OBTENCIÓN, REGENERACIÓN Y EVALUACIÓN DE HÍBRIDOS INTERGENÉRICOS ENTRE Carica papaya Y Vasconcellea cauliflora Ariadne Vegas, Gustavo Trujillo, Yanet Sandrea y Jonás Mata

RESUMEN El rescate de híbridos de cruces intergenéricos entre la lechosa (Carica papaya L.) y otras especies de vasconcelleas (antes conocidas como caricas) posibilita la transferencia de genes desde las especies silvestres hacia la cultivada. El objetivo del presente trabajo fue la obtención y evaluación de plantas híbridas mediante el rescate y regeneración de embriones u óvulos después del cruce entre C. papaya y Vasconcellea cauliflora. Se obtuvo un porcentaje de fructificación entre 0 y 76%,

de acuerdo al tipo de lechosa usada en el cruce. En los frutos, las semillas fueron vanas, inmaduras o contenían embriones cigóticos. En la mayoría de ellas ocurrió la poliembrionía cigótica in vivo, aún cuando también se produjeron híbridos individuales. Se logró el desarrollo, germinación y multiplicación de embriones híbridos, y la regeneración de plantas in vitro. Las plantas sembradas en campo produjeron flores andróicas y andromonóicas.

SUMMARY The rescue of hybrids from intergeneric crosses between papaya (Carica papaya L.) and other vasconcelleas species (known before as caricas) can make possible gene transfer from a wild species to a cultivated one. The object of this research was to obtain and evaluate hybrid plants after rescue and regeneration of embryos or ovules, from the crosses made between C. papaya and Vasconcellea cauliflora. After cross

Introducción Recientemente se reestableció el género Vasconcellea St. Hil. (anteriormente consideradas caricas) de acuerdo a, entre otros criterios, su imposibilidad de producir híbridos naturales entre Carica papaya L. (lechosa) con especies de Vasconcellea (Badillo, 2000). Además, pruebas filo genéticas con el ADN cloroplástico sugieren poca afinidad entre C. papaya y 12 especies de Vasconcelleas

estudiadas, y una estrecha relación entre las Vasconcelleas (Aradhya et al., 1999). Los cruces intergenéricos han sido realizados con miras a producir plantas de lechosa resistentes al virus de la mancha anillada de la lechosa (PRSV-P). La posibilidad de resistencia de algunas especies de Vasconcellea depende de un gen dominante alelo o idéntico (Micheletti, 1962; Horovitz y Jiménez, 1967; Magdalita et al., 1997b). En Carica papaya

pollination, 0 to 76% fructification was attained, according to the papaya type used. In the fruits, seeds were vain, immature or contained zygotic embryos. In most of them occurred in vivo zygotic polyembryony, although some individual hybrids were also formed. Development, germination, multiplication of embryo hybrids and plant regeneration in vitro were achieved. In the field, plants produced androic and andromonoic flowers.

no se ha encontrado resistencia o inmunidad, sólo grados de susceptibilidad y tolerancia intraespecífica que está condicionada por poligenes. Por lo tanto, mediante la selección, hibridación, autocruza y retrocruza se ha hecho posible obtener variedades e híbridos comerciales con un menor grado de susceptibilidad a la infección y altos rendimientos (Conover et al., 1986; Nopakunwong et al., 1993). En general, se ha experi-

mentado mucha dificultad en cruzar C. papaya con especies del género Vasconcellea. En la mayoría de los cruces ocurren problemas de incompatibilidad incompleta o completa. Se ha demostrado que las barreras precigóticas son mínimas y no se deben a la viabilidad del polen o a la penetración del tubo polínico (Mekako y Nakasone, 1975). Por otro lado, las barreras postcigóticas son importantes debido al colapso del endospermo y el aborto del em-

PALABRAS CLAVE / Carica papaya / Cultivo de Tejidos / Mejoramiento Genético / Rescate de Embriones / Vasconcellea cauliflora / Recibido: 18/08/2003. Modificado: 03/12/2003. Aceptado: 04/12/2003

Ariadne Vegas. BSc en Botánica, Universidad de Manchester, Inglaterra. MSc en Agronomía y Doctora en Ciencias Agrícolas, Universidad Central de Venezuela (UCV). Investigador, Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA), Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CENIAP). Di-

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rección: Unidad de Biotecnología Vegetal, INIA-CENIAP, Apartado Postal 588, Maracay 2101, Venezuela. e-mail: [email protected]. Gustavo Trujillo. Ingeniero Agrónomo, UCV. MSc y PhD, Universidad del Estado de Michigan, EEUU. Profesor, Facultad de Agronomía, UCV.

0378-1844/03/12/710-05 $ 3.00/0

Dirección: Instituto de Botánica Agrícola, Facultad de Agronomía, UCV. Apartado Postal 4579, Maracay 2101, Venezuela. e-mail: [email protected]. Yanet Sandrea. Estudiante de Postgrado, Facultad de Agronomía, UCV. e-mail: [email protected].

Jonás Mata. Ingeniero Agrónomo, UCV. Profesor, Facultad de Agronomía, UCV. Dirección: Instituto de Genética, Facultad de Agronomía, UCV. Apartado Postal 4579, Maracay, Venezuela. e-mail: [email protected].

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RESUMO O resgate de híbridos provenientes de cruzamentos intergenéricos entre mamão (Carica papaya L.) e outras espécies de vasconcelleas (antes conhecidas como caricas) possibilita a tranferência de genes das espécies selvagens para a cultivada. O objectivo do presente trabalho foi a obtenção e avaliação de plantas híbridas mediante o resgate e regeneração de embriões ou óvulos resultantes do cruzamento entre C. papaya e Vasconcellea cauliflora. Dos cruzamentos efectuados, 0 a 76%

brión (Manshardt y Wenslaff, 1989a, b). En los últimos años, algunos autores se han dedicado al rescate de embriones producto de estos cruces intergenéricos entre C. papaya y otras siete especies de Vasconcellea, incluyendo V. cauliflora, monoica, parviflora, cundinamarcensis, quercifolia, stipulata y heilbornii Badillo nm. pentagona (Mekako y Nakasone, 1975; Rojkind et al., 1982; Manshardt y Wenslaff, 1989a, b; Chen et al., 1991; González, 1992; Magdalita et al., 1996; Drew et al., 1998; Drew y O’Brien, 2001). La edad máxima de los embriones cultivables es de tres y medio meses, ya que después los embriones abortan. El éxito de los cruces intergenéricos tiene una posible influencia ambiental y varía considerablemente entre los genotipos. V. cauliflora ha sido la especie más usada por su conocida resistencia al virus y adaptabilidad a las mismas condiciones climáticas que la lechosa (Horovitz y Jiménez, 1967). En los cruces exitosos ha sido muy común observar la formación de embriones in vivo de origen cigótico (desde uno, hasta masas embriogénicas de número indeterminado). En los óvulos disectados no hubo signos de desarrollo del endospermo, ni hubo evidencia de la formación de embriones somáticos del nucelo o los integumentos (tejido materno) (Manshardt y Wenslaff, 1989a). Los embriones bien diferenciados pudieron germinar en medios de cultivo simples, mientras que los poco

diferenciados o las masas embriogénicas necesitaron de la adición de otros componentes para que continuaran produciendo masas de embriones secundarios, hasta su desarrollo y germinación. De estas dos formas se pudieron clonar los híbridos (Manshar dt y Wenslaff, 1989b; Chen et al., 1991; Magdalita et al., 1996). Los medios de cultivo usados por los autores incluyen MS (Murashige y Skoog, 1962) completo o al 50%, De Fossard et al. (1974) al 50%, y White (1963) completo. Dichos medios fueron suplementados, o no, con glutamina, asparagina o caseína hidrolisada, 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) o BA (N 6bencilaminopurina) y ANA (ácido naftalenoacético), en combinación o no con ácido giberélico. Los cultivos de embriones se colocaron en condiciones de luz u oscuridad (Rojkind et al., 1982; Manshardt y Wenslaff, 1989a, b; Chen et al., 1991; González, 1992; Magdalita et al., 1996; Drew et al., 1998). Después de 1 a 4 meses los embriones cigóticos germinaron, siendo transferidos a medios de cultivo frescos, MS sin reguladores de crecimiento o con BA y ANA. Las plántulas con raíces se transfirieron directamente a vermiculita y los brotes sin raíces se trataron con un enraizador comercial que contenía 0,1% de ácido indol-3-butír ico antes de aclimatarlos y colocarlos en cámaras húmedas. El tiempo requerido entre la siembra y su aclimatación varió de 2 a 10 meses (Manshardt y Wenslaff, 1989b).

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formaram frutos, de acordo com o tipo de papaya usado. As sementes presentes nos frutos foram vás, inmaduras o possuiam embriões zigóticos. Na maioria dessas sementes ocorreu poliembrionia zigótica in vivo, embora também foram formado alguns híbridos individuais. Conseguiu-se o desenvolvimento, germinação, multiplicação de embriões híbridos e regeneração de plantas in vitro. As plantas establecidas em campo produziram flores andróicas y andromonóicas.

Las plantas híbridas reportadas fueron de porte más bajo y florecieron más temprano que los padres y no mostraron síntomas al virus de la mancha anillada de la lechosa, al ser evaluadas en campos infectados con el virus. Con respecto a las características morfológicas, algunas fueron iguales, otras variaron o fueron intermedias con respecto a los padres (Manshardt y Wenslaff, 1989a; Magdalita et al., 1997a). Manshadt y Wenslaff (1989a) y Magdalita et al. (1997a, b) recobraron híbridos de C. papaya x V. cauliflora con poco vigor, baja viabilidad y fertilidad. Más recientemente se ha reportado éxito en retrocruces de los híbridos C. papaya x V. quercifolia con papaya; polen del híbrido ha polinizado flores de C. papaya y se ha generado una población de plantas resistentes al PRSVP que han producido polen fér til (Drew y O’Brien, 2001). En los patrones isoenzimáticos y los derivados de la técnica RAPD (del inglés random amplified polymorphic DNA, o ‘amplificación aleatoria del ADN polimórfico’) de los cruces se muestran bandas que corresponden a ambos padres, a uno de ellos, o bandas nuevas que tienen una tasa de migración intermedia a la encontrada en los padres. Estos resultados confirmaron el origen híbrido de los embriones (Moore y Litz, 1984; Manshardt y Wenslaff, 1989a, b; Chen et al., 1991; Magdalita et al., 1997a). El objetivo del presente trabajo fue el rescate y rege-

neración de embriones y óvulos provenientes del cruce intergenérico entre tipos de lechosa cultivadas en Venezuela y Vasconcellea cauliflora, y la posterior evaluación de las plantas híbridas en condiciones de umbráculo y campo. Materiales y Métodos Se realizaron cruces intergenéricos entre tipos de lechosa (ginóicas): Larga, Eleuteriego, Cariflora, Costa Rica y V. cauliflora (androica), sembradas en el Campo Experimental de la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela, en el estado Aragua. Los dos primeros tipos de lechosa procedían de los estados Apure y Guárico, y la variedad Cariflora y el tipo Costa Rica provenían de Florida (EEUU) y Costa Rica, respectivamente. La especie silvestre era nativa del Parque Henry Pittier, estado Aragua, Venezuela. Estos cruces se realizaron entre 8:00 y 10:00am, frotando las anteras de unas cinco flores andróicas en una flor ginóica, antes que ocurriera la antesis. Entre los 90 y 120 días después de la polinización, se cosecharon los frutos formados, que fueron esterilizados superficialmente con alcohol 70% y se extrajeron las semillas asépticamente (Micheletti, 1958). Las semillas fueron cortadas tangencialmente para tratar de no dañar los embriones. Los óvulos y los embriones híbridos fueron cultivados en los medios de cultivo de 1) embriogénesis: mitad medio

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TABLA I RESCATE DE EMBRIONES CIGÓTICOS PROCEDENTES DE SIETE CRUCES INTERGENÉRICOS EXITOSOS ENTRE C. papaya (GINÓICA) Y C cauliflora (ANDRÓICA) Cruce1 Híbrido (H)

a

b

Número de semillas Poliembrionia Semilla cigótica (PC) vacía

Semilla inmadura

Total

1 2 3 4 5 6 7

-2 10 03 01 02 08 06

-2 33 44 30 13 33 02

03 15 37 05 46 36 194

-2 09 00 04 02 00 00

51 67 84 40 63 77 202

Total

30

155

336

15

584

1 Los cruces del 1 al 4 provinieron de la población de lechosa Larga, el cruce 5 provino de la población Eleuteriego, y los cruces 6 y 7 de la población Costa Rica. 2 En el primer cruce no se contabilizó el número de embriones contenidos en cada semilla, por no considerarse importante.

c

d Figura 1. Rescate de embriones cigóticos en cruces intergenéricos de C. papaya x V. cauliflora. a: Híbrido (x10). b: Poliembriones cigóticos (x20). c: Multiplicación y desarrollo de los híbridos (x8). d: Híbrido aclimatado.

base MS, vitaminas MS, glutamina 400mg·l -1 con 10mg·l -1 de 2,4-D, sacarosa 60g·l -1 (Fitch y Manshardt, 1990); 2) germinación: medio base MS, vitaminas MS, cinetina 0,1/BA 0,2mg·l -1 , sacarosa 30g·l 1 (Fitch, 1993); 3) multiplicación: medio base MS, vitaminas MS, BA 0,4/ANA 0,08mg·l-1, sacar osa 30g·l -1 (Tovar, 1989). A todos los medios se les ajustó el pH a 5,8 y

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se solidificaron con agar 0,7%. Los explantes sembrados en los medios de embriogénesis, se colocaron a 25 ±2 ºC en condiciones de oscuridad y los demás en condiciones de luz, 32 µmol·s-1·m-2 y fotoperíodo de 16h. Al disectar las semillas se cuantificaron las que contenían un solo híbrido, poliembrionía cigótica, semillas vanas y semillas inmaduras.

Los híbridos intergenéricos se germinaron en los medios de cultivo de germinación o multiplicación descritos. Plántulas procedentes de embriones germinados mayores de 1cm se colocaron en el medio base MS sólido simple (medio base MS, vitaminas MS, pH 5,8 y agar 0,7%) para su posterior elongación y desarrollo. En algunos casos se indujo la formación de raíces en plántulas desprovistas de ellas, colocándolas en el medio de enraizamiento (medio base MS, ácido indolacético 5mg·l-1, pH 5,8 y agar 0,7%; Tovar, 1989). Las plántulas de ≥3cm fueron transferidas a macetas con una mezcla de suelo estéril, cubiertas con una bolsa plástica por 15 días. Posterior mente se llevar on a condiciones de umbráculo y campo para su aclimatación y evaluación. Las plantas aclimatadas se sembraron a 500 y 1500msnm en los estados Anzoátegui y Aragua, respectivamente. Resultados y Discusión De los cruces realizados, usando como madre a Carica papaya y como padre a Vasconcellea cauliflora, se cosecharon 18 frutos produc-

to de estas hibridaciones; los otros frutos abortaron. Esto representó entre 0 y 76% de fructificación, dependiendo del tipo de lechosa. Cuando se usaron las poblaciones locales Larga y Eleuteriego se obtuvieron 57 y 50% de fructificación, respectivamente. Mientras que la población Costa Rica dio el mayor porcentaje (76%) y con la variedad Cariflora no se logró la formación de ningún fruto (0%). Entre los 90 y 120 días se cosecharon los frutos, y al cortarlos asépticamente se observó que las semillas producidas eran blancas, pequeñas y de forma cilíndrica. Se ha reportado que las semillas de los cruces intergenéricos son más pequeñas que las semillas de los padres (Mekako y Nakasone, 1975). Al disectar la semilla, bajo el microscopio estereoscópico, se observó que la sarcotesta y la esclerotesta estaban bien formadas, pero hubo ausencia de endospermo. Un saco embrionario flácido, de color blanco aperlado, que recubría total o parcialmente los embriones o las masas embriogénicas estuvo presente en la mayoría de las semillas. Los embriones o las masas embriogénicas eran de color

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a

a

b Figura 2. Comparación entre plantas del híbrido intergenérico y lechosa procedentes del cultivo in vitro, a nivel de umbráculo. a: Lechosa (izquierda) e híbrido (derecha), después de tres meses del transplante a suelo. b: Morfología característica del híbrido, antes del transplante a campo.

verde claro y se encontraron ubicados en el extr emo opuesto del micrópilo (Figura 1). En la Tabla I se muestra el número de semillas híbridas conteniendo un sólo embrión híbrido (H), varios embriones (poliembrionía cigótica, PC), y semillas vacías e inmaduras, en los 7 frutos de las poblaciones Larga, Eleuteriego y Costa Rica. Los otros 11 frutos, pertenecientes al tipo Costa Rica, dieron semillas vanas, inmaduras o frutos sin semillas. En general, en la mayoría de las semillas que contenían embriones, ocurrió la poliembrionía cigótica in vivo, aún cuando también se produjeron embriones solos (Figura 1). Esto parece ser una tendencia que se ha ob-

servado en cruces realizados por otros autores, entre ellos Magdalita et al. (1996). De igual manera se observó la presencia de semillas vacías, que en algunos cruces sobrepasaba el número de semillas que contenían embriones. Los óvulos con masas embriogénicas más diferenciadas y los embriones híbridos más desarrollados, al sembrarlos en los medios de multiplicación o germinación y en condiciones de luz, se observa ron pr oliferados y verdes al cabo de 1,5 a 2,5 meses y en adelante. Después de 6 a 7 meses, algunas plantas híbridas ya habían alcanzado 2 a 3cm y poseían raíces. Por otro lado, los óvulos con masas embriogéni-

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b Figura 3. a: Comparación entre plantas del híbrido intergenérico de C. x V. cauliflora (derecha) y lechosa (izquierda), procedentes del cultivo in vitro, después de cuatro meses del transplante a campo, a 500msnm. b: Detalle de la floración del híbrido.

cas menos diferenciadas se engrosaron, produjeron un callo friable de color blanco en la parte cortada, y en la cavidad embrionaria se d e s a r ro l l a r o n a bu n d a n t e s masas embriogénicas de color crema, en los medios embriogénicos con 2,4-D, y luego se germinaron en los medios mencionados en condiciones de luz (Figura 1). En algunas de las semillas, aparentemente vacías antes de la siembra, se desarrollaron masas de embriones al ser cultivadas en los medios de multiplicación en la luz o en los me-

dios de embriogénesis en la oscuridad. Se recomienda el cultivo de los óvulos, en vez del cultivo de embriones, cuando los embriones híbridos son extremadamente pequeños, aún cuando no se visualiza una masa en el extremo del hipocótilo, ya que se ha observado que al eliminar el suspensor se reduce el desarrollo del embrión inmaduro (Monier, 1976). Se corrobora que el rescate de embriones híbridos en condiciones in vitro es un método viable, el cual permite el crecimiento, la mul-

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tiplicación y germinación (Figura 2) de los mismos de una manera continua (Chen et al, 1991), y con igual facilidad que los embriones somáticos obtenidos de tejidos de lechosa (Fitch y Manshardt, 1990; Fitch, 1993). Las plantas híbridas in vitro y en el umbráculo mostraron fenotipos que fueron consistentes con su origen paterno, tuvieron hojas más verdes y más brillantes, con márgenes más puntiagudas que las vitroplantas de lechosa ( Figura 2). En el umbráculo, los híbridos presentaron un crecimiento lento, en comparación con plantas de lec hosa provenientes del cultivo in vitro. El período de aclimatación de las plantas de lechosa fue de tres meses, mientras que los híbridos necesitaron entre seis a ocho meses. En el campo, los clones híbridos florecieron a los 3 a 4 meses después de la siembra, en ambos ensayos, al igual que las vitroplantas de lechosa, en el ensayo a 500msnm en el estado Anzoátegui; mientras que a 1500msnm, en el estado Aragua, las plantas de lechosa crecieron y florecieron poco y más tardíamente; las escasas flores producidas se cayeron y no fructificaron. El desarrollo de las plantas híbridas fue notablemente más lento, en comparación con plantas de lechosa, en el ensayo a 500msnm en el estado Anz oátegui ( F igur a 3). A 1500msnm ambos materiales se desarrollaron de maner a s i m i l a r. U n o d e l o s clones híbridos presentó flores normales tipo andróicas, en racimos y solitarias, en el ensayo a 500msnm (Figura 3), y el mismo clon produjo flores andróicas y andromonóicas a 1500msnm. Estos resultados son corroborados parcialmente por los obtenidos por Magdalita et al. (1997a), cuyas plantas híbridas entre C. papaya y V. cauliflora sólo produjeron flores andromonóicas.

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Conclusiones y Recomendaciones Los estudios demostraron que la hibridación intergenérica entre C. papaya y V. cauliflora seguida del cultivo de óvulos y de embriones inmaduros parece ser un método factib le para la transferencia de genes entre la especie silvestre y la cultivada. La ausencia de endospermo en las semillas formadas del cruce entre C. papaya y V. cauliflora evidencia la formación del híbrido, y las diferencias fenotípicas comparativas entre los híbridos y las plantas de lechosa lo ratifican. Se recomienda el uso de vasconcelleas geneticamente más relacionadas, como V. quercifolia y V. cundinamarcensis en los cruces con la lechosa, y la evaluación de un gran número de plantas híbrido en el campo para garantizar híbridos fértiles útiles en los programas de mejoramiento genético, como ha sido señalado por algunos autores (Aradhya et al, 1999; Magdalita et al, 1997a). AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen la colaboración de Luis Castro, Marlene Martínez y Gustavo Robles del Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, y al convenio FONTAGROIPGRI por el financiamiento parcial de este trabajo. REFERENCIAS Aradhya M, Manshardt R, Zee F, Morden C (1999) A phylogenetic analysis of the genus Carica L (Caricaceae) based on restriction fragment length variation in a cp DNA intergenic spacer region. Genetic Resources and Cro p Evolution 46: 579-586. Badillo V (2000) Carica L. vs. Vasconcellea St. Hill (Caricacea) con la rehabilitación de este último. Ernstia 10: 74-79. C o n ov e r R , L i t z R , M a l o S (1986) ‘Cariflora’-a papaya

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