VALIDACIÓN DE LA RETENCIÓN MICROBIANA EN LOS FILTROS DE ACETATO Y NITRATO DE CELULOSA EMPLEADOS DE LA TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD

NORMA ISABEL GALEANO ROJAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. JULIO DE 2007

VALIDACIÓN DE LA RETENCIÓN MICROBIANA EN LOS FILTROS DE ACETATO Y NITRATO DE CELULOSA EMPLEADOS DE LA TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD

NORMA ISABEL GALEANO ROJAS

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al titulo de MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. JULIO DE 2007

2

NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

3

VALIDACIÓN DE LA RETENCIÓN MICROBIANA EN LOS FILTROS DE ACETATO Y NITRATO DE CELULOSA EMPLEADOS DE LA TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD

NORMA ISABEL GALEANO ROJAS

APROBADO

______________________________

____________________________

Viviana Peña Paez,

Cindy Fernández,

Microbióloga Industrial

Microbióloga Industrial

DIRECTOR

ASESOR

______________________________

____________________________

Gineth Fajardo,

Jeinny Romero,

Microbióloga Industrial

Microbióloga Industrial

JURADO

JURADO

4

VALIDACIÓN DE LA RETENCIÓN MICROBIANA EN LOS FILTROS DE ACETATO Y NITRATO DE CELULOSA EMPLEADOS DE LA TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD

NORMA ISABEL GALEANO ROJAS

APROBADO

______________________________

______________________________

Angela Umaña Muñoz. M. Phil.

David Gómez Mendez M. Sc.

DECANO ACADEMICO

DIRECTOR DE CARRERA

5

A Dios y A mis padres por su apoyo y amor incondicional.

6

AGRADECIMIENTOS

A Viviana Peña, directora del trabajo por su tiempo, colaboración, apoyo y compromiso durante la ejecución del proyecto, al igual que por su amistad. A Cindy Fernández por su compromiso, responsabilidad, y aportes realizados para la elaboración de éste trabajo de grado A la Doctora Blanca Cecilia Suárez, gerente de AQM Ltda., por el préstamo de las instalaciones y recursos necesarios para llevar a cabo este trabajo. A AQM Ltda., especialmente al área de microbiología por su colaboración y apoyo.

7

TABLA DE CONTENIDO

PÁG 1. INTRODUCCIÓN

1

2. MARCO TEORICO

2

2.1. VALIDACIÓN

2

2.1.1. Protocolo de validación

4

2.1.2. TIPOS DE VALIDACIÓN

5

2.1.2.1. Validación prospectiva

5

2.1.2.2. Validación concurrente

5

2.1.2.3. Validación retrospectiva

5

2.1.2.4. Revalidación

6

2.1.3. PARAMETROS A EVALUAR PARA LA VALIDACION DE

6

METODOLOGIAS 2.1.3.1. Precisión

6

2.1.3.2. Especificidad

7

2.1.3.3. Selectividad

7

2.1.3.4. Exactitud

7

2.1.3.5. Límite de detección

7

2.1.3.6. Límite de cuantificación

7

2.1.3.7. Linealidad

8

2.1.3.8. Robustez

8

2.1.4. CALIFICACIÓN

8

2.1.4.1. Tipos de calificación

8

2.1.4.1.1. Calificación de las instalaciones - IQ

8

2.1.4.1.2. Calificación de desempeño - PQ

9

2.1.4.1.3. Calificación operacional - OQ

9

viii

2.2. FILTROS DE MEMBRANA

10

2.2.1. Tipos de filtros de membrana

11

2.2.1.1. Filtros de profundidad

11

2.2.1.2. Filtros de superficie o de membrana

12

2.2.1.2.1. Membrana nitrato de celulosa

13

2.2.1.2.2. Membrana de acetato de celulosa

14

2.3. PRUEBA DE ESTERILIDAD

16

2.3.1. MEDIOS DE CULTIVO

16

2.3.1.1. Medio Fluido de Tioglicolato

16

2.3.1.2. Medio de Digerido Caseína-Soja

18

2.3.1.3. Líquidos de dilución y lavado para la filtración por membrana

19

2.3.2. PRUEBAS DE APTITUD

20

2.3.2.1. Esterilidad de los medios de cultivo

20

2.3.2.2. Prueba de promoción del crecimiento de organismos aerobios,

20

anaerobios y hongos 2.3.3. MÉTODOS PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD

22

2.3.3.1. Filtración por membrana

22

2.3.3.2. Inoculación directa

24

2.3.4. Interpretación de resultados

25

2.3.5. Condiciones del área estéril de trabajo

28

2.4. ESPECTROFOTOMETRÍA

31

2.4.1. Aspectos Cuantitativos de las Mediciones de Absorción: Ley de Beer-

31

Bouguer-Lambert 2.4.2. Tratamientos de los datos espectrofotométricos

32

2.4.2.1. Curvas espectrales

32

2.4.2.2. Curvas de calibrado

32

3. JUSTIFICACIÓN

33

ix

4. OBJETIVOS

35

4.1. Objetivo general

35

4.2. Objetivos específicos

35

5. MATERIALES Y MÉTODOS

36

5.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

36

5.1.1. Población de estudio y muestra

36

5.1.2. Materiales utilizados durante la validación

37

5.1.2.1. Pruebas preliminares

37

5.1.2.1.1. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo

37

5.1.2.1.2. Prueba de promoción de crecimiento

38

5.1.2.2. Técnica de filtración por membrana

38

5.1.2.2.1. Controles para el proceso

38

5.1.2.2.2. Control negativo

38

5.1.2.2.3. Filtración por membrana

39

5.2. METODOLOGÍA DE VALIDACIÓN

40

5.2.1. Recopilación de la información

40

5.2.2. Calibración y mantenimiento de los equipos

41

5.3. Pruebas preliminares

41

5.3.1. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo

42

5.3.2. Prueba de promoción de crecimiento

42

5.4. TÉCNICA DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA UTILIZADA EN LA

45

PRUEBA DE ESTERILIDAD 6. RESULTADOS

50

6.1. Calibración y mantenimiento de equipos

50

6.2. Pruebas preliminares

51

6.2.1. Prueba organoléptica

51

6.2.2. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo

52

6.2.3. Prueba de promoción de crecimiento

52

6.2.3.1. Método turbidimétrico

56

6.3. Técnica de filtración por membrana utilizada en la prueba de esterilidad

80

x

6.3.1. Controles para el proceso

80

6.3.1.1. Control ambiental y de personal

80

6.3.1.2. Control negativo de la prueba

81

6.3.2. Técnica de filtración por membrana

81

6.3.3. Líquido filtrado

84

7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

87

8. CONCLUSIONES

94

9. RECOMENDACIONES

96

10. BIBLIOGRAFÍA

97

11. ANEXOS

101

xi

LISTA DE TABLAS PÁG Tabla Nº 1. Composición del medio Fluido de Tioglicolato

17

Tabla Nº 2. Composición del medio de Digerido Caseína-Soja

18

Tabla Nº 3. Cepas de microorganismos de prueba adecuados para la

20

prueba de promoción de crecimiento Tabla Nº 4. Comparación de los sistemas abierto y cerrado para técnica de

23

filtración por membrana Tabla Nº 5. Clasificación de ambientes controlados para la industria

30

farmacéutica Tabla Nº 6. Límites microbiológicos para el área aséptica manejados por

30

AQM Ltda. Tabla Nº 7. Límites microbiológicos para el control de personal.

30

Tabla Nº 8. Programa de calibración y mantenimiento de los equipos

50

utilizados en la validación Tabla Nº 9. Análisis organoléptico de los medios de cultivo

51

Tabla Nº 10. Resultados de la Prueba de esterilidad de los medios de

52

cultivo líquidos Tabla Nº 11. Recuentos obtenidos en la Prueba de promoción de

52

crecimiento Tabla 12. Resultados obtenidos en la Prueba de promoción de crecimiento

55

para medios de cultivo líquidos en los tres ensayos realizados Tabla Nº 13. Datos de % tramitancia del crecimiento de Clostridium

56

sporogenes en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría Tabla Nº 14. Datos de % tramitancia del crecimiento de Clostridium

58

sporogenes en medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría Tabla Nº 15. Datos de % tramitancia del crecimiento de Staphylococcus aureus en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría

xii

60

Tabla Nº 16. Datos de % tramitancia del crecimiento de Staphylococcus

62

aureus en medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría Tabla Nº 17. Datos de % tramitancia del crecimiento de Pseudomonas

64

aeruginosa en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría Tabla Nº 18. Datos de % tramitancia del crecimiento de Pseudomonas

66

aeruginosa en medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría Tabla Nº 19. Datos de % tramitancia del crecimiento de Bacillus subtilis en

68

medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría Tabla Nº 20. Datos de % tramitancia del crecimiento de Bacillus subtilis en

70

medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría Tabla Nº 21. Datos de % tramitancia del crecimiento de Candida albicans

72

en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría Tabla Nº 22. Datos de % tramitancia del crecimiento de Candida albicans

74

en medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría Tabla Nº 23. Datos de % tramitancia del crecimiento de Aspergillus niger en

76

medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometría Tabla Nº 24. Datos de % tramitancia del crecimiento de Aspergillus niger en

78

medio Digerido Caseína-Soja observados mediante espectrofotometría Tabla Nº 25. Resultados del control ambiental durante la prueba de

80

esterilidad Tabla Nº 26. Resultados del control de personal durante la prueba de

80

esterilidad Tabla Nº 27. Resultados obtenidos para el control negativo de la técnica de

81

filtración de membrana durante los 5 montajes realizados. Tabla Nº 28. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana

81

durante el Montaje 1, abril 14 de 2007 Tabla Nº 29. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana durante el Montaje 2, abril 21 de 2007

xiii

82

Tabla Nº 30. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana

82

durante el Montaje 3, abril 28 de 2007 Tabla Nº 31. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana

83

durante el Montaje 4, mayo 12 de 2007 Tabla Nº 32. Resultados obtenidos en la técnica de filtración por membrana

84

durante el Montaje 5, mayo 19 de 2007 Tabla Nº 33. Resultados obtenidos después del tiempo de incubación del

84

líquido filtrado del montaje 1 Tabla Nº 34. Resultados obtenidos después del tiempo de incubación del

85

líquido filtrado del montaje 3 Tabla Nº 35. Resultados obtenidos después del tiempo de incubación del líquido filtrado del montaje 5

xiv

86

LISTA DE FIGURAS PÁG Figura Nº 1. Filtro de profundidad

12

Figura Nº 2. Filtro de superficie o de membrana

12

Figura Nº 3. Filtros de nitrato de celulosa

13

Figura Nº 4. Filtro de acetato de celulosa

15

Figura Nº 5. Medio Fluido de Tioglicolato

17

Figura Nº 6. Medio Digerido Caseína-Soja

18

Figura Nº 7. Equipo de filtración

23

Figura Nº 8. Interpretación del ensayo de esterilidad.

27

Figura Nº 9. Validación de procedimientos.

40

Figura Nº 10. Pruebas preliminares

41

Figura Nº 11. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo

42

Figura Nº 12. Diagrama de las diluciones empleadas en la prueba de

43

promoción de crecimiento. Figura Nº 13. Prueba de promoción de crecimiento.

45

Figura Nº 14. Controles para el proceso en la técnica de filtración por

48

membrana. Figura Nº 15. Control negativo de la técnica de filtración por membrana.

48

Figura Nº 16. Técnica de Filtración por membrana.

49

Figura Nº 17. Bacillus subtilis en agar Casoy

53

Figura Nº 18. Clostridium sporogenes en agar Casoy

53

Figura Nº 19. Staphylococcus aureus en agar Casoy

54

Figura Nº 20. Pseudomas aeruginosa en agar Casoy

54

Figura Nº 21. Candida albicans en agar HC

54

Figura Nº 22. Aspergillus niger en agar HC

55

Figura Nº 23. Curva de crecimiento de Clostridium sporogenes en medio

57

Fluido de Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de crecimiento Figura Nº 24. Curva de crecimiento de Clostridium sporogenes en medio Digerido Caseína-Soja, observada en la prueba de promoción de crecimiento

xv

59

Figura Nº 25. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus en medio

61

Fluido de Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de crecimiento Figura Nº 26. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus en medio

63

Digerido Caseína-Soja, observada en la prueba de promoción de crecimiento Figura Nº 27. Curva de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en medio

65

Fluido de Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de crecimiento Figura. Nº 28. Curva de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en medio

67

Digerido Caseína-Soja, observada en la prueba de promoción de crecimiento Figura Nº 29. Curva de crecimiento de Bacillus subtilis en medio Fluido de

69

Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de crecimiento Figura Nº 30. Curva de crecimiento de Bacillus subtilis en medio Digerido

71

Caseína-Soja, observada en la prueba de promoción de crecimiento Figura Nº 31. Curva de crecimiento de Candida albicans en medio Fluido de

73

Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de crecimiento Figura Nº 32. Curva de crecimiento de Candida albicans en medio Digerido

75

Caseína-Soja, observada en la prueba de promoción de crecimiento Figura Nº 33. Curva de crecimiento de Aspergillus niger en medio Fluido de

77

Tioglicolato, observada en la prueba de promoción de crecimiento Figura Nº 34. Curva de crecimiento de Aspergillus niger en medio Digerido Caseína-Soja, observada en la prueba de promoción de crecimiento

xvi

79

RESUMEN

La validación de la retención microbiana en los filtros de acetato y nitrato de celulosa en la técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad tuvo como propósito la eficacia de los filtros de membrana para optimizar esta técnica en el laboratorio de Análisis Químico y Microbiológico AQM Ltda., siguiendo los parámetros establecidos por la USP 29 y basándose en la necesidad de realizar un montaje que garantice resultados confiables y la disminución de los riesgos de repetición que aumentan el tiempo de análisis y los costos. Al inicio de la validación se verificó la calibración y mantenimiento de los equipos para así garantizar los procedimientos realizados y los resultados obtenidos. Luego se realizaron las pruebas preliminares en las cuales se evaluó la calidad de los medios de cultivo Fluido de tioglicolato, Digerido caseína-soja, agar Casoy y agar HC. Se verificó en los medios de cultivo líquidos que contienen los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos mediante la prueba de promoción de crecimiento inoculados con cepas ATCC de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Candida albicans, Bacillus subtilis

y

Aspergillus

espectrofotometría

niger;

estos

resultados

determinando

para

cada

se

complementarón

microorganismo

su

curva

por de

crecimiento en un tiempo de 100 horas. Después de obtener resultados satisfactorios en las pruebas preliminares que indican la ausencia de resultados falsos negativos o positivos, se realizó la metodología de filtración por membrana en la cual se determinó la retención de los microorganismos contaminantes en los filtros de acetato y nitrato de celulosa con un tamaño de poro de 0,45 µm. Con los resultados obtenidos se ajustó el procedimiento de la prueba de esterilidad mediante la técnica de filtración por membrana para el laboratorio AQM Ltda., como fundamento para obtener resultados confiables, oportunos y con calidad que logren la satisfacción del cliente.

xvii

ABSTRACT

The validation of the microbial retention in the cellulose acetate filters and cellulose nitrate filters in the filtration technique used in sterility testing had the purpose to verified the effectiveness of membrane filters to optimize this technique in the laboratory Análisis Químico y Microbiológico AQM Ltda., following the established parameters by the USP 29 and based on the necessity to do a test with guarantee of reliable results, and the diminution of repetition risk which increases the analysis time and the cost. At the beginning of the validation the machine calibration and maintenance was verified to guarantee the process and results. Later the preliminaries tests was done to evaluate the quality of media, Fluid Thioglycolate medium, Soybean-casein digest medium, Casoy agar and HC agar. For the liquid media it was observed they had the necessary nutrients for the growth of microorganism by the growth promotion test inoculating microorganisms ATCC of Staphylococcus

aureus,

Pseudomonas

Candida albicans, Bacillus subtilis

aeruginosa,

Clostridium

sporogenes,

y Aspergillus niger. Furthermore this test

complemented by spectrofotometric method determining for each microorganism its growth curve in a time of 100 hours. After obtaining satisfactory results in the preliminary test that indicated the lack of false negative or false positive results, the membrane filtration methodology was done which determined the satisfactory retention of microorganism in cellulose nitrate filters and cellulose acetate filters with a pore size of 0,45 µm. With the results was fitted the process of sterility testing by membrane for the laboratory AQM Ltda., like fundament to obtain reliable results with quality to obtain the client satisfaction.

xviii

1. INTRODUCCIÓN

El control de calidad de productos farmacéuticos garantiza la seguridad y eficacia de cada uno, certificando que estos cumplen con los parámetros y normas reguladas por organizaciones nacionales e internacionales. Estas especificaciones constituyen un elemento importante para asegurar la calidad de los productos y sirven de base para el análisis de éstos en el laboratorio. Este control de calidad se debe realizar desde el inicio, durante y al final de la elaboración del producto para asegurar que el proceso se ha realizado bajo estrictas normas y controles. Al final del proceso de producción se deben realizar pruebas microbiológicas de acuerdo a la naturaleza y finalidad del producto, dentro de estas se encuentra la prueba de esterilidad, la cual demuestra la calidad de un producto referido a la ausencia de contaminantes microbianos, permitiendo su uso para humanos y animales sin ningún riesgo de infección. Dada la necesidad de optimizar la técnica para desarrollar la prueba de esterilidad, obtener resultados confiables, realizar un buen montaje que garantice los resultados, la disminución de los riesgos de repetición que aumentan el tiempo de análisis y la reducción de costos, este proyecto que tiene como finalidad validar la retención microbiana en los filtros de acetato y nitrato de celulosa empleados en la técnica de filtración por membrana para la prueba de esterilidad, y así asegurar que la efectividad de la filtración como principal proceso de esta técnica en el laboratorio de Análisis Químico y Microbiológico AQM Ltda., logre obtener resultados confiables, oportunos y con calidad para la satisfacción del cliente.

1

2. MARCO TEORICO 2.1. VALIDACIÓN Validación es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia documentada que un proceso específico producirá de forma consistente y permanente productos que reunirán las características de calidad predefinidas. (CORTES, A. et al. 2003) Mediante el proceso de validación se demuestra que el método es lo suficientemente fiable para producir el resultado; proporcionando confianza y seguridad del proceso productivo o del método analítico, así como también en la calidad de los resultados. (GARCIA, et al. 2005) La validación de un método analítico es el proceso que establece, mediante estudios de laboratorio, que las características de desempeño del método cumplen los requisitos para las aplicaciones analíticas previstas (USP 29, 2006); teniendo como objetivo confirmar y documentar que los resultados producidos son confiables. (CORTES, A. et al. 2003) El principal objetivo de una validación analítica es asegurar que el procedimiento analítico seleccionado va a dar resultados reproducibles y confiables que son adecuados para el propósito deseado. De esta manera es necesario definir apropiadamente las condiciones en las cuales va a ser realizado el procedimiento y su objetivo. Estos objetivos aplican a todos los procedimientos descritos o no en una Farmacopea los cuales son usados en una compañía manufacturera. (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1997) Igualmente establece las características de desempeño y las limitaciones de un método, la identificación de variables que influyen y pueden cambiar estas características determinado hasta que punto pueden ser cambiadas. (FDA, 2005) Para llevar a cabo una validación se debe tener clara la metodología analítica, la cual va de lo general a lo particular, se inicia con la valoración de la técnica, que es el principio científico que puede ser útil para suministrar información sobre la composición de una muestra; seguida del método que es la adaptación de la técnica

2

para un propósito específico, que para ser utilizado correctamente debe ir descrito en un procedimiento y finalmente a partir de la información recopilada se obtiene el protocolo en donde se suministran una serie de direcciones precisas y definitivas que deben seguirse si se quiere que los resultados analíticos se acepten, este es la evidencia objetiva de la validación. (BARRAGÁN y GARCÍA, 2001) Dentro de un proceso de validación se deben validar: -

Método analítico en el cual se evalúan y analizan parámetros como sensibilidad, exactitud, linealidad, selectividad, etc.

-

Sistema analítico incluye instrumentos, ordenador y método, con este se concluye que el conjunto funciona como se espera.

-

Análisis de la muestra donde se evidencia por medio de la documentación la comprobación de los datos primarios. (USP 29, 2006)

La importancia de la validación radica en la obtención de métodos estándar los cuales son parte integral del sistema de calidad de un laboratorio. Los métodos estándar son usados siempre que sea posible a menos que se especifique su no uso. (FDA, 2005) Además tiene ventajas como la optimización y estandarización de los procesos, el incremento de la productividad, la reducción de costos, la reducción de la probabilidad de fallas en el proceso y así la reducción de repeticiones y rechazos.

Para realizar validaciones en microbiología es importante: -

Conocer los métodos compatibles con los requerimientos, la compatibilidad de

los

métodos

es

revisada

y

confirmada

por comparación

con

requerimientos típicos para realizar la prueba. -

Incluir un medio control sin inocular para evaluar la contaminación a partir del laboratorio y no de la prueba. Este control es considerado un blanco y no muestra crecimiento.

3

-

Preparar y analizar visualmente controles positivos y negativos. Un control negativo no presenta crecimiento y el control positivo muestra crecimiento microbiano.

-

Evaluar interferencias. Esto asegura la selectividad y la especificidad del método.

-

Realizar documentación de la validación. (FDA, 2005)

De esta forma después de la validación se demuestra que el laboratorio es capaz de repetir con un nivel aceptable de ejecución el método estándar. Esto en condiciones específicas establecidas por el método, además de la demostración de exactitud y precisión o de otros parámetros dependiendo el tipo de método. (FDA, 2003) 2.1.1. Protocolo de validación Los protocolos de validación incluyen la definición clara del sistema a validar, la identificación de las variables operativas y los probables parámetros de control. En ellos se describe el proceso a validar, los objetivos de la validación, los métodos y el personal responsable de la validación, además de indicar el número de réplicas que se consideran adecuadas para la evaluación de un determinado parámetro para que los resultados sean estadísticamente confiables. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002) Dentro de un protocolo de validación también se encuentra el procedimiento operativo estándar (POE) del sistema validado, donde se describe el procedimiento de cómo deben realizarse determinados métodos analíticos, cómo deben manejarse los instrumentos o realizarse otras actividades de laboratorio cuyo seguimiento puntual es de obligatorio cumplimiento. (MEDINA y QUINTANA, 2002) Los laboratorios documentan sus protocolos, las características y medidas de ejecución y los límites aceptables para la validación de sus métodos. La magnitud de la validación depende de las limitaciones que se imponen como lo son el tiempo, el costo, la cantidad de muestras o estándares, el uso posterior del método o el tipo de información (cuantitativa, cualitativa).

4

De esta forma la buena documentación es una parte esencial del sistema de garantía de calidad y por lo tanto es importante en un proceso de validación. 2.1.2. TIPOS DE VALIDACIÓN 2.1.2.1. Validación prospectiva Se basa en la información obtenida antes de implantar el proceso de validación. Utiliza información generada durante todas las etapas de desarrollo del proceso y se puede definir como el establecimiento de un programa documentado, que proporciona un alto grado de seguridad que un proceso específico producirá consistentemente

una

forma

farmacéutica

que

lleva

las

especificaciones

predeterminadas y los atributos de calidad y que se basa en el análisis de los datos obtenidos a través del diseño y desarrollo de un protocolo de validación. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002) 2.1.2.2. Validación concurrente La información se obtiene durante la implementación del proceso, se debe tener en cuenta el monitoreo en proceso de las variables críticas que demuestre que el proceso está bajo control y el registro de datos sobre la marcha del proceso en estado productivo. (CORTES, A. et al. 2003) Se puede definir como el establecimiento de un programa documentado, que proporciona un alto grado de seguridad de que un proceso específico producirá consistentemente

una

forma

farmacéutica

que

lleva

las

especificaciones

predeterminadas y atributos de calidad y que se sustentan en datos o información obtenidos a partir de un proceso que se encuentra en marcha o en el cual se haya introducido alguna variación. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002) 2.1.2.3. Validación retrospectiva Es aquella donde se trabaja con los antecedentes históricos, obtenidos a partir de registros del proceso y control de calidad. Con esta recopilación de datos históricos

5

se obtiene documentación útil para la determinación de la reproducibilidad de dicho proceso. Por esto, para la obtención de información no es necesario aplicar ensayos analíticos o supervisión del proceso en forma explícita. (GONZALES, 2005) Se puede definir como el establecimiento de un programa documentado, que proporciona un alto grado de seguridad de que un proceso específico producirá consistentemente

una

forma

farmacéutica

que

lleva

las

especificaciones

predeterminadas, atributos de calidad y que se sustenta en el análisis de datos de lotes que han sido elaborados con anterioridad. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002) 2.1.2.4. Revalidación Este tipo de estudio se utiliza cuando se ha introducido alguna variable en algún procedimiento o metodología ya validado anteriormente, por lo que se alteran las características finales. (GONZALES, 2005)

2.1.3. PARAMETROS A EVALUAR PARA LA VALIDACION DE METODOLOGIAS No todas las características analíticas son aplicables a todos los procedimientos o a todos los materiales; depende del objetivo requerido. 2.1.3.1. Precisión Es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el método repetidamente a muestras separadas e idénticas, obtenidas del mismo lote de material homogéneo. (USP 29, 2006) El parámetro estadístico que caracteriza a este estudio es la desviación estándar o preferiblemente el coeficiente de variación (desviación estándar relativa). Este parámetro permite evaluar la incertidumbre en la estimación de la media, es decir, el error aleatorio que corresponde con la dispersión de los datos alrededor de la media. (CASTILLO Y GONZÁLES, 1996) Puede ser una medida del grado de reproducibilidad o de repetibilidad del método analítico en condiciones normales de operación. (USP 29, 2006)

6

Reproducibilidad es la medida de la precisión de los resultados de ensayos realizados sobre la misma muestra homogénea, pero ejecutados por diferentes analistas, en días diferentes y con diferentes instrumentos. Repetibilidad: refleja la precisión de un método, cuando se desarrolla bajo las mismas condiciones, utilizando la misma muestra, analizada por el mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos equipos y reactivos y durante una misma sesión de trabajo en un período corto. (CASTILLO Y GONZÁLES, 1996) 2.1.3.2. Especificidad Es la capacidad de evaluar de manera inequívoca el compuesto de interés en presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta previsible, como impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz. (USP 29, 2006) 2.1.3.3. Selectividad Un método selectivo aporta resultados para todos los analitos de interés, mientras que uno específico produce resultados exactos para un analito, al tiempo que los otros analitos de interés se pueden interferir los unos con los otros. (CORTES, A. et al. 2003) 2.1.3.4. Exactitud Indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo más próximos posibles al valor verdadero. A diferencia de la precisión, que refleja el error aleatorio, la exactitud refleja el error sistemático o la tendencia a él. (CASTILLO Y GONZÁLES, 1996) 2.1.3.5. Límite de detección Es la cantidad mínima de analito en una muestra que puede detectarse, aunque no necesariamente detectarse, en las condiciones experimentales indicadas. 2.1.3.6. Límite de cuantificación Es una característica de las valoraciones cuantitativas de compuestos que se encuentran en baja concentración en la matriz de una muestra. Es la mínima

7

cantidad de analito en una muestra que se puede determinar con precisión y exactitud aceptables en las condiciones experimentales indicadas. (USP 29, 2006) 2.1.3.7. Linealidad Es la capacidad del método analítico para obtener resultados directamente proporcionales a la concentración o cantidad del analito en un intervalo definido. Se determina mediante el tratamiento matemático de los resultados obtenidos en el análisis del analito a diferentes cantidades o concentraciones. (CASTILLO Y GONZÁLES, 1996) 2.1.3.8. Robustez Es la medida de la capacidad del método para no resultar afectado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y proporciona una indicación de su confiabilidad durante su uso normal. (USP 29, 2006)

2.1.4. CALIFICACIÓN Consiste en la realización de pruebas que determine si un componente de un proceso de fabricación posee los atributos requeridos para obtener un producto con una calidad determinada. (JAIME, 2002) 2.1.4.1. Tipos de calificación 2.1.4.1.1. Calificación de las instalaciones - IQ Verificación documentada de que todos los aspectos claves de la instalación están de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y corresponden a las especificaciones aprobadas en el diseño. (CORTES, A. et al. 2003) Se incluyen todos los equipos, instrumentos y aparatos que son utilizados en proceso productivo y en los métodos de análisis. Además es necesario considerar que éstos se encuentran localizados en instalaciones físicas que deben ser evaluadas. Otros aspectos

son la calibración de equipos y el mantenimiento

preventivo de los equipos.

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Calibración de equipos: La calibración es la comparación de un estándar de medida o instrumento de exactitud conocida con otro estándar o instrumento, sirve para detectar, correlacionar y/o reportar por ajuste cualquier variación en la exactitud del instrumento que está siendo comparado. (JAIME, 2002) 2.1.4.1.2. Calificación de desempeño - PQ Demostrar la efectividad y reproducibilidad del proceso, bajo condiciones normales de operación y bajo condiciones límite de operación. (JAIME, 2002) 2.1.4.1.3. Calificación operacional - OQ Verificación de que los equipos funcionan en la forma esperada y son capaces de operar satisfactoriamente los parámetros operacionales para los que han sido diseñados. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)

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2.2. FILTROS DE MEMBRANA Los filtros de membrana son un avance consecuente de los desarrollados por el premio Nóbel Richard Zsigmondy en 1925. La primera producción comercial en el mundo se llevó a cabo en Göttingen en 1927, el uso de los filtros de membrana se conoce desde los años cuarenta, cuando fueron utilizados para el control de agua potable. (AVENDANO y MOYANO, 1997) Existen distintos tipos de filtros: de asbesto-celulosa, de vidrio, de cerámica y de ésteres de celulosa. Las membranas están compuestas por ésteres de celulosa biológicamente inertes. Los poros varían desde 0.025 µm a 25 µm de diámetro, siendo los de 0.22 µm los más utilizados ya que son lo suficientemente pequeños para retener a todas las bacterias. Dado que las membranas son inertes, proporcionan un buen medio para retener microorganismos, por ejemplo para cultivar bacterias que se encuentran en bajas concentraciones en un gran volumen de líquido. El mecanismo de acción es bastante simple: retienen todas las partículas que posean un tamaño mayor que los poros. Estos poros quedan formados por los espacios que resultan de la superposición de las fibras de las distintas capas que forman la membrana. Así, algunas partículas de menor tamaño son retenidas por otros mecanismos como las fuerzas de Van der Waals o por la suma de partículas retenidas previamente. (PEARCE, 2007) Los filtros de membrana son utilizados para el control microbiológico de diversos productos, por ello requieren un control de calidad que se obtiene con una excelente uniformidad de un lote a otro manteniendo una técnica de producción cuidadosamente elaborada y por controles rígidos como: a) El examen de la materia prima con cromatógrafo de gas. b) Control durante el proceso de producción. c) Control de calidad: -

Comportamiento de autoclavado.

-

Punto de burbuja.

d) Control óptico de los rollos de membrana.

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e) Control microbiológico (Prueba de desafío). (AVENDANO y MOYANO, 1997) Para realizar la prueba de esterilidad es necesario usar filtros de membrana con un tamaño nominal de poro no mayor de 0,45 µm y un diámetro de aproximadamente 50mm. Se utilizan filtros de nitrato de celulosa para soluciones acuosas, oleosas y con bajo contenido alcohólico y filtros de acetato de celulosa para soluciones con alto contenido alcohólico. (USP 29, 2006) Los filtros de membrana con este tamaño de poro han sido reconocidos como un estándar para el crecimiento de microorganismos. Este tamaño de poro es usado para recuperar bacterias y otros microorganismos de muchas muestras y ambientes. (MILLPORE, 2000) 2.2.1. Tipos de filtros de membrana Hay varios tipos de filtros, entre ellos los que más se usan son los filtros de profundidad y los filtros de superficie o filtros de membrana. 2.2.1.1. Filtros de profundidad Estos filtros están elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de vidrio) dispuesto al azar, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean vías tortuosas donde pueden quedar retenidos la mayoría de los contaminantes presentes. Entre sus ventajas se encuentran su alta capacidad de retención de partículas sobre su superficie y a través de toda su estructura y que permiten filtrar grandes volúmenes. Sin embargo, tienen como desventajas que no presentan un tamaño de poro uniforme y existe la posibilidad de liberación, hacia el material filtrado, de partículas y microorganismos que hayan crecido dentro del filtro. Dadas sus características los filtros de profundidad se usan principalmente como prefiltros, ya que permiten eliminar las partículas grandes pero no la eliminación total de los microorganismos. http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf

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Figura Nº 1. Filtro de profundidad.

2.2.1.2. Filtros de superficie o de membrana Son filtros elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de celulosa y contienen poros de tamaño uniforme. Este tipo de filtro tiene como ventaja que al conocer exactamente el tamaño de poro que presentan, se pueden seleccionar filtros capaces de retener la totalidad de los microorganismos presentes en una solución. Sin embargo, se saturan rápidamente y la velocidad de filtración a través de ellos es lenta. Para la filtración esterilizante se pueden usar combinaciones de un filtro de profundidad con un filtro de superficie que tenga un tamaño de poro de 0.22µm. La mayor parte de los filtros de membrana se pueden esterilizar en autoclave y luego se manipulan asépticamente al ensamblar el equipo. http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf

Figura Nº 2. Filtro de superficie o de membrana

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2.2.1.1. Membrana de nitrato de celulosa La nitrocelulosa es un material utilizado de manera habitual para la fabricación de filtros de membrana. Estas membranas son de naturaleza hidrofílica, con una microestructura muy uniforme lo que permite excelentes niveles de retención de partículas y un comportamiento perfecto en pruebas microbiológicas. En esos casos pueden ser de utilidad membranas cuadriculadas con el fondo de color verde o negro, así mediante contraste, mejorar la visualización y el conteo de colonias. Otra característica importante de estas membranas es su elevada adsorción. Por ello, y en combinación con papeles de cromatografía FILTERLAB serie PC están especialmente indicados en procedimientos de identificación de los componentes en muestras de ácidos nucleicos y proteínas mediante técnicas de transferencia. http://www.fanoia.com/filterlab/micro-8-15.pdf Tienen una estructura de poro muy uniforme, lo que asegura una excelente retención y un óptimo crecimiento microbiológico en muestras de agua, bebidas, fármacos. (PEARCE, 2007)

Figura Nº 3. Filtros de nitrato de celulosa Fuente: www.whatman.com

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Aplicaciones de los filtros de nitrato de celulosa Filtración de aguas. Análisis microbiológico. Análisis gravimétricos. Análisis cualitativos de partículas. Esterilización de muestras. Determinación de proteínas. Identificación de ácidos nucleicos. Prefiltración de muestras. Clarificación de muestras.

2.2.1.2. Membrana de acetato de celulosa Los filtros de membrana de celulosa son de naturaleza hidrofílica. Presentan una excelente estabilidad térmica y una bajo nivel de adsorción, por lo que son especialmente indicados para la esterilización de soluciones biológicas., además estas membranas permiten gran capacidad de carga y altas velocidades de flujo, por lo que resultan apropiados para la esterilización y clarificación de soluciones acuosas, alcohólicas y aceites. Es un material muy fiable como filtro membrana por su excelente estabilidad química frente a soluciones acuosas con pH entre 4 y 8, la mayoría de los alcoholes, hidrocarburos y aceites. El tamaño de poro en la superficie de la mayoría de las membranas es altamente uniforme, existen de 0.20, 0.45, 0.65 y 0.80µm, en color blanco, con superficie lisa y no estéril. http://www.fanoia.com/filterlab/micro-8-15.pdf Las partículas más grandes que el tamaño del poro son rechazadas por la superficie de la membrana y el remanente permanece o se concentra allí. El volumen del fluido y otras partículas finas de menor tamaño del poro pueden pasar a través de la membrana al sitio de filtrado. (PEARCE, 2007)

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Figura Nº 4. Filtro de acetato de celulosa Fuente: Levy R. y Jornitz M., 2006.

Aplicaciones Filtración de muestras de aguas. Esterilización de muestras de proteínas. Esterilización de fluidos biológicos. Filtración de alcoholes. Filtración de aceites.

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2.3. PRUEBA DE ESTERILIDAD Se puede definir esterilidad como la total ausencia de toda vida viable. A partir de 1940 la definición de esterilidad aplicada a las industrias farmacéuticas fue “incapacidad de un producto de generar turbidez al ser adicionado a un medio de crecimiento estéril.” (ALLISON, 1999) La prueba de esterilidad es básicamente una prueba en la cual se evalúa si un producto médico o farmacéutico esterilizado está libre de microorganismos contaminantes, mediante la incubación de todo o parte del producto con un medio nutritivo. (HUGO y RUSSEL 1998) En esencia, se añade una muestra del material a analizar a un medio de cultivo, se incuba y se comprueba la existencia de signos de crecimiento. Si existe crecimiento, se supondrá que la contaminación procede de la muestra que, por tanto, no pasará la prueba. (HUGO y RUSSEL, 1998) El fundamento de la prueba de esterilidad consiste en establecer un procedimiento para valorar la ausencia/presencia de microorganismos aerobios y anaerobios viables (bacterias, hongos y levaduras) (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002); en sustancias, preparaciones y objetos que según la farmacopea deben ser estériles. Las Farmacopeas y las autoridades reguladoras exigen que el nivel de garantía de esterilidad para los productos esterilizados acabados sea de 10-6 o superior. Esto significa que la probabilidad de que un producto seleccionado al azar a partir de un lote no sea estéril debe ser inferior a 1 en 1 millón. (HUGO y RUSSEL 1998) 2.3.1. MEDIOS DE CULTIVO Según la USP 29, 2006 los siguientes medios de cultivo son adecuados para la prueba de esterilidad. 2.3.1.1. Medio Fluido de Tioglicolato Se utiliza principalmente para el cultivo de bacterias anaerobias. Sin embargo también detecta bacterias aerobias.

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Tabla Nº 1. Composición del medio Fluido de Tioglicolato L-cisteina

0.5 g

Cloruro de sodio

2.5 g

Dextrosa

5.5 g

Extracto de levadura (soluble en agua)

5.0 g

Digerido pancreático de Caseína

15.0 g

Tioglicolato de sodio o Ácido tioglicólico

0.3 mL

Rezarsurina sódica

1.0 mL

Agua purificada

1000 mL

Fuente: USP 29, 2006 Después de la esterilización, el pH del medio debe ser de 7,1 +/- 0,2. El Medio Fluido de Tioglicolato debe incubarse a 32,5 +/- 2,5 º.

Figura Nº 5. Medio Fluido Tioglicolato. Fuente: ZIMBRO M. y POWER D., 2003. Las sustancias reductoras, tioglicolato y cisteina, los cuales proporcionan una anaerobiosis suficiente, incluso para anaerobios exigentes. La elevada viscosidad del medio de cultivo tioglicolato impide la penetración rápida de oxígeno. El eventual aumento del contenido en oxígeno se pone de manifiesto por un viraje a rojo del indicador redox Resarzurina sódica. (MERCK, 1998) La dextrosa, peptona, L-cisteina, y el extracto de levadura proveen los factores de crecimiento necesarios para la replicación de los microorganismos. El cloruro de sodio da iones esenciales. El tioglicolato de sodio es un agente reductor que previene la acumulación de peróxidos que son letales para los microorganismos.

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Después de incubación, el crecimiento es evidente por la presencia de turbidez comparada al control sin inocular. Los aerobios estrictos tienden a crecer en la superficie del medio, los anaerobios obligados pueden crecer solamente en la porción del medio por debajo de la parte oxidada. (ZIMBRO y POWER, 2003)

2.3.1.2. Medio de Digerido Caseína-Soja Este medio es adecuado para el cultivo tanto de hongos como de bacterias aerobias. Es un medio de cultivo versátil y altamente nutritivo que se recomienda para el crecimiento de hongos y levaduras. Tabla Nº 2. Composición del medio de Digerido Caseína-Soja Digerido Pancreático de Caseína

17.0 g

Digerido Papaínico de Harina de Soja

3.0 g

Dextrosa

2.5 g

Cloruro de sodio

5.0 g

Fosfato Dibásico de Potasio

2.5 g

Agua purificada

1000 mL

Fuente: USP 29, 2006 Después de la esterilización, el pH debe ser de 7,3 +/- 0,2. El Medio de Digerido Caseína-Soja debe incubarse a 22,5 +/- 2,5 º.

Figura Nº 6. Medio Digerido Caseína-Soja Fuente: ZIMBRO M. y POWER D., 2003.

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El digerido pancreático de caseína y el digerido papaínico de harina de soja proveen aminoácidos y otras sustancias nitrogenadas. La dextrosa es una fuente de energía. El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico, y el fosfato dibásico de potasio actúa como buffer para controlar el pH. (ZIMBRO y POWER, 2003)

2.3.1.3. Líquidos de dilución y lavado para filtración por membrana Estas soluciones son empleadas para disolver y acondicionar la muestra a evaluar e inhibir sustancias bacteriostáticas y fungistáticas que puedan contener la muestra. (USP 29, 2006) Los líquidos contienen digerido péptico de tejido animal, que provee una fuente de nitrógeno para los microorganismos. (ZIMBRO y POWER, 2003) Liquido A Contiene digerido péptico de tejido animal en una concentración de 1g/L y un pH de 7,1 +/- 0,2. Se utiliza para sustancias líquidas miscibles en agua. (USP 29, 2006) Es un diluyente general o solución de lavado utilizado para evaluar antibióticos y sustancias que contienen preservativos. (MILLPORE, 2005) Líquido D Contiene digerido péptico de tejido animal y tween 80 en una concentración de 1ml/L y un pH de 7,1 +/- 0,2 se usa este líquido para artículos que contengan lecitina o aceite. (USP 29, 2006) Los líquidos A y D ayudan en el completo enjuague de los filtros de membrana y no son tóxicos para los microorganismos. Además el tween 80 actúa como un surfactante para romper la lecitina o aceites presentes. (ZIMBRO y POWER, 2003) Líquido K Contiene digerido péptico de tejido animal, extracto de carne bovina y tween 80, con un pH de 6,9 +/- 0,2. (USP 29, 2006) Es generalmente utilizado como solución de lavado cuando se evalúan sustancias que contienen petrolato. (MILLPORE, 2005)

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2.3.2. PRUEBAS DE APTITUD 2.3.2.1. Esterilidad de los medios de cultivo Se confirma la esterilidad del medio para cada partida de esterilización, incubando una porción del medio a la temperatura de incubación especifica, durante 14 días. No se debe producir crecimiento de ningún organismo. (USP 29, 2006). Estos medios sirven como controles negativos durante la realización de la prueba de esterilidad.

2.3.2.2. Prueba de promoción del crecimiento de organismos aerobios, anaerobios y hongos Se evalúa cada lote de medio preparado o cada lote de medio deshidratado, para garantizar que el medio de cultivo contiene los nutrientes necesarios para promover el crecimiento de microorganismos presentes en el producto y para demostrar que este medio puede sostener el crecimiento de los contaminantes habituales para los que está diseñado. (HUGO y RUSSEL, 1998) Para realizar esta prueba se debe inocular cada medio con un número pequeño (no más de 100 UFC) de los microorganismos viables (ver tabla Nº 6) e incubarlos durante no más de 3 días en el caso de bacterias y durante no más de 5 días en el caso de hongos. Los medios son adecuados (prueba satisfactoria) si se produce un crecimiento claramente visible de los microorganismos. (USP 29, 2006) Tabla Nº 3. Cepas de microorganismos de prueba adecuados para la prueba de promoción de crecimiento. Fuente: USP 29, 2006 Medio de cultivo

Microorganismo

Cepa

Staphylococcus aureus

ATCC 6538

Fluido de

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 9027

Tioglicolato

Clostridium sporogenes

ATCC19404

Candida albicans

ATCC 10231

Digerido de

Bacillus subtilis

ATCC 6633

Caseína-Soja

Aspergillus niger

ATCC 16404

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Temperatura 32,5 +/- 2,5º C

22,5 +/- 2,5º C

Para realizar la prueba de promoción de crecimiento se puede emplear el patrón de McFarland, este patrón es utilizado como estándar de turbidez en la preparación de suspensiones de microorganismos. Los estándares de turbidez son preparados por la mezcla de químicos que precipitan para formar una solución de turbidez reproducible. Son realizados adicionando ácido sulfúrico a una solución acuosa de cloruro de bario, del cual resulta la formación de un precipitado de sulfato de bario. (ZIMBRO y POWER, 2003) Esta escala de turbidez es elaborada con una mezcla de BaCl2 de 0.048 M y H2SO4 0.6M, la turbidez la da el cloruro de bario, el cual va en cantidad creciente mientras el ácido sulfúrico va disminuyendo la proporción. Cada uno de los tubos del patrón de acuerdo con la turbidez, representa un número de bacterias, para suspensiones de igual turbidez, que ha sido determinado por recuento de colonias. De esta forma al comparar una emulsión de bacterias con el tubo del patrón de McFarland que más se asemeje se puede saber aproximadamente el número de bacterias en la emulsión. (ESCOBAR, 2002) Igualmente es importante tener en cuenta la recuperación microbiana, ya que esto va a determinar la cantidad de microorganismos que van a crecer durante la prueba de promoción de crecimiento y si es o no satisfactoria esta prueba. Las pruebas microbianas no utilizan células individuales, se recolectan poblaciones de células para su estudio. Los datos generados en estos estudios son menos variables si las poblaciones de células son homogéneas. Los cultivos líquidos o los cultivos confluentes en medios sólidos son más adecuados para la preparación de cultivos reproducibles. Las condiciones de recuperación microbiana están dentro de las más cruciales para calcular con exactitud el número de microorganismos presentes en la solución de prueba. Se debe considerar el medio de recuperación que permita el crecimiento, las condiciones de incubación, las condiciones óptimas de crecimiento para así asegurar el crecimiento completo y resultados reproducibles. (USP 29, 2006) La prueba de esterilidad es no válida si las pruebas de aptitud no son satisfactorias.

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2.3.3. MÉTODOS PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD 2.3.3.1. Filtración por membrana Esta técnica es recomendada por la mayoría de las Farmacopeas y envuelve la filtración de fluidos a través de un filtro de membrana estéril, cualquier microorganismo presente es retenido en la superficie del filtro. También se pueden analizar sólidos solubles en agua, los cuales pueden ser disueltos en un diluyente apropiado y procesados por medio de esta técnica. (HUGO y RUSSEL, 1998) La técnica de filtración por membrana se basa en hacer pasar la muestra a través de una membrana porosa delgada, elaborada con plástico de celulosa inerte, los poros son de tamaño uniforme lo suficientemente pequeños para retener los microorganismos. (AVENDANO y MOYANO, 1997) Esta técnica involucra la filtración a través de una membrana la cual se coloca en el equipo de filtración, donde los microorganismos son atrapados en la superficie del filtro. Después de lavar el filtro de membrana con el fin de eliminar los residuos de las sustancias antimicrobianas del producto que puedan inhibir el crecimiento de los posibles contaminantes, la membrana se transfiere a los correspondientes medios de cultivo los cuales son incubados a 32,5 +/- 2,5ºC para bacterias en el medio Fluido de Tioglicolato y para hongos en el medio Digerido Caseína-Soja a 22,5 +/2,5ºC, durante el tiempo apropiado. (HUGO y RUSSEL 1998) Se debe transferir la membrana completa al medio de cultivo o cortarla asépticamente en dos partes iguales y transferir una mitad a cada uno de los medios de cultivo e incubar los medios durante no menos de 14 días. Cuando se obtengan evidencias de contaminación microbiana en algún artículo el resultado es concluyente para determinar que el artículo no cumple con los requisitos de la prueba de esterilidad. (USP 29, 2006) La membrana debe sostenerse firmemente en una unidad de la filtración que consiste en una base de apoyo para la membrana, un vaso para el fluido que va a ser evaluado, un depósito colectivo para el fluido filtrado, y los tubos necesarios o conexiones. El aparato se diseña de forma que la solución a ser filtrada se puede

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introducir y filtrarse bajo las condiciones asépticas. Además permite retirar asépticamente la membrana para transferirla al medio de cultivo o es adecuado para llevar a cabo la incubación dentro del aparato mismo después de agregar el medio. (AUSTRALIAN GOVERNMENT, 2006)

Figura Nº 7. Equipo de filtración por membrana. Fuente: http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf

Existen dos tipos de sistemas de filtración por membrana: el sistema abierto y el sistema cerrado. Tabla Nº 4. Comparación de los sistemas abierto y cerrado para la técnica de filtración por membrana. SISTEMA ABIERTO

SISTEMA CERRADO

Preparación del material: se debe Preparación del material: si el equipo esterilizar el equipo

junto

portafiltros y la membrana.

con

los es reutilizable se debe esterilizar el manifold junto con los portafiltros y la membrana.

Sitio de trabajo: se debe llevar a cabo Sitio de trabajo: se debe llevar a cabo en un área estéril en cabina de flujo en un área estéril en cabina de flujo laminar clase 100.

laminar clase 100.

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Filtración del producto: se debe abrir Filtración

del

producto:

no

hay

el sistema para adicionar la muestra. manipulación de la muestra. (Momento en que puede presentarse contaminación de la muestra). Adición de la membrana al medio de Adición de la membrana al medio de cultivo: se debe desmontar el equipo y cultivo: no hay contacto en ningún cortar la membrana por mitad para momento adicionarla a los medios de cultivo.

con

la

membrana

ni

manipulación, se adiciona el producto y el medio de cultivo, para su posterior incubación.

Fuente: Catalogo Sartorius. Sterility Testing System.

2.3.3.2. Inoculación directa En condiciones asépticas se transfiere directamente en los medio de cultivo (Fluido de Tioglicolato y Digerido Caseína-Soja) la cantidad apropiada de producto a examinar, de modo que el volumen del producto no sea mayor de 10% del volumen del medio, a menos que se indique algo diferente. Se incuban los medios por no menos de 14 días a la temperatura adecuada, 32,5 +/- 2,5ºC para el medio Fluido de Tioglicolato y para el medio Digerido Caseína-Soja a 22,5 +/- 2,5ºC. Se observan los medios de cultivo periódicamente durante el periodo de incubación para determinar la ausencia o presencia de microorganismos. (USP 29, 2006) Este método es de elección para dispositivos médicos debido a que estos dispositivos están en contacto directo con los medios de cultivo durante el periodo de incubación. De esta forma los microorganismos viables que se pueden encontrar en un producto después de una inadecuada o defectuosa esterilización tienen un ambiente ideal donde pueden crecer y proliferar. (RICHTER, 2006)

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2.3.4. Interpretación de resultados A intervalos durante el período de incubación y al momento de su finalización, examinar los medios en busca de evidencias macroscópicas de crecimiento microbiano. (USP 29, 2006) Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano, los microorganismos deben aislarse e identificarse y el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad, a menos que pueda demostrarse claramente que la prueba resultó inválida por causas no relacionadas con el producto examinado. (RICHTER, 2006) El crecimiento es determinado mediante la observación del medio, el cual es generalmente claro y transparente, la turbidez en el medio indica el crecimiento microbiano. Una vez la turbidez es detectada se debe confirmar que es causada por el crecimiento de microorganismos y no por la desintegración de la muestra. Algunas muestras producen turbidez cuando son vertidas en los medios o producen reacciones químicas con los medios de cultivo. La prueba puede considerarse inválida si se cumple una o más de las siguientes condiciones: -

los datos de monitoreo microbiológico de las instalaciones para la prueba de esterilidad demuestran una falla.

-

Una revisión del procedimiento analítico usado durante la prueba revela una falla.

-

Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos.

-

Después de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la prueba, el crecimiento de esta especie puede atribuirse de manera inequívoca a fallas con respecto al material o a la técnica usados al realizar el procedimiento de la prueba de esterilidad.

Si la prueba se declara inválida, se repetirá con el mismo número de unidades de la prueba original. Si no se hallan pruebas de crecimiento microbiano en la prueba

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repetida, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad. (USP 29, 2006) (Ver Figura Nº 8.)

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de incubación

Fuente: PRADEAU, 1997.

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Turbiedad después

después de incubación

Ausencia de turbiedad

Turbiedad después de incubación

Figura Nº 8. Interpretación del ensayo de esterilidad.

realizado en n muestras

Segundo ensayo,

en n muestras

Primer ensayo, realizado

Conclusión: producto estéril

Conclusión: producto no estéril

Conclusión: producto estéril

Repetición del ensayo

Identificación A

Ausencia de turbiedad después de incubación

2.3.5. Condiciones del área estéril de trabajo Las áreas limpias para la manufactura y análisis de productos estériles son clasificadas de acuerdo a las características ambientales requeridas. Cada operación requiere un nivel de limpieza ambiental apropiado para minimizar los riesgos de contaminación microbiana en el producto. Un área limpia o cuarto limpio es un espacio definido en el cual la concentración de microorganismos en el aire, en superficies y en el personal, se encuentra entre límites o niveles específicos a una clase. Para la fabricación normal de productos estériles pueden distinguirse cuatro calidades de cuartos limpios: -

Grado A: es la zona para operaciones de alto riesgo, tales condiciones son proporcionadas por un trabajo bajo cámara de flujo laminar.

-

Grado B: es el ambiente de los alrededores de la zona A.

-

Grado C y D: áreas limpias donde se realizan las fases menos críticas, pero igualmente importantes, en la fabricación de productos estériles.

Esto es un punto importante que se debe tener en cuenta para que la preparación de los productos estériles se lleve de una forma controlada, evitando riesgos de contaminación

y

garantizando

la

calidad

de

estos

productos

para

su

comercialización. (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002) Para lograr las condiciones asépticas en la prueba de esterilidad, el entorno de la prueba tendrá que adaptarse a la manera en que se realice. Se deben tomar precauciones para

evitar la contaminación de modo que no afecte a ningún

microorganismo que deba detectarse en esta prueba. Las condiciones asépticas para la ejecución de la prueba deben ser usadas en una cabina de flujo laminar (cuarto limpio clase A) localizado en un cuarto limpio clase B. (Ver tabla Nº 5) (EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0., 2005) Las condiciones de trabajo en las que se efectúan las pruebas se controlan regularmente mediante un muestreo adecuado del área de trabajo y la realización

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de controles adecuados para verificar que estas condiciones sean apropiadas. (EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0., 2005) El control microbiológico de las áreas estériles se puede realizar por diferentes métodos como el método de sedimentación, el método de impactación utilizando un equipo muestreador de aire y también por muestreo de superficies. (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002) Al realizar los análisis de esterilidad en estas condiciones y con los debidos controles se reduce la incidencia de resultados falsos positivos debido a contaminaciones extrañas introducidas durante la realización del análisis. (HUGO y RUSSEL, 1998) Las condiciones de trabajo donde se realizó la evaluación práctica, laboratorio de microbiología de AQM Ltda., presenta especificaciones ambientales establecidas mediante estudios previos y resultados históricos. (Ver tabla Nº 6) Debido a que las pruebas de esterilidad constituyen un procedimiento cuya asepsia debe garantizarse para lograr una interpretación correcta de los resultados, es importante que el personal esté debidamente entrenado y calificado. (USP 29, 2006) Es importante que los materiales en los que se va a analizar la esterilidad no sufran contaminaciones procedentes de los operadores o del ambiente durante la realización del análisis. (HUGO y RUSSEL 1998) Por ello, estas pruebas deben llevarse a cabo en laboratorios adecuados y por personal competente y experto usando técnicas y equipo, lo cual minimiza los riesgos de contaminación microbiana accidental en las pruebas y en el muestreo ambiental. (AUSTRALIAN GOVERNMENT, 2006) El personal que ocupa el área aséptica durante la prueba de esterilidad debe llevar vestimenta estéril. (Ver tabla Nº 7) Igualmente todo el material, equipo y demás objetos que pueden entran en contacto durante el curso de la prueba deben ser esterilizados antes de su uso. (AUSTRALIAN GOVERNMENT, 2006) En conclusión el ensayo de esterilidad debe realizarse en condiciones muy estrictas, respetando las exigencias en cuanto a los procedimientos establecidos por la Farmacopea.

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Tabla Nº 5. Clasificación de ambientes controlados para la industria farmacéutica. Área

Denominación

Nº máximo de

Nº máximo de

grado

US

partículas/m3

microorganismos viables/m3

A

100

3530