por la copa de este. 4° Cuando tratemos de investigar se seleccionarán

trozos

del

la

mismo,

presencia de procurando

nemátodos en material vegetal, que

pertenezcan

a

las

partes

afectadas, preferentemente en sus límites con zonas sanas. 5° Las muestras deben colocarse en bolsas de plástico cerradas para prevenir su secado, mantenerse a temperatura fresca durante el transporte y evitar el contacto directo con la luz solar. 6° Cerrar la bolsa e incluir nombre y número de muestra en una etiqueta dentro de la bolsa y con un rotulador fuera de la bolsa, colocar la bolsa en un contenedor fuerte para prevenir roturas y enviarlo al laboratorio de análisis, junto a un formulario semejante al siguiente,

en el que se debe incluir la mayor cantidad de información disponible, respecto al cultivo, parcela, síntomas, etc.

4. HONGOS CAPTURADORES DE NEMÁTODOS Para comprobar que existe algo parecido a la justicia en el mundo microbiano, basta observar a ciertos hongos, que atrapan nemátodos para alimentase. Los hongos realizan este trabajo de diversas maneras. Los

Arthrobotrys forman anillos

contráctiles

inductibles,

los

cuales

se

engendran

cuando los nemátodos están en presencia de estos hongos. Así,

los hongos pueden

reconocer

su presencia,

puesto que

disponen

de unos

receptores que detectan proteínas especiales, llamadas lectinas, en los nemátodos. Estos anillos son sensibles a la presión. Cuando los nemátodos pasan a través de los anillos, estos se contraen e inmovilizan a su presa. Unas estructuras especializadas de los hongos llamadas

haustorios penetran en los

nemátodos. Asimismo, se forman anillos no contráctiles que actúan como laberinto por el cual circulan los nemátodos, sin posibilidad de escapar. A continuación, se forman unos botones adhesivos en los nemátodos, en los cuales se instalan los haustorios. Los hongos también producen conidios que germinan en el interior de los nemátodos una vez que se han consumido.

AUTOEVALUACIÓN 1. ¿En que circunstancias se deben de tomar muestras en el suelo, cunado aún no existe el cultivo? 2. Explique dos precauciones que tomaría en cuenta para poder obtener buenos resultados en el manejo integrado de enfermedades. 3. ¿En que consiste el auger? Descríbalo. 4. ¿Cuáles son los hongos mas comunes que capturan a los nemátodos?

LECCIÓN N° 5. MÉTODOS PARA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DEL SUELO 1. MÉTODO DE LA BANDEJITA Materiales: •

Tubos de PVC de 10 cm de diámetro

•

Bandejitas de plástico con un diámetro superior de 11 cm y uno inferior de 9.

•

Mallas de tela o plástico

•

Papel higiénico

Procedimiento: 1° Cortar los tubos de PVC en anillos de un ancho de 5 cm. y adaptarlos a las bandejitas de tal modo que no choque con la base de la bandejita, pegar la malla en uno de los extremos del tubo. 2° Luego colocar un pedazo doblado de papel higiénico o papel facial por el interior del colador de tubo de PVC de modo que lo cubra por completo. 3° Colocar 50 cc de suelo homogenizado dentro del tubo de PVC. 4° Colocar el tubo de PVC con el suelo dentro de la bandejita. 5° Llenar con una pizeta la bandejita de modo que el agua cubra el suelo. 6° Luego de 48 horas retirar el suelo y el agua de la bandejita con los nematodos, pasarla por un tamiz de 38 micras. 7° Colectar en una placa petri, pequeña, rayada, que facilita el conteo de nematodos del tamiz. 8° Ver al microscopio.

los

2. MÉTODO DE TAMIZADO Y DECANTACIÓN DE COBB (1918) MODIFICADO Materiales: • 100 ml de suelo • 2 recipientes (baldes 1 y 2) de aproximadamente 4 litros de capacidad. • 1 espátula • Tamices de: 500 µm o 34 mesh∗ • 350 µm o 45 mesh • 175 µm o 80 mesh • 100 µm o 150 mesh • 50 µm o 280 mesh • 4 beakers (vasos) de 500 o 250 ml • 1 pizeta Procedimiento: 1° Coloque 100 ml de suelo en un recipiente o balde (1) con agua, más o menos 2 litros, agite bien con una espátula para separar los nematodos de las partículas de suelo, deje reposar la suspensión por 5 segundos para permitir que las partículas más grandes de suelo sedimenten. 2° Pase íntegramente toda la suspensión a través de un tamiz de 500 µm sobre el otro recipiente o balde (2). Descarte el suelo que quedó en el balde (1) y el material grueso que ha quedado en el tamiz de 500 µm, porque todos los nematodos activos han pasado a través del tamiz y se encuentran en el recipiente (2).

Algunos

nematodos

muy

largos

como

algunos Longidoridae no pasan

rápidamente y es conveniente agitar suavemente dentro del agua los restos que quedaron en el tamiz. Lave el tamiz. 3° Agite la suspensión que contiene el recipiente (2) y pásela lentamente por el tamiz de 350 µm sobre el recipiente (1). Al suelo que ha quedado en el recipiente (2) agregue un poco más de agua, agite y pase esta suspensión lentamente por el tamiz de 350 µm sobre el mismo recipiente (2), repita esta operación una tercera vez. Descarte el suelo que quedó en el recipiente o balde (2) y deje limpio el recipiente.

4° Lo que queda en el tamiz de 350 µm son los nematodos activos muy grandes como Xiphinema. Para extraerlos enjuague el tamiz con una pizeta y recoja la suspensión en un beaker que le llamaremos 1. Esta operación se realiza cada vez que se pasa la suspensión del recipiente 2 a través del tamiz de 350 µm. Deje limpio el tamiz de 350 µm. 5° Agite la suspensión que se colectó en el recipiente 1 del paso 3 y pásela lentamente a través de un tamiz de 175 µm sobre el recipiente 2 el mismo número de veces y de la misma manera como en el paso 3. Descarte el suelo que quedó en el recipiente 1 y deje limpio el recipiente. 6° Lo que queda en el tamiz de 175 µm son nematodos medianos como por ejemplo Helicotylenchus. Para extraerlos, enjuague el tamiz con una pizeta y reciba la suspensión en un beaker que le llamaremos 2. Esta operación se realiza después de cada vez que se pasa la suspensión del recipiente 1 sobre el tamiz de 175 µm. Deje limpio el tamiz de 175 µm. 7° Agite la suspensión que se colectó en el recipiente 2 del paso 5 y pásela lentamente a través de un tamiz de 100 µm, sobre el recipiente 1 de la misma manera y el mismo número de veces como en el paso 3 descarte el suelo que quedó en el recipiente 2 y deje limpio el recipiente. 8° Lo que queda en el tamiz de 100 µm son nematodos pequeños como por ejemplo Pratylenchus. Para extraerlos, enjuague el tamiz con la pizeta y reciba la suspensión en un beaker al que llamaremos 3. Esta operación se realiza después de cada vez que se pasa la suspensión del recipiente 2 sobre el tamiz de 100 µm. Deje limpio el tamiz de 100 µm. 9° La suspensión que se recibió en el recipiente 1 del paso 7 se agita y pasa lentamente a través de un tamiz de 50 µm, el mismo número de veces y de la misma manera como en el paso 3. La suspensión que pasa el tamiz y el suelo que quedó en el recipiente 1 se descarta. Deje limpio el recipiente. 10° Lo que queda en el tamiz de 50 µm son los nematodos más pequeños y larvas, para extraerlos enjuague el tamiz con una pizeta y reciba la suspensión en un beaker que llamaremos 4. Deje limpio el tamiz de 50 µm.

11° Los nematodos que se encuentran en los beakers 1, 2, 3 y 4 se observan directamente o si las suspensiones turbias,

se

pueden utilizar

el

tienen muchas partículas de suelo y están

método de

la

bandejita

para

clarificar

las

suspensiones.

3. MÉTODO DE CHRISTIE Y PERRY (1951) (Modificaciones del método de Baerman, 1917) Materiales: • 100 cc de suelo seco. • Embudos de vidrio de 100 mm de diámetro. • Mangueritas de jebe de 8 – 15 cm de largo. • Clips • Tamiz de 500 µm (34 mesh). • Tamiz de 50 µm (325 mesh). • Recipiente o balde de aproximadamente 4 litros de capacidad. • Pizeta. • Solución de metileno (4 ppm) para preservar los nematodos del ataque de hongos y bacterias. • Papel filtro tipo muselina o papel facial. • Mallas de metal de 90 mm de diámetro. • Soporte de madera o metal para embudos. Procedimiento: 1° Coloque los 100 cc de suelo en

balde y agregue aproximadamente 2 litros de

agua. Agite con una espátula para separar y suspender los nematodos y partículas de suelo, deje reposar la suspensión por 5 segundos. Esto permite que las partículas más grandes de suelo sedimenten. 2° Coloque el tamiz de 500 µm sobre el tamiz de 50 µm y a través de ellos, haga pasar lentamente la suspensión del recipiente o balde, haciendo rotar el balde para que las partículas de

tierra se vayan depositando en las paredes del balde.

Agregue nuevamente 2 litros de agua al suelo que quedó en el balde, deje reposar 5 segundos y pase esta suspensión por los tamices. Agregue por tercera vez 2 litros de agua al suelo que quedó en el balde, deje reposar 5 segundos y pase esta suspensión por los tamices.

3° Descarte el material grueso que quedó en el tamiz de 500 µm. Los nematodos y las partículas de suelo más pequeñas quedan en el tamiz de 50 µm. Concentre los nematodos en un solo lado del tamiz para facilitar su traslado al embudo. 4° Prepare el embudo conectando a su cuello, la manguerita de jebe y colóquelo en el soporte de madera o metal. Cierre la manguerita con un clip y llene el embudo con la solución de azul de metileno, hasta un poco más de la mitad del embudo. Coloque la malla de metal y papel filtro o facial en la parte superior del embudo. 5° Con una pizeta conteniendo la solución de azul de metileno (0.01%), enjuague el tamiz de 50 µm sobre el embudo trasladando los nematodos y las partículas de suelo, que quedarán sobre el papel filtro y la malla de metal. Agregue suficiente solución de azul de metileno hasta que cubra con una ligera capa, la suspensión que contiene los nematodos. Los nematodos por movimiento propio atravesarán sedimentarán

en

la

parte

inferior

del

embudo.

el Las

papel partículas

filtro de

y suelo

quedarán retenidas en el papel filtro. Debe evitarse que los bordes del papel sobrepasen el diámetro del embudo. 6° Al cabo de 48 horas, abra el clip y colecte 50 ml de la suspensión con los nematodos. En una placa de Siracusa observe bajo el microscopio estereoscópico los nematodos colectados.

4. MÉTODO DE CENTRIFUGACIÓN EN AZÚCAR Materiales: • 300 cc de suelo • Recipiente graduado de 2 litros • Espátula • Tamiz de 500 µm • Recipiente de 2 a 5 litros • Tamiz de 44 µm • Vaso de 200 ml • Pizeta • Centrifugadora con tubos de 100 a 200 ml

Procedimiento: 1° Colocar 200 cc de suelo en el envase graduado de 2 litros y completar con agua hasta 800 ml. Agite bien con una espátula, para desmenuzar el suelo y éste se suspenda. Agregue

agua hasta completar dos litros y agite para facilitar la

separación de los nematodos de las partículas de suelo. 2° Deje reposar 10 minutos para que las partículas más grandes de suelo, sedimenten y pase la suspensión a través del tamiz de 500 µm, sobre el recipiente de 2 a 5 litros. Elimine los restos que han quedado sobre el tamiz de 500 µm (piedras pequeñas y restos orgánicos). Deje limpio el tamiz . 3° Agite bien con una espátula, l suspensión que recibió en el recipiente de 2 a 5 litros, deje reposar 10 minutos y pase la suspensión a través del tamiz de 44 µm, mediante una corriente suave de agua, concentre el suelo con los nematodos en un solo lado del tamiz de 44 µm y con una pizeta recójalos en el vaso de 200 ml. 4° Pase la suspensión a un tubo de centrífuga de 100 a 200 cc. Si es necesario complete con agua hasta llenar el tubo. Agite la suspensión y centrifugue a 1250 rpm durante 3.5 minutos. Los nematodos con el suelo quedan en le fondo del tubo,

en

el

tubo

queda

el

agua

sin nematodos y en la superficie del agua

algunos restos orgánicos. Elimine el agua y los residuos orgánicos. 5° Al mismo tubo que contiene el suelo, agregue la solución de azúcar al 50%, hasta la mitad del tubo. Agite para suspender el suelo y los nematodos. Llene el tubo con la solución de azúcar y centrifugue durante 2.5 minutos. Los nematodos flotan en la solución azucarada, las partículas de suelo quedan en el fondo de tubo. 6° Pase la solución de azúcar con los nematodos, del tubo del tubo de centrífuga, a un tamiz de 35 µm e inmediatamente enjuáguelos con agua corriente,

para

eliminar el azúcar y evitar que los nematodos se plasmolicen. Concentrar, los

nematodos

en

una

placa

petri

o

de Siracusa y observarlos bajo el

microscopio de disección. El método tiene la ventaja de ser rápido, pero el azúcar siempre afecta a los nematodos, por lo cual los nematodos obtenidos por este método no son útiles para montajes al microscopio o para inoculaciones.

5. MÉTODO MODIFICADO DE FENWICK (Para extracción de quistes) En este método, es necesario hacer secar la tierra con quistes para que los quistes secos, floten en el agua,

mientras que las partículas de suelo sedimenten. La

separación de los quistes del suelo, usando el principio de flotación se puede lograr de

varias

maneras,

pero

a

continuación

se

indican

algunos

materiales

y

procedimientos que pueden ser usados. El equipo Fenwick modificado, consiste en un embudo colocado sobre una especie de jarra. El embudo tiene en la base de su parte ensanchada un tamiz de 1 mm de tamaño de poro. La jarra tiene forma trapezoidal, en su parte superior presenta los soportes del embudo y una aleta inclinada que bordea la jarra como collar, pero que termina en un solo conducto. La jarra en su parte inferior tiene un tapón que se retira para enjuagarla y limpiarla.

Figura N° 15. Equipo de Fenwick

El equipo de Fenwick esta compuesto por: - Tamiz de 175 µm de tamaño de poro - Embudo de más o menos 10 cm de diámetro - Embudo de 15 cm de diámetro - Papel filtro o papel facial - Erlenmeyers de 500 ml de capacidad - Fiolas de 250 ml de capacidad - Placas petri Materiales: • 100 cc de suelo • Equipo de Fenwick modificado Procedimiento: 1° Colocar 100 cc de suelo sobre el tamiz del embudo de equipo de Fenwick y coloque el tamiz de 175 µm para recibir lo que rebalsa de la jarra. 2° Lave el suelo colocado en el tamiz del embudo, hasta que solo queden retenidas piedras, restos de raíces y material orgánico. Las partículas pesadas del suelo se van depositando en la base

inclinada y la parte inferior de la jarra. Algunas

partículas pequeñas de suelo, quistes y restos orgánicos flotan, rebalsan, salen a través de la aleta de la jarra y se depositan en el tamiz de 175 µm (si espera encontrar especies de quistes más pequeños puede usar un tamiz de menor tamaño de poro). Las partículas menores de 175 µm y agua pasan a través del tamiz. Los quistes y restos orgánicos quedan retenidos en el tamiz. Retire el tapón de la parte inferior de la jarra para desaguarla y deje limpio el equipo. 3° Coloque un pedazo de 10 x 10 cm de tela (tul fino) sobre un círculo de metal y malla metálica, soldados a la parte superior de un soporte de metal. 4° Los quistes y material orgánico que quedaron en el tamiz de 175 µm concéntrelos en un solo lado del tamiz y con una pizeta y un embudo transfiéralos a un Erlenmeyer de 500 ml. Los quistes y restos orgánicos flotan, orgánicos

y

partículas

de

suelo

sedimentan. Decante

Erlenmeyer sobre la tela del soporte de metal.

la

algunos

restos

suspensión

del

5° Los quistes y restos orgánicos quedan retenidos en la tela, el agua pasa a través de la tela. Doble los bordes de la tela, asegúrelos con un clip y puede hacerlos secar a temperatura ambiente o con un desecador. 6° Luego de secado la tela calada o

el papel filtro, se puede observar al

estereoscopio, pero esta muestra aún tendrá gran cantidad de estos orgánicos que dificultaran el conteo. Por ello se utiliza un método complementario que es el de la acetona.

6. MÉTODO DE LA ACETONA Materiales: • Fiola de 250 ml. • Acetona • Embudo • Beakers • Papel filtro Procedimiento: 1° Cuando los quistes y restos orgánicos estén secos, se puede usar el mismo principio del método de Fenwick para separarlos, es decir hacer flotar los quistes y sedimentar los restos orgánicos. Para esto se transfieren los quistes con la ayuda de un embudo a una fiola de 250 ml (puede utilizarse un embudo para que esta operación sea más fácil). Llene hasta la mitad de la fiola con acetona; para que los quistes floten con facilidad, agite la fiola para que los quistes se separen de los restos orgánicos, llene con acetona, hasta 1 ó 2 cm del borde superior de la fiola. La mayoría de restos orgánicos se depositan en la parte inferior de la fiola, los quistes y algunos restos orgánicos afloran y se sitúan en la superficie de líquido. 2° Si usa acetona en la separación de quistes, puede realizar los siguientes operaciones para recuperar la acetona. Coloque un embudo sobre el beaker de 500 ml y un papel filtro puede estar rayado en forma de cono dentro del embudo, (el papel filtro puede estar rayado en cuadros). Decante los quistes y restos orgánicos que están en la superficie de la acetona, haciendo rotar la fiola para que no retenga quistes.

Los quistes quedan retenidos en el papel de filtro y la acetona pasara al frasco. Cuando no queden quistes en la fiola, agite, haga rotar la fiola y decante los restos orgánicos sobre un embudo de mayor diámetro, que contenga papel facial y que este colocado sobre un frasco 2 a 5 litros. Los restos orgánicos quedan retenidos en el filtro y la acetona se recupera en el frasco. 3° Cuando la acetona del papel filtro del embudo se haya evaporado, retire el papel filtro y colóquelo en una placa petri. Observe bajo el microscopio de disección. Si el papel filtro está rayado en cuadros, le facilitará el contaje de número de quistes (use iluminación de

arriba

hacia abajo). Cuando el número y restos orgánicos es

demasiado se puede contar por partes. 4° Para

separar

los

restos

orgánicos

hacerlos rodar a través de una hoja

y

aún

quedan

los

quistes,

puede

de papel. Los quistes ruedan y los restos

orgánicos quedan en el papel.

7. MÉTODO DE BAUNACKE (Para extraer quistes) El principio de usado en este método, es hacer secar los quistes para que la masa de huevos del suelo interior de cada quiste se contraiga y deje el mayor espacio en aire. Esto permite que los quistes floten en la superficie del agua, mientras que las partículas de suelo sedimentan. Materiales: • 50 ml de suelo seco • Tamiz de 175 µm • Recipiente blanco de más o menos 10 cm de profundidad y 20 cm de diámetro, con los bordes inclinados (lavatorio, lavador o ponchera) • Pincel fino (Nº 061) • Papel filtro •

Placa petri

• Contómetro

Procedimiento: 1° Coloque

50

ml

de

suelo

seco,

en

el

tamiz

de

175

µm

y

lávelos

cuidadosamente con agua. Lo que ha quedado en el tamiz, deposítelo en

el

recipiente blanco de bordes inclinados y llene con agua el recipiente hasta más o menos 3 cm del borde superior. 2° Los quistes flotan en la superficie del agua y se dirigen a los bordes del recipiente blanco. Por su color marrón contrastan con el recipiente y pueden ser extraídos con el pincel. 3° En la placa petri coloque un disco de papel filtro rayado en líneas o en cuadrículas, humedecer y depositar sobre este papel, los quistes colectar 4° Observar bajo el microscopio de disección, la placa de petri con los quistes. Use iluminación directa (de arriba hacia abajo) y cuente los quistes. 8. MÉTODO DE LA COCA COLA Materiales: •

50 ml de suelo

•

Botella transparente de pico angosto

•

Papel filtro

•

Placa petri

Procedimiento: 1° Coloque 50 ml de suelo seco en la botella. 2° Agregue agua hasta la mitad de la botella y agite bien. 3° Llene con agua hasta 1 cm del pico. 4° Transfiera los quistes y la materia orgánica que han flotado en el pico al papel filtro rayado en líneas o en cuadritos. 5° Cuente los quistes bajo el microscopio de disección

9. CONTAJE DE QUISTES Y DE HUEVOS DE GLOBODERA SP Materiales: •

Quistes

•

Homogenizador de Huijsman

•

Plaquita de contaje

•

Estereoscopio

Procedimiento: Para el contaje de quistes deben eliminarse los quistes formados de hembras que no han completado su desarrollo y

que generalmente son más claros y muy

pequeños. Contaje de quistes: Una vez obtenidos los quistes por cualquiera de los métodos anteriormente señalados

se

colocarán

éstos

en

una

placa

de

conteo,

se

llevarán

al

estereoscopio y se procederá a su contaje con la ayuda del contómetro. Contaje de huevos: Para realizar el contaje de los huevos. Se dispondrá de quistes y se procederá de la siguiente manera: 1° Coger 20 quistes, colocarlos en el homogenizador de Huijsman y proceder a triturarlos. 2° Llevar la muestra triturada a una solución de 100 ml agregándole agua. 3° Homogenizar la solución con una bomba de pecera y extraer una alícuota de 10 ml colocarla en una plaquita petri rayada para contaje y llevarla al microscopio. 4° Realizar el conteo con la ayuda del estereoscopio. 5° Sacar el promedio del número por quiste, restarle de 10 a 20% del número de huevos que representa el contenido residual en cada quiste.

AUTOEVALUACIÓN 1. ¿Cuáles son los métodos de extracción de nemátodos mas eficientes, económicos y fácil de emplear, indistintamente? Explique por que. 2. ¿Que indica la medida mesh y a cuanto equivale? 3. Describa los componentes del equipo de Fenwick.

LECCIÓN N° 6. MÉTODOS PARA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DE TEJIDO VEGETAL 1. MÉTODO DEL LICUADO Materiales: •

5 g de tejido vegetal

•

Licuadora

•

Pizeta

•

Tamices de 500 y 38 µm

•

Balanza

•

Fuente o bandeja plástica

•

Tijeras

•

Placa petri pequeña rayada en el fondo.

Procedimiento: 1° Se toma la muestra de tejido vegetal (raíces, bulbos, hojas) y con la ayuda de la tijera se pican en trozos de 1 cm aproximadamente. 2° En la bandeja se homogeniza la muestra picada y al azar se cogen y pesan 5 g de tejido vegetal. 3° La muestra de 5 g se introduce a una licuadora con aproximadamente 100 ml de agua y se agita a velocidad moderada por 10 segundos. 4° La muestra licuada se echa sobre la batería de tamices de 500 y 38 µm puestos el primero sobre el segundo y se enjuaga con abundante agua corriente. 5° Con ayuda de la pizeta se colecta lo que queda en el tamiz de 38 µm en la placa petri para el contaje.

2. MÉTODO DEL LICUADO, TINCIÓN Y MICROONDAS Este

método

se

emplea

ensanchadas de raíces.

principalmente

para

extraer

hembras

adultas

Materiales: •

Hipoclorito de sodio al 10%

•

Fucsina ácida

•

Raíces frescas

•

Licuadora

•

2 Tamices de 100 y 400 mesh

•

Vaso de vidrio

•

Horno microondas

Procedimiento: 1° Colocar

5

g

de

raíces

frescas

en

una

licuadora.

Agregar

20

ml

de

hipoclorito de sodio al 10% e incrementar el volumen a 200 ml agregando agua de caño. Licuar por 30 segundos lavar las paredes de la licuadora y licuar por 30 segundos más. 2° Verter la suspensión sobre 2 tamices, en la parte de arriba 1 tamiz de 100 mesh y en la parte de abajo en un tamiz de 400 mesh. Enjuagar los 2 tamices, descartar lo que quedó en el tamiz de 100 mesh y colectar el material que quedó en el tamiz de 400 mesh en un vaso de vidrio. 3° Teñir la muestra con fucsina ácida (agregar 1 gota de fucsina ácida por cada 10 ml de la suspensión). 4° Colocar la muestra en un horno microondas y calentar por 5 minutos. 5° Contar el número de hembras y otros estados en el estereoscopio.

3. MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE HUEVOS DE MELOIDOGYNE Este nemátodo no forma quistes sino nódulos y deposita sus huevos en una masa gelatinosa ubicada en la parte posterior de su cuerpo.

Materiales: •

Hipoclorito de sodio al 0.5% y 1%

•

Beaker con tapa de sellado hermético

•

5 g de raíces

•

Tamices de 180 y 38 µm

•

Pizeta

•

Bomba de pecera

•

Contómetro

Cuando se quiera obtener nematodos vivos para inoculación se debe emplear hipoclorito de sodio al 0.5%. En caso

contrario, para propósitos de contaje

solamente, se emplea la solución al 1%. Procedimiento: 1° Colocar en un beaker con tapa de sellado hermético 5 g de raíces mas la solución de hipoclorito de sodio al 0.5% en cantidades suficiente que cubra a todo el tejido vegetal luego proceder a taparlo y agitarlo por tres minutos. 2° Luego se disponen dos tamices de

180 y 38 µm de arriba hacia abajo

respectivamente. Se vierte las raíces tratadas con lejía y se procede a lavarlas con abundante agua. 3° Seguidamente los huevos retenidos en el tamiz de 38 µm se juntan a un lado con el agua de la pizeta y se vacea a un

beaker; se completa a 100 ml y se

homogeniza la solución con la bomba de pecera. Por último, se saca a placas petri tres alícuotas de 10 ml cada una. 4° Finalmente se procede al conteo con la ayuda del contómetro, y se determina el número de huevos por planta y el número de huevos por gramos de raíz. Se ha determinado que el hipoclorito de sodio diluye la masa que cubre a los huevos, por lo cual se debe tener cuidado con el tiempo de exposición que no debe mayor de 4 minutos para evitar su desintegración completa.

4. MÉTODO DE FUCSINA ÁCIDA - LACTOFENOL Materiales: •

Raíces infectadas libres de suelo

•

Lactofenol puro

•

Fenol líquido 94 ml

•

Acido láctico 63 ml

•

Glicerina 160 ml

•

Agua destilada 100 ml

•

Fucsina ácida al 0.1% del lactofenol

Procedimiento: 1° Lave cuidadosamente las raíces sumergidas en agua para quitar el suelo. 2° La tinción se puede hacer caliente o fría. Primero podría tratarse la tinción fría para lo cual el material vegetal se transfiere a fucsina ácida lactofenol al 0.1 %. Se deja allí 12 ó 24 horas dependiendo del grosor del material vegetal. Si no se obtienen buenos resultados con la tinción fría se puede tratar con la tinción caliente, para lo cual se sumerge el material vegetal en fucsina ácida lactofenol 0.1% caliente (80°C o más dependiendo del grosor del material vegetal). 3° Después de la tinción fría transfiera el material teñido directamente a lactofenol puro para clarificar el tejido vegetal. Después de la tinción fría caliente el material vegetal teñido a un recipiente conteniendo agua y lávelo con agua en circulación para

eliminar

el

exceso

de

tinte. Transfiera el material vegetal teñido

a

lactofenol puro para clarificar el tejido vegetal. 4° Después de algún tiempo que puede ser 3 días o un mes, el material estará listo para su observación. Los nematodos que estarán teñidos pueden ser vistos dentro del tejido vegetal. 5° Los nematodos teñidos pueden ser montados en porciones de tejido vegetal en lactofenol puro o pueden ser disecados del material vegetal y montados en lactofenol puro, pero los porta objetos deben llevar un anillo de parafina, glicel o esmalte de uñas para sostener el cubre- objeto. El cubre-objeto se coloca sobre este anillo y así no se aplasta los nematodos.

6° Las partes del cubre - objeto que van a ser sellados límpielas con un hisopo pequeño de algodón humedecido en etanol de 100 %. Fije el cubre -objeto con tres gotas pequeñas de glicel o esmalte de uñas, mediante un pincel de pintar. Después de 24 horas vuelva a aplicar glicel a todo el contorno del cubre-objeto. 7° Anotar en el montaje permanente: •

El nombre especifico del nematodo.

•

El número, sexo o estado del nematodo.

•

El método de montaje.

•

Lugar del que se extrajeron los nematodos (suelo y el cultivo).

•

Número de slides en su colección.

•

Iniciales del nombre de la persona que realiza el montaje.

•

La fecha del montaje.

AUTOEVALUACIÓN 1. ¿Se puede sustituir algún material utilizado en el método del licuado con algún otro mas domestico, diga cual? 2. ¿Especialmente, para que se emplea el método del licuado, tinción y microondas? 3. ¿Qué sustancia se debe usar en el método de extracción de huevos de Meloidogyne sp para obtener nemátodos vivos para inocular? 4. Describa brevemente el proceso del método de fucsina.

LECCIÓN N° 7. PROCESO DE MUERTE, FIJACIÓN Y MONTAJE DE NEMÁTODOS 1. MUERTE 1° Colectar los nematodos en una gota de agua sobre una luna de reloj. 2° Coloque en un tubo de vidrio cerrado, una mezcla de formalina y ácido propiónico en la proporción 4:1 y caliente a Baño María (90º C). En otro tubo tenga formalina al 4%. En lugar del ácido propiónico puede usar ácido acético (80º C). 3° Agregue

a

la

luna

de

reloj

que

contiene

la

gota

de

agua

con

los

nemátodos, 5 cc de FP 4:1, caliente a 90 ºC e inmediatamente agregue 50 cc de formalina al 4%.

2. FIJACIÓN Después de matar los nematodos, transfiéralos a una placa de fijación con formalina al 4%. Tape la placa con una laminilla cubreobjeto y guárdela en una placa petri conteniendo en el

fondo, papel filtro humedecido en formalina

al 4%. Mantenga los nematodos en este lugar por 10 a 15 días. Después de matar

el

protoplasma

sin

causar distorsión, los diferentes tejidos deben ser

deshidratados y endurecidos para que los nematodos puedan ser montados. La deshidratación se realiza con la finalidad de facilitar la penetración de la glicerina, no soluble en agua, dentro de los tejidos del nematodo, esto se consigue mediante los siguientes pasos: 1° Transfiera los nematodos de la placa de fijación con formalina al 4%, a otra placa de fijación conteniendo la solución SEINHORST I: Solución Seinhorst I: •

Etanol al 96%, 26 partes

•

Glicerina, 1 parte

•

Agua destilada, 73 partes

2° Tape la placa de fijación con una laminilla cubreobjeto y colóquela en un vaso conteniendo exceso de etanol de 0.6% (mas o menos la mitad del vaso). Cierre herméticamente el vaso y deposítelo en una incubadora a 35 - 40º C por 16 horas. 3° Al cabo de 16 horas con una micropipeta, saque la solución de la placa de fijación, chequeando bajo el estereoscopio que los nemátodos no sean sacados y llénela con la solución Seinhorst II. Solución Seinhorst II: •

Glicerina deshidratada, 7 partes

•

Etanol 96%, 93 partes

4° Tape la placa de fijación con un cubre objeto y colóquela en una placa petri. Guarde la placa petri en una incubadora a 30 - 40 º C. Después de 3 horas agregue a la placa de fijación una gota de glicerina deshidratada tápela con la laminilla cubreobjeto y déjela en la incubadora a 35 - 40ºC. 5° Al día siguiente retire la laminilla cubreobjeto y después de 4 a 5 horas, coloque la placa de fijación en un desecador con CaCl2 o sílica gel por 4-5 días.

3. MONTAJE 1° Transfiera los nematodos procesados a glicerina deshidratada. 2° Limpie el cubre y portaobjeto con etanol al 96%. Coloque una gota de glicerina deshidratada sobre el portaobjeto. 3° Coloque los nematodos

a montar en el centro de la gota de glicerina y en

posición radial a la gota tres fibras de vidrio de diámetro similar al de los nematodos. Deposite suavemente

una laminilla cubreobjetos tibia para que

no

quede burbujas de aire. El cubre-objetos queda sobre las fibras de vidrio las que impiden que los nematodos sean presionados por el cubreobjeto. 4° Si

la

gota

no

llena

el

cubreobjeto,

se

puede

añadir

deshidratada. Si lo sobrepasa retire el exceso con pedazos de papel filtro.

glicerina

5° Las partes del porta y cubreobjetos que van a ser sellados límpielas con un hisopo de algodón humedecido en etanol al 100%. Fije el cubreobjeto con tres gotas de glicel aplicados en tres puntos distintos. Después de 5 minutos selle completamente con glicel mediante un pincel. Después de 24 horas vuelva aplicar glicel en el contorno. 6° Rotule en el montaje permanente: •

Nombre especifico del nematodo.

•

Número y sexo.

•

El método de montaje.

•

Lugar del que se extrajeron los nematodos (suelo y cultivo).

•

Número de slide en su colección.

•

Iniciales de la persona que realiza el montaje.

AUTOEVALUACIÓN 1. ¿Qué sustancias y materiales se emplean en el proceso de muerte de los nemátodos? 2. ¿Con que finalidad se deshidratan los tejidos en el proceso de fijación? 3. ¿Cuáles son las especificaciones que debe ir en el montaje?

Cuadro N°4. Características básicas para la identificación al estereoscopio de algunos fitonemátodos.

GENERO DE LA

ESCLEROTIZACIÓN

ODONTOESTILETE

CABEZA

ESTOMATOESTILETE

Pratylenchus

Corto, desarrollado

Meloidogyne

Delgado c/porción hialina

Ventral subaguda

Helycotylenchus

Desarrollado

Ventral punta hemisférica

Heterodera

Desarrollado

Ventral aguda c/porción hialina

Globodera

Desarrollado

Xiphinema

Largo, desarrollado

Tylenchulus

Débil, no existe

Radopholus

Corto desarrollado

Rotylenchulus

Ligeramente desarrollado

Ditylenchulus

ONCHIO

SUPERPOSICIÓN

ESTILETE Ventral cónica

COLA

DE LA

POSICIÓN

VULVA

OVARIOS

redonda

55-69%

02

No existe

Variable

50-55%

02

Dorsal redondeada

casi

59-60%

02

Ventral terminal redondeado

57-63%

02

Corto, no existe

Alongada, cónica terminal

80-85%

01

Hemicycliophora

Largo delgado

Hemisférica alongada aguda

Rotylenchus

Bien desarrollado

Dorsal redondeada

51-62%

02

Trichodorus

Curvado

No existe

Cilíndrica

50-60%

02

Hirschmaniella

Bien desarrollado

Ventral terminal puntiaguda mic

48-58%

02

Paratylenchus

Variable

No existe

Curvada ventral

76-86%

01

Tylenchorhynchus

Bien desarrollado

No existe

Cónica redondeada

46-60%

02

Scutellonema

Bien desarrollado

Escutelo

Dorsal hemisférica

50-60%

02

Tylenchus

Débil

No existe

Filiforme

55-78%

02

Psilenchus

Débil

No existe

Filiforme clavida

55-78%

02

Aphelenchus

Débil

Sin nódulos

Dorsal roma redond

74-78%

01

Aphelenchoides

Débil

Dorsal cónica

62-83%

01

Bursaphelenchus

Débil

Ligeramente dorsal

Larga c/punta redon.

Criconemoides

Largo, fuerte

No existe

Cilíndrica

Nacobbus

Fuerte dorsal redondeado

Term. puntiaguda subaguda

Cónica y aguda

01 85-96%

01