Monolisa™ Anti-HBs PLUS 192 tests

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EQUIPO REACTIVO DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LOS ANTICUERPOS ANTI-HBs EN EL SUERO/PLASMA HUMANO POR EL MÉTODO INMUNOENZIMÁTICO

IVD Control de calidad del fabricante Todos los reactivos fabricados y comercializados están sujetos a un completo sistema de calidad que se inicia al recibir las materias primas y se extiende hasta la comercialización final del producto. Cada lote se somete a un control de calidad y únicamente se aprueba su introducción en el mercado cuando cumple los criterios de aceptación. La empresa posee los registros relativos a la producción y el control de cada uno de los lotes.

ÍNDICE

1. FINALIDAD DEL TEST 2. PRESENTACIÓN DEL TEST 3. PRINCIPIOS DEL TEST 4. COMPOSICIÓN DEL EQUIPO REACTIVO 5. PRECAUCIONES 6. CONSIGNAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD 7. MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO 8. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS 9. CONSERVACIÓN Y VALIDEZ 10. MUESTRAS 11. MODO DE EMPLEO 12. VALIDACIÓN DE LOS RESULTADOS POR LOS MÉTODOS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO 13. CÁLCULOS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 14. COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DEL SEDIMENTO DE LAS MUESTRAS Y DE LOS REACTIVOS 15. LÍMITES DEL TEST 16. RESULTADOS 17. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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1 - FINALIDAD DEL TEST Monolisa™ Anti-HBs PLUS permite determinar cualitativa y cuantitativamente, mediante una técnica inmunoenzimática, los anticuerpos dirigidos contra el antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B (anti-HBs) que pudieran estar presentes en el suero o el plasma humanos.

2 - PRESENTACIÓN DEL TEST La presencia de anticuerpos contra el antígeno de superficie de la Hepatitis B es un factor importante en el diagnóstico y el pronóstico de una infección por el virus de la Hepatitis B (VHB). Entre los pacientes en fase de infección aguda, los anti-HBs se detectan en casi el 80% de los casos, entre 1 y 3 meses después de haber aparecido los antígenos de superficie de la Hepatitis B (HBs Ag). Cuando se realizan los controles epidemiológicos, el anti-HBs se utiliza a fin de estimar los riesgos de exposición al virus de la Hepatitis B entre los posibles receptores de la vacuna contra la Hepatitis B, para hacer el seguimiento de las vacunaciones y para seleccionar el plasma altamente concentrado de anticuerpos con el fin de preparar inmunoglobulinas específicas. Monolisa™ Anti-HBs PLUS es un test EIA directo de tipo sándwich que utiliza microplacas sensibles a los antígenos de superficie de la Hepatitis B como fase sólida (HB Ag, subtipos ad y ay) y un conjugado que contiene peroxidasa de rábano marcador del antígeno de superficie HBs Ag (subtipos ad y ay). Los niveles de concentración en anti-HBs se han establecido a través de la Preparación de Referencia Anti-HBs de la OMS y se expresan en Milésimas de Unidad Internacional por mililitro (mUI/ml). Un nivel superior o igual a 10 mUI/ml se considera generalmente como el nivel estándar de protección contra el VHB después de la vacunación. Es necesaria una comprobación del nivel de concentración mínimo de 10 mUI/ml, nivel umbral de inmunidad, para hacer el seguimiento de los individuos vacunados que hubieran podido estar expuestos posteriormente al VHB.

3 - PRINCIPIO DEL TEST Muestras y controles se incuban en las cúpulas sensibles al antígeno de superficie de la Hepatitis B. Los anticuerpos anti-HBs potencialmente presentes en una de las muestras o de los controles se unen con los antígenos para formar un compuesto inmunológico antígeno/anticuerpo. El exceso de muestra se elimina durante la fase de lavado. El conjugado añadido se une a los compuestos antígenos /anticuerpos formados con anterioridad en las cúpulas. El exceso de conjugado se elimina durante una fase de lavado; posteriormente, en cada cúpula se añade una solución de detección enzimática, para continuar con una fase de incubación. Si una muestra contiene anticuerpos anti-HBs, la enzima unida HRP provoca la coloración del TMB de la solución cromógena que se vuelve azul. Después de añadir la solución de interrupción, la coloración del substrato azul pasa al color amarillo. Para las muestras que no contienen anticuerpos anti-HBs, la coloración del substrato desaparece de las cúpulas que pasan a ser incoloras durante la fase de incubación, una vez añadida la solución de interrupción. La intensidad de la coloración, medida por espectrofotometría, es proporcional a la concentración en anti-HBs de la muestra. Los valores de absorbancia medidos por espectrofotometría para cada muestra se comparan a un valor umbral (Vs) determinado a partir del calibrador 10 mUI/ml.

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4 - COMPOSICIÓN DEL EQUIPO REACTIVO Todos los reactivos se destinan exclusivamente al diagnóstico in vitro. ETIQUETADO

NATURALEZA DE LOS REACTIVOS

PRESENTACIÓN

R1

MICROPLACA 12 tiras de 8 cúpulas sensibilizadas con los antígenos de superficie del virus de la Hepatitis B, de subtipos ad y ay (humanos)

2 microplacas 240 ml

R2

SOLUCIÓN DE LAVADO CONCENTRADA (20X) Tampón Tris NaCl, pH = 7,4 Conservante : ProClinTM 300 (0,04%)

1 frasco 235 ml

C0

CONTROL NEGATIVO Tampón con suero de ternero fetal y estabilizador de proteínas Conservante : ProClin™ 300 (0,5%)

1 frasco 2.2 ml

C1

CALIBRADOR 10 mUI/ml * Tampón con anticuerpos Anti-HBs (humanos), suero de ternero fetal, estabilizador de proteínas e indicador coloreado para el sedimento Conservante : ProClin™ 300 (0,5%)

1 frasco 3 ml

C2

CALIBRADOR 100 mUI/ml – CONTROL POSITIVO Tampón con anticuerpos Anti-HBs (humanos), suero de ternero fetal, estabilizador de proteínas e indicador coloreado para el sedimento Conservante : ProClin™ 300 (0,5%)

1 frasco 2.2 ml

C3

CALIBRADOR 400 mUI/ml Tampón con anticuerpos Anti-HBs (humanos), suero de ternero fetal, estabilizador de proteínas e indicador coloreado para el sedimento Conservante : ProClin™ 300 (0,5%)

1 frasco 2.2 ml

C4

CALIBRADOR 1000 mUI/ml Tampón con anticuerpos Anti-HBs (humanos), suero de ternero fetal, estabilizador de proteínas e indicador coloreado para el sedimento Conservante : ProClin™ 300 (0,5%)

1 frasco 2.2 ml

R6

DILUYENTE DE MUESTRA Tampón con suero de ternero fetal, estabilizador de proteínas e indicador colorado para el sedimento Conservante : ProClin™ 300 (0,1%)

1 frasco 27 ml

R7a

CONJUGADO CONCENTRADO (11X) Tampón con una mezcla de antígenos HBs de los subtipos ad y ay (humanos) sensibles a la peroxidasa y un estabilizador de proteínas Conservante : ProClin™ 300 (0,5%)

1 frasco 2.5 ml

R7b

DILUYENTE DEL CONJUGADO Tampón con suero de ternero fetal y estabilizador de proteínas Conservante : ProClin™ 300 (0,1%)

1 frasco 25 ml

R8

TAMPÓN DEL SUBSTRATO Solución de ácido cítrico y acetato de sodio pH 4,0 que contiene 0,015% H2O2 y 4% de dimetilsulfóxido (DMSO)

1 frasco 60 ml

R9

CROMÓGENO Solución que contiene tetrametilbenzidina (TMB)

1 frasco 5 ml

R10

SOLUCIÓN DE INTERRUPCIÓN Solución de ácido sulfúrico1 N

1 frasco 28 ml

* Los controles se calibran a partir de una referencia interna, que a su vez se ha calibrado a partir de la preparación de referencia 1st IRP WHO 1977. Conservar el material entre +2ºC y +8°C. Antes de la utilización, los reactivos, excepto el conjugado concentrado, deberán alcanzar la temperatura del laboratorio (18-30°C). 20

Inmediatamente después de la utilización, los reactivos se guardarán de nuevo entre +2ºC y +8°C. Las tiras sin utilizar se guardarán en la bolsa cerrada. No hay que quitar el desecador. Conservar las tiras entre +2ºC y +8°C.

5 - PRECAUCIONES La calidad de los resultados depende del empleo de las buenas prácticas de laboratorio, entre las que se cuentan : • El nombre del test así como su número de identificación específico se muestran en el embalaje de cada microplaca. Este número de identificación específico figura también en cada tira. Monolisa™ Anti-HBs PLUS: número de identificación específico = 63. Esta identificación se debe comprobar antes de cada utilización. Las tiras que no contengan el número de test, o que éste sea diferente al del test correspondiente, no se deberán utilizar. • No hay que usar reactivos cuya validez haya caducado. • No hay que mezclar reactivos de lotes diferentes durante una misma prueba. OBSERVACIÓN : se pueden utilizar otros lotes de solución de lavado (R2, identificación en la etiqueta : 20X color verde), de tampón de substrato (R8, identificado TMB buf. en azul), de cromógeno (R9, identificado TMB 11X en violeta) y de solución de interrupción (R10, identificada 1N en rojo), que los suministrados con el equipo reactivo, con la condición de utilizar el mismo lote durante la realización de la misma prueba. Estos reactivos se pueden emplear con otros productos de nuestra empresa. Además, la solución de lavado (R2, identificación en la etiqueta: 20X color verde) se puede mezclar con las otras 2 soluciones de lavado incluidas en los distintos kits de reactivos de Bio-Rad (R2, identificaciones en la etiqueta: 10X color azul o 10X color naranja) cuando se reconstituyen debidamente, siempre que se use sólo una mezcla en cada tanda de pruebas. Si desea información detallada, sírvase contactar con nuestro servicio técnico. • Antes del empleo, habrá que esperar 30 minutos a que los reactivos se equilibren a la temperatura ambiente. • Hay que reconstituir cuidadosamente los reactivos evitando todo tipo de contaminación. • No hay que realizar el test en presencia de vapores reactivos (ácidos, alcalinos, aldehídos) o de polvos que pudiesen alterar la actividad enzimática del conjugado. • Hay que utilizar una cristalería perfectamente lavada y enjuagada con agua destilada o, preferentemente, material de usar y tirar. • No hay que dejar que la microplaca se seque entre el final del lavado y la distribución de los reactivos. • La reacción enzimática es muy sensible a todos los metales o iones metálicos. Por consiguiente, ningún elemento metálico deberá entrar en contacto con las diferentes soluciones que contengan el conjugado o la solución del substrato. • La solución de revelación (tampón substrato + cromógeno) tendrá que ser de color de rosa. La aparición de otra coloración en los minutos que siguen a la reconstitución indica que el reactivo no se puede utilizar y debe sustituirse. • Para esta preparación, hay que utilizar preferentemente recipientes y material de distribución de plástico, de usar y tirar, o cristalería lavada previamente con ácido clorhídrico 1N, enjuagada con agua destilada y que esté seca. Conservar la solución en un sitio oscuro. • Hay que utilizar un cono de distribución nuevo para cada suero. • El lavado de las cúpulas es una etapa esencial de la manipulación : hay que respetar el número de ciclos de lavado prescritos y asegurarse de que todas las cúpulas se hayan llenado completamente, y luego que se hayan vaciado del todo. Un lavado defectuoso puede dar lugar a resultados incorrectos. • Nunca hay que utilizar el mismo recipiente para distribuir el conjugado y la solución de revelación.

6 - CONSIGNAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD Algunos reactivos contienen ProClin™ 300 (0.04%, 0.1% y/o 0.5%) R43 : Puede ser sensible al contacto con la piel. S28-37 : si se ha producido el contacto con la piel, habrá que lavarse inmediata y abundantemente con agua y jabón. Se deben llevar guantes adecuados. Xi Irritante

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• El equipo reactivo Monolisa™‚ Anti-HBs PLUS contiene componentes de origen humano que se han comprobado y se ha verificado que no son reactivos ante los antígenos de superficie del virus de la Hepatitis B (VHB), ante anticuerpos dirigidos contra el virus de la Hepatitis C (VHC), y ante anticuerpos dirigidos contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2). No obstante, ningún método puede garantizar de forma absoluta la ausencia de virus VIH, de Hepatitis B o C, o de otros agentes infecciosos. Hay que considerar estos reactivos, así como las muestras de los pacientes, como potencialmente infecciosos y, consecuentemente, habrá que manipularlos con las debidas precauciones de empleo. • Hay que considerar el material que está directamente en contacto con las muestras y los reactivos, así como las soluciones de lavado, como productos contaminados y tratarlos como tales. • Hay que evitar las salpicaduras de las muestras o de las soluciones que las contengan. • Durante la manipulación de los reactivos, hay que llevar guantes de usar y tirar. • No hay que utilizar la boca con las pipetas. • Las muestras, los reactivos de origen humano, así como el material y los productos contaminados se eliminarán después de la descontaminación: - Ya sea sumergiéndolos en lejía con una concentración final del 5% de hipoclorito sódico (1 volumen de lejía por 10 volúmenes de líquido contaminado o de agua) durante 30 minutos - O bien mediante el autoclave a 121°C durante 2 horas como mínimo. El autoclave a 121°C, durante una hora como mínimo, es el mejor procedimiento para inactivar los virus VIH y los de la Hepatitis B. ATENCIÓN : EN EL AUTOCLAVE NO SE DEBEN INTRODUCIR SOLUCIONES QUE CONTENGAN HIPOCLORITO SÓDICO. Las superficies manchadas se limpiarán con lejía diluida al 10%. Si el líquido contaminante es un ácido, las superficies manchadas se neutralizarán previamente con bicarbonato de sosa y a continuación se limpiarán con lejía y se secarán con papel absorbente. El material utilizado para la limpieza se tendrá que eliminar en un contendor especial para residuos contaminados. • No hay que olvidar que las soluciones efluentes o los líquidos que contengan muestras biológicas hay que neutralizarlos y/o introducirlos en el autoclave antes de verterlos en el fregadero. • Si se solicita, existe una ficha de datos de seguridad disponible.

7 - MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO • Agua destilada. • Hipoclorito sódico (lejía) y bicarbonato de sodio. • Pipetas, multipipetas automáticas o semiautomáticas, ajustables o fijas, para medir y distribuir de 10 µl a 200 µl, 1 ml, 5 ml, 10 ml. • Probetas graduadas de 25 ml; 100 ml; 1000 ml. • Contenedor de residuos contaminados. • Baño María o incubadora de microplacas con regulación de temperatura a 37°C ± 1°C . • Dispositivo de lavado manual, semiautomático o aparato de lavado para placa de microtitulación. • Aparato de lectura para microplacas equipado con filtros de 405, 450 nm y 620 nm. • Papel absorbente. • Guantes. • Contenedores limpios de polipropileno para la preparación del TMB.

8 - PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS Antes de utilizar los reactivos del equipo reactivo Monolisa™ Anti-HBs PLUS, hay que dejar que se equilibren a temperatura ambiente (18-30°C) durante 30 minutos. 1) Reactivos listos para usar Microplaca (R1) Cada soporte marco que contiene 12 tiras está incluido en una bolsa sellada. Abrir la bolsa con unas tijeras o un escalpelo de 0,5 a 1 cm por encima del la soldadura. Sacar el marco y volver a introducir inmediatamente en la bolsa las tiras no utilizadas. Cerrar la bolsa cuidadosamente y volver a guardarla a +2-8°C. 22

Diluyente de la muestra (R6) Control negativo Anti-HBs (C0) Calibrador 10 mUI/ml (C1) Calibrador 100 mUI/ml – Control positivo Anti-HBs (C2) Calibrador 400 mUI/ml (C3) Calibrador 1000 mUI/ml (C4) Antes del empleo, hay que homogeneizar los reactivos mediante un torbellino o vuelta de campana. 2) Reactivos que hay que reconstituir Solución de lavado concentrada (20X) : R2 Diluya al 1:20 en agua destilada para obtener una solución de lavado lista para su uso. Prepare 800ml para una placa de 12 tiras. Solución del conjugado (R7a + R7b) Hay que equilibrar el diluyente del conjugado (R7b) con la temperatura del laboratorio. Antes de usarlos, hay que mezclar mediante vuelta de campana el diluyente (R7b, de incoloro a amarillo pálido) y el conjugado Anti-HBs (R7a, verde). Para cada tira que haya que someter a prueba, hay que diluir el reactivo R7a en el reactivo R7b en la proporción de 1/11 (ejemplo : 100 µl de conjugado Anti-HBs (R7a) en un 1 ml de diluyente de conjugado (R7b) en un tubo de polipropileno limpio). Utilizar la tabla como guía. Mezclar suavemente para evitar la formación de espuma. La solución de conjugado activa debe protegerse de la luz, tanto cuando esté a temperatura ambiente como cuando esté a una temperatura de entre +2ºC y+8ºC. La solución de conjugado debe ser verde. Es estable 8 horas a la temperatura del laboratorio, y 24 horas si se conserva entre +2ºC y +8°C. La solución de conjugado puede preparase vaciando mediante una pipeta la totalidad del frasco de conjugado Anti-HBs (R7a) e introduciéndolo en el frasco de diluyente del conjugado (R7b). Antes de su empleo, siempre hay que mezclar la solución de trabajo dándole la vuelta al frasco. Inmediatamente después de la utilización, hay que guardar de nuevo el conjugado Anti-HBs (R7a) en el frigorífico. A fin de evitar la contaminación del conjugado, hay que ponerse guantes limpios y evitar tocar la contera de las pipetas. Preparación de la solución de conjugado por tira. Número de tiras que 1 se utilizarán Cantidad de conjugado 100 concentrado (µl) R7a Cantidad 1 de diluyente (ml) R7b

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3

4

5

6

7

8

9

200

300

400

500

600

700

800

900

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12*

24**

1000 1100 1200 2400 10

11

12

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* 1 placa completa ** 2 placas completas Solución de revelación enzimática (R8 + R9) Dejar que el cromógeno (R9) y el tampón substrato (R8) alcancen la temperatura del laboratorio. Antes de usarlos, mezclar, dándole la vuelta, el cromógeno (R9) y el tampón substrato (R8). Diluir el reactivo R9 en el reactivo R8 al 1/11 (ejemplo : 1 ml de reactivo R9 en 10 ml de reactivo R8) sabiendo que son necesarios y suficientes 10 ml para tratar 12 tiras. Homogeneizar. Antes de usarla, mezclar suavemente la solución de revelación enzimática. Esperar 5 minutes antes del empleo. Esta solución se deberá utilizar dentro de las 8 horas siguientes y se conservará a la temperatura ambiente y en lugar oscuro. El cromógeno debe ser rosa. Cualquier otro color indica que el reactivo se ha contaminado: en ese caso, no se tiene que utilizar. Sólo se preparará la cantidad de reactivo que se vaya a utilizar dentro de las 6 horas siguientes. Habrá que asegurarse de que el volumen de reactivo diluido será suficiente para la totalidad de la prueba en curso. Utilizar la tabla como guía. 23

Preparación de la solución de revelación enzimática por tira Número de tiras que se utilizarán Cantidad de Cromógeno (µl) R9 Cantidad de Tampón de substrato (ml) R8

1

2

3

4

5

6

7

8

9

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1

2

3

4

5

6

7

8

9

* 1 placa completa

10

11

12*

24**

1000 1100 1200 2400

10

11

12

24

** 2 placas completas

9 - CONSERVACIÓN Y VALIDEZ El estuche se debe conservar a +2-8°C. Cuando se conserva a esta temperatura, cada reactivoincluido en el estuche se puede usar hasta la fecha de caducidad mencionada en el envase (excepto en el caso de instrucciones específicas). • R1 : Una vez abierta la bolsa sellada al vacío, las tiras de micropocillos almacenadas a +2-8°C en la bolsa cuidadosamente sellada se pueden usar durante 1 mes. • R2 : La solución de lavado diluida se puede conservar a temperatura ambiente (2-30°C) durante 2 semanas. La solución de lavado concentrada (R2) se puede conservar a +2-30°C . • R7a + R7b : a solución de conjugado activa debe protegerse de la luz, tanto cuando esté a temperatura ambiente como cuando esté a una temperatura de entre +2ºC y+8ºC. La solución de conjugado se pueden usar durante 24 horas si se conservan a +2-8°C y 8 horas si se almacenan a temperatura ambiente (18-30°C). • R8 + R9 : Después de su reconstitución, el reactivo almacenado en la oscuridad se puede usar durante 6 horas a temperatura ambiente (18-30°C). Después de la abertura, el resto de reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el estuche, si se conservan entre +2ºC y +8°C.

10 - MUESTRAS Sacar una muestra de sangre según las prácticas normales. Los tests se efectúan sobre muestras de suero o de plasma. Solamente se han sometido a prueba las muestras siguientes: suero recogido en tubos estándares o que contengan un gel separador, plasma recogido en EDTA o heparina. En caso de utilizar plasma recogido en citrato o ACD, los resultados obtenidos son inferiores en un 20% a los obtenidos en suero (recogido con anticoagulantes como el EDTA y la heparina). Las muestras que presentan agregados se tienen que clarificar mediante centrifugación antes de la prueba; efectivamente, las partículas o agregados de fibrina pueden ofrecer resultados falsamente positivos. Las muestras se conservarán entre +2ºC y +8°C si el diagnóstico precoz se efectúa dentro de los 7 días siguientes o se pueden conservar congeladas a -20°C. Evitar las congelaciones / descongelaciones repetidas. Las muestras que hayan sufrido más de 5 ciclos de congelación / descongelación no se deben utilizar. Si las muestras tienen que viajar, se embalarán según las normas vigentes para el transporte de agentes etiológicos y se transportarán preferiblemente congeladas. OBSERVACIÓN : no se ha evidenciado ninguna interferencia en las muestras que contienen hasta 90 g/l de albúmina y 100 mg/l de bilirrubina, ni tampoco en las muestras lipémicas que contienen hasta 36 g/l de triglicéridos, ni en las muestras que contienen hasta 2,55 g/l de hemoglobina. No se utilizarán las muestras que hayan sido sometidas a tratamiento a 56 °C durante 30 minutos.

11 - MODO DE EMPLEO Seguir estrictamente el protocolo propuesto. Para validar la calidad del test se utilizarán los sueros de control negativo y positivo en cada ejecución del test. Aplicar las buenas prácticas de laboratorio. 24

Protocolo 1. Establecer cuidadosamente el plan de distribución y de identificación de las muestras. 2. Antes de aplicar el test, todos los reactivos deberán alcanzar la temperatura del laboratorio. 3. Preparar la solución de conjugado (R7a+R7b), la solución de revelación enzimática (R8+R9) y la solución de lavado diluida R2. 4. Sacar el marco soporte y las tiras (R1) del embalaje protector. Quitar las tiras que no sean necesarias para la prueba y reemplazarlas por tiras vacías. 5. Diluir las muestras, calibradores y controles en la proporción de 3/4 en el diluyente de la muestra R6 según uno de los dos métodos siguientes : a. Directamente en la cúpula (añadir 25 µl de diluyente de muestra en cada cúpula, luego 75 µl de muestra o control; mezclar por aspiración, comprimiendo 2 veces (suavemente para evitar la formación de espuma). b. Antes de la adición en las cúpulas (ejemplo : diluir 150 µl de muestra en 50 µl de diluyente de muestra, mezclar suavemente para evitar la formación de espuma y transferir 100 µl a la cúpula). NOTA : después de la utilización de la muestra, el diluyente pasará de púrpura a azul. Es posible comprobar la presencia de la muestra en los pozos mediante lectura espectrofotométrica a 620 nm (véase el capítulo 14 : COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DEL SEDIMENTO DE LAS MUESTRAS Y DE LOS REACTIVOS) 6. Depositar directamente, sin lavado previo de la placa, y de forma sucesiva (plan de placa sugerido), siguiendo el método elegido : Método Cualitativo - Control negativo Anti-HBs (C0) en A1, - Calibrador 10 mUI/ml (C1) en B1, C1, D1, - Calibrador 100 mUI/ml – Control Positivo (C2) en E1, - Muestras en F1, G1, etc.… Método Cuantitativo - Control negativo Anti-HBs (C0) en A1, - Calibrador 10 mUI/ml (C1) en B1, C1, - Calibrador 100 mUI/ml – Control Positivo (C2) en D1, - Calibrador 400 mUI/ml (C3) en E1, - Calibrador 1000 mUI/ml (C4) en F1, - Muestras en G1, etc.… En función del sistema utilizado, se puede modificar la posición o el orden de distribución de los controles. 7. Cubrir, a ser posible, con una película autoadhesiva presionando bien sobre toda la superficie para garantizar la estanqueidad. 8. Incubar la microplaca durante 60 ± 5 minutos a 37°C ± 1°C. 9. Retirar la película adhesiva. Aspirar el contenido de todas las cúpulas hacia un contendor para residuos contaminados y añadir inmediatamente en cada una de ellas un mínimo de 0,375 ml de solución de lavado. Respetar un tiempo de remojo (tiempo de espera) mínimo de 30 segundos y de 60 como máximo. Aspirar de nuevo. Repetir el lavado al menos 4 veces (es decir, un mínimo de 5 lavados en total). El volumen residual debe ser inferior a 10 µl (si es necesario, habrá que secar la placa dándole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente). 10. Si se dispone de un equipo de lavado automático, respetar el mismo ciclo de actuación. 11. Distribuir rápidamente 100 µl de la solución de conjugado (R7a+R7b) en todas las cúpulas. Recubrir, si es posible, con una película nueva e incubar sin esperar durante 60 ± 5 minutos a 37°C ± 1°C. NOTA : el conjugado es de color verde. Es posible comprobar la presencia de conjugado en los pozos por lectura fotométrica a 620 nm (véase el Capítulo 14 : COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DEL SEDIMENTO DE LAS MUESTRAS Y DE LOS REACTIVOS).

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12. Retirar la película adhesiva. Aspirar el contenido de todas las cúpulas hacia un contendor para residuos contaminados y añadir inmediatamente en cada una de ellas un mínimo de 0,375 ml de solución de lavado. Respetar un tiempo de remojo (tiempo de espera) mínimo de 30 segundos y de 60 como máximo. Aspirar de nuevo. Repetir el lavado al menos 4 veces (es decir, un mínimo de 5 lavados en total). El volumen residual debe ser inferior a 10 µl (si es necesario, habrá que secar la placa dándole la vuelta sobre una hoja de papel absorbente). 13. Si se dispone de un equipo de lavado automático, respetar el mismo ciclo de actuación. 14. Distribuir rápidamente en todas las cúpulas 100 µl de solución de revelación de la actividad enzimática (R8+R9). Dejar que la reacción se desarrolle en la oscuridad durante 30 ± 5 minutos a temperatura ambiente (18 a 30°C). En el momento de la incubación, no se tiene que utilizar película adhesiva. NOTA : La solución de revelación es de color rosa. Es posible comprobar la presencia de substrato en los pozos mediante lectura fotométrica a 490 nm (véase el Capítulo 14 : COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DEL SEDIMENTO DE LAS MUESTRAS Y DE LOS REACTIVOS). 15. Añadir 100 µl de la solución de interrupción (R10) adoptando la misma secuencia y el mismo ritmo de distribución que para la solución de revelación. Homogeneizar la mezcla de reacción. 16. Secar cuidadosamente la parte inferior de las placas. Esperar al menos 4 minutos después de haber distribuido la solución de interrupción y, en los 30 minutos siguientes a la interrupción de la reacción, leer la densidad óptica a 450/620-700 nm y 405/620-700 nm con la ayuda de un lector de placas. Antes de la trascripción de los resultados, habrá que asegurarse de la concordancia entre la lectura y el plan de distribución e identificación de las placas y de las muestras.

12 - VALIDACIÓN DE LOS RESULTADOS MEDIANTE LOS MÉTODOS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO El valor umbral (Vs) corresponde a la media de las DO medidas por el calibrador 10 mUI/ml (C1). Para el control negativo (C0) La absorbancia medida debe ser superior a 0,000 e inferior o igual a 0,070 (0,000 < DOC0 ≤ 0,070). Para el control positivo (C2) La absorbancia medida debe ser superior o igual a 0,400 (DOC2 ≥ 0,400). Para los controles negativo (C0) y positivo (C2), si no se observa uno de estos criterios en los métodos cualitativo y cuantitativo, el test no es válido y se debe iniciar de nuevo. Para el calibrador 10 mUI/ml (C1) La absorbancia medida debe ser superior o igual a 0,050 e inferior o igual a 0,200 (0,050 ≤ DOC1 ≤ 0,200). Cada valor de absorbancia medido debe ser superior o igual a 1,5 veces el valor de la DO del control negativo C0 : DOC1 ≥ (1,5 x DOC0). En el caso del método cualitativo, si uno de los tres valores de DOC1 medidos no se encuentra en la escala de valores de validación (la DOC1 medida debe ser superior o igual a 0,050 e inferior o igual a 0,200), la media se calculará a partir de los dos valores restantes. Por tanto, el test se validará. Si varios valores de DOC1 medidos no se encuentran dentro de la escala de valores de validación, el test no será válido y se deberá iniciar de nuevo. En el caso del método cuantitativo, si uno de los dos valores de DOC1 medido no se encuentra dentro de la escala de valores de validación (la DOC1 medida debe ser superior o igual a 0,050 e inferior o igual a 0,200), el test no es válido y deberá iniciarse de nuevo.

13 - CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La presencia o ausencia de anticuerpos anti-HBs se determina comparando, para cada muestra, la absorbancia registrada con la del valor umbral calculado. 1. Método cualitativo Calcular la media de absorbancias medidas para el calibrador 10 mUI/ml (C1) 26

Ejemplo : Calibrador 10 mUI/ml C1 B1 0,078 C1 0,079 D1 0,089 Suma = 0,246 Media DOC1 = 0,246 / 3 = 0,082 Si uno de los valores de DOC1 medidos no se encuentra dentro de la escala de valores de validación (la DOC1 medida debe ser superior o igual a 0,050 e inferior o igual a 0,200), la media se calculará a partir de los dos valores restantes. Cálculo del valor umbral (Vs) El valor umbral corresponde a la media de las DO medidas para el calibrador 10 mUI/ml (C1) : Vs = Media DOC1 Interpretación de los resultados Las muestras cuya densidad óptica medida sea superior o igual al valor umbral, se consideran como inicialmente reactivas. Las muestras cuya densidad óptica medida sea inferior al valor umbral, se consideran no reactivas. Aquellas, cuya densidad óptica medida sea superior al límite superior de detección del lector, se tendrán que considerar como reactivas. OBSERVACIONES : En razón de la diversidad de los anticuerpos y de la diversidad de los antígenos utilizados en cada test, los resultados obtenidos pueden ser diferentes según el test utilizado. Estrategias de vacunación: se proponen diferentes recomendaciones según las zonas y los países en los que se vayan a realizar las pruebas. En caso de cambio de método de análisis durante un control de vacunación, la tasa de anticuerpos anti-HBs debe determinarse en paralelo para los dos métodos durante un periodo transitorio. 2. Método cuantitativo A fin de determinar la concentración de anticuerpos Anti-HBs de las muestras (suero o plasma), se deben utilizar los calibradores C0 (0 mUI/ml), C1(10 mUI/ml), C2 (100 mUI/ml), C3 (400 mUI/ml) y C4 (1000 mUI/ml). Los calibradores se depositan directamente en cada cúpula, sin lavado previo de la placa, de forma sucesiva como se ha indicado en el protocolo (véase el Capítulo 10 : MODO DE EMPLEO : Método cuantitativo). Leer la densidad óptica a 450/620-700 nm con la ayuda de un lector de placa. Para las muestras cuya absorbancia medida a 450 nm (A450) sea superior o igual a la del calibrador 400mUI/ml C3 (A450 ≥ DOC3), leer la densidad óptica a 405/620-700 nm. La absorbancia medida a 450 nm (A450) para los 4 calibradores C0, C1, C2 y C3, se registra gráficamente en función de su concentración respectiva siguiendo una regresión polinómica de orden 2. La A450 del calibrador C4 (1000 mUI/ml) no se puede usar en este gráfico, el valor de absorbancia puede estar fuera de los límites de detección del lector; de aquí, la necesidad de la segunda gráfica. Las muestras cuyas DO medidas sean inferiores a la DO del C3 se interpretan con la curva establecida a 450 nm. La absorbancia medida a 405 nm (A405) para los calibradores C3 (400 mUI/ml) y C4 (1000 mUI/ml) se registra gráficamente en función de su concentración respectiva, punto por punto. Se traza una línea recta que una estos puntos. De este modo, en la intersección del valor de absorbancia medido, se puede leer la concentración en anticuerpos Anti-HBs (mUI/ml) de cada muestra. Esta curva de absorbancia a 405 nm se utiliza para determinar la concentración de anticuerpos Anti-HBs de las muestras (suero o plasma) cuyo valor sea superior a 400 mUI/ml e inferior o igual a 1000 mUI/ml. Las muestras cuya concentración en anticuerpos anti-HBs sea superior a 1000 mUI/ml pueden diluirse utilizando la solución de lavado (R2 diluida), para luego recomenzar el test.

14 - COMPROBACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DEL SEDIMENTO DE LAS MUESTRAS Y DE LOS REACTIVOS (OPCIONAL) COMPROBACIÓN DEL SEDIMENTO DEL DILUYENTE (R6) Y DE LAS MUESTRAS Una vez añadida la muestra, el diluyente R6 cambia de violeta a azul. La presencia simultánea del diluyente R6 y de la muestra o del control, se puede comprobar mediante una lectura espectrofotométrica a 620 nm : el valor de la DO medida para cada cúpula tendrá que ser superior o igual a 0,150 (un valor que se sitúe por debajo de esta norma indica una mala distribución de la muestra o del control). 27

COMPROBACIÓN DEL SEDIMENTO DE LA SOLUCIÓN DE CONJUGADO (R7a + R7b) La solución de conjugado (R7a + R7b) es de coloración verde. La presencia de la solución de conjugado en las cúpulas puede comprobarse mediante lectura espectrofotométrica a 620 nm: el valor de la DO medida para cada cúpula tendrá que ser superior o igual a 0,070 (un valor que se sitúe por debajo de esta norma indica una mala distribución de la solución de conjugado). COMPROBACIÓN DEL SEDIMENTO DE LA SOLUCIÓN DE REVELACIÓN (R8 + R9) La solución de revelación es de color rosa. Se puede comprobar la presencia de la solución de revelación rosada mediante lectura automática a 490 nm : una cúpula que contenga la solución de revelación debe tener una densidad óptica superior a 0,100 (una DO menor indica una mala distribución de la solución de revelación). Existe una diferencia de coloración significativa entre una cúpula vacía y una cúpula que contenga la solución de revelación rosada.

15 - LÍMITES DEL TEST • Durante el análisis de las muestras de suero o de plasma para la detección de anticuerpos antiHBs se deben respetar el protocolo y la interpretación de los resultados. A cada usuario de este kit se le aconseja que lea atentamente las instrucciones antes de comenzar con las manipulaciones. Particularmente, el protocolo relativo a la distribución de las muestras y de los reactivos, las etapas de lavado, así como las etapas de incubación, que deberán controlarse escrupulosamente. • Una mala distribución de las muestras o de los reactivos puede acarrear resultados falsamente negativos. Se aconseja comprobar de nuevo las muestras para las que subsista una duda mientras se sigue el protocolo. • Los factores que pueden afectar a la validez de los resultados son: una mala distribución de las muestras en las cúpulas, una etapa de lavado de las cúpulas ineficaz, temperaturas o tiempos de incubación incorrectos, la adición de reactivos en mal estado en las cúpulas, la presencia de metales o de lejía en las cúpulas. • En razón de la variabilidad de las respuestas inmunológicas de un individuo a otro, así como también después de una infección por el virus de la Hepatitis B que siga a una vacunación o a una inyección de inmunoglobulinas terapéuticas, se recomienda interpretar con precaución los resultados de valor bajo.

16 - RESULTADOS Los resultados analíticos que se presentan a continuación, se han obtenido durante las evaluaciones del test Monolisa™ Anti-HBs PLUS. Los resultados obtenidos en el laboratorio pueden diferir de éstos. 1. Intra-serie Se han sometido a prueba, 10 veces por triplicado en la misma serie, cinco muestras positivas y una negativa. Muestra Anti-HBs Negativa Anti-HBs Positiva ~ 20 mUI/mL Anti-HBs Positiva ~ 50 mUI/mL Anti-HBs Positiva ~ 100 mUI/mL Anti-HBs Positiva ~ 150 mUI/mL Anti-HBs Positiva ~ 300 mUI/mL

28

Media del DO 0,023 0,143 0,358 0,715 1,231 1,982

DS 0,003 0,005 0,012 0,019 0,037 0,048

CV% 13,6 3,4 3,3 2,6 3,0 2,4

2. Inter-serie Se han sometido a prueba, por duplicado y dos veces al día durante 20 días según el procedimiento EP5 NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards), 3 muestras positivas y una negativa. Muestra Anti-HBs Negativa Anti-HBs Positiva ~ 20 mUI/mL Anti-HBs Positiva ~ 150 mUI/mL Anti-HBs Positiva ~ 300 mUI/mL

Media del DO 0,023 0,146 1,284 2,015

DS 0,004 0,008 0,060 0,067

CV% 15,5 5,5 4,9 3,6

3. Precisión de la técnica Los resultados cuantitativos se ofrecen en mUI/ml calibrados en virtud de la preparación internacional de referencia : 1st IRP WHO Reference Standard 1977. Se ha realizado un estudio de correlación comprobando las concentraciones de 0, 10, 100,400 y 1000 mUI/mL obtenidas por dilución del estándar internacional de la OMS frente a los calibradores suministrados en el equipo reactivo. Tanto el coeficiente de correlación como la inclinación de la recta de correlación obtenidos son R2 = 0,99 y a= 0,96. 4. Sensibilidad analítica (= Límite inferior de detección que corresponde a la concentración que se puede medir de producto analizado que tenga el valor más bajo distinto de cero calculado a partir de las medias y de las desviaciones estándares obtenidas en el punto 0 y 10 mlU/ml): se ha obtenido un valor inferior a 2 mUI/ml. 5. Linealidad del método Se han sometido a prueba 5 muestras fuertemente positivas en anti-HBs (dosificación: 924 mUI/ml, 330 mUI/ml, 326 mUI/ml, 544 mUI/ml y 857 mUI/ml) sin diluir, además de a diferentes porcentajes de dilución (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 y, para algunas, 1/64). Los porcentajes de recubrimiento están comprendidos entre 92% y 116%. 6. Campo de medición El campo de medición se sitúa entre 2 y 1000 mUI/mL, y está definido por el límite inferior de detección y el máximo de la curva de referencia. Los valores situados por debajo del límite de detección están expresados de la siguiente forma: < 2,00 mUI/mL, mientras que los valores situados por encima del campo de medición se expresan así: > 1000 mUI/mL. 7. Efecto gancho Se han sometido a prueba 4 muestras sin diluir cuyas concentraciones en Anticuerpos anti-HBs se han evaluado en 200000 mIU/mL, 5500 mUI/mL, 28000 y 9000 mUI/mL. Concentración

200000 mUI/mL

28000 mUI/mL

9000 mUI/mL

5500 mUI/mL

DO 450

Leer a 405 nm

Leer a 405 nm

Leer a 405 nm

Leer a 405 nm

DO 405 Resultado

1,342

1,596

1,629

1,310

>1000 mUI/mL

> 1000 mUI/mL

> 1000 mUI/mL

> 1000 mUI/mL

No se ha evidenciado ningún efecto gancho durante la evaluación de los resultados. 8. Especificidad a) Se ha sometido a prueba un muestreo de 179 sueros de pacientes aquejados de las siguientes patologías hepatitis A, hepatitis C, VIH1, VIH2, HTLV, HSV, EBV, Rubéola, Toxoplasmosis, Mieloma (IgG, IgM), RF, ANA, HAMA, Cirrosis y multitransfusión. Se han encontrado positivas 21 muestras con Monolisa™ Anti-HBs PLUS y otros dos tests de detección de los anti-HBs marcados CE. Una muestra ANA positiva presentó una reactividad con el test Monolisa™; otras dos muestras, 1 HIV1 y 1HIV2, presentaron una reactividad con Monolisa™ y un test alternativo. b) La especificidad del test se determinó a partir de las muestras de donantes de sangre y de pacientes hospitalizados, que se tomaron al azar.

29

Nº de muestras Positivas % Especificidad

Lugar 1 Donantes y hospitalizados 511 3 99,4%

Lugar 2 Donantes 300 0 100%

Lugar 3 Hospitalizados 240 3 98,7%

TOTAL 1051 6 99,4%

La especificidad es del 99,4% (98,8% - 99,8% con un intervalo de fiabilidad del 95%). 9. Sensibilidad Se han sometido a prueba, con el test Monolisa™ Anti-HBs PLUS y otro test anti-HBs, 654 muestras provinentes de diferentes poblaciones de pacientes vacunados o infectados naturalmente. Las discordancias se han sometido a prueba con una tercera técnica marcada CE. Perfil del paciente

N

Concordancia Monolisa™ Test 1 marcado CE Test 2 marcado CE*

Vacunados

347

98,8%

Hepatitis B resuelta

71

95,8%

99,1% 100%

Hepatitis B crónica

37

100%

No probado

Pacientes hospitalizados

199

98,6%

No probado

Total

654

98,5%

99,5%

Entre estos 654 pacientes sometidos al ensayo, 617 resultaron ser positivos en anti-HBs y 37 negativos (pacientes aquejados de hepatitis crónica) con el test 1. Para estos 617 pacientes, la concordancia es del 98,4% (intervalo de fiabilidad del 95%, 97% - 99,2%). * La sensibilidad del test evaluado, una vez resueltas las discordancias con el test 2, es igual al 99,2% (intervalo de fiabilidad del 95%, 98,1% - 99,7%).

17 - REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Lai CL, Ratziu V, Yuen M-F, Poynard T: Viral hepatitis B. Lancet 362 : 2089-2094, 2003. 2. Maddrey WC: Hepatitis B : an important public health issue. J Med Virol 61: 362-366, 2000. 3. Delmonico FL, Snydman DR: Organ donor screening for infectious diseases. Transplantation 65 : 603-610, 1998. 4. Centers for Disease Control : Recommendations for preventing transmission of infections among chronic hemodialysis patients. MMWR 50 (No. RR-5): 1-43, 2001. 5. Tiollais P, Pourcel C, Dejean A : The hepatitis B virus. Nature 317: 489-495, 1985. 6. Lee WM: Hepatitis B infection. New Engl J Med 337 : 1733-1745, 1997. 7. Mushahwar IK, Dienstag JL, Polesky HF, McGrath LC, Decker RH, Overby LR Interpretation of various serological profiles of hepatitis B virus infection. Am J Clin Pathol 76: 773-777, 1981. 8. McMahon BJ, Alward WLM, Hall DB, et al.: Acute hepatitis B infection: relation of age to the clinical expression of disease and subsequent development of the carrier state. J Infect Dis 151: 599-603, 1985. 9. Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM: Serologic diagnosis of acute and chronic viral hepatitis. Semin Liver Dis 11: 73-83, 1991. 10. Centers for Disease Control: Hepatitis B vaccination—United States, 1982-2002. MMWR 51(No. 25): 549-563, 2002. 11. Yu AS, Cheung RC, and Keefe EB : Hepatitis B vaccines. Clin Liver Dis 8: 283-300, 2004. 12. Bos ES, van der Doelen AA, van Rooy N, Schuurs AHWM : 3,3',5,5' - tetramethylbenzidine as an ames test negative chromogen for horseradish peroxidase in enzyme immunoassay. J Immunoassay 2 : 187-204, 1981. 13. Garner RC, Walpole AL, Rose FL : Testing of some benzidine analogues for microsomal activation to bacterial mutagens. Cancer Letters 1 : 39-42, 1975. 14. Bond WW, Favero MS, Petersen NJ, Ebert JW : Inactivation of hepatitis B virus by intermediateto-high-level disinfectant chemicals. J Clin Microbiol 18: 535-538, 1983.

30

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(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

-

CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)   CE (   98/79/CE   in vitro       )

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

-

For in vitro diagnostic use Pour diagnostic in vitro Para diagnóstico in vitro Per uso diagnostico in vitro In-vitro-Diagnostikum Para uso em diagnóstico in vitro In vitro-diagnostik In vitro diagnose  in vitro    

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

-

Manufacturer Fabricant Fabricante Produttore Hersteller Fabricante Tillverkad av Fremstillet af    

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

-

Batch code Code du lot Código de lote Codice del lotto Chargen-Bezeichnung Código do lote Batchnr Batchkoden  

CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия)

IVD

Do stosowania in vitro in vitro diagnostikai Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra In vitro diagnostiliseks kasutamiseks Na diagnostiku in vitro Pro diagnostiku in vitro (NO) - Til in vitro-diagnostikk (RO) - Pentru diagnostic in vitro (BG) - За ин витро диагностика

Producent Gamintojas Gyártó Tootja Výrobca Výrobce (NO) - Produsent (RO) - Producător (BG) - Производител

Numer serii Serijos numeris Gyártási szám Partii kood Číslo šarže Číslo šarže (NO) - Partikode (RO) - Număr de lot (BG) - Партиден номер

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

- Catalogue number - Référence catalogue - Número de catálogo - Numero di catalogo - Bestellnummer - Número de catálogo - Katalognummer - Katalognummer -    - Numer katalogu - Katalogo numeris - Cikkszám - Katalooginumber - Katalógové číslo - Katalogové číslo

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

-

Authorised Representative Représentant agréé Representante autorizado Distributore autorizzato Bevollmächtigter Representante Autorizado Auktoriserad representant Autoriseret repræsentant  

  

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

-

Expiry date YYYY/MM/DD Date de peremption AAAA/MM/JJ Estable hasta AAAA/MM/DD Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG Verwendbar bis JJJJ/MM/TT Data de expiração AAAA/MM/DD Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD 

   YYYY/MM/DD

(NO) - Katalognummer (RO) - Număr de catalog (BG) - Каталожен номер

Upoważniony Przedstawiciel Įgaliotasis atstovas Meghatalmazott Képviselő Volitatud esindaja Autorizovaný zástupca Zplnomocněný zástupce (NO) - Autorisert representant (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Упълномощен представител

Data ważności YYYY/MM/DD Galioja iki YYYY/MM/DD Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP Použiteľné do RRRR/MM/DD Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Срок на годност година/месец/ден

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

- Storage temperature limitation - Limites de températures de stockage - Temperatura límite - Limiti di temperatura di conservazione - Lagertemperatur - Limites de temperatura de armazenamento - Temperaturbegränsning - Temperaturbegrænsning -           - Temperatura przechowywania - Saugojimo temperatūriniai apribojimai - Tárolási hőmérsékleti határok - Piirangud säilitustemperatuurile - Skladovacia teplota od do - Teplotní rozmezí od do

(NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение

(GB) (FR) (ES) (IT) (DE) (PT) (SE) (DK) (GR) (PL) (LT) (HU) (EE) (SK) (CZ)

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