CUBA TABACO

Vol.9, No. 1, 2008

POLIMORFISMO GENÉTICO DE LA REGIÓN 1602 EN SEIS AISLAMIENTOS DE PERONOSPORA HYOSCYAMI F. SP. TABACINA (ADAM), AGENTE CAUSAL DEL MOHO AZUL DEL TABACO 1

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Yussuan K. Silva Larrañaga , Berta L. Muiño García , Osmani Chacón Chacón , José 1 3 A. Crespo Romero y Orlando Borras Hidalgo . 1 Instituto de Investigaciones del Tabaco. Ctra. Tumbadero km 8 ½, San Antonio de los Baños, La Habana, Cuba 2 Instituto Nacional de Investigaciones de Sanidad Vegetal 3 Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB) E-mail: [email protected]

RESUMEN Un número limitado de marcadores moleculares han sido aplicado en las investigaciones sobre la diversidad genética de Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina . Los marcadores incluyen isoenzimas, espaciadores internos que se transcriben y fragmentos de ADN polimórficos amplificados aleatoriamente. Muy poco se conoce acerca de la biología molecular y la genética de este mildeu. El objetivo de este estudio fue analizar una región de ADN polimórfica para determinar la variabilidad genética entre aislados cubanos de P. hyoscyami f. sp. tabacina. La región genómica 1602 perteneciente a un aislado de P. hyoscyami f. sp. tabacina de Kentucky (EEUU) fue seleccionada para detectar el polimorfismo genético entre seis aislamientos cubanos previamente colectados. El genoma completo de los seis aislamientos fue utilizado como molde para la amplificación especifica de la región 1602. Un fragmento de 232 pb (pares de bases) se obtuvo a partir del PCR. Se realizó secuenciación nucleotidica y alineamiento para los seis aislamientos. La región amplificada mostró un alto grado de polimorfismo genético de tal manera que permitió relacionar a los aislamientos con su área de origen. Los aislamientos 5 y 6 de Pinar del Río compartieron entre ellos una alta homología de secuencia (98 %) y fueron los más similares a la región 1602 con un 97 % de secuencias homologas. Los aislados de La Habana 1,2 y 3 fueron muy cercanos entre sí, ya compartieron una identidad de secuencia de un 98 %; sin embargo, la similitud con la región 1602 y los aislados de Pinar de Río fue escasa del 29 % y 31 % respectivamente. Por otra parte, el aislado 4 de Holguín mostró la menor similitud con la región 1602 (24%) y cuando fue comparada con los aislados de Pinar del Río y la Habana la identidad nucleotídica fue de 35 % y 45 % respectivamente. Este trabajo representa el primer informe en el esclarecimiento de la estructura genética poblacional de aislados cubanos de Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina de diferentes zonas de colecta. Palabras claves: Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina, polimorfismo genético, RCP, marcadores moleculares, tabaco

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ABSTRACT GENETICPOLYMORPHISM IN THE 1602 REGION OF SIX ISOLATES OF PERONOSPORA HYOSCYAMI F. SP. TABACINA (ADAM), CAUSAL AGENT OF BLUE MOLD IN TOBACCO A few numbers of molecular markers have been applied to investigate genetic diversity in Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina including isoenzymes, internal transcribed spacer sequences and random amplified polymorphic DNA. Very little is known about the genetics or molecular biology of this mildew. The objective of this study was to analyze a DNA polymorphic region to find genetic variability among P. hyoscyami f. sp. tabacina Cuban isolates. The 1602 genomic region from P. hyoscyami f. sp. tabacina Kentucky (EEUU) isolated was selected to detect the genetic polymorphism between the six previously collected Cubans isolated. The purified genomes from the six isolated were used as template for the 1602 region specific -PCR amplification. A 232 bp (base pairs) DNA fragment was yielded from the PCR. The fragment from the six isolates was sequenced and alignments were performed. The region amplified shown high degree of genetic polymorphism within the isolates so that the sequence differences allowed relate to them with the own origin area. The 5 and 6 isolated from Pinar del Río shared among them a high homology sequence (98 %) and were the most similar to 1602 region with a 97 % homology sequences. The isolated from Havana 1, 2 and 3 were very closer between them because they shared an identity sequence of a 98 %, however the similarities with the 1602 and the Pinar del Río isolated was poor, approximately 29 % and 31 % respectively. In the other hand the isolate 4 from Holguín shown the most little similarities with the region 1602 (24 %) and when its compare with the Pinar del Río and Havana isolated the nucleotide identity was 35 % and 45 % respectively. This work represents the first report in the genetic structure populations understand within the Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina Cubans isolated from distinct origins Key words: Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina, genetic polymorfism PCR, molecular markers, tobacco

INTRODUCCIÓN El agente causal del moho azul de tabaco es el hongo parásito obligado Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina. Desde los años 1980 hasta la actualidad ha sido la enfermedad fungosa de mayor incidencia e impacto económico en el cultivo del tabaco, Nicotiana tabacum L. (Muiño et al., 2001). La enfermedad es endémica en Cuba, Centroamérica y América del Norte (Aylor et al., 1982). Anualmente se producen epifitias en estas regiones o focos persistentes de la enfermedad causando pérdidas económicas de valor considerable.

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En las regiones de Texas y Kentucky en los EEUU se han realizado estudios epidemiológicos que han revelado la heterogénea mezcla de poblaciones del hongo (Reuveni et al., 1988). Los estudios de patogenicidad y virulencia de estas poblaciones han mostrado diferencias significativas que han llevado a plantear a varios investigadores que las fuentes de contaminación y dispersión del hongo tienen su origen en la región caribeña y en particular en Cuba, República Dominicana y México (Kuchareck et al., 1996). La capacidad de

Vol.9, No. 1, 2008 dispersión del hongo es notable ya que su fase asexual, los esporangiosporos, son capaces de ser transportados por los vientos a cientos de kilómetros de su lugar de origen (Davis et al., 1991). Los epidemiólogos han relacionados las severas epifitias con eventos meteorológicos como ciclones y tormentas tropicales pues estas estructuras serian llevadas a mayor distancia durante su dispersión (Main et al., 2001). Resultan escasos los estudios moleculares entre las poblaciones de P. hyoscyami f. sp. tabacina (Cohen et al., 1980). Algunos autores han utilizado isoenzimas (Micales et al., 1988), otros han comparado las regiones repetitivas del ácido dexosiribonucleico ribosomal (ADNr) (Wiglesworth et al., 1994) y las secuencias génicas de los espaciadores internos que se transcriben (ITS), (Riethmuller et al., 2002; Ristaíno et al 2007). A su vez (Suckno et al., 2002) informan la uniformidad genética entre diferentes poblaciones de Kentucky, Tennessee y Virginia en los EEUU, utilizando para ello sondas específicas del ADN de P. hyoscyami f. sp. tabacina. Sin embargo aunque en Cuba ha sido amplia la investigación sobre la virulencia de los aislamientos del hongo (Muiño et al., op. cit.) no se ha realizado aun ningún estudio genético que permita comparar los aislados cubanos entre sí. Por ello el objetivo de este trabajo ha sido determinar la variabilidad genética en

CUBA TABACO la región genómica 1602 mediante el análisis de secuencia de ADN, en seis aislados de P. hyoscyami f. sp. tabacina (Adam), lo cual constituye el primer informe realizado en Cuba sobre el polimorfismo genético del hongo.

MATERIALES Y MÉTODOS Colecta y conservación de los aislamientos de Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina (Adam) Colecta de los aislamientos Los aislamientos utilizados en este estudio provienen de campos de tabaco cultivados en las áreas de producción durante la campaña del 2006-2007. Las poblaciones fueron mantenidas en condiciones in vivo en el laboratorio de Micología del Instituto Nacional de Sanidad Vegetal. Conservación de Peronospora hyoscyami f. sp. tabacina Los esporangiosporos fueron colectados de las lesiones con esporulación abundante a partir de la previa inoculación de las poblaciones del hongo en la variedad tradicional Criollo descrita como susceptible al ataque de moho azul. La suspensión de esporangios fue conservada a -70 ºC en una solución de Dimetil Sulfóxido al 10 % v/v y transferido a un tubo criogénico de 1.5 ml (Moss et al., 1988).

Tabla 1. Procedencia de los aislados de P. hyoscyami f. sp. tabacina (Adam)

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CUBA TABACO Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (RCP) de la región genómica 1602 en las poblaciones de Peronospora hyoscyami f. sp tabacina (Adam). La amplificación genómica se realizó mediante RCP con los cebadores específicos para P. hyoscyami f. sp. tabacina 1602A5´CTCTATGTACAGTGTCGGTAA-3´ 1602B- 5´GAACGGTAGATGATCGACTGT3´ (Wiglesworth et al., op. cit.). El volumen de reacción total fue de 50 ul dentro de tubos de 0,5 ml de paredes delgadas. El molde utilizado fue 100 ug de ADN total purificado mediante el protocolo de Sunkno et al., (op. cit.)para cada uno de los seis aislamientos, como control negativo se utilizaron 100 ug ADN de planta de tabaco, Phythopthora spp y Pythium spp donados gentilmente por el Departamento de Genómica del CIGB. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes, 2 minutos a 96 ºC, seguidos por 35 ciclos consecutivos de 1 min a 96 ºC, una hibridización a 55 ºC por 1 min y una extensión a 72 ºC por 2 min, por último un paso más de extensión por 10 min a 72 ºC (Wiglesworth et al., 1994). Los productos amplificados fueron separados en gel de agarosa al 1 % y luego purificados mediante el protocolo de QIAGEN (Bothell, NA, QiAquick PCR Purification kit). Análisis comparativo de la secuencia amplificada entre los seis aislamientos de Peronospora hyoscyami f. sp tabacina (Adam) Los fragmentos de ADN purificados fueron secuenciados por los servicios de MACROGEN (Korea). Las secuencias generadas fueron alineadas y comparadas con la informada y publicada por (Wiglesworth et al., op. cit.) y entre sí mediante el programa computarizado Clustal W.

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN Colecta y conservación de los aislamientos Los aislamientos del hongo se distribuyen de la manera siguiente: aislamientos 1,2 y 3 de la región tabacalera de la provincia la Habana, aislamiento 4 de la región de Holguín, zona oriental de Cuba y los aislamientos 5 y 6 de la provincia Pinar del Río, región más occidental de Cuba. La conservación de los aislamientos en condiciones de congelación mantuvo las características patogénicas de los mismos ya que fueron capaces de infestar la variedad tradicional Criollo susceptible al ataque del mildiu. Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (RCP) de la región genómica 1602 en las poblaciones de Peronospora hyoscyami f. sp tabacina (Adam) La región 1602 del genoma de los seis aislados fue amplificada con cebadores específicos (Fig. 1). Las bandas mostraron un peso molecular de 232 pares de bases lo cual coincide con el peso molecular obtenido por Wiglesworth et al., (op. cit.) La región amplificada resultó única y específica para todos los aislamientos pues a pesar de que la misma está repetida en el genoma del hongo en aislados de EEUU al menos en los colectados para este estudio se evidenció una sola banda. En el RCP no se amplificaron bandas en los genomas de N. tabacum, Phythopthora spp., o Pythium spp., lo cual corrobora la idoneidad de esta región para la detección y diagnóstico temprano de la presencia del hongo cuando no se hayan presentado los síntomas macroscópicos típicos de la enfermedad. Peronospora hyoscyami f. sp tabacina (Adam) se agrupa entre los hongos omicetos en donde se encuentran además los géneros patogénicos de tabaco Phythopthora spp., y Pythium spp entre

Vol.9, No. 1, 2008 ellos existen relaciones filogenéticas que han sido mencionadas en los trabajos de Ristaíno et al., (op. cit.). Al analizar las secuencias ITS y a pesar de la homología de secuencias que pueden compartir el genoma de estos hongos la región 1602 es muy específica para distinguir Peronospora hyoscyami f. sp tabacina (Adam) del resto de los oomicetos. Análisis comparativo de la secuencia amplificada entre los seis aislamientos de Peronospora hyoscyami f. sp tabacina (Adam) El alineamiento de secuencias amplificadas de 232 pares de bases se aprecia en la Fig.2. Las mismas fueron comparadas con la secuencia de referencia 1602, descrita por Wiglesworth et al., (op. cit.) y se comprobó el polimorfismo genético de esta región. Las zonas marcadas con los recuadros en negro son las regiones de homología

CUBA TABACO idéntica que solo se observan en 24 pares de bases. Las zonas marcadas en gris reflejan el cambio de al menos una base y las zonas no marcadas son las regiones de mayor variabilidad. En la matriz de similitud de secuencias (Fig. 3) se observan los porcentajes de homología. Los aislamientos 5 y 6 de Pinar del Río presentan una alta identidad de secuencia entre ellos (98 %) y son los de mayor similitud con respecto a la región 1602 descrita por Wiglesworth (96 % y 97 % respectivamente). Los aislamientos 1, 2 y 3 de la Habana presentan un porcentaje de homología superior al 98 % entre ellos, sin embargo, sólo se asemejan a la región 1602 en un 29 % y en un 31 % a los aislados de Pinar del Río. El aislamiento 4 procedente de Holguín resultó el de mayor variabilidad pues mostró el menor porcentaje de homología (24 %) con la región de referencia. Además los porcentajes de similitud con

Figura 1. Amplificación de la región 1602, banda amplificada de 232 pares de bases. MWM, marcador de peso molecular de 100 pares de bases, carriles 1-6, aislamientos del estudio. Carriles 7,8 y 9 ausencia de banda en los genomas de N. tabacum L., Phythopthora spp., y Pythium

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CUBA TABACO los aislados de Pinar del Río y de la Habana fueron de un 35 % y 45 % respectivamente. La secuencia 1602, informada y publicada por Wiglesworth en 1994, es de un aislamiento de Kentucky del año 1992. Es significativo que aislamientos del año 2007, 5 y 6 colectados en Pinar del Río presenten alta homología con la secuencia anterior y constituye una evidencia de que existe identidad genética entre los aislamientos de dos regiones tabacaleras distantes entre sí, de Pinar de Río, Cuba y Kentucky, EEUU al menos para un marcador molecular polimórfico como lo es 1602. Las diferencias observadas entre los aislados de diferentes regiones han sido corroboradas an-

Vol.9, No.1, 2008 teriormente por otros autores. Suckno et al., (op. cit.) encontraron 10 haplotipos diferentes entre aislados estadounidenses de diferentes zonas utilizando sondas específicas para la especie. Sin embargo concluyen que existe homogeneidad genética determinada por el escaso polimorfismo hallado en esta cantidad de marcadores analizados. En contraste con estos resultados, la región amplificada en este estudio fue muy polimórfica y permitió distinguir y agrupar los aislados por regiones.

CONCLUSIONES La región 1602 fue amplificada y secuenciada en los seis aislamientos cuba-

Figura 2. Alineamientos de secuencias generados por el Clustal W en los diferentes aislamientos. Las secuencias se exponen de manera horizontal. Aislamientos 5 y 6 de Pinar del Río. Aislamientos 1,2 y 3 de la Habana y el aislamiento 4 de Holguín. Se utilizó la secuencia de referencia publicada por Wiglesworth et al., (op. cit.).

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Figura 3. Matriz de similitud de secuencia entre los aislamientos y la región de referencia 1602. Los aislamientos 5 y 6 proceden de Pinar del Río. Los aislamientos 1, 2 y 3 pertenecen a la Habana y el 4 a Holguín.

nos. La región presenta una alta especificidad en P. hyoscyami f. sp tabacina y no fue amplificada en otros omicetos relacionados, lo cual puede ser útil para el diagnóstico temprano de la enfermedad. Se evidenció el polimorfismo genético en la región 1602 entre los aislamientos de la Habana, los de Pinar del Río y el de Holguín. Existe una alta homología de secuencia entre los aislamientos de Pinar de Río 5 y 6 y el aislado de Kentucky a pesar de que no están relacionados espacial y temporalmente.

RECOMENDACIONES Realizar el estudio con un número representativo de aislados de cada localidad para considerar la idoneidad de este marcador molecular en estudios epidemiológicos del hongo en Cuba. Emplear este marcador con aislamientos foráneos que permitan la comparación con los aislamientos cubanos.

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